JP6720298B2 - ビメンチン由来のペプチドに特異的に結合する抗体または断片 - Google Patents

ビメンチン由来のペプチドに特異的に結合する抗体または断片 Download PDF

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Description

本発明は配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体に関するもので、具体的には配列番号１の分離されたペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片、前記抗体または前記ペプチドの結合断片をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターが導入された細胞、前記細胞を利用した抗体または前記ペプチドの結合断片の生産方法、前記生産方法により生産された組換え抗体または前記ペプチドの結合断片、前記抗体または前記ペプチドの結合断片を含む抗ウイルス用組成物、前記抗体または前記ペプチドの結合断片を含む炎症性疾患の予防または治療用組成物、及び前記組成物を用いたウイルス感染性疾患の治療方法、または炎症性疾患の治療方法に関する。
ウイルス性疾患は、細菌性疾患とは異なって抗生剤があまり効かないため治療が難しく、常に人間における疾患及び死亡の主な原因中の一つとしてウイルス疾患が浮上している。
また、ウイルス感染性疾患は炎症を誘発し、多様な炎症性疾患を誘発することもある。
このようなウイルス感染性疾患などの治療のために開発された製剤としては化学物質と生体由来物質とに区分されるが、化学物質の場合のほとんどが特定ウイルス疾患のみに作用するように開発されており、様々な副作用が現れ、耐性ウイルスが容易に出現するなどの多くの欠点がある。
一方、生体由来物質としては、インターフェロン（interferon、IFN）のようなサイトカインがよく知られている。この中でインターフェロンはウイルスに感染された細胞で生産されるサイトカイン中、最初に発見されたものとして、最も優れた抗ウイルス性を有するサイトカインとして知られている。インターフェロンは、次のような多様な疾患、慢性Ｂ型、Ｃ型肝炎や血液がん、多発性硬化症などの多様な疾病の治療に用いられることが報告された。最近には、ＨＩＶ（Human immunodeficiency virus）患者に対する効能が証明されている。ここで、数年前から抗ウイルス製剤及び免疫増強剤を開発するための一環としてインターフェロンを大量生産するために、遺伝工学的方法や生物工学的な方法の研究が行われていて、最近は天然物や合成化合物からインターフェロン活性を誘導する化合物を探索するための研究が活発に行われてきた（非特許文献１）。そこで、３Ｍ 製薬会社によりイミキモド（Imiquimod）という強力なインターフェロン誘導剤が開発されたが、臨床試験で様々な副作用が現れたことにより開発が中断されたことがある。
インターフェロンは強力な抗ウイルス剤として知られているが、免疫細胞の浸潤など炎症反応を誘導してほぼすべての細胞がインターフェロンに対する受容体を常に発現していて、抗細胞作用など多様な副作用を示し、臨床に使用時に多くの量を必要として６ヶ月以上は使用できないという欠点がある。
ここで、正常細胞ではなくウイルス感染細胞に対して選択的に作用して治療時に少量で適用可能であり、特定ウイルスではない多様なウイルスに適用可能で、免疫細胞浸潤を抑制することにより炎症を抑制する抗ウイルス活性及び抗炎症作用を同時に有する治療剤の開発が求められている。
Alcaro S et al., Bioorg Med Chem. 2005, 13(10), 3371-3378
本発明者らはウイルス感染細胞にのみ特異的に作用し、免疫細胞の浸潤を抑制して炎症を抑制することができる抗ウイルス活性及び抗炎症作用を有する治療剤を開発しようと鋭意努力した結果、新規なヒト化抗体であるｈｚＶＳＦが多様なウイルスに特異的に作用し、免疫細胞の浸潤抑制及びウイルス抑制能があるだけではなく、免疫原性を下げたヒト化抗体としてヒトに投与時、副作用もない安全な製剤であることを確認して、本発明を完成した。
本発明の一つの目的は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する新規な抗体または前記ペプチドの結合断片を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体または前記ペプチドの結合断片をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ベクターが導入された細胞、前記細胞を用いた抗体または前記ペプチドの結合断片の生産方法、前記生産方法により生産された抗体または前記ペプチドの結合断片を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体または前記ペプチドの結合断片を含む抗ウイルス用組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗ウイルス用組成物を用いたウイルス感染疾患の予防または治療方法を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記抗体または前記ペプチドの結合断片を含む炎症性疾患の予防または治療用組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、前記炎症性疾患の予防または治療用組成物を用いた炎症性疾患の治療方法を提供することにある。
本発明の配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片はウイルス感染細胞に選択的に作用して、治療時に少量が必要で、副作用もないだけでなく、免疫細胞の浸潤を抑制して炎症を抑制する、優れた抗ウイルス及び抗炎症作用を示すヒト化抗体新薬として提供されうる。
キメラＶＳＦの製造のためのベクターの模式図である。 キメラＶＳＦの模式図である。 キメラＶＳＦの発現を確認した図である。 ＶＳＦのｓｃＦｖのＤＮＡ配列を示した図である。 ＶＳＦのｓｃＦｖをベクターにクローニングした模式図である。 ＶＳＦのｓｃＦｖを精製して確認した図である。 ＶＳＦ、ｓｃＦｖ及び抗ＥＭＣＤウイルス抗体の抗ウイルス効能をウイルス感染における細胞の生存量と確認した図である。 キメラＶＳＦの抗ウイルス効能を確認した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの製造のためのベクターの模式図である。 本発明のヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの模式図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの発現を確認した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの抗ウイルス効能を確認した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認した還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＬＣ/ＭＳ結果を示した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＬＣ/ＭＳ結果を示した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＬＣ/ＭＳ結果を示した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＬＣ/ＭＳ結果を示した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＳＥＣ−ＨＰＬＣ結果を示した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＩＦ（Isoelectric focusing）を示した図である。 ５１名の血液ドナーの中でＫＬＨ、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３に反応してＴ細胞の増殖が起こったドナーの数を示した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３に対する５１名のＴ細胞増殖反応の程度を示した図である。 ＫＬＨ、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３により誘導されたＴ細胞増殖を平均ＳＩ値で示した図である。 代表的なヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示した図である。 代表的なヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の物性を確認したＨＰＬＣ結果を示した図である。 代表的なヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の薬物動態学を示した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ及びヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のウイルス抑制能を確認した図である。 ヒト細胞におけるヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３及びｈＩＦＮ−αの抗細胞作用を確認した図である。 ウイルス性糖尿病におけるヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの炎症細胞の浸潤抑制を確認した図である。 ｍＶＳＦの抗ＨＢＶ効果を確認した図である。 ＨＢＶで感染された肝組織におけるＶＳＦ受容体の発現様相を確認した図である。 ＨＣＶで感染された肝組織におけるＶＳＦ受容体の発現様相を確認した図である。 インフルエンザウイルス感染細胞におけるＶＳＦ受容体の発現を確認した図である。 ＥＭＣ−Ｄウイルス感染細胞におけるＶＳＦ受容体の発現を確認した図である。 ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のＢ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス効果をｃｃｃＤＮＡの量をリアルタイム定量ＰＣＲ（Real-time quantitative PCR）で確認した図である。 ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のＢ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス効果を細胞外ＨＢＶ ＤＮＡの量をリアルタイム定量ＰＣＲ（Real-time quantitative PCR）で確認した図である。 ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のＢ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス効果を細胞内ＨＢＶ ＤＮＡの量をリアルタイム定量ＰＣＲ（Real-time quantitative PCR）で確認した図である。 ｈｚＶＳＦのＣ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス効果をＦＡＣＳで確認した図である。 ｈｚＶＳＦのＣ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス効果をリアルタイム定量ＰＣＲで確認した図である。 ｈｚＶＳＦ_ｖ１３のＣ型肝炎ウイルス遺伝子１ａ型に対する抗ウイルス効果をリアルタイム定量ＰＣＲとウエスタンブロットで確認した図である。 ｈｚＶＳＦ_ｖ１３のＣ型肝炎ウイルス遺伝子１ａ型に対する長期間の抗ウイルス効果をリアルタイム定量ＰＣＲで確認した図である。 ｈｚＶＳＦ_ｖ１３のＣ型肝炎ウイルス遺伝子１ｂ型に対する抗ウイルス効果をリアルタイム定量ＰＣＲとウエスタンブロットで確認した図である。 ｈｚＶＳＦ_ｖ１３のＣ型肝炎ウイルス遺伝子２ａ型に対する抗ウイルス効果をリアルタイム定量ＰＣＲとウエスタンブロットで確認した図である。 ｈｚＶＳＦ_ｖ１３のＣ型肝炎ウイルス遺伝子２ａ型に対する長期間の抗ウイルス効果をリアルタイム定量ＰＣＲで確認した図である。 ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖ１３のインフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）に対するウイルス増殖抑制効果をマウスから確認した図である。 インフルエンザウイルスに感染されたマウスにｈｚｖＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与した後、肺組織の治療効果を確認した図である。 インフルエンザウイルスに感染されたマウスにｈｚｖＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３によるマウス粘膜上皮細胞と繊毛の保護効果を確認した図である。 インフルエンザウイルスに感染されたマウスにｈｚｖＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３が投与された時期と濃度別の肺炎抑制効果を確認した図である。 インフルエンザウイルスに感染（１００，０００ｐｆｕ）されたマウスにｈｚＶＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与した後、ＣＤ４免疫細胞の浸潤抑制効果を示した図である。 インフルエンザウイルスに感染（１０，０００，０００ｐｆｕ）されたマウスにｈｚＶＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与した後、ＣＤ４免疫細胞の浸潤抑制効果を示した図である。 インフルエンザウイルスに感染（１００，０００ｐｆｕ）されたマウスにｈｚＶＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与した後、マクロファージの浸潤抑制効果を示した図である。 インフルエンザウイルスに感染（１０，０００，０００ｐｆｕ）されたマウスにｈｚｖＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与した後、マクロファージの浸潤抑制効果を示した図である。 マウスにウイルス感染させた後、ｈｚＶＳＦの炎症性サイトカイン分泌抑制効果を示した図である。 ＶＳＦ受容体が発現しないＭＣＦ−７細胞に野生型のＶＲと変異型のＶＲを過発現させた後、ウイルスを感染させてｈｚＶＳＦ_ｖ１３の抗ウイルス能をＭＶＩＴアッセイで確認した図である。 ＶＳＦ受容体が発現しないＭＣＦ−７細胞に野生型のＶＲと変異型のＶＲを過発現させた後、ウイルスを感染させてｈｚＶＳＦ_ｖ１３の抗ウイルス能をＷＳＴアッセイで確認した図である。 ＶＳＦ受容体が発現しないＭＣＦ−７細胞に野生型のＶＲと変異型のＶＲを過発現させた後、ウイルスを感染させてｈｚＶＳＦ_ｖ１３の抗ウイルス能をＭＶＩＴアッセイで確認した図である。 ＶＳＦ受容体が発現しないＭＣＦ−７細胞に野生型のＶＲと変異型のＶＲを過発現させた後、ウイルスを感染させてＶＳＦ受容体とｈｚＶＳＦ_ｖ１３との結合を免疫蛍光染色法で確認した図である。 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で過発現させて精製した野生型及び変異型のＶＳＦ受容体（ビメンチン）とｈｚＶＳＦ_ｖ１３との結合をプルダウン（pull-down）アッセイで確認した図である。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で過発現させた野生型及び変異型のＶＳＦ受容体（ビメンチン）とｈｚＶＳＦ_ｖ１３との結合を免疫沈降（immunoprecipitation）で確認した図である。 ビメンチンとＶＳＦとの結合部位をシミュレーションした図である。 ビメンチンとＶＳＦとの結合をシミュレーションした図である。 ビメンチンとＶＳＦ_ｖ１３との結合部位をシミュレーションした図である。
前記目的を達成するために、本発明は一つの様態として配列番号１の分離されたペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片を提供する。
