BR112016028911B1 - Processo para a purificação de l-alfa- glicerofosforilcolina, l- alfaglicerofosforilcolina e método para determinar a pureza de l-alfaglicerofosforilcolina - Google Patents
Processo para a purificação de l-alfa- glicerofosforilcolina, l- alfaglicerofosforilcolina e método para determinar a pureza de l-alfaglicerofosforilcolina Download PDFInfo
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Abstract
PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE L-ALFA-GLICEROFOSFORILCOLINA Um processo para a purificação de L-(Alfa)- glicerofosforilcolina é descrito, em que L-(Alfa)- glicerofosforilcolina é cristalizado a partir de DMSO ou a partir de uma mistura de DMSO com pelo menos outro solvente, preferivelmente selecionado a partir de água, álcool, solventes halogenados, éteres, ésteres e/ou amidas. Tal processo permite obter L-(Alfa)-glicerofosforilcolina tendo uma pureza maior do que 99,5%, preferivelmente maior do que 99,7%, ainda mais preferivelmente maior do que ou igual a 99,9%. Um método para determinar a pureza de L-(Alfa)-glicerofosforilcolina também é descrito, compreendendo a eluição de L-(Alfa)-glicerofosforilcolina através de uma coluna de HPLC tendo uma fase estacionária amino, e subsequente detecção de L-(Alfa)-glicerofosforilcolina em si, e qualquer impureza do mesmo, por meio de um tipo de Detector de Dispersão de Luz por Evaporação.
Description
[0001] O objetivo da presente invenção é um processo para a purificação de L-α-glicerofosforilcolina, em que L-α-glicerofosforilcolina é cristalizada a partir de DMSO ou a partir de uma mistura de DMSO com pelo menos outro solvente, preferivelmente selecionado a partir de água, álcool, solventes halogenados, éteres, ésteres e/ou amidas. Tal processo permite obter L-α- glicerofosforilcolina, que também constitui um objetivo da presente invenção, tendo uma pureza maior do que 99,5%, preferivelmente maior do que 99,7%, ainda mais preferivelmente maior do que ou igual a 99,9%; em particular, permite obter GPC contaminada por menos do que 0,1% pelo seu isômero β-GPC e/ou por menos do que 0,1% por cGP de espécies cíclicas.
[0002] Um objetivo adicional da presente invenção é representado por um método para determinar a pureza de L-α- glicerofosforilcolina compreendendo a eluição de L-α- glicerofosforilcolina através de uma coluna de HPLC tendo uma fase estacionária amino, e subsequente detecção de L-α- glicerofosforilcolina em si, e qualquer impureza da mesma, por meio de um tipo de Detector de Dispersão de Luz por Evaporação (Evaporative Light Scattering Detector type).
[0003] As tendências demográficas e econômicas levaram a um envelhecimento geral da população, e este fenômeno é particularmente comercializado nas regiões mais ricas do globo.
[0004] Um declínio de capacidades individuais com envelhecimento, portanto, se tornou um problema muito importante, e existe uma necessidade crescente de métodos de identificação que ajudem a desacelerar este declínio.
[0005] Em particular, o enfraquecimento de capacidades mentais é uma das consequências mais negativas do envelhecimento, e muitos esforços de pesquisa são devotados a encontrar terapias eficazes para lutar com isto.
[0006] Nesta área, um dos produtos de maior interesse é L-α-glicerofosforilcolina (GPC), em que a estrutura é mostrada abaixo.
[0007] GPC possui um uso bem estabelecido como agente terapêutico no campo de desordens cognitivas, e o seu consumo mundial, com base em uma grande confirmação de eficácia na prática médica e em várias tentativas clínicas, é bem estabelecido.
[0008] Os métodos de preparo de GPC podem ser divididos em dois tipos principais: aqueles com base na reação de desacetilação de fosfatidilcolina de origem natural, e aqueles em que GPC é sintetizada a partir de matérias-prima comercialmente disponíveis no mercado de intermediários químicos.
[0009] Os métodos do primeiro tipo possuem a vantagem de usar como produtos de matéria-prima, tais como lecitina de soja, já bastante usado na indústria de alimentos, e caracterizado pelo fato de que a sua manipulação não gera qualquer risco de segurança particular.
[00010] Os procedimentos com base na abordagem sintética de GPC em vez disso podem originar preocupações no gerenciamento de substâncias usadas e, em particular, dos precursores sintéticos quirais. Estes são principalmente R-glicidol e R-cloropropanodiol (estruturas I e II destacadas abaixo, respectivamente) e, em ambos os casos, estas são moléculas de alquilação que possuem consideráveis características de toxicidade. Portanto está claro que o seu uso pode gerar problemas de perigo durante o uso e a manipulação, e até perigos no consumo de GPC obtida a partir destes, no caso de traços residuais ou se outras espécies estavam presentes (por exemplo, intermediários ou subprodutos) mantendo as suas características de toxicidade.
