JP6745223B2

JP6745223B2 - ワクチン組成物

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Publication number: JP6745223B2
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Authority: JP
Inventors: ドリュー，ジェフリー
Original assignee: スタビリテックリミテッド
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2015-04-08
Publication date: 2020-08-26
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Description

本発明は、インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させるための特定のジアルキルグリシン及びトリアルキルグリシン賦形剤の使用、並びにインフルエンザ抗原の免疫原性を増加させるための方法、本方法を使用して得られるワクチン組成物、並びに患者のワクチン接種におけるワクチン組成物の使用に関する。

インフルエンザウイルスは、オルソミクソウイルスファミリーのメンバーである。ヒトに感染するA、B、及びCと呼ばれる3つのサブタイプのインフルエンザウイルスがある。

インフルエンザの季節性の流行は、迅速に世界中に広がる可能性があり、病院や他のヘルスケアにかかる費用及び生産性の損失の観点から著しい経済的負担を負わせる。世界保健機関は、毎年のインフルエンザ流行で、世界中で毎年300万から500万の重病例及び約250,000〜500,000の間の死亡例が生じていると推定している。

高病原性及び抗原新規性を有する集団内で新しいインフルエンザ株が発生すると、インフルエンザパンデミックが起こる。世界規模のパンデミックは、単年で、世界人口の20%〜40%を苦しめる可能性がある。1918〜1919年のパンデミックにより、例えば、世界的に2億人が影響を受け、3000万を超える人が死亡した。その時以来、ワクチン及び抗ウイルス療法が開発され、ヘルスケアが劇的に改善されてきたが、今日のパンデミックにより、世界的に200万から700万人が死に至ると推定されている。

インフルエンザパンデミックが起きた場合、起こる可能性のある1つの問題は、必要とされるタイムスケールでワクチンの使用に必要とされる十分な量のインフルエンザ抗原を製造することが困難な可能性があるということである。起こり得るもう1つの問題は、インフルエンザワクチンは、免疫を付与するのに数週間かかる可能性があることである。これは、高感染性株の拡散を防止するか、又は低減させるのに十分に迅速ではない可能性がある。

それゆえに、より少量で使用でき、及び/又は既存の抗原よりも迅速に免疫を付与できる、免疫原性が増加したインフルエンザ抗原が求められている。

WO2011/121301、WO2011/121306、及びWO2013/050780は、ウイルス粒子及び/又はポリペプチドを安定化させるためのジメチルグリシン(DMG)などのジアルキルグリシン及びトリアルキルグリシンを含む特定の賦形剤の使用に関する。WO2011/121305は、凍結又は乾燥中にアルミニウム塩アジュバントを安定化させるための類似の賦形剤の使用に関する。これらの参考文献は、インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させることに関するものではない。

ReapらによるJournal of Laboratory and Clinical Medicine (1990), 115(4), 481-6は、ウサギモデルにおけるジメチルグリシン(DMG)の免疫調節機能について記載している。インフルエンザ抗原の接種の前後に、ウサギにDMGを強制給餌した。Reapらは、ウサギへの投与前におけるDMGの存在下でのインフルエンザ抗原の凍結、凍結乾燥、又は加熱を記載していない。

本発明の驚くべき発見は、ジメチルグリシン(DMG)などのジアルキルグリシン及びトリアルキルグリシンの存在下で、インフルエンザ抗原を凍結すること、凍結乾燥すること、又は加熱することにより、インフルエンザ抗原の免疫原性を増加できることである。得られた変性インフルエンザ抗原は、未変性インフルエンザ抗原と比較して免疫原性が増加している。得られた変性インフルエンザ抗原はまた、ジアルキルグリシン/トリアルキルグリシンと混合されているが、凍結、凍結乾燥、又は加熱を受けていないインフルエンザ抗原と比較して、免疫原性が増加している。

変性インフルエンザ抗原の免疫原性の増加に関連する2つの重要な利点がある。

まず、変性インフルエンザ抗原は、未変性インフルエンザ抗原よりもはるかに少ない用量を使用して、患者において同等の免疫応答を引き起こすことができる。この「抗原節約」特性は、特に数百万の患者がワクチン接種を必要とするパンデミックの状況において非常に有利である。

次に、変性インフルエンザ抗原は、未変性インフルエンザ抗原よりも迅速に患者に免疫を付与できる。免疫のより迅速な発生も、特にパンデミックの拡散の阻止を試みることが重要なパンデミックの状況において非常に有利である。

したがって、本発明は、インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させるための、式(I):

(式中、
R₁は、水素又はC_1〜6アルキルを表し、
R₂は、C_1〜6アルキルを表し、
R₃は、C_1〜6アルキルを表す)
の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである賦形剤の使用であって、インフルエンザ抗原及び賦形剤を含む水性組成物を(a)凍結すること、(b)熱処理すること、及び/又は(c)凍結乾燥することを含む、使用を提供する。