前記抗体はこれに制限されないが、その例としてマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよい。
本発明の前記ヒト化抗体または前記ペプチドの結合断片は抗原と直接的に結合するマウスの単クローンまたはモノクローナル抗体の可変領域の相補性決定部位を人間抗体骨格に移植して、本来のマウス抗体の親和度及び特異性を維持しながら人体内でＨＡＭＡ（human anti-mouse antibody）反応を抑制する優秀性を有している。さらに、脱免疫（de-immunization）方法を用いて免疫原性を下げたヒト化抗体として、人間に投与する時に免疫原性を著しく下げて安全な製剤として使用されうる。すなわち、これは配列番号１のペプチド部位が外部に露出された細胞に反応して影響を与えながら人間の免疫システムとより良好に相互作用して、例えばウイルス感染細胞と反応しながら補体依存性細胞毒性（complement-dependent cytotoxicity、CDC）または抗体依存性細胞性細胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity、ADCC）を起こさないようにして目的細胞をより効率的に治療することができる。また、免疫原性の減少により人間の免疫システムが前記抗体を外来のものと認識しないという利点がある。また、より少ない量、より少ない頻度の薬物を投与した時にも、人間の循環システム内の半減期が天然発生抗体と類似するという利点がある。
本発明で前記配列番号１の分離されたペプチドに特異的に結合するマウス抗体は「ｍＶＳＦ（mouse Virus Suppressing Factor）」と通称してもよく、キメラ抗体は「ｃｈＶＳＦ（chimeric Vrus Suppressing Factor）」と通称してもよく、ヒト化抗体は「ｈｚＶＳＦ（humainzed Virus Suppressing Factor）」と通称してもよい。本発明で用語、ヒト化抗体ｈｚＶＳＦまたはその変異体は互いに混用されてもよく、ｈｚＶＳＦはｈｚＶＳＦ野生型（ｈｚＶＳＦ_ｗｔ）及びｈｚＶＳＦの変異体（例えば、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１、ｈｚＶＳＦ_ｖ１またはｈｚＶＳＦ_１などで表記）と混用されてもよい。
本発明で配列番号１の分離されたペプチドはビメンチン（vimentin）のアミノ酸１４２番〜２９４番の位置に該当するもので、本発明の抗体またはその断片が結合することができる限り、前記配列だけでなく前記配列と８０%以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９７%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。前記配列番号１の分離されたペプチドはエピトープを含む抗原領域であって、抗体またはその断片と結合されて本発明と同様の機能を示すことができる限り、ビメンチンアミノ酸の１４２番〜２１１番または２１１番〜２９４番であってもよい。また、このような相同性を有するアミノ酸配列であれば、一部配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列も本発明の範囲内に含まれるのは自明である。ビメンチンはＶＩＭ遺伝子によりコードされるタンパク質であって、細胞内の小器官（organelle）を支持し位置に固定させる機能をするもので、主に細胞の骨格、タンパク質の移動及び細胞のシグナル伝達に関与することが知られており、がんマーカーとして用いられることが知られているが、ここに結合しうる抗体が抗ウイルス作用をすることができることに関しては知られていなかった。
本発明の配列番号１の分離されたペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片はウイルスに感染された細胞に特異的に反応することで、ウイルス感染細胞でＶＳＦ（Virus suppressing factor）の受容体が外部に現れ、これに結合することである。このような本発明の抗体または前記ペプチドの結合断片は前記のようにウイルス感染細胞特異的な結合により抗ウイルス活性及び抗炎症活性を示すため、抗ウイルス用組成物、ウイルス感染性疾患、炎症性疾患の予防または治療分野においても有用に用いることができる。
前記抗体または前記ペプチドの結合断片は、具体的に配列番号１のペプチドの９番目、４５番目、５４番目、７６番目、９４番目または１２９番目のアミノ酸残基に特異的に結合するものであってもよく、より具体的には配列番号１のペプチドの９番目、４５番目、５４番目、７６番目、９４番目及び１２９番目のアミノ酸残基に特異的に結合するものであってもよいが、配列番号１の分離されたペプチドに特異的に結合する限り、これに制限されない。
本発明において用語、「抗体」は、免疫学的に特定抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識するリガンド役割をするタンパク質分子を意味し、ポリクローン抗体、モノクローン抗体、全体（whole）抗体及び抗体断片をすべて含む。また前記用語はキメラ性抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）及び二価（bivalent）または二重特異性分子（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディー、トリアボディー及びテトラボディーを含む。前記用語はさらにＦｃＲｎに対する結合機能を保有した単鎖抗体、ｓｃＡｂ、抗体不変領域の誘導体及びタンパク質スカフォールドに基礎した人工抗体を含む。全体抗体は２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全体抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（subtype）としてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む。
ここで使用される用語、「断片」、「ペプチドの結合断片」及び「抗体断片」は、抗体の抗原結合活性を保有する本発明の抗体の任意の断片を称するもので、互換的に用いられる。例示的な抗体断片は一本鎖抗体、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖまたはｓｃＦｖを含むが、これに限定されない。前記ＦｄはＦａｂ断片に含まれている重鎖部分を意味する。前記Ｆａｂは軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で、一個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（hinge region）を有することでＦａｂと相異する。Ｆ（ａｂ’）２抗体はＦａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。Ｆｖ（variable fragment）は重鎖可変部位及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体フラグメントを意味する。二重ジスルフィドＦｖ（ｄｓＦｖ）はジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片はタンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、好ましくは遺伝子組み換え技術を通じて製作することができる。
本発明で用語、「モノクローナル抗体」は、実質的に同様の抗体集団から収得した単一分子組成の抗体分子を称して、このようなモノクローナル抗体は特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。
典型的に免疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を有し、それぞれの重鎖及び軽鎖は不変領域及び可変領域（前記部位はドメインとしても知られている）を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（complementarity-determining region、以下「ＣＤＲ」という）と呼ばれる３つの多変可能な領域及び４つの構造領域（framework region、以下「ＦＲ」という）を含む。前記ＣＤＲは主に抗原のエピトープ（epitope）に結合する役割をする。それぞれの鎖のＣＤＲは典型的にＮ末端からスタートして順次的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また特定ＣＤＲが位置している鎖により識別される。
また、前記のような本発明の抗体が不変領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来またはこれらの組み合わせ（combination）またはこれらの混成（hybrid）による不変領域を含むことができる。
本発明で用語、「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源単鎖免疫グロブリン不変領域を暗号化するポリペプチドが相異する起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。その例として、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭの不変領域からなるグループから選択された２つ以上の不変領域から二量体または多量体を形成することができる。
本発明で用語、「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖免疫グロブリンの重鎖不変領域内に２つ以上の相異した起源の免疫グロブリン重鎖不変領域に該当する配列が存在することを意味し、その例としてＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなるグループから選択される１つ〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能である。
本発明のヒト化抗体はこれに制限されないが、人間免疫グロブリンγ４を基盤にヒト化されることができ、補体結合性がないためＣＤＣを起こさないという利点がある。
前記ヒト化抗体または前記ペプチドの結合断片は、配列番号２で表された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３または配列番号１４（配列番号３の９番目アミノ酸であるトレオニンがアスパラギン酸に置換）で表された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４または配列番号１５（配列番号４の４番目アミノ酸であるトレオニンがアスパラギンに置換）で表された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号５で表された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６、配列番号１６（配列番号６の３番目アミノ酸であるトレオニンがアスパラギン酸に置換）、配列番号１７（配列番号６の３番目アミノ酸であるトレオニンがアスパラギン酸に、６番目アミノ酸であるアラニンがグリシンに置換）、または配列番号１８（配列番号６の３番目アミノ酸であるトレオニンがアスパラギン酸に、５番目アミノ酸であるロイシンがアルギニンに、６番目アミノ酸であるアラニンがグリシンに置換）で表された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７または配列番号１９（配列番号７の６番目アミノ酸であるセリンがトレオニンに置換）で表された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗体または前記ペプチドの結合断片であってもよい。
また、前記ヒト化抗体または前記ペプチドの結合断片は人間のＦＲ（framework region）を含み、これに制限されないが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１で表された人間免疫グロブリンガンマであってもよく、また配列番号２０で表された重鎖ＦＲ１（framework region 1）；配列番号２１で表された重鎖ＦＲ２；配列番号２２または配列番号２８（配列番号２２の８番目アミノ酸であるリジンがトレオニンに、１０番目アミノ酸であるイソロイシンがアラニンに置換）で表された重鎖ＦＲ３；及び配列番号２３で表された重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域、及び配列番号２４で表された軽鎖ＦＲ１；配列番号２５で表された軽鎖ＦＲ２；配列番号２６で表された軽鎖ＦＲ３；及び配列番号２７で表された軽鎖ＦＲ４を含む、軽鎖可変領域であってもよい。
前記ヒト化抗体または前記ペプチドの結合断片は、具体的に、（ａ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；（ｂ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；（ｃ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１７及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；（ｅ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号１９でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；（ｆ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；（ｇ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；（ｈ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；（ｉ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号１５でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；（ｊ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；（ｋ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号１５でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；（ｌ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号１９でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；（ｍ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号１５でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号１９でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４；（ｎ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含む、抗体または前記ペプチドの結合断片であってもよい。
前記（ａ）抗体はｈｚＶＳＦ_ＷＴ、（ｂ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１、（ｃ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ２、（ｄ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ３、（ｅ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ４、（ｆ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ５、（ｇ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ６、（ｈ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ７、（ｉ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ８、（ｊ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ９、（ｋ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１０、（ｌ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１１、（ｍ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２、（ｎ）抗体はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３をそれぞれ含んでもよい。