[00011] Qualquer que seja o método de preparo de GPC, a parte com relação a sua purificação e isolamento vai ter um grande impacto na qualidade do produto, em particular a sua pureza química pode influenciar o seu perfil de toxicidade e terapêutico. Tal pureza é verificada de maneira tradicional através de “Cromatografia de Camada Fina” (TLC). Este tipo de análise possui bocas características de versatilidade e permite avaliar a amostra como um todo, já que todos os componentes, a partir do mais polar para o menos polar, podem ser observados ao mesmo tempo. Esta técnica analítica, no entanto, não é inteiramente satisfatória com relação à determinação quantitativa de qualquer impureza e a separação das espécies com similares funcionalidades estruturais, tais como, por exemplo, isômeros com polaridade comparável.
[00012] HPLC é a técnica analítica adotada de maneira mais frequente para superar estas desvantagens de TLC; no caso de GPC, o uso de HPLC resulta, no entanto, menos facilmente do que é usual devido às características de alta polaridade do analito, que limitam a interação com as fases estacionárias, e a ausência de cromóforos que tornam possível o uso de um detector de UV, isto é o detector mais prevalente em laboratórios de controle de qualidade. Os métodos publicados não são satisfatórios para a sensibilidade, e para a forma dos sinais cromatográficos tendo picos alargados ou assimétricos; nestas condições existe uma redução da energia de separação, e existe o risco de ter sinais que correspondem com certas espécies que são ocultas sob outros sinais cromatográficos, resultando em perda da capacidade de destaque de qualquer impureza presente. Ver, por exemplo: J. Am. Oil Chem. Soc (2012) 89:1155-1163; Talanta (2012) 94:22-29; Journal of Cromatografia A (2012)1220:108-114, incorporado aqui por referência.
[00013] Esta situação está mal relacionada com diretrizes correntes no campo farmacêutico, que proveem uma descrição detalhada do perfil de impurezas na produção de ingredientes ativos intencionados para o uso humano.
[00014] O desenvolvimento de novas técnicas analíticas para a determinação da qualidade das diferentes preparações de GPC, portanto, é de importância primária e, no evento em que a presença de impurezas nas preparações de GPC foi destacada com tais técnicas analíticas, a definição de novos padrões de pureza para GPC, e novos procedimentos de purificação tais como para permitir a produção de GPC de acordo com os padrões de qualidade correntes.
[00015] A Figura 1 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida pelo procedimento 1
[00016] A Figura 2 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida a partir do exemplo 2
[00017] A Figura 3 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida a partir do exemplo 1 (Comparativo)
[00018] A Figura 4 é um espectro de RMN 31P de GPC obtida pelo procedimento 2
[00019] A Figura 5 é um espectro de RMN 31P de GPC obtida a partir do exemplo 3
[00020] A Figura 6 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida pelo procedimento 1
[00021] A Figura 7 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida a partir do exemplo 3
[00022] A Figura 8 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida pelo procedimento 3
[00023] A Figura 9 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida a partir do exemplo 4
[00024] A Figura 10 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida a partir do exemplo 5 (Comparativo)
[00025] A Figura 11 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida pelo procedimento 4
[00026] A Figura 12 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida a partir do exemplo 6
[00027] A Figura 13 é um Cromatograma de HPLC-ELSD de GPC obtida a partir do exemplo 7 (Comparativo)
[00028] Nós descobrimos de maneira inesperada agora que na análise de HPLC de GPC é possível superar os problemas descritos acima através do emprego de maneira adequada de um tipo de coluna cromatográfica de HPLC de amino, isto é, aqueles em que uma funcionalidade de amino está ligada com a superfície da fase estacionária. Várias colunas deste tipo estão comercialmente disponíveis: por exemplo, Supelcosil™ LC-NH2, Hypersil Gold™ amino, Zorbax® NH2, YMC™ Polyamina II, Nucleosil® NH2, Luna® NH2. A fase estacionária pode consistir em partículas de material de suporte, tais como, por exemplo, sílica, com um revestimento que consiste de um revestimento de polímero contendo grupos amino, preferivelmente grupos amino secundário e terciário. A descrição de uma fase estacionária deste tipo é reportada nas páginas 22 e 23 da publicação “HPLC Columns YMC Classics”, de YMC Europe GmbH, incorporada aqui por referência.
[00029] Ao mesmo tempo, um tipo de Detector de Dispersão de Luz por Evaporação (ELSD) vai precisar ser usado.