本発明は、インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させる方法であって、インフルエンザ抗原、及び式(I):

(式中、
R₁は、水素又はC_1〜6アルキルを表し、
R₂は、C_1〜6アルキルを表し、
R₃は、C_1〜6アルキルを表す)
の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである賦形剤を含む水性組成物を(a)凍結すること、(b)熱処理すること、及び/又は(c)凍結乾燥することを含む、方法をさらに提供する。

本発明は、前記方法により得られるワクチン組成物をさらに提供する。

本発明は、ヒト又は動物の患者においてインフルエンザ感染を予防するために使用される前記ワクチン組成物をさらに提供する。

本発明は、ヒト又は動物の患者のインフルエンザ感染を予防するための薬品の製造における前記ワクチン組成物の使用をさらに提供する。

本発明は、ヒト又は動物の患者のインフルエンザ感染を予防する方法であって、前記ワクチン組成物を患者に投与することを含む、方法をさらに提供する。

実施例2における、1日目及び24日目に組成物A〜Fを投与されたマウスに対し種々の時点で測定された赤血球凝集抑制試験(HIA:Haemagglutination Inhibition Assay)力価を示す。組成物A〜Cは、賦形剤で処理されていなかった。組成物Aは、通常の用量の抗原を含有し、一方、組成物B及びCは、100分の1の用量の抗原を含有した。組成物D〜Fは、100分の1の用量の抗原を含有したが、賦形剤と混合され、次に熱処理された。組成物D〜Fに対するHIA力価は、対照組成物B及びCで観察されたものよりも著しく高かった。実施例3における、1日目及び24日目に組成物G〜Nを投与されたマウスに対し種々の時点で測定された赤血球凝集抑制試験(HIA)力価を示す。HIA力価が50を超えれば、マウスは免疫を獲得しているとみなされた。免疫は、賦形剤、アジュバント、及び熱処理の組合せ(組成物N)で、最も迅速に獲得された。実施例4における、1日目及び24日目に組成物O〜Rを投与されたマウスに対し種々の時点で測定された赤血球凝集抑制試験(HIA)力価を示す。これらの結果は、実施例1及び2並びに実施例3の組成物Qのポリエチレンイミンで観察されたインフルエンザ抗原の効果は、実施例3の組成物Rのジメチルグリシンでも観察されることを実証する。

要旨
本発明は、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである賦形剤、例えばジメチルグリシンを使用して、インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させることに関する。

典型的には、インフルエンザ抗原を賦形剤と混合して水性組成物を得て、次に水性組成物を、インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させる凍結、加熱、及び/又は凍結乾燥などの処理に供する。インフルエンザ抗原を、賦形剤の存在下で凍結すること、加熱すること、及び/又は凍結乾燥することは、凍結、加熱、及び/又は凍結乾燥なしにインフルエンザ抗原が賦形剤と単に混合される場合に観察されるものと比較して、抗原の免疫原性を増加させる。

インフルエンザ抗原及び賦形剤は、処理中に相互作用することにより、処理前のインフルエンザ抗原の免疫原性と比較して、インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させる。それゆえに、抗原の免疫原性は、典型的には処理工程中に増加する。

処理は、典型的に凍結若しくは加熱又は凍結乾燥であり、好ましくは凍結又は加熱、より好ましくは凍結である。あるいは、凍結に続いて加熱、又は凍結乾燥に続いて加熱などの、処理の組合せが使用されてもよい。後者の場合、凍結乾燥組成物は、典型的には加熱前に再構成されることになる。

得られた組成物は、凍結、凍結乾燥、又は加熱の後にそれぞれ、解凍させる、再構成する、又は冷却することができ、患者にワクチン組成物として投与できる。

水性組成物
水性組成物は、賦形剤及びインフルエンザ抗原を含む。水性組成物は、典型的には懸濁液又は溶液である。水性組成物は水性溶媒中で、賦形剤をインフルエンザ抗原と混合することにより調製される。任意の好適な水性溶媒系が使用されてもよい。水性溶媒は、緩衝水であってもよい。水性溶媒は、典型的にはHEPES緩衝水、トリス緩衝水、リン酸緩衝水、又は純水である。

任意選択で、賦形剤及びインフルエンザ抗原との混合前に、1種以上の糖が水性溶媒と混合される。あるいは、賦形剤及びインフルエンザ抗原の後に、1種以上の糖が水性溶媒と混合されてもよい。

任意選択で、賦形剤及びインフルエンザ抗原との混合前に、アジュバントが水性溶媒と混合される。あるいは、賦形剤及びインフルエンザ抗原の後に、アジュバントが水性溶媒と混合されてもよい。