前記ヒト化抗体及び前記ペプチドの結合断片は、これに制限されないが、それぞれ配列番号１０及び配列番号１２；配列番号３２及び配列番号３４；配列番号３６及び配列番号３８；配列番号４０及び配列番号４２；配列番号４４及び配列番号４６；配列番号４８及び配列番号５０；配列番号５２及び配列番号５４；配列番号５６及び配列番号５８；配列番号６０及び配列番号６２；配列番号６４及び配列番号６６；配列番号６８及び配列番号７０；配列番号７２及び配列番号７４；配列番号７６及び配列番号７８；配列番号８０及び配列番号８２で記載された重鎖及び軽鎖可変領域を含む、抗体及び前記ペプチドの結合断片であってもよい。
前記マウス抗体は具体的に、配列番号１３７で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１３８で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３９で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１３４で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１３５で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３６で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含んでもよく、より具体的に、配列番号９で記載された重鎖可変領域及び配列番号８で記載された軽鎖可変領域を含むものであってもよいが、これに制限されるものでははい。
前記キメラ抗体は具体的に、配列番号１４１または配列番号１４２で記載された重鎖可変領域及び配列番号１４０で記載された軽鎖可変領域を含むものであってもよく、より具体的に、配列番号１４６または配列番号１４８で記載された重鎖及び配列番号１４４で記載された軽鎖を含むものであってもよいが、これに制限されるものではない。
前記ｓｃＦｖはこれに制限されるものではないが、ｍＶＳＦの安全性のために製造したｓｃＦｖも含んでもよい。その例として、図４に記載された配列により製造されたｓｃＦｖであってもよい。また、配列番号１３１で記載された重鎖可変領域及び配列番号１３３で記載された軽鎖可変領域がリンカーで連結された形態であってもよい。また、配列番号１３０の塩基配列でコードされる重鎖可変領域及び配列番号１３２の塩基配列でコードされる軽鎖可変領域がリンカーで連結された形態であってもよい。このようなｓｃＦｖはＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター内に配列番号１５０の塩基配列でクローニングされてもよい。
具体的な実施例によると、本発明者らはｈｚＶＳＦ_ｗｔ、３個の代替（alternative）及びその１３個の変異体であるヒト化抗体を製造した後、抗ウイルス効能を確認した（実施例６）。また、ＦＤＡ承認を受けて市販中である医薬品との免疫原性を比較した結果、免疫原性が最も低い人間抗体であるヒュミラ（Humira）と同様な水準の免疫原性を示すことを確認して（表７）、抗ウイルス剤または抗炎症剤として使用するとき起こりうる副作用がなく、安全な抗ウイルスまたは医薬品として使用可能であることを確認した。また、ｈｚｖＳＦ_ｗｔ変異体を用いてＴ細胞分析を介してＴ細胞の増殖に大きく影響与えないことを確認し（表８）、臨床に用いるときに免疫源として作用して副作用を起こす可能性が低いことを確認した。また、薬物動態学分析を介して、生体内の半減期が臨床的利用に用いられるほどに高いことを確認した（実施例８）。また、インターフェロンと比較時、４ｎＭ以上の濃度で細胞毒性を示さないことを確認し、インターフェロンとは異なり副作用が少ないことを確認した（実施例１１）。また、本発明のｈｚＶＳＦ（野生型及び変異体）がマウスにおいてＥＭＣ−Ｄウイルス感染に対する抗ウイルス効能及び免疫細胞の浸潤抑制とそれによるランゲルハンス島の破壊を著しく阻害し、ウイルス感染による糖尿病を格別に治療しうることを確認した（実施例１２）。肝炎ウイルスも著しく阻害しうることを確認した（実施例１３〜１６）。インフルエンザウイルス感染に対しても免疫細胞の浸潤なく、抗ウイルス効果及び抗炎症効果を確認し（実施例１７）、多様なウイルスに対して抗ウイルス効果があることを確認して（表１５）、汎用的な抗ウイルス剤として用いられることを確認した。また、マウスモデルにおけるウイルス感染時に炎症性サイトカインの分泌を抑制することを確認して（実施例１９）、様々な炎症性疾患の治療剤として用いられることを確認した。
本発明はまた一つの様態として、前記抗体または前記ペプチドの結合断片をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター前記ベクターが導入された細胞、前記細胞を用いた抗体または前記ペプチドの結合断片の生産方法及び前記生産方法により生産された抗体または前記ペプチドの結合断片を提供する。
前記抗体及び前記ペプチドの結合断片は前記で説明したとおりである。
本発明で抵抗する前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、特にこれに制限されないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞またはバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核または原核細胞で、前記ポリヌクレオチドを複製及び/または発現することができるベクターであってもよく、好ましくは宿主細胞で前記ヌクレオチドが発現されるように適切なプロモーターに作動可能に連結され、少なくとも一つの選別マーカーを含むベクターであってもよい。その例として、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、ウイルスまたはレトロウイルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態であってもよい。
前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、前記抗体の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ含む発現ベクターまたは重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドをすべて含む発現ベクターであってもよい。
本発明で提供する前記発現ベクターが導入された細胞（形質転換体）は、特にこれに制限されないが、前記発現ベクターが導入され形質転換された大腸菌、ストレプトマイセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞；酵母細胞；ピキア・パストリスなどの菌類細胞；ドロソフィラ（Drosophila）、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣細胞、chinese hamster ovary cells）、ＳＰ２/０（マウス骨髄腫）、人間リンパ芽球（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、メラノーマ細胞、ＨＴ-１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞、baby hamster kidneycells）、ＨＥＫ（ヒト胚腎臓細胞、human embryonic kidney cells）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞；または植物細胞であってもよい。
本発明で用語、「導入」は、前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に伝達する方法を意味する。このような導入は、リン酸カルシウム‐ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、ポリブレン媒介形質感染法、電気衝撃法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミン及び原形質体融合法などの当分野で公知された様々な方法により行われる。また、形質導入は感染（infection）を手段としてウイルス粒子を用いて、目的物を細胞内に伝達させることを意味する。また、遺伝子ボンバードメントなどによりベクターを宿主細胞内に導入することができる。本発明で導入は形質転換と混用して使用される。
本発明のもう一つの様態として、前記抗体または前記ペプチドの結合断片を含む抗ウイルス用組成物を提供する。
前記抗体及び前記ペプチドの結合断片は前記で説明したとおりである。
本発明で「抗ウイルス」は、病原性ウイルスの増殖または複製を抑制してウイルス感染を減少、抑制または予防する効果を意味するが、これに制限されない。前記抗ウイルス活性によりウイルスの増殖または複製が抑制される「病原性ウイルス」は、これに制限されないが、ウイルス感染により宿主細胞のビメンチンの一部が宿主細胞膜の外部に露出されることを特徴とする。この例としては、動物またはヒトで疾病起こすウイルスであって、病原性ウイルスの例としては、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）に属するウイルス、ピコルナウイルス科（Picorna viridae）に属するウイルス、レトロウイルス科（Retroviridae）に属するウイルス、ヘルペス（Herpes）属ウイルス、フィロウイルス科（Filoviridae）に属するウイルス、コロナウイルス科（Coronaviridae）に属するウイルス、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）に属するウイルス、フラビウイルス科（Flaviviridae）に属するウイルス、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）に属するウイルスなどを含んでもよい。病原性ウイルスは、例えば、インフルエンザウイルス、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス、脳心筋炎ウイルス、メンゴウイルス（Mengovirus）、エボラウイルス（Ebolavirus）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus；SARS）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus；MERS）、レオウイルス（Reovirus）、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）、ＨＣＭＶ（human cytomegalovirus）またはハンタンウイルス（Hantaan virus）であってもよいが、これに制限されない。特に、本発明によるｈｚＶＳＦはピコルナウイルス科（Picorna viridae）に属するメンゴウイルスだけでなく、ピコルナウイルス科に属するＥＭＣウイルスとは遺伝体構造とライフサイクルが全く異なるオルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）に属するインフルエンザウイルスでも抗ウイルス効果を示し、またレトロウイルス科（Retroviridae）に属するＨＩＶの増殖も効果的に阻害するなどの汎用的なウイルスに効果を示す（表１５）。
前記組成物は薬学的組成物、医薬部外品組成物、健康食品用組成物の形態であってもよい。
前記薬学的組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。
本発明で用語、「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体に適したものであり、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、及びこれらの成分の中１成分以上を混合して用いてもよく、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化してもよい。
前記薬学的組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってもよい。製剤化する場合は、通常に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、１つ以上の化合物の少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の他にステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルでなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの製剤を有してもよい。
前記本発明の組成物は薬学的に有効な量で投与する。
本発明で用語、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵/リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、疾患の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野でよく知られている要素に応じて決定することができる。本発明の組成物は、個別治療薬として投与するか、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは、順次にまたは同時に投与することができる。そして、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して副作用なく最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定することができる。前記の他の治療剤は、インターフェロンであってもよいが、これに制限されない。
前記組成物は、抗ウイルス作用によるウイルス感染性疾患の予防または治療を行う組成物であってもよい。
本発明でウイルス感染症は、これに限定されないが、前記ウイルス感染により宿主細胞のヒメンチンの一部が宿主細胞膜の外部に露出される疾患を含んでもよく、その例として、肝炎、エイズ、肺炎、糖尿病だけではなく、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）に属するウイルス、ピコルナウイルス科（Picorna viridae）に属するウイルス、レトロウイルス科（Retroviridae）に属するウイルス、フィロウイルス科（Filoviridae）に属するウイルス、コロナウイルス科（Coronaviridae）に属するウイルス、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）に属するウイルス、フラビウイルス科（Flaviviridae）に属するウイルス、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）に属するウイルス、ヘルペス（Herpes）属ウイルスにより感染されて発生されうるすべての疾患を含むことができる。
本発明において用語、「予防」とは、前記組成物の投与により疾患の発症を抑制したり、遅延させるすべての行為を意味し、前記「治療」とは、前記組成物の投与により疾患の症状が好転したり、有利に変更されるすべての行為を意味することができる。
前記組成物はウイルス感染細胞に特異的に作用する組成物であってもよい。
前記組成物は免疫細胞の浸潤を抑制するものであってもよく、炎症反応を抑制するものであってもよい（図４５〜４８）。本発明の組成物は、炎症誘発サイトカインであるＩＬ-６、ＴＮＦ-α、ＩＦＮ-γ、ＣＣＬ２（ＭＣＰ-１）を著しく抑制することを確認することができる（図４９）。