[00030] Tais detectores são descritos, por exemplo, em Anal. Chem (1997) 69:561A-563A e US6229605, incorporado aqui em referência. Estas são ferramentas em que o eluato é enviado para uma câmara de evaporação onde o solvente é evaporado para deixar uma névoa de pequenas partículas de amostra que espalham um feixe de luz. A resposta de detector é proporcional com a difusão que é dependente da quantidade de amostra presente; este sistema torna possível a detecção de espécies desprovidas de cromóforos, tais como GPC, ainda enquanto usa métodos de eluição não isocráticos.
[00031] Com esta combinação de fase estacionária e de detector, vários eluentes podem ser usados e, em particular, sistemas que de maneira adequada consistem em sistemas de tampão aquoso, tais como, por exemplo, tampão de acetato de amônio, possivelmente em combinação com solventes orgânicos tais como, por exemplo, metanol e/ou acetonitrila. Tais sistemas de eluente podem ser usados no modo isocrático, isto é, mantendo o mesmo eluente por toda a duração da corrida cromatográfica, ou no modo de gradiente, em que a composição do eluente varia durante a cromatografia de acordo com um programa predeterminado. A otimização do método de análise será realizada seguindo os ensinamentos da técnica.
[00032] Um objetivo da presente invenção é, portanto, um método para determinar a pureza de L-α- glicerofosforilcolina compreendendo a eluição de L-α- glicerofosforilcolina através de uma coluna de HPLC tendo uma fase estacionária amino, e subsequente detecção de L-α- glicerofosforilcolina em si, e qualquer impureza da mesma, por meio de um tipo de Detector de Dispersão de Luz por Evaporação.
[00033] A fase de eluente ou as fases de eluente podem consistir em uma solução aquosa, a solvente orgânico polar, ou uma mistura dos mesmos; a solução aquosa preferivelmente possui um pH que varia entre 3 e 6, ainda mais preferivelmente entre 4 e 5. O solvente orgânico polar pode ser um álcool C1-C4, acetonitrila, ou uma mistura dos mesmos; o álcool C1-C4 é preferivelmente metanol.
[00034] Esta combinação permite superar o defeito do alargamento do pico cromatográfico que corresponde com GPC, e ao mesmo tempo permite realizar a determinação da concentração de GPC com alta sensibilidade.
[00035] Ao mesmo tempo, foi descoberto que é possível detectar a presença em preparações de GPC de outras espécies que derivam do processo de preparação de GPC partindo de lecitina de soja.
[00036] Dentre estas espécies, estão incluídos L-α- glicerofosfoetanolamina (GPE), açúcares, e análogos dos mesmos, derivando a partir da sua presença, ou a presença de um dos seus precursores, na lecitina de soja usada como matéria-prima no processo de produção de GPC.
[00037] Tendo obtido este resultado importante, foi de interesse imediato verificar de um modo mais sensível e seletivo do que no passado, o perfil de impurezas, se estiver presente, em amostras de GPC obtidas pelos métodos de produção ainda mais adequado para o produto farmacêutico para o uso humano.
[00038] Para este propósito, processos semi- sintéticos com base em desacilação de lecitina de soja foram principalmente considerados, sendo o procedimento completamente sintético julgado para ser não adequado para a produção de GPC para o uso humano, em vista da contaminação potencial com matérias-prima altamente tóxicas, tais como glicidol ou cloropropanodiol, que são usados nestes procedimentos. Enquanto leva em consideração as ditas contraindicações relacionadas com a produção de GPC por uma rota completamente sintética, uma amostra de GPC de origem chinesa, produzido sob esta abordagem, foi submetido para o novo procedimento analítico, para uma avaliação completa.
[00039] As amostras derivando a partir de procedimentos semi-sintéticos foram geradas seguindo os procedimentos reportados no WO9013552 (especificamente o Exemplo 2) e EP575717 (especificamente o Exemplo 1). Nestes documentos, procedimentos com base na purificação de GPC com resinas de troca iônica são reportadas, e eles não envolvem a precipitação de GPC como aduto com cloreto de cádmio (GPC^CdCl2) e cromatografia de sílica; estes são, portanto, métodos que, evitando o uso de sais de cádmio tóxicos e procedimento caracterizado por baixa produtividade, são realmente aplicáveis à produção em grande escala de GPC.
[00040] Os resultados de análise mostrados, em todas as amostras, a presença de uma eluição de pico antes e com um tempo de retenção muito próximo daquele de GPC, tendo um RRT (Tempo de Retenção Relativo) igual a cerca de 0,94. Este sinal, de intensidade significativa, não corresponde com espécies que pode ser razoável para esperar em vista do processo de preparo, tal como glicerol, GPE, ácido glicerofosforico, ou sacarose.