一般に、1種以上の糖は特に処理工程中にアジュバントを安定化させるから、アジュバントが存在する場合、典型的には1種以上の糖も存在することになる。

他の構成成分も、水性組成物中に存在してもよい。例えば、式(II):

(式中、Xは、-S(O)₂-を表し、R_a及びR_bは独立して、C_1〜6アルキルを表す)
の化合物も存在してもよい。好ましい式(II)の化合物は、メチルスルホニルメタン(MSM)であり、R_a及びR_bの両方とも、メチルを表す。賦形剤及び式(II)の化合物の組合せは、供に相互作用することがあり、それにより、処理工程中に、インフルエンザ抗原の免疫原性をさらに増加させる。

水性組成物中の賦形剤の濃度は、典型的には0.001M以上の範囲、好ましくは0.01M以上の範囲、より好ましくは0.1M以上、例えば、0.1M〜5.0M又は約0.5Mである。

1種以上の糖が使用される場合、水性組成物中の糖の濃度又は糖の合計濃度は、典型的には1M以下、好ましくは0.7M以下、例えば、0.5M以下又は0.3M以下である。糖の濃度又は合計濃度は、0.1mMまで又は0.5mMまで下げてもよい。

用いられる各構成成分の特定濃度は、インフルエンザ抗原の性質;使用される賦形剤;1種以上の糖が使用されているかどうか、そうである場合、糖の種類;アジュバントが存在するか否か；及び採用される特定の凍結、凍結乾燥、又は熱処理手順；を含むいくつかの要因に依存することになる。

インフルエンザ抗原
本発明での使用に適するインフルエンザ抗原は、インフルエンザ(A型、B型、又はC型)ワクチンの任意の免疫原性構成成分を含む。

インフルエンザ抗原は、不活化インフルエンザウイルスの全体、又は弱毒化生インフルエンザウイルスであってもよい。インフルエンザ抗原は、インフルエンザ(A型、B型、又はC型)の表面タンパク質であってもよい。特に、インフルエンザ抗原は、赤血球凝集素(HA)、ノイラミニダーゼ(NA)、核タンパク質、M1、M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2、及び/若しくはPB2タンパク質、又はこれらのタンパク質のいずれかの免疫原性誘導体若しくはフラグメントであってもよい。インフルエンザ抗原は、HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15及び/又はHA16、それらの任意の免疫原性フラグメント若しくは誘導体、並びにHAタンパク質、フラグメント、又は誘導体の任意の組合せであってもよい。ノイラミニダーゼは、ノイラミニダーゼ1(N1)又はノイラミニダーゼ2(N2)であってもよい。

賦形剤
賦形剤は、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである。

生理学的に許容される塩は、典型的には生理学的に許容される酸との塩であり、したがって、塩酸若しくは硫酸などの無機酸、又はクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、マンデル酸、フマル酸、若しくはメタンスルホン酸などの有機酸と形成された塩を含む。塩酸塩が好ましい。

エステルは、典型的にはC_1〜6アルキルエステル、好ましくはC_1〜4アルキルエステルである。それゆえに、エステルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、又はtert-ブチルエステルであってもよい。エチルエステルが好ましい。

本明細書で使用される場合、C_1〜6アルキル基は、好ましくはC_1〜4アルキル基である。好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、及びtert-ブチルから選択される。メチル及びエチルが、特に好ましい。

誤解を避けるために言えば、式(I)の化合物の定義は、カルボン酸アニオンがプロトン化されて-COOHを生じた化合物、及びアンモニウムカチオンが薬学的に許容されるアニオンと会合している化合物も含む。さらに誤解を避けるために言えば、上記定義の化合物は、任意のエナンチオマーの形態で使用されてもよい。

典型的には、R₁は、水素又はC_1〜4アルキル、好ましくは水素又はC_1〜3アルキル、より好ましくは水素、エチル、又はメチル、最も好ましくは水素又はメチルを表す。

典型的には、R₂は、C_1〜4アルキル、好ましくはC_1〜3アルキル、より好ましくはエチル又はメチル、最も好ましくはメチルを表す。

典型的に、R₃は、C_1〜4アルキル、好ましくはC_1〜3アルキル、より好ましくはエチル又はメチル、最も好ましくはメチルを表す。

R₂及びR₃は、同じ又は異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。R₁が、C_1〜6アルキルを表す場合、次に、R₁、R₂、及びR₃は、同じ又は異なっていてもよいが、同じであることが好ましい。

好ましい実施形態では、R₁は、水素を表し、R₂及びR₃は上で定義された通りである。したがって、R₁は、水素を表し、R₂及びR₃は、メチルを表し、その結果、式(I)の化合物は、ジメチルグリシンであることが特に好ましい。

代替的な好ましい実施形態では、R₁は、C_1〜6アルキルを表し、R₂及びR₃は、上で定義された通りである。したがって、R₁〜R₃は全て、メチルを表し、その結果、式(I)の化合物は、トリメチルグリシンであることが特に好ましい。