本発明はもう一つの様態として、前記抗ウイルス用組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、ウイルス感染疾患の治療方法であってもよい。
前記抗ウイルス用組成物及びウイルス感染疾患は前記で説明したとおりである。
前記ウイルス感染疾患を治療する方法は、抗体及び薬学的に許容可能な担体をさらに含む薬学的組成物をウイルス感染疾患が発症したり、発症の疑いがある個体に投与する段階を含む、ウイルス感染疾患を治療する方法であってもよく、前記薬学的に許容可能な担体は前記で説明したとおりである。前記ウイルス感染疾患を治療する方法は、好ましくは抗体を含む組成物をウイルス感染疾患にかかった個体に投与する段階を含む、ウイルス感染疾患を治療する方法であってもよい。
前記個体は、牛、豚、羊、鶏、犬、ヒトなどを含む哺乳動物、鳥類などを含み、本発明の前記組成物の投与によりウイルス感染疾患が治療される個体は、制限なく含む。
ここで前記組成物は、薬学的に有効な量で、単一または多重投与されてもよい。ここで、組成物は液剤、散剤、エアロゾル、カプセル剤、腸溶皮錠剤またはカプセル剤または坐剤の形態で投与してもよい。投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これに限定されない。しかし、経口投与時、ペプチドは消化されるため経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり、胃での分解から保護されるように剤形化されるべきである。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されてもよい。
本発明のまた一つの様態として、前記抗体または前記ペプチドの結合断片を含む炎症性疾患の予防または治療用組成物を提供する。
前記炎症性疾患の予防または治療用組成物は薬学的組成物、医薬部外品組成物、健康機能食品組成物の形態であってもよい。
前記炎症性疾患はウイルス感染によるものであってもよい。
本発明はもう一つの様態として、前記炎症性疾患の予防または治療用組成物を、これを必要とする個体に投与する段階を含む、炎症性疾患の治療方法を提供する。
本発明のもう一つの様態として、前記抗体または前記ペプチドの結合断片の抗ウイルス用途を提供する。
（実施例）
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例はただ本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものと解釈されることではない。
実施例１：新規なヒト化抗体であるＶＳＦの製造
実施例１−１：ｃｈＶＳＦ（chimeric VSF）の製造
マウスＶＳＦ（ｍＶＳＦ）の主要な機能的部分が単細胞群抗体であるものと仮定し、これと人間免疫グロブリンを遺伝子操作法で交雑（chimerization）してマウス/人間交雑抗体（ｃｈＡｂ）を製作した。
具体的に、交雑抗体を製作するために、マウスＶＳＦの軽鎖及び重鎖の不変領域（constant region）を人間免疫抗体（κ、γ２またはγ４）の不変領域で代替した。ｃｈＶＳＦはｐＣＡＧＧＳベクターを鋳型にして発現ベクターを製作した（図１）。ｍＶＳＦの可変重鎖（ｍＶＨ）（配列番号９）はＳａｃＩとＫｐｎＩ制限酵素部位を含みＰＣＲで増幅した。可変軽鎖（ｍＶＬ）（配列番号８）はＣｌａＩとＸｈｏＩ制限酵素部位を含みＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲに用いられたプライマーは表１に記載されたプライマーを利用し、ＰＣＲ条件は９４℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で４５秒で３５サイクルを行い、７２℃で１０分間進行した。
ヒトの重鎖（配列番号１１）はＫｐｎＩとＳｐｈＩ制限酵素部位を用い、軽鎖（配列番号１３）はＸｈｏＩとＢｇｌＩ制限酵素を用いてクローニングした。軽鎖と重鎖を同時に発現させるために、ＩＲＥＳ（(internal ribosome entry site）をＳｐｈＩとＣｌａＩ制限酵素部位を用いて軽鎖と重鎖の間にクローニングした。選別マーカーはＳａｌＩ制限酵素部位に挿入した。このような方式で図２の模式図に開示されたようにｃｈＶＳＦを製造した。
実施例１−２：２つベクターの発現システムを用いたｃｈＶＳＦの発現
１ｍｇ/ｍｌのＰＥＩ（Polyethyleneimine）を用いて１５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＧＦＰをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションの程度及び発現水準を確認した。同様の方法で前記実施例１-１のｃｈＶＳＦをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後、６時間後に培地を２％ＦＢＳを含む培地に交替した。３日ごとに細胞培養液を集めて０．４５μｍのフィルターを利用し、不純物を除去した。タンパク質Ａセファロースビーズ（nプロテインＡ sepharose bead）を用いてｃｈＶＳＦを精製した。ｃｈＶＳＦは０．２Ｍ グリシン/塩酸バッファー（Glycine/HCl）（ｐＨ２．５）で溶出し、中和バッファーとしては１Ｍトリス‐Ｃｌ（Tris-Cl）バッファー（ｐＨ９．０）を使用した。具体的に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）をレジン体積の１０倍に使用してレジンが均質化されるようにした後、ＶＳＦ培養液をカラムに通過させた。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）をカラム体積の５倍以上を流して洗浄した。溶出は０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ/ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．５）をレジン体積の５倍に流し、中和バッファーを予めて入れておいたチューブに精製されたＶＳＦを収得した。その後に精製されたＶＳＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
その結果、図３で示したように、ｃｈＶＳＦは免疫グロブリンの特性を有する５０ｋＤａの重鎖と２５ｋＤａの軽鎖からなる構造であることを確認した。
実施例２：ｓｃＦｖ（single-chain variable fragment）の製造及び抗ウイルス効果の確認
ＶＳＦの可変領域を用いてｓｃＦｖを製造した。ｓｃＦｖは配列番号１５０のＤＮＡ配列を有し、前記ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターであるｐＥＴ-２２ｂ（＋）にクローニングしてｓｃＦｖを製造した（図４及び図５）。
具体的に、ｍＶＳＦのＶＨとＶＬをリンカーで連結してｓｃＦｖを製作し、バクテリア発現ベクターであるｐＥＴ２２ｂ（＋）に挿入した後、ＩＰＴＧを添加して発現を誘導した後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを用いて精製した（図６）。
その後、前記精製されたｓｃＦｖを用いて抗ウイルス能を確認した。具体的にＥＭＣ−Ｄウイルスを感染させたＬ９２９細胞をｓｃＦｖ、ＶＳＦまたは抗ＥＭＣＤウイルス抗体と共に３７℃で３０時間培養した。その後、上清液を除去してＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した後、ＯＤ４５０で測定した。その結果ＶＳＦ（５〜５００ｎｇ）、ｓｃＦｖ（５〜１０μｇ）及び抗ＥＭＣＤウイルス抗原（１：２０希釈）を処理した群すべてで抗ウイルス効果があることを確認した（図７）。
実施例３：ｃｈＶＳＦの抗ウイルス能の確認
前記実施例１で製造したｃｈＶＳＦの抗ウイルス能を確認するためにＭＶＩＴ分析を実施した。
具体的に、２％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）が入っているＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培地を利用して２Ｘ１０４の数で９６ウェルプレートに敷かれているネズミの星状細胞であるＬ９２９に１００ｐｆｕのＥＭＣ−Ｄウイルスを１時間感染させた後、４μｇ/ｍｌのＶＳＦを２倍ずつ希釈して処理した。４８時間後、１０％のホルマリンで１０分間細胞を固定させた後、１％のクリスタルバイオレットで１０分間染色させた。染色された細胞をＰＢＳを洗浄した後、細胞の生存能を染色程度で評価した。ウイルスの増殖が抑制されたら、すべての細胞が生きて均等な層をなし、クリスタルバイオレット染色も均一な層で染色される。逆に細胞がウイルス感染により溶解されると細胞が外れて染色層がほぼ存在しない。
その結果、図８で示したように、本発明のｃｈＶＳＦはＥＭＣ−Ｄウイルスに対する抗ウイルス効能を示した。このような結果は、既存のマウスＶＳＦだけでなく、マウスＶＳＦを単細胞群抗体と仮定してこれを人間免疫抗体の不変領域と交雑した本願発明のｃｈＶＳＦも抗ウイルス用途に使用されうることを支持するものである。
実施例４：ヒト化抗体であるＶＳＦの製造
前記実施例１及び３を基にｃｈＶＳＦを用いてヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ（Humanized VSF）を製造した。
真核細胞を用いて２種類の組換えタンパク質を発現させようとするとき、使用する発現システム中の一つである２つ遺伝子発現ベクター（two gene expression vector）に該当するｐｄＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ｖｅｃｔｏｒ（図９）を利用した。前記ベクターは２種類の遺伝子を一つのベクター内で互いに異なるトランスクリプションユニットで構成してそれぞれ自体のプロモーターとポリＡシグナル（polyA signal）を用いて発現するもので、強力な哺乳類発現プロモーターであるＣＭＶ（cytomegalovirus）プロモーターを用いるベクターシステムである。これを利用して図１０の模式図のようなｈｚＶＳＦを製造した。
ここで、前記ｈｚＶＳＦの重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１０で、重鎖領域を配列番号１１で、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号１２で、軽鎖領域を配列番号１３で表した。
１ｍｇ/ｍｌのＰＥＩ（Polyethyleneimine）を用いて１５μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＧＦＰをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションして、トランスフェクションの程度及び発現水準を確認した。同様の方法で前記ｃｈＶＳＦ及びｈｚＶＳＦをＨＥＫ ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした後、６時間後に培地を２％ＦＢＳを含む培地に交替した。３日ごとに細胞培養液を集めて０．４５μｍのフィルターを利用し、不純物を除去した。タンパク質Ａセファロースビーズ（nプロテインＡ sepharose bead）を用いてｃｈＶＳＦ及びｈｚＶＳＦを精製した。ｃｈＶＳＦ及びｈｚＶＳＦは０．２Ｍ グリシン/塩酸バッファー（Glycine/HCl）（ｐＨ２．５）で溶出し、中和バッファーとしては１Ｍ トリス‐Ｃｌ（Tris-Cl）バッファー（ｐＨ９．０）を使用した。具体的に、１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）をレジン体積の１０倍に使用してレジンが均質化されるようにした後、ＶＳＦ培養液をカラムに通過させた。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ８．０）をカラム体積の５倍以上を流して洗浄した。溶出は０．２Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ/ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．５）をレジン体積の５倍に流し、中和バッファーを予め入れておいたチューブに精製されたＶＳＦを収得した。その後に精製されたＶＳＦをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、活性はＭＶＩＴアッセイを通じて確認した。
実験で使用されたＶＳＦを表示すると、次の表２のとおりである。
その結果、図１１で確認したように、ｃｈＶＳＦ２及びｃｈＶＳＦ４、ｈｚＶＳＦ２及びｈｚＶＳＦ４は免疫グロブリンの特性を有する５０ｋＤａの重鎖と２５ｋＤａの軽鎖からなることを確認した。
また、図１２で確認したように、ｈｚＶＳＦも抗ウイルス効果があることを確認した。このような結果は、ヒト化抗体であるｈｚＶＳＦもＶＳＦと同様に抗ウイルス効果かあることを示唆する。
実施例５：ヒト化抗体であるＶＳＦの物性確認
前記実施例４で製造したｈｚＶＳＦの物性を次のように確認した。
実施例５-１：基本的な分子量パターン及び純度の確認
還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用して分子量のパターン及び純度を確認した。具体的に、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量に応じてクマシー染色法（Coomassie Staining）で染色してｈｚＶＳＦ_ｖ１３の分子量及び純度を確認した。
その結果、図１３で示したように、１レーンは非還元ゲルであって、ＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）で予想される位置に主要バンドが観察されて、２レーンは還元ゲルであって、ＩｇＧ抗体の重鎖（約５０ｋＤａ）と軽鎖（約２５ｋＤａ）で該当する位置にバンドが観察され、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３が一般的なＩｇＧ抗体パターンを示すことが確認された。
実施例５-２：分子量、糖パターン及びサイズ変異などの確認
ｈｚＶＳＦ_ｖ１３の分子量、糖パターン、サイズ変異などを確認するために液体クロマトグラフィー/質量分析（Liquid Chroｍatography/Mass Spectrometry）を行った。少量のｈｚＶＳＦ_ｖ１３をＨＰＬＣに注入してピークを観察した。
その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３は免疫グロブリンＧ（IgＧ）の特性を示すことを確認した（図１４）。Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓでは全体分子量（約１４０ｋＤａ）が観察されて、Ｇ０/Ｇ０、Ｇ０Ｆ/Ｇ１、Ｇ１/Ｇ１など一般的な糖化されたＩｇＧに該当するピークのパターンが観察された。また、糖除去後の重鎖（約４９ｋＤａ）及び軽鎖（約２３ｋＤａ）が観察された。ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理で糖鎖が除去された重鎖とＰＮＧａｓｅ Ｆを処理しない重鎖の分子量を総合するとき、一般的なＩｇＧのグリカンパターンを確認した（Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ）。
実施例５-３：純度及び凝集度の確認
ｈｚＶＳＦ_ｖ１３の純度と凝集度を確認するためにＳＥＣ−ＨＰＬＣを利用した。
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ条件は次のようである。
‐ＨＰＬＣシステム： Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００
‐カラム： Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷｘｌ
‐移動相：リン酸バッファー、０．５ｍｌ/分
‐注入量：１０μｌ
その結果、典型的なＩｇＧ抗体の単量体に該当する位置（渋滞時間約１６分）で９２．４４％の主要ピークが観察されて、二量体位置（渋滞時間約１３分）で約６．８４％のピークが観察された（図１５）。
実施例５−４：ｐＩ及び電荷不均一性（charge heterogeneity）の確認