[00041] Dado que o comportamento cromatográfico das novas espécies detectadas foi tão similar com aquele de GPC, como para não ter sido destacado até agora, e que mesmo com o novo método de HPLC que é objetivo da presente invenção difere muito pouco daquele de GPC, então nós temos a hipótese de que corresponde com um isômero de posição do mesmo.
[00042] A estrutura química do isômero beta de GPC (β-GPC) é reportada abaixo.
[00043] β-GPC não está comercialmente disponível e, de maneira a verificar se β-GPC pode ser as espécies de acordo com o esquema ilustrado abaixo.
[00044] β-GPC obtida assim foi analisada por NMR, para confirmar a estrutura, e por HPLC mostrando que não apenas a sua pureza foi alta, mas também que o seu tempo de retenção foi compatível com aquele das espécies conhecidas reveladas analisando as diferentes amostras de GPC. Portanto, foi possível atribuir para o sinal desconhecido uma correspondência com a estrutura de β-GPC, e esta atribuição foi confirmada por experimentos “de pico” de HPLC, em que para uma amostra de GPC mostrando a presença de espécies com a RRT em cerca de 0,94 em HPLC, quantidades calibradas de β-GPC foram adicionadas, observando o correspondente aumento do sinal com RRT em cerca de 0,94 sem uma divisão do mesmo.
[00045] Como confirmação adicional da atribuição de estrutura, experimentos de RMN de 31P foram realizados que permitem a identificação de um sinal em cerca -0,6 ppm nas amostras em que a presença de espécies com RRT em cerca 0,94 foi maior. O sinal de β-GPC sintetizada seguindo o esquema reportado acima foi revelado no mesmo valor de campo.
[00046] O método de RMN de 31P portanto é uma alternativa possível para o procedimento de HPLC, no entanto, devido a sua sensibilidade inferior e a maior disponibilidade de instrumentação de HPLC nos laboratórios de controle de qualidade, o método de HPLC objetivo da presente invenção permanece preferível para a determinação das espécies tendo RRT de cerca de 0,94 (β-GPC).
[00047] Por meio de análise de RMN de 31P também foi possível identificar no espectro do produto obtido de acordo com EP575717 um sinal adicional em cerca 18,4 ppm. Estes valores são compatíveis com aqueles de cGP de fosfato cíclico, ilustrados abaixo na forma do sal de sódio.
cGP (sal de sódio)
[00048] A formação deste fosfato cíclico é concebível nas condições de isolamento de GPC de acordo com o procedimento de EP575717. Para suportar esta hipótese, uma amostra autentica de cGP foi preparada de acordo com o esquema ilustrado abaixo.
[00049] Análise de RMN de 31P deste produto confirma a designação, mostrando o mesmo sinal em cerca 18,4 ppm e a ausência de divisão do sinal em experimentos de pico apropriados.
[00050] Na luz do que foi descoberto com os métodos analíticos inovadores que representam uma modalidade da invenção, nós experimentamos de maneira experimental se os métodos de purificação de GPC conhecidos podem remover de maneira adequada as impurezas destacadas.
[00051] Excluindo, para as razões já expressas, a purificação por complexação com cloreto de cádmio e cromatografia em sílica, nós identificamos a cristalização de etanol como o melhor procedimento, em termos de capacidade de aplicação industrial, dentre aqueles reportados na técnica anterior (ver, por exemplo, WO9013552).
[00052] A amostra obtida de acordo com o procedimento de WO9013552 foi cristalizada a partir de etanol, mas a análise de HPLC mostrou que a purificação foi apenas parcial, sendo uma quantidade significativa de isômero beta (0,48%) ainda presente no produto.
[00053] A seguinte Tabela 1 sumariza os resultados analíticos das amostras de GPC obtidas seguindo os diferentes procedimentos de preparo.
[00054] Um novo sistema para a purificação de GPC agora foi identificado, e esta descoberta também representa uma modalidade da invenção.
[00055] A nova purificação está baseada no uso de dimetil sulfóxido (DMSO). Para a realização da invenção, este solvente pode ser usado em diferentes condições e em diferentes razões quantitativas com relação à GPC a ser purificada.
[00056] Na modalidade da invenção, em adição a DMSO, outros solventes podem estar presentes, tais como solventes polares, de polaridade média ou não polares. Estes solventes adicionais podem pertencer às diferentes classes de solventes tais como, mas não limitado a solventes halogenados, álcoois, éteres, ésteres e amidas.
[00057] Exemplos de solventes que podem ser empregados para a realização da invenção são, mas não estão limitados a água, metanol, etanol, isopropanol, n-butanol, cloreto de metileno, tetraidrofurano, acetato de etila, e DMF.