あるいは、式(I)の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである代わりに、賦形剤は、ポリエチレンイミン(PEI)などのポリマーであってもよい。

PEIは、-(CH₂-CH₂-NH)-と表記される化学的反復単位を特徴とする脂肪族ポリアミンである。本明細書でのPEIへの言及は、ポリエチレンイミンホモポリマー又はコポリマーを含む。ポリエチレンイミンコポリマーは、ランダム又はブロックコポリマーであってもよい。例えば、PEIは、ポリエチレンイミンとポリエチレングリコール(PEG)などの別のポリマーとのコポリマーから構成されてもよい。ポリエチレンイミンは、直鎖状又は分岐状であってもよい。

PEIへの言及は、誘導体化形態のポリエチレンイミンも含む。ポリエチレンイミンは、種々の位置に窒素原子を含有する。窒素原子は、末端アミノ基、例えばR-NH₂、及び内部基、例えばポリマー構造内でアルキル基又はアルキレン基の間に入る基、例えばR-N(H)-R'、並びにポリマー分岐の交点、例えばR-N(-R')-R”に存在し、ここでR、R'、及びR”は、例えばアルキレン基であり得る。アルキル基又はアリール基は、水素原子に加えて、又は水素原子の代わりに、窒素中心に結合されてもよい。このようなアルキル基及びアリール基は、置換されていてもよいし、又は非置換であってもよい。アルキル基は、典型的にはC₁〜C₄アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec.ブチル、又はtert.ブチルである。アリール基は、典型的にはフェニルである。

PEIは、種々の他のポリマー、例えばポリエチレングリコールに共有結合的に結合されているポリエチレンイミンであってもよい。PEIの他の変性型が作製されており、一部は市販されており、分岐状PEI 25kDa、jetPEI(登録商標)、LMW-PEI 5.4kDa、疑似デンドリマーPEI、PEI-SS-PEI、PEI-SS-PEG、PEI-g-PEG、PEG-co-PEI、PEG-g-PEI、PEI-co-Lラクトアミド-co-スクシンアミド、PEI-co-N-(2-ヒドロキシエチル-エチレンイミン)、PEI-co-N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、PEI-g-PCL-ブロック-PEG、PEI-SS-PHMPA、PEI-g-デキストラン10000、及びPEI-g-トランスフェリン-PEG、Pluronic85(登録商標)/Pluronic123(登録商標)-g-PEIがある。PEIは、過メチル化(permethylated)ポリエチレンイミン又はポリエチレンイミン-エタンスルホン酸であってもよい。

例えば、300Daから800kDaの間の広い範囲の数平均モル質量(M_n)のPEIが利用可能である。数平均モル質量は、好ましくは、300から2000Daの間、500から1500Daの間、1000から1500Daの間、10から100kDaの間、20から100kDaの間、30から100kDaの間、40から100kDaの間、50から100kDaの間、60から100kDaの間、50から70kDaの間、又は55から65kDaの間である。約60kDaの比較的高いM_nのPEI、又は1200Daの比較的低いM_nのPEIが好適である。

PEIの重量平均モル質量(M_w)は、好ましくは、500Daから1000kDaの間である。PEIのM_wは、最も好ましくは、500Daから2000Daの間、1000Daから1500Daの間、又は1から1000kDaの間、100から1000kDaの間、250から1000kDaの間、500から1000kDaの間、600から1000kDaの間、750から1000kDaの間、600から800kDaの間、700から800kDaの間である。約750kDaの比較的高いM_w、又は約1300Daの比較的低いM_wが好適である。

PEIの重量平均モル質量(M_w)及び数平均モル質量(M_n)は、当業者周知の方法により決定できる。例えば、M_wは、光散乱、小角中性子散乱(SANS)、X線散乱、又は沈降速度により決定されてもよい。M_nは、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー、粘度測定(Mark-Houwinkの式)、及び蒸気圧浸透圧法又は末端基滴定などの束一的方法により決定されてもよい。

種々の形態のPEIは、市販されている(例えば、Sigma,Aldrich)。例えば、約60kDaのM_n及び約750kDaのM_wを有する、本明細書で使用される分岐状の比較的高い分子量形態のPEIは、市販されている(Sigma P3143)。このPEIは、次式で表すことができる。

1300DaのM_w及び1200DaのM_nを有する、本明細書で使用される比較的低い分子量形態のPEIも市販されている(例えば、Aldrich 482595)。

糖
水性組成物中に1種以上の糖が任意選択で存在する。2種以上の糖、例えば2、3、又は4種の糖が存在してもよい。好ましくは1又は2種の糖、最も好ましくは2種の糖が存在する。賦形剤及び糖の組合せは、供に相互作用してもよく、それにより、処理工程中に、インフルエンザ抗原の免疫原性をさらに増加させる。糖は、存在する場合、処理工程中に、アジュバント、特に、アルミニウム塩アジュバントの安定化も助ける。