ｈｚＶＳＦ_ｖ１３の等電荷点を調べるために、ｐＨ３からｐＨ１０まで勾配を示すゲルでランニングした。
その結果、図１６で示したように、ｈｚＶＳ_ｖ１３ＦのｐＩは７．７と分析され、主要バンドの他、酸性及び塩基性アイソフォーム（acidic/basic isoform）も観察された。これはＩｇＧ抗体で一般的に観察される異性体[isomer（例えば、Ｃ末端領域の脱アミノ化）]に該当される。
前記のような結果は、本発明のヒト化抗体であるｈｚＶＳＦ_ｖ１３がＩｇＧ抗体と同様な物性を示すことを裏付けるものである。
実施例６：ウイルス抑制効能は維持または増加されながら免疫原性が減少されたヒト化抗体であるｈｚＶＳＦの変異体製造
実施例６−１：ｈｚＶＳＦ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅの製造
前記実施例４で製造したｈｚＶＳＦを基に、３つのａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅを製造した。各ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅの活性は野生型の活性と同様または減少した（０．５≦≦１Ｕ<１ｍｇ/ｍｌ）（表３及び表４）。それぞれのａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅのＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を表３に、それぞれの変異体のＦＲ１〜ＦＲ４のアミノ酸配列を表４に記載した。
実施例６-２：ｈｚＶＳＦ変異体の製造
前記実施例４で製造したｈｚＶＳＦを基に、実際生体内で活用するための免疫原性の減少及び親和性成熟（affinity maturation）を介したｈｚＶＳＦ変異体を製造した。その結果、１３個の変異体を製造した（表５及び表６）。それぞれの変異体のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配列を表５に、それぞれの変異体のＦＲ１〜ＦＲ４のアミノ酸配列を表６に記載した。
前記で製造した１３個の変異体はすべて抗ウイルス能及び抗炎症能が維持または増加され、野生型に比べて免疫原性が減少されたことを確認した。
前記変異体の中で免疫原性が最も低いｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２はｈｚＶＳＦ野生型と同様に1ｕｎｉｔが５００ｎｇで抗ウイルス活性を示し、抗ウイルス能が高く、免疫原性が相対的に低いｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の場合は、２５０ｎｇ/ｕｎｉｔの抗ウイルス活性を示した。
実施例６-３：ｈｚＶＳＦ野生型及びその変異体のエピトープ数（epitope count）の確認
ｈｚＶＳＦ野生型とその免疫原性を減少させた前記変異体の中で、代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のエピトープ数は、現在抗体医薬品として製薬市場でブロックバスター医薬品である４種のエピトープ数を比較した結果、表７で示したように、各ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩで相対的に免疫原性可能性を確認することができた。
前記表７で総合の値が高いほど世界全体人口でＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩによる副作用の可能性が高いことを意味する。前記結果を通じて免疫原性が減少された本発明のｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のエピトープ数が全世界的に市販されている４種の医薬品中に免疫原性が最も低いＨｕｍｉｒａと同様であることを確認し、このような結果は、本発明のヒト化抗体が抗ウイルス剤として用いられる時起こりうる重大な副作用が極めて低いことを示唆するものであって、安全な抗ウイルスまたは炎症用医薬品としての安定性を裏付けることである。
また、各変異体の活性はｖａｒ１からｖａｒ１２までは野生型と同様な活性（０．５ｍｇ/Ｕ）を示し、ｖａｒ１３は野生型より高い活性を示した。
実施例６-４：ｈｚＶＳＦ変異体のＴ細胞分析確認
ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の免疫原性を評価するために５１名の健康なドナーの血液を用いて、ロンザ（Lonza）のインビトロＴ細胞分析により、本物質がＴ細胞の増殖に影響を与えるかどうかを確認した。各ドナーの全体末梢血単核球（Peripheral Blood Mononuclear Cell; PBMC）にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３またはＫＬＨ（Keyhole limpet hemocyanin）を処理した後、７日間培養した。ＫＬＨは酸素を運搬する機能をするメタロタンパク質（metalloprotein）であって、抗体生産時にキャリアタンパク質として用いられ、効果的に免疫反応を起こすため陽性対照群として使用した。その後、ＣＤ３+ＣＤ４+Ｅｄｕ+で染色されるＴ細胞の割合（％）を測定した。その結果、ＫＬＨは４５名の血液ドナーからＴ細胞の増殖が起こり、８８％が反応したが、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２またはｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３に反応してＴ細胞の増殖を誘導した個体は、それぞれ３個体で、５．８％のみ本物質に反応した（図１７）。
一方、対照群として７日間培養したＰＢＭＣを用いてＫＬＨ、ｈｚＶＳＦ_ｖ１２またはｈｚＶＳＦ_ｖ１３によって誘導されたＴ細胞増殖の刺激指数（stimulation index; SI）を計算した。ＳＩ値が２より大きい場合、人に適用したときに免疫原性が大きいと予想され、ＳＩ値が０．５より小さい場合はむしろＴ細胞の増殖を抑制することが予想される。その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖ１３は１．１２及び１．０３の低い値のＳＩ値であって、ほとんどの個体で０．６以上２以下のＳＩ値を示すことを確認した。反面、陽性対照群として用いられたＫＬＨは３．９１の高いＳＩ値を示した（図１８、図１９及び表８）。
このような結果により、ｈｚＶＳＦ_ｖ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖ１３は実際にウイルス疾患にかかった患者に投与時、免疫原性が低いと予想され、それによる副作用が低いと予想される。
実施例７：ｈｚＶＳＦ及びその変異体の結合エピトープの確認
前記実施例で製造したｈｚＶＳＦ及びその変異体が結合するペプチドを同定しようとした。
その結果、ビメンチン（vimentin）のアミノ酸１４２番〜２９４番の分離された配列番号１のペプチドに結合することを確認した（図５４〜図５８）。
実施例８：ｈｚＶＳＦ変異体の物性及び薬物動態学の確認
前記実施例６で製造したｈｚＶＳＦ変異体の物性及び薬物動態学を確認するために、代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を対象に実験を行った。
実施例８-１：ｈｚＶＳＦ変異体の分子量パターン及び純度の確認
ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の分子量パターンと純度を確認するためにＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いた。還元されたサンプルは、ＮｕＰａｇｅ４Ｘ ＬＤＳサンプルバッファー（Invitrogen社、NP0007）とＮｕＰａｇｅ１０Ｘサンプル還元剤（Invitrogen社、NP0009）をｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３と混合した後、７０℃で１０分間加熱して準備した。非還元サンプルは、還元剤添加及び加熱処理を省略して準備した。それぞれ１０μｌの１ｍｇ/ｍｌの対照群抗体、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を４〜１２％のＳＤＳ-ＰＡＧＥで電気泳動した後、ゲルをＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（TripleRed、ISB01L）で染色し、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の純度を確認した。
その結果、図２０で示したように、非還元サンプルのレーン２及び４では、ＩｇＧ抗体（約１５０ｋＤａ）で予想される位置で主要バンドが観察され、還元サンプルであるレーン３及び５は、ＩｇＧ抗体の重鎖（約５０ｋＤａ）と軽鎖（約２５ｋＤａ）において該当する位置にバンドが観察されることで、ｈｚＶＳＦの変異体もｈｚＶＳＦのように、一般的なＩｇＧ抗体パターンを示すことが確認された。また、対照群としてＩｇＧ４を使用したとき、非還元サンプルのレーン６及び還元サンプルであるレーン７で確認されるパターンと同一であった。また、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３すべてが良い純度を示すことが確認できた。
また、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の純度と凝集度を確認するために、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３をＺｏｒｂａｘ ＧＦ-２５０μｍ ９．２ｍｍ ＩＤ Ｘ２５ｃｍカラム（Agilent）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズのＨＰＬＣ（High-performance liquid chromatography）を利用して、ＳＥ（Size Exclusion）-ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣに注入する前に、１ｍｇ/ｍｌ濃度のサンプルを０．２μｍフィルターでろ過して不純物を除去した。それぞれ１００μｌのサンプルを注入して、１５分間１ｍｌ/分にＨＰＬＣを作動した。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。
その結果、典型的なＩｇＧ抗体の単量体に対応する位置（渋滞時間約８．６５分）で主要ピークを確認し、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の純度が９５％以上であることを確認した（図２１）。二量体の位置（渋滞時間約７．８９-７．９３分）から約３．７２％と４．４３％のピークが観察され、ＳＤＳ-ＰＡＧＥの結果と同様にＩｇＧ抗体と同様の形態を示すことが確認できた。
実施例８-２：ｈｚＶＳＦ変異体の 薬物動態学（pharmacokinetics）分析
マウスにｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３投薬後の薬物の生体内移行、すなわち血中濃度、消失半減期、代謝速度などを定量的に予測することにより、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の体内適正投与量、投与間隔及び投与剤形を決定することにより、臨床試験時の参考にする客観的指標を得ようと、次の実験を行った。
対照群には、６．２５μｇ（０．３１ｍｇ/ｋｇ）のヒト免疫グロブリンＧ（Human IgG、polyclonal）を、実験群では６．２５μｇ（２５Ｕ；０．３１ｍｇ/ｋｇ）、６２．５μｇ（２５０Ｕ；３．１０ｍｇ/ｋｇ）、と６２５μｇ（２５００Ｕ；３１．０ｍｇ/ｋｇ）のｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３をマウスの尾静脈に注入した。注入後、１、２、４、８、１４、２１、２８、３５日にマウスから採血した後、血清（serum）を分離した後ＥＬＩＳＡ法を用いて、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の血中濃度を測定した。
ＥＬＩＳＡは、プレート上にヒトのガンマ特異免疫グロブリン（anti-human IgG（γ specific））で３７℃で２時間、または４℃で一晩培養して固定させた後、３％ ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）でコーティングされていない部分を遮断するために３７℃で２時間インキュベーションした。マウスから採血した血清を３７℃で１時間反応させた後、ＨＲＰ（Hoseradish peroxidase）がついているヒトのカッパ特異免疫グロブリン（anti-human IgG（κ specific））で３７℃で３０分間反応させた。基質としてＴＭＢ溶液を用いて暗室で室温で９分３０秒間培養した後、４５０ｎｍの波長でＯＤ値を測定し、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の血中量を測定した。マウスに投与したｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の各濃度別に単回投与したときのＰＫパラメータを表９及び図２２のグラフに示した。
その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の２５Ｕ容量で単一投与した場合には、同一容量を投与したＳｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＩｇＧ）と比較して血中濃度の推移が同様に減少した。最高濃度（Ｃｍａｘ）及び血中時間濃度の曲線下面積（area under theconcentration curve; AUC）は、投与量が増加するにつれて上昇し、容量に比例することを確認できた。ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の２５Ｕの生体内半減期（ｔ１/２）は、雄１０日、雌１３日であって、ｓｈａｍ ｃｏｎｔｒｏｌ（雄１６日、雌２０日）に比べてやや低く現れ、投与量が増加するにつれて生体半減期はやや減少する傾向があることを確認した。雄に比べて雌におけるＣｍａｘ、ＡＵＣ、生体内半減期（ｔ１/２）、生体内全身クリアランス値（ＣＬｔ）が各投与濃度ですべて高かった。投与３５日後、すべてのマウスは剖検を実施して、長期重量測定、組織病理検査、免疫毒性実験、中和能実験を行い、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３が体内に及ぼす毒性有無を調査し、なんの副作用も発見されなかった。
前記のような結果は、本発明のｈｚＶＳＦ及びその変異体などが生体内の半減期が異なるヒト化抗体と類似しており、臨床的利用に問題がないことを裏付けることである。
実施例９：ｈｚＶＳＦ及び変異体のウイルス抑制能の確認
マウス細胞であるＬ９２９細胞にＥＭＣ-Ｄウイルスを感染させ、ｈｚＶＳＦ野生型及びｈｚＶＳＦ変異体の代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２及びｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を処理して、実施例２のＭＶＩＴ法によりウイルス抑制能を確認した。
その結果、図２３で示したように、ｈｚＶＳＦ野生型は０．５μｇ/ｍｌの濃度で１００％抗ウイルス効果を示し、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１２は０．２μｇ/ｍｌ、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３は０．１μｇ/ｍｌの濃度で１００％の抗ウイルス効果を示すことを確認した。
これにより、Ｌ９２９細胞にＥＭＣ-Ｄウイルスを感染させ、同時にＶＳＦを処理したとき、１００％の抗ウイルス効果を示すＶＳＦのｍｌに含まれている最小量を生物学的活性（biological activity）１ｕｎｉｔとした。
それで各ＶＳＦの生物学的活性を表１０に示した。
前記のような結果は、人間単細胞群抗体化、免疫原性の減少及び親和性成熟（affinity maturation）を行って、新たに製造したｈｚＶＳＦ変異体もｍＶＳＦより力価が落ちるが、ｈｚＶＳＦ_ｗｔよりは優れた効果で副作用がほとんどなく、抗ウイルス効果及び抗炎症効果を示すことができあることを示唆する。