[00058] De acordo com um aspecto da invenção, DMSO é usado em uma quantidade que varia entre 2 e 100 partes por volume por uma parte em peso de L-α-glicerofosforilcolina, preferivelmente entre 3 e 70, mais preferivelmente razões que variam entre 4 e 30, mais preferivelmente razões que variam entre 5 e 15 partes em volume.
[00059] De acordo com um aspecto adicional da invenção, qualquer solvente ou quaisquer solventes adicionais são usados em uma quantidade que varia entre 0,01 e 10 volumes por volume de DMSO, preferivelmente de 0,05 a 5, mais preferivelmente razões que variam entre 0,1 e 1.
[00060] Dependendo dos parâmetros de processo, uma cristalização apropriada de GPC pode ser obtida, ou a purificação de cristais de GPC contendo impurezas também pode ser realizada suspendendo os mesmos em DMSO, usando combinações adequadas de tempo e temperatura, e então separando os cristais a partir da fase líquida; também neste caso outros solventes podem estar presentes em combinação com DMSO.
[00061] A purificação pode ser realizada em diferentes temperaturas; como usual, pode ser conveniente adotar diferentes temperaturas nos diferentes estágios do processo de purificação, tendo uma menor temperatura na fase de isolamento final de GPC.
[00062] Temperaturas adequadas para a condução da purificação podem estar entre 100 °C e 0 °C, preferivelmente entre 70 °C e 5 °C, mais preferivelmente entre 50 °C e 15 °C.
[00063] Na escolha da temperatura, pode ser preferível levar em conta a temperatura de congelamento de DMSO, que pode variar principalmente dependendo da presença de solventes adicionais, e a concentração de GPC e outras espécies presentes.
[00064] Para o isolamento de GPC, equipamento conhecido do perito na técnica pode ser usado, tal como centrífugas ou sistemas de filtração, aberto ou fechado. Os cristais podem ser sujeitados diretamente a um procedimento de lavagem que usa o mesmo solvente, ou a mesma mistura de solventes, usada para a purificação; alternativamente, para lavar o produto, solventes ou misturas de solvente diferentes do que aqueles usados na etapa de cristalização ou suspensão podem ser usados.
[00065] A razão de DMSO a ser usado comparado com a quantidade de GPC usado no processo de purificação objetivo da invenção pode variar de maneira considerável, e convenientemente pode ser escolhido de acordo com os ensinamentos da técnica. Na prática, de maneira a não reduzir mais do que o necessário a produtividade do processo, será conveniente o uso em quantidades muito altas de DMSO e, por outro lado, estas quantidades não devem ser excessivamente reduzidas para evitar criar dificuldades nas operações de separação do produto cristalizado. Razões de DMSO e GPC que variam entre 2 e 100 partes em volume (litros) por partes em peso (kg) podem ser consideradas convenientes para esta modalidade, mais preferivelmente razões que variam entre 3 e 70, mais preferivelmente razões que variam entre 4 e 30, mais preferivelmente razões que variam entre 5 e 15 partes em volume por parte em peso de GPC.
[00066] Um modo particularmente vantajoso de realizar esta invenção é a cristalização de GPC a partir das suas soluções em água, ou outros solventes, ou misturas de solvente. Adicionando DMSO para tais soluções, foi descoberto que soluções que são estáveis com um tempo suficiente para conduzir as operações de destilação sem precipitação concorrente de GPC são obtidas. Explorando a maior temperatura de ebulição de DMSO com relação aos outros solventes comumente usados, portanto é possível modificar, sem obstáculos causados pela precipitação simultânea do produto, a composição da mistura de solventes usada para realizar a cristalização.
[00067] Uma vez que a composição de mistura de solventes foi alcançada, é possível induzir a cristalização de GPC pela adição de uma alíquota de GPC cristalizada, que vai atuar como um gatilho. Esta opção não parece ser necessária; quando a sua aplicação é desejada, uma amostra de cristais de GPC pode ser usada como um gatilho que não necessariamente deve ter um grau de pureza particularmente alto, já que uma dependência próxima entre a qualidade do gatilho usado e aquela dos cristais de GPC isolados no fim da purificação não foi observada.
[00068] Foi surpreendente observar como estes procedimentos de purificação usando DMSO permitem obter GPC de alta pureza, mesmo a partir de preparações contendo quantidades significativas de outras espécies moleculares, incluindo aquelas descritas anteriormente.
[00069] Em particular, a capacidade do sistema de purificação objetivo da presente invenção de remover o isômero beta GPC parece significativa e imprevisível, já que possui características químico-físicas muito similares com aquelas do produto em que o isolamento com um alto grau de pureza é desejado.