糖は、典型的には単糖、二糖、三糖、四糖、糖アルコール、又は別のオリゴ糖である。

単糖は、典型的には、グルコース、フルクトース、アラビノース、グリセルアルデヒド、ガラクトース、又はマンノースである。二糖は、典型的には、スクロース、トレハロース、ラクトース、セロビオース、ツラノース、マルツロース、メリビオース、イソマルトース、又はマルトースである。三糖は、典型的には、ラフィノース、メレジトース、又はウンベリフェロースである。四糖は、典型的には、スタキオースである。糖アルコールは、典型的には、マンニトールである。オリゴ糖の他の例としては、五糖ベルバスコースが挙げられる。

糖は、典型的には非還元糖であり、例えばスクロース又はラフィノースである。

1種の糖が水溶液中に存在する場合、糖は、好ましくはマンニトール又はスクロース、好ましくはマンニトールである。

2種の糖が水性懸濁液中に存在する場合、糖は、好ましくはスクロース及びラフィノースである。

アジュバント
任意選択で、アジュバントが水性組成物中に存在する。任意の好適なアジュバントを使用することができるが、アルミニウム塩アジュバントが好ましい。アルミニウム塩アジュバントが使用される場合、処理工程中に、アジュバントを安定化させるために、水性組成物中に1種以上の糖が存在することも好ましい。

アルミニウム塩は、典型的には、水酸化アルミニウム(Al(OH)₃)、リン酸アルミニウム(AlPO₄)、アルミニウム塩酸塩、硫酸アルミニウム、アンモニウムミョウバン、カリウムミョウバン、又はケイ酸アルミニウムである。使用されるアルミニウム塩アジュバントは、好ましくは、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムである。アルミニウム塩アジュバントは、最も好ましくは、水酸化アルミニウム(Al(OH)₃)である。

アルミニウム塩アジュバントは、典型的に、アルミニウム塩から作成される水和ゲルの形態をとり、水和ゲルは、水性媒体中の粒子懸濁液である。アルミニウム塩アジュバントの調製は、当業者に周知である。例えば、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムアジュバントは一般に、(典型的には、硫酸塩又は塩酸塩としての)アルミニウムイオンの水溶液を、当業者公知の組成が明らかな制御された化学環境において、アルカリ性条件に曝露することにより調製される。このような方法は、例えば、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムの水和ゲルを調製するために使用できる。

凍結
水性組成物の凍結は、任意の好適な方法で行うことができる。したがって、凍結は、液体窒素又は液体窒素蒸気に浸漬するか、冷凍庫に入れるか、又はドライアイス及びアルコール凍結浴を使用することにより行ってもよい。

水性組成物は、典型的には-4℃以下に、好ましくは-10℃以下に、より好ましくは-20℃以下に、より好ましくは-30℃に凍結される。水性組成物は、典型的には-100℃以下に凍結されない。水性組成物は、例えば、約-80℃に凍結されてもよい。

水性組成物は、典型的には30分間以上、好ましくは1時間以上、例えば、2〜24時間、所望の温度に凍結されたままにする。

凍結水性組成物は、典型的には、ワクチンとして使用する前に、室温で放置することにより、解凍される。

凍結及び解凍条件は、所定の実験で、適切に最適化できる。

凍結乾燥
凍結乾燥は、標準手順に従って行うことができる。3つの主要な段階:凍結、1次乾燥、及び2次乾燥がある。凍結は、典型的には、凍結乾燥機を使用して行われる。この工程では、生体材料の固相及び液相が共存する最も低い温度である共晶点(eutectic point)未満に、生体材料を冷却することが重要である。これにより、融解よりも昇華が、次の工程で起こることになることが確実になる。あるいは、非晶質材料は、共晶点を有しないが、臨界点を有し、生成物は、1次及び2次乾燥中に、メルトバック又は崩壊を防止するために、この臨界点未満に維持されなければならない。

1次乾燥中に、圧力は、適切なレベルの真空を適用することにより制御され、一方、水が昇華できるような十分な熱が供給される。材料中の水の、少なくとも50%、典型的には60〜70%が、この工程で昇華される。あまりにも多くの熱は生体材料の構造を分解又は変更する可能性があるので、1次乾燥は、時間がかかることがある。冷凝縮チャンバ及び/又は凝縮板は、水蒸気が再凝固により捕捉される表面を提供する。

2次乾燥プロセスでは、水和水は、熱のさらなる適用により除去される。圧力はまた、典型的に、さらなる乾燥を促進するように低下させる。凍結乾燥プロセスの完了後、真空は密封前に窒素などの不活性気体で破ることができ、又は材料を真空下で密封できる。