実施例１０：ｈｚＶＳＦの親和力確認
ｈｚＶＳＦの受容体に対する親和性（Affinity）は、次のような方法で測定した。
Ｌ９２９細胞を６ｘ１０５でプレーティングした後、２ ＭＯＩのＥＭＣ-Ｄウイルスを０、２、６、１０時間、感染させた。 ４ｕｎｉｔのリガンド（ｍＶＳＦ、ｈｚＶＳＦ_ｗｔ及びｈｚＶＳＦ ｖ１３）を添加した後、１時間培養してから培養液を集めてＫａ値を求めた。添加したリガンドの量と反応後に回収されたリガンドとの量の間の差が受容体と結合した量であり、これにより親和度Ｋａ（affinity Ka）及び解離定数Ｋｄ（dissociation constant）を求めた（表１１）。
その結果、バイオ製剤の候補物質に相当するＫａ値（１ｘ１０９）以上を示すことを確認して、バイオ製剤としてｈｚＶＳＦ及びその変異体もまた、受容体に対する結合力が高いことを確認した。
実施例１１：人間細胞におけるｈＩＦＮ−α及びｈｚＶＳＦ_ｗｔの抗細胞作用の確認
ヒトの繊維母細胞であるＷＩ-３８細胞にＥＭＣ-Ｄを感染させた後、異なる濃度のヒトのインターフェロンとｈｚＶＳＦ_ｗｔを処理して、それぞれの抗ウイルス能と細胞生存力をＭＴＳ方法で測定した。
詳細は、細胞を９６ウェルプレートに入れた後、２４時間底につくように培養した。１００ｐｆｕのＥＭＣ-Ｄウイルスを感染させた後、インターフェロンまたはｈｚＶＳＦを処理した。４８時間を培養した後、ＭＴＳ[３-（４,５-ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ-２-ｙｌ）-５-（３-ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）-２-（４-ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）-２Ｈ-ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ]を処理した。再び２〜３時間を培養した後、４９０ ｎｍで吸光度を測定し、細胞の生存力を確認した。図２４で見られるように、ヒトのインターフェロンを処理した細胞では、ｈｚＶＳＦ_ｗｔ処理細胞に比べて少ない量でも９０％程度の生存率を示すが、むしろ４ｎＭ以上の高濃度を処理すると細胞毒性を示すことを確認した。一方、ｈｚＶＳＦ_ｗｔは約４ｎＭから１００％の生存率を示し、４ｎＭ以上の濃度でも細胞毒性を示さなかった。
前記結果から、ｈｚＶＳＦはインターフェロンとは異なり、副作用が少ないことが予測できる。
実施例１２：ウイルス性糖尿病におけるｈｚＶＳＦ_ｗｔの炎症細胞の浸潤抑制及び抗炎症の確認
マウスにおけるｈｚＶＳＦ薬物濃度別の糖尿病に対する効能を調査するために、５週齢の雄ＤＢＡ/２Ｎマウスに１００ｐｆｕのＥＭＣ-Ｄウイルスを腹腔注射で感染させた。この後、２、４、１６ｕｎｉｔのｈｚＶＳＦ_ｗｔを尾静脈に注射した後、３日目から血糖と尿中糖の程度を調査した。また、感染後３日目と７日目のマウスを犠牲にして膵臓を摘出し組織学的調査を実施した。
その結果、図２５で示したように、マウスにＥＭＣ-Ｄウイルスを感染させた後、膵臓を摘出してＨｅｍａｔｏｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ染色した場合、ウイルスのみ感染させた群（virus control）では炎症細胞が浸潤されたか、ｉｓｌｅｔが破壊され、サイズが小さくなった。一方、ｈｚＶＳＦ_ｗｔを４ｕｎｉｔ以上投与した群（virus+ hzVSF）では炎症細胞の浸潤が見えず、ｉｓｌｅｔも正常であった。したがってｈｚＶＳＦ_ｗｔがＥＭＣ-Ｄの増殖を抑制し、炎症細胞の浸潤を防いでｉｓｌｅｔが破壊されないと考えられる。
また、血糖を検出した結果、ｈｚＶＳＦ_ｗｔを４ｕｎｉｔ以上投与した群では、糖尿病が発症しなかったし、血糖水準は２００ｍｇ/ｄＬ未満であって、正常のマウスの範囲に該当された。尿でも８ｕｎｉｔ以上投与した群では、尿糖（urine glucose）が全く検出されなかった（表１２〜表１４）。
ウイルス糖尿病におけるｈｚＶＳＦ_ｗｔ薬物濃度別の糖尿病の発症率を表１２に、ｈｚＶＳＦ_ｗｔ薬物濃度別の血液内のグルコースレベルを表１３に、ｈｚＶＳＦ_ｗｔ薬物濃度別の尿糖レベルを表１４に示した。
前記の結果は、本発明のｈｚＶＳＦ及びその様々な変異体は、マウスにおいてＥＭＣ-Ｄウイルス感染に対する抗ウイルス効能及び免疫細胞の浸潤抑制とそれによるランゲルハンス島（islet）の破壊を著しく阻害し、ウイルスの感染により誘発される糖尿病を著しく治療できることがわかった。すなわち、免疫細胞の浸潤を誘導せずに抗ウイルス効果を示すだけでなく、ウイルス性糖尿病に対する治療可能性のために、様々な炎症性疾患の治療剤として使用できることを示唆するものである。
実施例１３：ｍＶＳＦの抗ＨＢＶ効果の確認
ｍＶＳＦのヒトＢ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus; ＨＢＶ）に対する抗ウイルス効果を確認するために、ＨＢＶを発現するヒトの肝がん細胞であるＨｅｐＧ２．２．１５細胞を用いた。
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞をプレートに貼り付けた後、ｍＶＳＦを処理して、３日ごとに細胞から培養液に増殖されて出てくるＨＢＶの表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の量をＥＬＩＳＡで定量した。これを細胞当りのウイルス量で換算した。これと同時に、細胞の数を数えて、相対的な細胞当たりのウイルスの量を測定した。
その結果、ｍＶＳＦの処理はＨＢｓＡｇの量を明確に減少させ、これらの結果でｍＶＳＦが抗ＨＢＶ効果があることがわかった（図２６）。このような結果は、本発明のｈｚＶＳＦ及びその変異体がＨＢＶウイルスのような肝炎ウイルスも効果的に抑制することで様々なウイルスに対する抗ウイルス効果を示すことを裏付けるものであり、また、９日間ｍＶＳＦを処理した場合、ウイルスが細胞当たり８０％以上減少して、実際のヒトでは、さらに炎症を抑制するため、臨床症状の治療に特に効果があることを示唆する。
実施例１４：ウイルス感染細胞におけるＶＳＦ受容体の発現様相の確認
まず、ウイルス感染細胞におけるＶＳＦ受容体が発現されるかを確認するために、Ｂ型肝炎にかかった患者の肝臓組織（Ｂ型肝炎により肝がんに進行されたが、がんがない部分）とＣ型肝炎にかかった患者の肝臓組織（Ｃ型肝炎により肝がんに進行されたが、がんがない部分）をｍＶＳＦ抗体で染色した。対照群では、ウイルスに感染していない肝組織（がんがない部分）を使用した。その結果、ＨＢＶとＨＣＶが感染した患者から得られた肝組織では、ＶＳＦ受容体が発現されたが、対照組織では発現されなかったし、これはウィルス感染特異的にＶＳＦの受容体が発現されることを意味する。このような結果は、他の患者から由来した肝組織で繰り返し実験を行った場合も、同様な様相を示した（図２７及び図２８）。
次に、ウイルス感染に伴うＶＳＦ受容体の発現時期を確認するために、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスをＭＤＣＫ細胞株に感染させた後、ウイルス複製とＶＳＦ受容体の発現を蛍光染色を用いて観察した。その結果、インフルエンザウイルス感染後の時間につれてウイルスの複製が起こり、これにより、ＶＳＦ受容体の発現も増加することが確認できた（図２９）。これらの結果でＶＳＦ受容体は、ウイルス感染によって誘導されることが分かった。
また、ヒトのＷＩ-３８線維芽細胞にＥＭＣ-Ｄウイルスを感染させた後、ＶＳＦ受容体の発現とＶＳＦの抗ウイルス効果を確認した（図３０）。図３０の左側は、ＥＭＣ-Ｄ感染によるＶＳＦ受容体の発現を確認したものであり、右側はｈｚＶＳＦ_ｗｔ処理による抗ＥＭＣ-Ｄ効果及びＶＳＦ受容体の発現を示したものである。前記結果を通じてＶＳＦがＥＭＣ-Ｄウイルス感染に対しても抗ウイルス効果及び感染特異的に受容体を発現させることが確認できた。
結論的に、ウイルスが感染した細胞は細胞によって時間の差はあるがＶＳＦ受容体を発現し、ＶＳＦの処理は受容体の発現には影響を及ぼさないが抗ウイルス効果を示すことがわかった。
実施例１５：Ｂ型肝炎ウイルスに対するｈｚＶＳＦの抗ウイルス効果の確認
ヒトＢ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus; ＨＢＶ）に対するｈｚＶＳＦの効能を調査するために、代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３で次のような実験を行った。
実施例１５-１：ｃｃｃＤＮＡ（covalently closed circular DNA）分析
ＨＢＶが感染したＨｅｐＧ２．２．１５細胞株にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３及びＨＢＶ薬物（lamivudine；Lami）を各用量に応じて処理して、一週間ごとに細胞数をカウントし、同じ量の細胞を収得した。
前記細胞からＨＢＶのｃｃｃＤＮＡを得るために、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を回収した後、溶解緩衝液（２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ；ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ/ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）で細胞を再懸濁した後、５５℃で１時間反応させた。ＭＥＧＡ ｑｕｉｃｋ-ｓｐｉｎ ｔｏｔａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡ精製キット（intron）で全体ＨＢＶ ＤＮＡを精製した後、ｐｌａｓｍｉｄ-ｓａｆｅ ＡＴＰ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮａｓｅで３７℃で1時間反応させて、７０℃で３０分間酵素を不活性させた。その次にＨＢＶ ｒｃＤＮＡ（relaxed circular DNA）を除去し、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡのみを収得した。以後Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ２ｘ ｇｒｅｅｎｓｔａｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （Bioneer）を用いてｑＰＣＲでＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの定量分析を行った。
ＰＣＲプライマーはｆｏｒｗａｒｄ ５’-ＴＧＡＡＴＣＣＹＧＣＧＧＡＣＧＡＣＣ-３’ (配列番号１５３)、ｒｅｖｅｒｓｅ ５’-ＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＡＣＡＧ-３’ (配列番号１５４)(ヌクレオチド１８６２-１８８１)(Ｙ＝Ｃ/Ｔ)を使用した。
その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を処理した場合、ＨＢＶ感染細胞のｃｃｃＤＮＡ含量は濃度依存的に減少したことが確認され、特に１０μｇ/ｍｌを処理した場合はｃｃｃＤＮＡ含量がほとんどないことが確認された（図３１）。
それで、ｈｚＶＳＦの投与は細胞内のｃｃｃＤＮＡの量を著しく減少させるため、ＨＢＶ治療剤として優れた効果があることが分かった。
実施例１５-２：ＨＢＶ ＤＮＡ抑制の確認
次に、ＨＢＶが感染したＨｅｐＧ２．２．１５細胞株にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３とＨＢＶ薬物（lamivudine；Lami）を各用量に応じて処理して、一週間ごとに細胞数をカウントし、同じ量の細胞を収得した。
細胞内（Intracellular）ＨＢＶ ＤＮＡの場合は、次のように収得した。前記収得したＨｅｐＧ２．２．１５細胞を溶解緩衝液（２５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ；ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ/ｍｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）で再懸濁させた。以後、５５℃で１時間反応させた。その次にＭＥＧＡ ｑｕｉｃｋ-ｓｐｉｎ ｔｏｔａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡ精製キット（intron）に細胞内ＨＢＶ ＤＮＡを得た。細胞外（Extracellular）ＨＢＶ ＤＮＡの場合、細胞を培養した培養液の一定量に溶解緩衝液を処理して抽出した。以後Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ２ｘ ｇｒｅｅｎｓｔａｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （bioneer）を用いてｑＰＣＲでＨＢＶ全体ＤＮＡの定量分析を行った。
ＰＣＲプライマーはｆｏｒｗａｒｄ ５’-ＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴ-３’（配列番号１５５）、ｒｅｖｅｒｓｅ ５’-ＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＣＡＧＴＧ-３’（配列番号１５６）を使用した。
その結果、細胞外ＨＢＶ ＤＮＡの場合、非常に低濃度（０．１μｇ/ｍｌ）のｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を処理した場合も、対照群であるＬａｍｉ処理群に比べてＨＢＶ ＤＮＡ量を大幅に減少させた（図３２）。細胞内ＨＢＶ ＤＮＡの場合、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の濃度依存的にＨＢＶ ＤＮＡを抑制することが確認され、対照群であるＬａｍｉ処理群に比べて著しく優れた効果を示すことが確認された（図３３）。
結論として、ｈｚＶＳＦの投与は、細胞内及び細胞外のＨＢＶ ＤＮＡの量を著しく減少させるので、ＨＢＶの治療剤として優れた効果を有することが分かった。
実施例１６：Ｃ型肝炎ウイルスに対するｈｚＶＳＦの抗ウイルス効果の確認
実施例１６-１：Ｃ型肝炎ウイルスのｈｚＶＳＦ_ｗｔの抗ウイルス効果を確認
ヒトＣ型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus；HCV）に対するｈｚＶＳＦ_ｗｔの効能を調査するために、次のような実験を行った。
Ｃ型肝炎ウイルスＪＦＨ-１ウイルス株（strain）を０．１ ＭＯＩ（multiplicity ofinfection）でヒト肝細胞であるＨｕｈ７．５細胞に感染させた後、３日目、３ｎｇ/ｍｌのインターフェロンβと５００、１０００、２０００ ｕｎｉｔのｈｚＶＳＦ_ｗｔを処理した後、４日目の細胞培養液と細胞を収集した。細胞はＦＡＣＳでＨＣＶ ＮＳ５Ａを抗ＨＣＶ ＮＳ５Ａ抗体染色を用いて測定し、細胞培養液はリアルタイム定量ＰＣＲ（real-timequantitative ＰＣＲ）を利用してＨＣＶ ＲＮＡ力価（titer）を測定した。
その結果、１０００ Ｕ/ｍｌの処理は、ＦＡＣＳでインターフェロン-βと同様に抗-ＨＣＶ効果を示した（図３４）。また、リアルタイム定量ＰＣＲでウイルス力価を測定した結果、１０００ Ｕ/ｍｌでｈｚＶＳＦ_ｗｔは約５０％の抗ＨＣＶ効果があるが、インターフェロン-βより弱いことが確認できた（図３５）。
しかし、実際のインビボ（in vivo）でのインターフェロンは副作用があるが、ｈｚＶＳＦは副作用がないだけでなく、炎症による症状を治療すると見られるので、実際に適用時は著しい優位性があるだろう。したがって、ウイルス感染の初期に細胞におけるウイルス増殖抑制は、化学薬剤とインターフェロンとの併用にして、ウイルス感染の中期または症状が現れた以降はｈｚＶＳＦと化学薬品を併用して免疫病理現象を抑制するだけでなく、ウイルスの増殖を抑制する必要がある。つまり、前記のような結果は、ウイルス増殖抑制能に優れた化学薬品（またはインターフェロン）と免疫病理現象の抑制能に優れた本発明のｈｚＶＳＦ_ｗｔ及びその様々な変異体の併用治療の可能性を示唆する。しかし、他にもｈｚＶＳＦ_ｗｔ及びその様々な変異体の単独でも副作用のない抗ウイルス剤としての適用を示唆する。