[00070] Diferentemente da cristalização do etanol, também foi descoberto que o método de purificação objetivo da invenção permite purificar GPC a partir de algumas das espécies mais frequentemente encontradas em preparações de GPC obtidas a partir de lecitinas.
[00071] Em particular, foi descoberto nas modalidades da invenção que é possível remover de maneira eficaz as impurezas GPC tais como sacarose e GPE.
[00072] A Tabela 2 abaixo sumariza os resultados principais alcançados nestes experimentos em comparação com aqueles com relação aos experimentos comparativos realizados usando etanol como o solvente de cristalização.
Baixo rendimento * Medição de RMN de 31P
[00073] Os resultados mostrados na Tabela 2 destacam a utilidade das modalidades da invenção na purificação de GPC. Neste sentido, vale a pena destacar o fato em que, como no Exemplo 6, a realização da invenção demonstra a possibilidade de cristalizar GPC também na presença de açúcares, neste caso a sacarose, e a alta eficiência de purificação que pode ser alcançada mesmo em tais casos. Reciprocamente, a cristalização de GPC a partir de etanol não permite a remoção satisfatória de sacarose. Além disso, GPC, e açucares em medidas ainda maiores tais como, se comportam como inibidores de cristalização quando etanol é usado como o solvente de cristalização; consequentemente, nestes casos os rendimentos de cristalização são tão baixos quanto para tornar o procedimento não prático nos processos para a produção industrial de GPC.
[00074] Uma modalidade adicional da invenção consiste em GPC em que pureza é maior do que 99,5%, preferivelmente maior do que 99,7%, ainda mais preferivelmente com uma pureza maior do que ou igual a 99,9%.
[00075] Uma funcionalidade específica é representada por GPC contaminada por menos do que 0,1% pelo seu isômero β-GPC, e a GPC contaminada por menos do que 0,1% pelas espécies cíclicas cGP.
[00076] Para os propósitos da presente invenção, as purezas indicadas acima são medidas como as áreas de porcentagem com métodos de HPLC e/ou RMN de 31P e, preferivelmente, com métodos de HPLC e/ou RMN de 31P descritos e exemplificados nos Exemplos 8 e 9, respectivamente.
[00077] Os seguintes exemplos estão intencionados a ilustrar alguns dos métodos da invenção sem limitar a mesma de qualquer maneira.
[00078] A 125 g de lecitina de soja, 500 mL de metanol são adicionados e mantidos sob agitação até a dissolução completa. 20 mL de metilato de sódio 30% em metanol são adicionados. A agitação é continuada em temperatura ambiente por 3 horas. Após a filtração, o resíduo é lavado com metanol (3 x 10 mL). O filtrado é neutralizado (pH de cerca de 6) com ácido acético glacial, então é concentrado até um volume residual de cerca de 125 mL, a fase oleosa superior é separada. A fase inferior enriquecida é eluída em uma coluna contendo 140 mL de resina Amberlyst 15 (na forma ácida) deixada em metanol. A eluição é progredida com 375 mL de metanol, seguida por 300 mL de água. O eluato aquoso é eluído em uma sequência de três colunas cromatográficas preparadas assim: a primeira com 30 mL de resina IR 93 na forma de OH- deixada em água, a segunda com 30 mL de resina IR 401 na forma de OH- deixada em água, a terceira com 12 mL de resina IRC 50 na forma ácida deixada em água.
[00079] O eluato final é concentrado para um fluido viscoso residual com um conteúdo de água igual a 15%.
[00080] A análise de HPLC-ELSD mostra um conteúdo de β-GPC igual a 0,8% (porcentagem em área).
[00081] 200 g de fração enriquecida em fosfatidilcolina obtida comercialmente pela extração de lecitina de soja são dissolvidos em 600 mL de metanol. A solução obtida é eluída em uma coluna cromatográfica contendo resina Duolite A 147 na forma básica, deixada em metanol. Após o carregamento da solução enriquecida, a eluição de GPC é completada com metanol. O eluato é neutralizado com ácido acético, e concentrado até um volume residual de 300 mL obtendo uma estratificação aguda de duas fases. A fase inferior enriquecida é separada, diluída com metanol, e extraído duas vezes com 200 mL de n-heptano.
[00082] 800 mL de n-butanol são adicionados para a fase inferior enriquecida, e a solução é concentrada para um volume residual de cerca de 300 mL, refrigerada até T~5 °C, e filtrada. Os cristais de GPC são dissolvidos em 30 mL de demi água, e a solução é concentrada até um líquido viscoso com um conteúdo residual de água igual a 15%.
[00083] A análise HPLC-ELSD mostra conteúdo de um β- GPC igual a 0,1% (área percentual).
[00084] A análise de RMN de 31P mostra um conteúdo de cGP igual a 0,2% (porcentagem de área).