凍結乾燥組成物は、ワクチンとして使用する前に、例えば、水又は水性緩衝液を使用して、水性組成物として再構成される。

凍結乾燥条件は、所定の実験で適切に最適化できる。

熱処理
水性組成物の熱処理は、任意の好適な方法で行うことができる。

水性組成物は、典型的に30℃を超えるまで、好ましくは40℃を超えるまで、加熱される。水性組成物は、より好ましくは30℃〜80℃、例えば35℃〜60℃又は40℃〜50℃の温度まで加熱される。好ましい温度は、約45℃である。

一旦、水性組成物が、所望の温度まで加熱されていると、30分間以上、好ましくは1時間以上、例えば、2時間〜2週間又は4時間〜24時間、その温度に維持されることが好ましい。

典型的な熱処理は、約45℃まで加熱すること、及び約7日間その温度に維持することを含む。

熱処理した水性組成物は、典型的には、ワクチンとして使用する前に、室温に戻される。

熱処理条件は、所定の実験で適切に最適化できる。

免疫原性の増加
インフルエンザ抗原の免疫原性は、ヒト又は動物の身体において、その抗原が免疫応答を誘発する能力である。免疫原性における変化は、赤血球凝集抑制試験などの、免疫応答のレベルを予測するための標準試験を使用して、未変性(対照)インフルエンザ抗原の免疫原性を、本発明に従って変性させたインフルエンザ抗原の免疫原性と比較することにより測定できる。

インフルエンザ抗原の免疫原性は、当業者公知の任意の好適な手法を使用して測定できる。好ましい標準手法は、赤血球凝集抑制試験である。この試験に対する例示的プロトコールは、以下の実施例に記載される。

本発明の変性インフルエンザ抗原の免疫原性の増加は、同じ免疫応答が、より少量の変性抗原で得ることができることを意味する。したがって、患者に用量Dの未変性抗原が投与されて所定レベルの免疫原性が達成された場合、典型的には0.5D以下、好ましくは0.1D以下、より好ましくは0.01D以下の用量が、同レベルの免疫原性を達成する。免疫原性は、典型的には、患者への投与から少なくとも10日後、例えば、10日後、15日後、又は20日後に測定される。

本発明の変性インフルエンザ抗原の免疫原性の増加は、免疫の発生が未変性抗原よりも迅速に起こることを意味する。したがって、患者が、所与の用量の未変性抗原の投与後に免疫を獲得するのに時間Tがかかる場合、次に、同じ用量の変性抗原を投与された患者が、免疫を獲得するのに、典型的には0.75T以下の時間、好ましくは0.5T以下の時間、最も好ましくは0.2T以下の時間がかかることになる。

ワクチン組成物の使用
凍結、凍結乾燥、又は加熱後に、得られた組成物はそれぞれ、解凍、再構成、又は冷却することができ、次に、ワクチン組成物として使用できる。ワクチン組成物は、使用前に、例えば、リン酸緩衝生理食塩水又は注射用水で必要に応じて希釈できる。

ワクチン組成物は、典型的には、1種以上の異なるインフルエンザ抗原を含有し、これらの少なくとも1つが、本発明に従って調製される。一実施形態では、ワクチン組成物は、2つ、3つ、又は4つの異なるインフルエンザ抗原を含有し、好ましくはこれらの全ては本発明に従って調製されている。

次に、得られたワクチン組成物は、例えば、注射により、ワクチン接種を必要としているヒト又は動物の患者に投与できる。患者は、典型的にはヒトである。

患者は、好ましくは、「リスクのある」集団の一部であるヒトである。このような患者としては、子供、高齢患者、及び/又は肺疾患、糖尿病、癌、若しくは腎臓若しくは心臓の病気に罹患している患者が挙げられる。この患者グループは、本発明のワクチン組成物での治療に対して特に好ましい。なぜなら、標準的なワクチンと比較して、本ワクチンで達成される免疫の迅速な発生は、患者がワクチン接種と免疫の発生の間の期間中に感染するリスクを減少させるからである。

患者は、好ましくは、インフルエンザワクチンに対する有害反応を以前に経験している。この患者グループは、本発明のワクチン組成物での治療に対して特に好ましい。なぜなら、抗原節約効果は、患者により少ないワクチン組成物を送達する必要があり、したがって、ワクチンに対するアレルギー反応又は他の有害反応のリスクが減少することを意味するからである。