実施例１６-２：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ １ａ）に対するｈｚＶＳＦ変異体の抗ウイルス効果の確認
次に、Ｃ型肝炎ウイルスに対してｈｚＶＳＦ変異体の抗ウイルス効果を確認するために、代表的にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３に対して実験を行った。
まず、ｈｚＶＳＦ変異体のＨＣＶ １ａ複製抑制効果を確認するために、ＨＣＶ ＴＮｃｃ（TN cell-culture derived；遺伝子型１ａ）が感染したＨｕｈ７細胞にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を各容量に応じて処理し、３、６、９、１２日に細胞を収得した。次に、ＨＣＶ感染細胞を回収した後、トリゾール（trizol）を使用して全体ＲＮＡを抽出した。以降逆転写を通じてｃＤＮＡを収得した後、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ２ｘ ｇｒｅｅｎｓｔａｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（bioneer）を用いてｑＰＣＲでＨＣＶ ＲＮＡ及び補正のためのＧＡＰＤＨ（housekeepinggene）の定量分析を行った。
ＨＣＶ標的ＰＣＲプライマーとしては、ｆｏｒｗａｒｄ ５’-ＧＧＧＣＴＡＴＡＡＧＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣ-３’（配列番号１５７）、ｒｅｖｅｒｓｅ ５’-ＧＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＴＧＴＴ-３’（配列番号１５８）を使用し、ＧＡＰＤＨ ＰＣＲプライマーとしては、ｆｏｒｗａｒｄ ５’-ＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧ-３’（配列番号１５９）、ｒｅｖｅｒｓｅ ５’-ＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴ-３’（配列番号１６０）を用いた。
その結果、ＨＣＶ １ａ ＲＮＡの含有量は、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を０．１ Ｕ/ｍｌ以上の濃度で処理した場合、時間の経過に応じて減少することを確認しており、このようなＨＣＶ １ａ複製の抑制効果はｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の濃度依存的であることを確認した（図３６のＡ）。
さらに、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を処理した場合、ＨＣＶコアタンパク質の含量を確認するためにウェスタンブロット分析を行った結果、処理された濃度に依存的にタンパク質の含量が減少することを確認した（図３６のＢ）。
次に、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のＨＣＶ薬物対比の効果を確認しようとした。ＨＣＶ ＴＮｃｃ（遺伝子型１ａ）が感染したＨｕｈ７細胞にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３とＨＣＶ薬物（sofosbuvir、simeprevir）を各用量に応じて処理し、一週間ごとにＨＣＶ感染細胞を回収した後、トリゾールを用いて全体ＲＮＡを抽出した。以後逆転写を通じてｃＤＮＡを収得した。次に、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ２ｘ ｇｒｅｅｎｓｔａｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（bioneer）を使用してｑＰＣＲでＨＣＶ全体ＲＮＡ（配列番号１５７及び１５８のプライマーを用いる）及び補正のためのＧＡＰＤＨ（housekeeping gene）の定量分析を行った。
その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を１μｇ/ｍｌの濃度で処理した場合は、対照群の薬物に比べても著しくＨＣＶ １ａの複製を阻害することを確認した（図３７）。
したがって、ＨＣＶ ＴＮｃｃ（遺伝子型１ａ）感染細胞にｈｚＶＳＦ変異体を投与すると、ＨＣＶ遺伝子（ＲＮＡ）及びＨＣＶコアタンパク質を減少させるため、ｈｚＶＳＦ変異体がＨＣＶに対する抗ウイルス効果を有することが分かった。
実施例１６-３：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ １ｂ）に対するｈｚＶＳＦ変異体の抗ウイルス効果の確認
次に、ｈｚＶＳＦ変異体のＨＣＶ １ｂ複製の抑制効果を確認するために、ＨＣＶ遺伝子型１ｂのサブゲノムレプリコン（subgenomic replicon）を発現するＨｕｈ７細胞にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３とＨＣＶ薬物（sofosbuvir、simeprevir）とを各用量に応じて処理し、一週間ごとにＨＣＶ感染細胞を回収した後、トリゾールを用いて全体ＲＮＡを抽出した。以降逆転写を通じてｃＤＮＡを収得した。Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ２ｘ ｇｒｅｅｎｓｔａｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（bioneer）を使用してｑＰＣＲでＨＣＶ全体ＲＮＡ及び補正のためのＧＡＰＤＨ（housekeeping gene）の定量分析を行った。
ＨＣＶ標的ＰＣＲプライマーとしては、ｆｏｒｗａｒｄ ５’-ＡＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＧＧＧＴＡＴＡＡＧ-３’（配列番号１６１）、ｒｅｖｅｒｓｅ ５’-ＧＧＴＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡＧＧＧＴＣＧＡＴＡＣ-３’（配列番号１６２）を用い、ＧＡＰＤＨ ＰＣＲプライマーとしては、配列番号１５９と１６０のプライマーを用いた。
その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を処理した場合、濃度依存的にＨＣＶ １ｂの複製を抑制することが確認できており、特にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を１μｇ/ｍｌの濃度で処理した場合、対照薬であるＳｏｆｏｓｂｕｖｉｒ及びＳｉｍｅｐｒｅｖｉｒと同様のレベルで効果を示すことを確認した（図３８のＢ）。また、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の処理濃度別にＨＣＶ ＮＳ５Ａのレベルをウエスタンブロットで確認した結果、濃度依存的にＨＣＶ ＮＳ５Ａの量が減少することを確認した（図３８のＡ）。
したがって、ＨＣＶレプリコン（遺伝子型１ｂ）発現細胞にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与すると、ＨＣＶ遺伝子（ＲＮＡ）及びＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質の量を減少させるため、ＨＣＶに対する抗ウイルス効果を有することが分かった。
実施例１６-４：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ ２ａ）に対するｈｚＶＳＦ変異体の抗ウイルス効果の確認
次に、ｈｚＶＳＦ変異体のＨＣＶ ２ａ複製の抑制効果を確認するために、ＨＣＶ遺伝子型２ａが感染したＪＦＨ-１細胞にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３とＨＣＶ薬物（sofosbuvir、simeprevir）とを各用量に応じて処理し、一週間ごとにＨＣＶ感染細胞を回収した後、トリゾールを用いて全体ＲＮＡを抽出した。以後逆転写を通じてｃＤＮＡを収得した。次に、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ ２ｘ ｇｒｅｅｎｓｔａｒ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（bioneer）を使用してｑＰＣＲでＨＣＶ全体ＲＮＡ及び補正のためのＧＡＰＤＨ（housekeeping gene）の定量分析を行った。ＨＣＶ標的ＰＣＲプライマーは配列番号１５７及び１５８のプライマーを用い、ＧＡＰＤＨ ＰＣＲプライマーは配列番号１５９及び１６０のプライマーを用いた。
その結果、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を処理した場合、７週が経過した時点では処理濃度に大きな差がない対照群の薬物と同様のレベルでＨＣＶ ２ａの複製を抑制することを確認した（図３９のＢ）。さらに、前記の結果を長期的に、すなわち、２１週まで確認したとき、１μｇ/ｍｌの高濃度で処理した場合には、Ｓｏｆｏｓｂｕｖｉｒ及びｓｉｍｅｐｒｅｖｉｒを処理した場合と同様にＨＣＶ ２ａの複製抑制効果が維持されることを確認した（図４０）。
前記の結果を総合すると、ＨＣＶ遺伝子型２ａ感染細胞にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与する場合、ＨＣＶの遺伝子（ＲＮＡ）及びＨＣＶコアタンパク質（図３９のＡ）を減少させるため、ＨＣＶに対する抗ウイルス効果を示すことがわかった。
実施例１７：インフルエンザウイルス感染に対するｈｚＶＳＦの治療効果の確認
本願発明のｈｚＶＳＦの代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３のインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス及び抗炎症効果を確認するために、マウスで次のような実験を行った。
４週齢の雌Ｂａｌｂ/ｃマウスに１Ｘ１０５ｐｆｕのＨ１Ｎ１インフルエンザＡ/Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ/８/３４ウイルスを鼻腔に感染させた後、感染２、４または６日目に２５、１００、４００ｕｎｉｔのｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を尾静脈から投与した。ウイルス感染後の７日目と９日目のマウスを犠牲にして、Ｈ＆Ｅ染色、肺と体重の重量、粘膜上皮細胞及び繊毛、及び免疫組織化学染色法で免疫細胞の浸潤を調査した。
その結果、５００ ＵのｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与した群では、対照群に比べてインフルエンザ力価が１００倍以上減少した（図４１）。
また、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスを感染させた群は、肺胞に免疫細胞と浸潤が起こった反面、１００Ｕと４００Ｕを投与した群は、投与時期に関係なく非感染対照群の肺組織のように正常の肺のようにインフルエンザウイルスによる症状が治療された。２５Ｕを投与した場合も、投与時期による差はあるが、免疫細胞の浸潤を抑制するため、治療効果があることを確認した（図４２）。
また、マウスの肺の気道上皮細胞（epithelial cell）の繊毛（cilia）を観察した結果、非感染対照群と４００Ｕ ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３投与群は、肺気道に繊毛を有している上皮細胞を観察することができた反面、ウイルスに感染された肺では、上皮細胞層がウイルス感染によって消失した（図４３）。
また、肺重量とマウスの体重の割合を測定した結果、ウイルスに感染された群は肺に液体が満ちる肺炎の症状により体重あたり肺の割合が増加する反面、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与した群は濃度にある程度比例して、正常マウスの体重あたり肺の割合方向に減少することを確認した（図４４）。
最後に、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の免疫細胞浸潤の抑制効果を観察するために免疫組織化学染色法でＣＤ４ Ｔ細胞（図４５及び４６）とマクロファージ（macrophage）のマーカー（図４７及び４８）を用いて確認した（図４６と４８では、１０７ｐｆｕ感染）。 Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス１０７ ｐｆｕの感染後７日目のマウスの肺染色でＣＤ４ Ｔ細胞とマクロファージの浸潤が起こった反面、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与した群では、ＣＤ４ Ｔ細胞とマクロファージの浸潤が著しく減少することが確認できた（図４５〜４８）。
このような結果は、本発明のｈｚＶＳＦ及びその様々な変異体がインフルエンザウイルスに対する優れた抗ウイルス効果だけでなく、さらに免疫細胞の浸潤を抑制する抗炎症効果により炎症を抑制し、副作用がない抗ウイルス剤だけでなく、抗炎症剤として使用することができることを示唆する。
実施例１８：様々なウイルスに対するｈｚＶＳＦの抗ウイルス効果の確認
本発明のｈｚＶＳＦ_ｗｔ及びその変異体が、様々なウイルスに対する抗ウイルス効果を示すことを確認するために、ｈｚＶＳＦ_ｗｔ及び代表的な変異体であるｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３の効果をインビトロ及びインビボで確認した。インビトロの実験は抗ウイルス能に関するものであり、インビボ実験は抗ウイルス及び抗炎症に対するものである。
その結果を表１５に示した。
その結果、脳心筋炎（ＥＭＣＶ）ウイルスに対してはｈｚＶＳＦがインビトロ及びインビボ両方で著しい抗ウイルス能と抗炎症を示した。メンゴウイルスに対してはインビトロで著しい抗ウイルス能を示した。レオウイルス（Reovirus）に対してもインビトロ及びインビボでの効果を示した。ＨＩＶに対しても、インビトロで抗ウイルス効果を示した。ＨＣＭＶに対しても抗ウイルス能及び抗炎症機能を示した。ハンタンウイルス（Hantaan virus）に対してもインビトロでの効能を示し、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルスに対してもインビトロでの抗ウイルス能を示した。ヒト肝炎と類似の機序でマウスで肝炎を引き起こすＭＨＶに対しては、特にインビボで抗ウイルス及び抗炎症能を示した。インフルエンザウイルスに対してインビトロ及びインビボで抗ウイルス及び抗炎症能を示し、インビボでの効能がさらに優れていた。
実施例１９：マウスモデルにおけるｍＶＳＦ投与による炎症性サイトカイン分泌の抑制効果の確認
ｍＶＳＦが炎症性サイトカインの生成に及ぼす影響を確認するために、マウスにＥＭＣ-Ｄウイルスを感染させ、ｍＶＳＦを投与して３日後、炎症性サイトカインの量を血清からＥＬＩＳＡで測定した。下記表１６で示したように、ウイルス感染後の炎症性サイトカインであるＩＬ-６、ＴＮＦ-α、ＩＦＮ-γ及びＭＣＰ-１が増加したが、ｍＶＳＦの投与はこれらの炎症性サイトカインの発現を阻害した。
前記の結果からｍＶＳＦはウイルス感染によって誘導される炎症を抑える抗炎症効果もあることが分かった。
さらに、マウス急性肝炎でｍＶＳＦが炎症性サイトカインの生成に及ぼす影響を確認するために、マウスにマウス肝炎ウイルスを感染させてＶＳＦを処理した後、１日または３日後、炎症性サイトカインの量を血清からＥＬＩＳＡで測定した。下記表１７で示したように、ウイルス感染後の炎症性サイトカインであるＩＬ-６、ＴＮＦ-α、ＩＦＮ-γ及びＭＣＰ-１が増加したが、ＶＳＦの投与はこれらの炎症性サイトカインの発現を阻害した。また、ＩＦＮ-αの１回投与がより大きな相乗効果を示すことが分かった。
前記の結果から、ＶＳＦはウイルス感染によって誘導される炎症を抑える抗炎症効能もあることが分かった。
実施例２０：マウスモデルにおけるｈｚＶＳＦ投与による炎症性サイトカイン分泌の抑制効果の確認
本発明のｈｚＶＳＦが炎症性疾患の治療のための炎症性サイトカインの分泌を抑制することができるかどうかを確認するために、次のような実験を行った。