[00085] GPE em cristais é adicionada a uma solução de GPC em água, a solução é concentrada até um líquido viscoso com um conteúdo residual de água igual a 15%.
[00086] A análise de HPLC-ELSD mostra um conteúdo de GPE igual a 0,2% (como porcentagem de área).
[00087] Sacarose nos cristais é adicionada a uma solução de GPC em água, a solução é concentrada até um líquido viscoso com um conteúdo residual de água igual a 15%.
[00088] A análise de HPLC-ELSD mostra um conteúdo de sacarose igual a 2% (como porcentagem de área).
[00089] 2,5 g de GPC na forma de um fluido viscoso (obtido pelo procedimento 1) são dissolvidos em 5 mL de etanol sob agitação a T~50 °C. A solução é resfriada até T~10 °C e disparada com alguns cristais de GPC, em alguns minutos a formação de um precipitado é observada. É resfriada até T~5 °C e deixada sob agitação entre 0 °C e 5 °C por 1,5 horas, os cristais são filtrados através de um funil de Büchner, lavagem com etanol. Após a secagem sob vácuo, 1,4 g de GPC é obtido.
[00090] A análise HPLC-ELSD mostra um conteúdo de β- GPC igual a 0,48% (como porcentagem de área).
[00091] A 2,5 g de GPC na forma de um fluido viscoso (obtido pelo procedimento 1), 14 mL de DMSO são adicionados, a mistura é aquecida até T~50 °C sob agitação, é resfriada até T~25 °Ce disparada com alguns cristais de GPC. É mantida sob agitação entre 20 °C e 25 °C por 16 horas; durante este tempo a formação de um precipitado é observada, os cristais são filtrados através de um funil de Büchner, lavagem com etanol. Após a secagem sob vácuo, 1,9 g de GPC são obtidos.
[00092] A análise de HPLC-ELSD mostra um conteúdo de β-GPC igual a 0,16% (porcentagem de área).
[00093] A 11,2 g de GPC na forma de um fluido viscoso (obtido pelo procedimento 2), 60 mL de DMSO são adicionados, a mistura é aquecida até T~50 °C sob agitação, é resfriada até T~25 °C e disparada com alguns cristais de GPC. É mantida sob agitação entre 20 °C e 25 °C para 16 horas; durante este tempo a formação de um precipitado é observada, os cristais são filtrados através de um funil de Büchner, lavagem com etanol. Após a secagem sob vácuo, 8,2 g de GPC são obtidos.
[00094] A análise de HPLC-ELSD mostra a ausência de β-GPC
[00095] A análise de RMN de 31P mostra a ausência de cGP
[00096] A 10,7 g de GPC na forma de um fluido viscoso (obtido pelo procedimento 3) 20 mL de DMSO são adicionados, a mistura é aquecida até T~70 °C sob agitação, 80 mL de DMSO são adicionados, é resfriada até T~25 °C e disparada com alguns cristais de GPC. É mantida sob agitação entre 20 °C e 25 °C para 16 horas; durante este tempo a formação de um precipitado é observada, os cristais são filtrados através de um funil de Büchner, lavagem com etanol. Após a secagem sob vácuo, 8.7 g de GPC são obtidos.
[00097] A análise de HPLC-ELSD mostra a ausência de GPE
[00098] 11,2 g de GPC na forma de um fluido viscoso (obtido pelo procedimento 3) são dissolvidos em 20 mL de etanol sob agitação a T~45 °C. A solução é resfriada até T~5 °Ce disparada com alguns cristais de GPC. É mantida sob agitação entre 0 °C e 5 °C por 3 horas; durante este tempo a formação de um precipitado é observada, os cristais são filtrados através de um funil de Büchner, lavagem com etanol. Após a secagem sob vácuo, 3,4 g de GPC são obtidos.
[00099] A análise de HPLC-ELSD mostra um conteúdo de GPE igual a 0,02% (como porcentagem de área).
[000100] A 11 g de GPC na forma de um fluido viscoso (obtido pelo procedimento 4) 20 mL de DMSO são adicionados, a mistura é aquecida até T~70 °C sob agitação, 80 mL de DMSO são adicionados, é resfriada até T~25 °C; durante este tempo a formação de um precipitado é observada. É mantida sob agitação entre 20 °C e 25 °C para 16 horas, os cristais são filtrados através de um funil de Büchner, lavagem com etanol. Após a secagem sob vácuo, 7,8 g de GPC são obtidos.