次の実施例は、本発明を例示する。

[実施例1]
ワクチン組成物の調製
材料
ジメチルグリシン(DMG)、スクロース、ラフィノース、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)緩衝液、塩化ナトリウム、及び滅菌水は全て、商業的な供給元(Aldrich)から入手したままの状態で使用した。Alhydrogel(商標)は、商業的な供給元(Source Bioscience)から入手したままの状態で使用した。ポリエチレンイミン(PEI)(Sigmaカタログ番号:P3143-50%w/v水溶液;M_n60,000)は、商業的な供給元から入手したままの状態で使用した。完全不活化インフルエンザA/ソロモン諸島/2006 H1N1型抗原を、国立生物学的製剤研究所(NIBSC)から入手した。

組成物調製
150mlのHEPES緩衝液を次の通り調製した。100mlの滅菌水をシリンダー内で測定した。2.5gのNaClを、較正チェックされた秤で計量し、電磁撹拌器及び撹拌子を使用して、滅菌水に溶解させた。6mlの1MのHEPESを加え、撹拌した。完全に溶解した時、pHメーター及び水酸化ナトリウムを使用して、pHを7.9に変更した。最終体積を、滅菌水で150mlにした。次に、最終のHEPES緩衝液ミックスを、生物学的安全キャビネット内で、0.2μmのフィルターユニットで濾過した。

以下の表1〜3に提示された必要とされる賦形剤の構成成分を計量した後、それらを50mlの滅菌フラスコに入れた。次に、約6mlのHEPES緩衝液を、フラスコに加え、内容物をかき回しながら混合した。次に、フラスコ及び内容物を、溶解するまで、+60℃の水浴中で加熱した。溶解した時、混合物の体積を測定し、最終体積を、さらなるHEPES緩衝液で10mlにした。賦形剤製剤を、生物学的安全キャビネット内で、0.2μmのフィルターユニットで濾過した。

凍結乾燥インフルエンザウイルス抗原A/ソロモン諸島/2006H1N1型のバイアルを、-20℃から室温に到達させ、滅菌水中の抗原の作業ストックを調製した。

以下の表1〜3に記載される(予めオートクレーブ処理された)ガラス製スクリューバイアルを、調製した。各バイアルは、最終的に1mlの合計体積を含んでいた。必要とされる場合、500μlのAlhydrogel(商標)ストック(2%w/vの濃度で、1%w/vの最終濃度になる)を、各バイアルにピペッティングした。次に、インフルエンザウイルス抗原ストックを、バイアルごとに2又は0.2μgの抗原の最終抗原濃度になるように、各バイアルにピペッティングした。バイアルをキャップし、短時間ボルテックスしながら混合した。

次に、バイアルを、以下に記載される、及び表1〜3に提示されるように、処理A〜Cの1つで任意に処理した。
処理1 バイアルを7日間45℃で保存し、次に、室温に戻した。
処理2 バイアルを-80℃に凍結し、次に、室温で放置することにより解凍した。
処理3 80℃まで凍結し、真空下16時間乾燥することにより、バイアルを市販の凍結乾燥機内で凍結乾燥した。次に、バイアルを、7日間45℃で保存し、次に、1mlの合計体積に再構成して戻し、室温に戻した。

[実施例2]
抗原節約効果
実施例1において調製された組成物A〜Fを、0日目及び24日目に、BALB-cマウスに皮下投与した。組成物のインフルエンザに対する予防効果を、種々の時点でマウスから採取した血液の赤血球凝集抑制試験(HIA)力価を測定することにより判定した。

赤血球凝集抑制試験は、次の工程を含む。
1. 血清を30分間56℃で不活化した。
2. 非特異的ニワトリ赤血球(CRBC:chicken red blood cell)凝集活性を、血清を30分間1%のCRBCとプレインキュベーションすることにより除去した。CRBCを除去し、血清を単離した。
3. 血清を、PBS/0.5%のBSAで連続希釈した。
4. HAUのインフルエンザウイルスを、ウェルに加えた。
5. プレートを、室温で30分間インキュベーションした。
6. 1%のCRBC/PBS懸濁液を、ウェルに加えた。
7. プレートを、室温で30〜45分間インキュベーションした。
8. ウェル中の凝集を、目視で判定した。
9. HIA力価を記録及び報告した。HIA力価は、CRBCペレットを形成する最大希釈倍率の逆数である。

結果を、図1に示す。組成物D〜Fに対するこれらの結果は、賦形剤の熱処理との組合せが、対照組成物Aと比較して同等以上のHIA力価をもたらすことを実証する。組成物D〜Fは、対照と比較して1重量%の抗原しか含有しないので、このことは予想外である(組成物Bで得られた結果と比較)。

[実施例3]
免疫の発生の促進
実施例1において調製された組成物G〜Nを、0日目及び24日目に、BALB-cマウスに皮下投与した。組成物のインフルエンザに対する予防効果を、実施例2に記載されるように、HIA力価を測定することにより、種々の時点で判定した。

結果を、図2に示す。HIA力価が50を超えたら、マウスは免疫を獲得しているとみなされた。免疫は、賦形剤、アジュバント、及び熱処理の組合せ(組成物N)で、最も迅速に獲得された。

[実施例4]
異なる賦形剤で観察された類似の結果
実施例1において調製された組成物O〜Rを、0日目及び21日目に、BALB-cマウスに皮下投与した。組成物のインフルエンザに対する予防効果を、実施例2に記載されるように、HIA力価を測定することにより、種々の時点で判定した。

結果を、図3に示す。これらの結果は、実施例1及び2のポリエチレンイミンで観察されたインフルエンザ抗原における効果は、ジメチルグリシンでも観察されることを実証する。したがって、ポリエチレンイミンで観察された抗原節約効果及び免疫の発生の促進は、ジメチルグリシンでも観察される。
（付記）
（付記１）
インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させるための、式(I):
(式中、
R₁は、水素又はC_1〜6アルキルを表し、
R₂は、C_1〜6アルキルを表し、
R₃は、C_1〜6アルキルを表す)
の化合物又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである賦形剤の使用であって、
インフルエンザ抗原及び賦形剤を含む水性組成物を(a)凍結すること、(b)熱処理すること、及び/又は(c)凍結乾燥することを含む、使用。
（付記２）
式(I)の化合物が、ジメチルグリシン又はトリメチルグリシンである、付記1に記載の使用。
（付記３）
式(I)の化合物が、ジメチルグリシンである、付記2に記載の使用。
（付記４）
水性組成物が、1種以上の糖をさらに含む、付記1〜3のいずれか1項に記載の使用。
（付記５）
1種以上の糖が、スクロース及びラフィノースである、付記4に記載の使用。
（付記６）
水性組成物が、アジュバントをさらに含む、付記1〜5のいずれか1項に記載の使用。
（付記７）
アジュバントが、アルミニウム塩アジュバントである、付記6に記載の使用。
（付記８）
インフルエンザ抗原の免疫原性が、水性組成物の(a)凍結、(b)熱処理、及び/又は(c)凍結乾燥中に増加する、付記1〜7のいずれか1項に記載の使用。
（付記９）
インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させるための方法であって、
インフルエンザ抗原及び付記1〜3のいずれか1項に記載の賦形剤を含み、任意で付記4又は6に記載の1種以上の糖及び任意で付記6又は7に記載のアジュバントを含む水性組成物を(a)凍結すること、(b)熱処理すること、及び/又は(c)凍結乾燥することを含む、方法。
（付記１０）
付記9に記載の方法により得られる、ワクチン組成物。
（付記１１）
ヒト又は動物の患者のインフルエンザ感染の予防に使用される、付記10に記載のワクチン組成物。
（付記１２）
患者が、(a)子供、高齢患者、及び/又は肺疾患、糖尿病、癌、若しくは腎臓若しくは心臓の問題に罹患している患者、又は(b)インフルエンザワクチンに対する有害反応を以前に経験している患者である、付記11に記載の使用のためのワクチン組成物。
（付記１３）
付記11又は12に記載のヒト又は動物の患者のインフルエンザ感染を予防するための薬品の製造における、付記10に記載のワクチン組成物の使用。
（付記１４）
付記11又は12に記載のヒト又は動物の患者のインフルエンザ感染を予防する方法であって、
付記10に記載のワクチン組成物を、前記患者に投与することを含む、方法。

Claims

インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させるための、ジメチルグリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである賦形剤の使用であって、
インフルエンザ抗原、賦形剤及び1種以上の糖を含む水性組成物を40〜50℃で2時間〜2週間熱処理することを含む、使用。
1種以上の糖が、スクロース及びラフィノースである、請求項1に記載の使用。
水性組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項1又は2に記載の使用。
アジュバントが、アルミニウム塩アジュバントである、請求項3に記載の使用。
インフルエンザ抗原の免疫原性が、水性組成物の熱処理中に増加する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
インフルエンザ抗原の免疫原性を増加させるための方法であって、
インフルエンザ抗原、ジメチルグリシン又はその生理学的に許容される塩若しくはエステルである賦形剤、請求項1又は2に記載の1種以上の糖及び任意で請求項3又は4に記載のアジュバントを含む水性組成物を40〜50℃で2時間〜2週間熱処理することを含む、方法。
請求項6に記載の方法により得られる、ワクチン組成物。
ヒト又は動物の患者のインフルエンザ感染の予防に使用される、請求項7に記載のワクチン組成物。
患者が、(a)子供、高齢患者、及び/又は肺疾患、糖尿病、癌、若しくは腎臓若しくは心臓の問題に罹患している患者、又は(b)インフルエンザワクチンに対する有害反応を以前に経験している患者である、請求項8に記載の使用のためのワクチン組成物。
請求項8又は9に記載のヒト又は動物の患者のインフルエンザ感染を予防するための薬品の製造における、請求項7に記載のワクチン組成物の使用。