[000101] A análise de HPLC-ELSD mostra a ausência de sacarose
[000102] 11,0 g de GPC na forma de um fluido viscoso (obtido pelo procedimento 4) são dissolvidos em 20 mL de etanol sob agitação a T~45 °C. A solução é resfriada até T~5 °C e disparada com alguns cristais de GPC. Ela é resfriada até T~5 °C e mantida sob agitação entre 0 °C e 5 °C para 2,5 horas; durante este tempo a formação de um precipitado é observada. Os cristais são filtrados através de um funil de Büchner, lavagem com etanol. Após a secagem sob vácuo, 1,1 g de GPC são obtidos.
[000103] A análise de HPLC-ELSD mostra um conteúdo de sacarose igual a 0,14% (como porcentagem de área).
[000104] Parâmetros de operação: Coluna de HPLC: YMC™ Poliamina II 250 x 4, 6 mm (5 μm) Temperatura do forno: 35 °C Fluxo: 0,7 mL/min Fases de eluente: Fase A: 85% (acetonitrila 75%, metanol 25%) 15% (tampão de acetato de amônio 50mM pH 4,5) Fase B: 65% (acetonitrila 75%, metanol 25%) 35% (tampão de acetato de amônio 50mM pH 4.5)
[000105] Programa de gradiente:
Detector ELSD
[000106] Parâmetros de Detector: fluxo de nitrogênio = 1,4 mL/min; Temperatura = 90 °C; Ganho = 1
[000107] Preparo das amostras: diluição de amostras de GPC até cerca de 20 mg/ mL em metanol.
[000108] Volume de injeção: 20 a 40 μL
[000109] NOTA: As flutuações de linha base que são observadas até RT~5 minutos estão presentes no modelo (não devido às substâncias presentes na amostra).
[000110] Na seguinte tabela os valores de referência para a eluição das espécies de interesse são mostradas.
[000111] O limite de detecção (LOD) das impurezas analisadas usando este método é menor do que 0,01% com relação à GPC. Exemplo 9 Método de análise de GPC por RMN de 31P
[000112] Instrumento RMN Varian VXR-200 ou instrumentos pelo menos equivalentes
[000113] Preparação de amostra 0,8 g de GPC a ser analisada são dissolvidos em 0,8 mL de D2O e a solução é carregada para o tubo de RMN Temperatura temperatura ambiente Número de aquisições não menos do que 400
[000114] Na seguinte tabela os valores de referência para o deslocamento químico das espécies de interesse são mostrados.
[000115] O limite de detecção (LOD) das impurezas analisadas usando este método é menor do que 0,01% com relação à GPC.
Claims (15)
1. Processo para a purificação de L-α- glicerofosforilcolina caracterizado pelo fato de que L-α- glicerofosforilcolina é cristalizada a partir de DMSO ou de uma mistura de DMSO com pelo menos outro solvente e em que DMSO é usado em uma quantidade compreendida entre 2 e 100 partes em volume por parte em peso de L-α- glicerofosforilcolina.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos outro solvente é selecionado a partir de água, álcool, solventes halogenados, éteres, ésteres e/ou amidas.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito álcool é metanol, etanol, isopropanol e/ou n-butanol; o dito solvente halogenado é cloreto de metileno; o dito éter é tetraidrofurano; o dito éster é acetato de etila; a dita amida é DMF.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que DMSO é usado em uma quantidade compreendida entre 5 e 15 partes em volume por parte em peso de L-α-glicerofosforilcolina.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos outro solvente é usado em quantidades compreendidas entre 0,01 e 10 volumes por volume de DMSO, preferivelmente entre 0,1 e 1.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita cristalização é realizada em uma temperatura que varia entre 0 °C e 100 °C, preferivelmente entre 15 °C e 50 °C.
7. L-α-glicerofosforilcolina purificada pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que possui uma pureza maior do que ou igual a 99,9%.
8. L-α-glicerofosforilcolina purificada pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que possui um teor do seu isômero β e/ou de cGP menor do que 0,1%.
9. Método para determinar a pureza da L-α- glicerofosforilcolina como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende a eluição de L-α-glicerofosforilcolina através de uma coluna de HPLC tendo uma fase estacionária amino, e subsequente detecção de L-α-glicerofosforilcolina em si, e qualquer impureza possível da mesma, por meio de um tipo de um Detector de Dispersão de Luz por Evaporação.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária possui grupos amino secundário e terciário.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita fase estacionária consiste em partículas de material de suporte, preferivelmente sílica, com um revestimento de polímero contendo grupos amino, preferivelmente secundário e terciário.
12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as fases de eluente consistem em uma solução aquosa, um solvente orgânico polar, ou uma mistura dos mesmos.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a dita solução aquosa possui um pH que varia entre 3 e 6, preferivelmente entre 4 e 5.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico polar é um álcool C1-C4, acetonitrila, ou uma mistura dos mesmos.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito álcool C1-C4 é metanol.
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