１ｘ１０５ ｐｆｕのＨ１Ｎ１（インフルエンザＡ/ＰＲ８）インフルエンザウイルスに感染したマウスの肺と感染１日後５００ｕｎｉｔのｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を投与したマウスの肺を摘出した。ＧＬＢ（Greenberger Lysis Buffer）を肺と一緒に均質化した後、氷の上に３０分間静置した後、３，４７０Ｘｇ、７分、４℃で遠心分離を行った。上清液を収得した後、４２０ Ｘ ｇ、１０分、４℃で遠心分離した後、前記の肺試料とキャプチャービーズ（capture bead）、ＰＥ検出試薬（PE detectionreagent）を１：１：１で５０μｌずつ混合した後、光を遮断した常温で２時間反応させた。反応後の洗浄バッファーでビーズを再懸濁した後、ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏＩＩでデータを測定した。
その結果、インフルエンザウイルスに感染した７日目に、マウスの肺に前炎症性サイトカイン（pro-inflammatory cytokine）に属するＩＬ-６、ＴＮＦ-α、ＩＦＮ-γ、ＣＣＬ２（ＭＣＰ-１）の量が著しく増加することが確認できた。しかし、本発明のｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３投与の結果、マウスの肺において、前記サイトカインの生成を著しく抑制することが確認できた（図４９）。
すなわち、様々な炎症性サイトカインを抑制し、ウイルス感染による様々な炎症性疾患の治療剤として用いられることを示唆する。
実施例２１：ビメンチン過発現細胞株（stable cell line）におけるＥＭＣ−Ｄ感染後のｈｚＶＳＦの効果確認
ビメンチンを発現しないＭＣＦ-７細胞にビメンチン（ｗｔ）またはｈｚＶＳＦとの結合部位を突然変異させたビメンチン（ｍｔ）を形質転換させて、ビメンチン（ｗｔ）またはビメンチン（ｍｔ）過発現細胞株を作製した。次に、同様の発現レベルを有する選別された細胞を用いてＭＶＩＴアッセイを行った。
具体的には、ウェルあたり２ｘ１０４個の細胞を接種した後、２ ＭＯＩのＥＭＣ-Ｄウイルスを感染させ、２時間後にｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を２５６Ｕから４倍ずつ連続的に希釈して添加し、２日間培養した。その後、細胞をメタノールで固定させた後、０．５％クリスタルバイオレット（crystal violet）で染色し、空気乾燥した後に観察した。
その結果、ＭＣＦ-７親細胞、Ｍｏｃｋ及びビメンチン（ｍｔ）は、ウイルス感染に対するｈｚＶＳＦの効能を観察できなかったのに対し、ビメンチン（ｗｔ）を発現するＭＣＦ-７は、ウイルス感染によってビメンチンがＶＳＦ受容体（ＶＲ）に構造的な変化が誘導されて、ｈｚＶＳＦの抗ウイルス効能があることが確認できた（図５０及び図５１）。
次に、細胞毒性を確認するために、ＷＳＴアッセイをさらに実施した。前記ＭＶＩＴアッセイと同じ条件でビメンチン（ｗｔ）及びビメンチン（ｍｔ）細胞を３日間培養した後、テトラゾリウム塩（tetrazolium salt、WST-1）を処理してさらに４時間培養し、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。測定後、上清液を除去して細胞をメタノールで固定させた後、０．５％クリスタルバイオレットを用いて固定染色を２０分間行った後、空気乾燥させた。染色された細胞をメタノールに溶かし５４０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
その結果、ＭＣＦ-７親細胞、Ｍｏｃｋ及びビメンチン（ｍｔ）は、ＥＭＣ-Ｄウイルス感染に対するｈｚＶＳＦ効能が観察されなかったのに対し、ビメンチン（ｗｔ）を発現するＭＣＦ-７は、ウイルス感染によってビメンチンがＶＳＦ受容体（ＶＲ）に構造的な変化が誘導されて、ｈｚＶＳＦの抗ウイルス効能があることを確認した（図５２）。
次に、ビメンチン過発現細胞株（stable cell line）におけるＥＭＣ-Ｄ感染によるＶＳＦ受容体（ＶＲ）の発現様相を確認しようとした。それで、それぞれの安定したＭＣＦ-７細胞、すなわち、ビメンチン（ｗｔ）及びビメンチン（ｍｔ）に５ ＭＯＩのＥＭＣ-Ｄを９時間感染させた後、ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３で細胞を免疫染色した。細胞を固定させた後、透過化（permeabilization）させ、１：２５０に希釈したｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を細胞と反応させた。２次抗体としてＦＩＴＣ-ヤギ‐ヒトＩｇＧで反応させて、蛍光顕微鏡で細胞でのｈｚＶＳＦに対する受容体（ＶＲ）発現を確認した（５００倍率）。
その結果、図５５で示したようにmock及びｈｚＶＳＦの結合部位が突然変異されたビメンチン発現細胞にはｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３が結合しなかったが、ｗｔのビメンチンを発現する細胞ではウイルス感染によってＶＲが発現されることを確認した（図５３）。
実施例２２：大腸菌における精製したＶＲ ＷＴ及びＭＴとＶＳＦの結合の確認
Ｎｉ-ＮＴＡシステムを用いて精製されたｐ６０組換えタンパク質５ｍｇとｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３をモル比２：１で計算して、最終的体積が７００ｍｌになるようにＰＢＳ（phosphate bufferedsaline）で満たした後、４℃オービタルシェーカー（orbital shaker）で３時間インキュベーションした。次に、プロテインＡビーズ（５０％スラリー）を添加して４℃で1時間インキュベーションした後、プロテインＡ-ｈｚＶＳＦ-ＶＲ複合体を３，０００ｘｇで４℃で３分間遠心分離した。その後、上清液を除去し、ＰＢＳでビーズを洗浄した後、３，０００ ｘｇで４℃で３分間再び遠心分離し、このプロセスを３回繰り返した。次に、２Ｘ ＳＤＳ標準緩衝液を加えて５分間加熱し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットを行った。
その結果、ビメンチンのＹ１５０/Ｒ１８６/Ｑ１９５/Ｒ２１７/Ｋ２３５/Ｒ２７０である６個のアミノ酸をそれぞれＦ、Ｋ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｋに置換突然変異をさせたタンパクはｈｚＶＳＦとの結合が確実に低下することを確認した（図５４）。これで、ｈｚＶＳＦはビメンチンのＹ１５０/Ｒ１８６/Ｑ１９５/Ｒ２１７/Ｋ２３５/Ｒ２７０に結合することがわかった。
実施例２３：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における過発現させたＶＲ（ｍｔ）とＶＳＦとの結合の確認
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐ６０ ＷＴまたはｐ６０ ＭＴを形質転換させた後、ｈｚＶＳＦ_ｖ１３との結合を確認した。
具体的に、２ｘ１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１００ｍｍ培養ディッシュに接種した後、ｐ６０ＷＴ（野生型）及びＭＴ（変異体）ＤＮＡ（ベクター：ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃＨｉｓＣ）に形質転換させて４８時間インキュベーションした。その後、前記細胞を回収した後、１ｍｌの１％ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液を添加して２０分間氷に静置させ、細胞を溶解させた。溶解された細胞を４℃、１３，０００ ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清液を新しいチューブに移した。７００ｍｇのタンパク質に５０％スラリーのプロテインＡビーズを添加して４℃で１時間の間ｐｒｅｃｌｅａｒ反応を行った。次に、４℃、３，０００ ｘｇで３分間遠心分離した後、上清液を新しいチューブに移した。ｈｚＶＳＦ_ｖａｒ１３を１：１００で処理した後、４℃で一晩インキュベーションしＶＳＦとＶＲとを結合させた。その後、５０％スラリーのプロテインＡを添加した後、４℃で1時間反応させた。プロテインＡ-ＶＳＦ-ＶＲ複合体を得て、ビーズを洗浄するために４℃、３，０００ ｘ ｇで３分間遠心分離し、上清液を除去した。次に、沈殿した複合体に１％ＣＨＡＰＳ溶解緩衝液を添加してビーズを３回洗浄した。２Ｘ ＳＤＳ標準緩衝液を入れて加熱し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥとイムノブロットを行った。
その結果、細胞で過発現させたビメンチンのＹ１５０/Ｒ１８６/Ｑ１９５/Ｒ２１７/Ｋ２３５/Ｒ２７０の６個アミノ酸をそれぞれＦ、Ｋ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、Ｋに置換突然変異をさせたタンパク質は、ｈｚＶＳＦとの結合が確実に低下することを確認した（図５５）。これで、ｈｚＶＳＦはビメンチンのＹ１５０/Ｒ１８６/Ｑ１９５/Ｒ２１７/Ｋ２３５/Ｒ２７０に結合することがわかった。６個のアミノ酸を突然変異で置換したレーンにおけるＶＳＦとの弱い結合はＨＥＫ２９３Ｔ細胞に内在する野生型ビメンチンと過発現させた変異ビメンチンとの二量化及び四量化によりＶＳＦが弱く結合すると推定される。
前記の結果に続いて、コンピュータプログラムを用い、ビメンチンＶＳＦ結合デルを確認した（図５６〜図５８）。分析に使用された具体的なプログラムは、下記の通りである。
ＶＲダイマーモデリング：Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ/ａｎａｌｏｇＹ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅ Ｖ ２．０
（ Component software Template detection: HHpred 1.51
Secondary structure prediction: Psi-pred 2.5
Disorder prediction: Disopred 2.4
Transmembrane prediction: Memsat_SVM
Multi-template modelling and ab initio: Poing 1.0
Re-orienting structures for easy viewing: OVOP ）
ＶＲ_ダイマー及びＶＳＦの複合体モデリング：Ｐｙｍｏｌ
ＶＲ_ダイマー及び化合物の複合体モデリング:ａｕｔｏｄｏｃｋ ｖｉｎａ
ＶＲダイマーモデリングを介してＶＲがｈｚＶＳＦと結合したときの構造を推定し、結論的にｈｚＶＳＦはビメンチンのＹ１５０/Ｒ１８６/Ｑ１９５/Ｒ２１７/Ｋ２３５/Ｒ２７０残基に結合することを確認した。
前記のような結果は、本発明の配列番号１のペプチドに特異的に結合する抗体または前記ペプチドの結合断片が幅広いウイルス疾患に対して抗ウイルス及び抗炎症効果を示すことを示唆するもので、既存の抗ウイルス剤であるインターフェロンや化学療法剤とは異なり、副作用がなくウイルス感染細胞のみ選択的に適用して、治療時は少量で可能であり、免疫細胞の浸潤を抑制して抗炎症作用をして、様々なウイルスの治療剤として用いられることを示唆する。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (27)

  1. 配列番号１のペプチドに特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であって、前記ペプチドはウイルス感染細胞の細胞外部位に現れるものであり、前記ヒト化抗体が、配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３または配列番号１４で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４または配列番号１５で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号５で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７または配列番号１９で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ヒト化抗体またはその断片。
  2. 前記ヒト化抗体またはその断片が、配列番号２０で記載された重鎖ＦＲ１（Framework region 1）；配列番号２１で記載された重鎖ＦＲ２；配列番号２２または配列番号２８で記載された重鎖ＦＲ３；及び配列番号２３で記載された重鎖ＦＲ４を含む重鎖可変領域と、配列番号２４で記載された軽鎖ＦＲ１；配列番号２５で記載された軽鎖ＦＲ２；配列番号２６で記載された軽鎖ＦＲ３；及び配列番号２７で記載された軽鎖ＦＲ４を含む軽鎖可変領域とをさらに含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその断片。
  3. 前記ヒト化抗体またはその断片が、
    （ａ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｂ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｃ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１７及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｄ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｅ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号１９でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｆ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３；
    （ｇ）配列番号２、配列番号３及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；
    （ｈ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；
    （ｉ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号１５でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；
    （ｊ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；
    （ｋ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号１５でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；
    （ｌ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号１９でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；
    （ｍ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号１５でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２０、配列番号２１及び配列番号２８及び配列番号２３でそれぞれ記載された重鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４、及び配列番号５、配列番号１８及び配列番号１９でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３、及び配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６及び配列番号２７でそれぞれ記載された軽鎖ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４；または、
    （ｎ）配列番号２、配列番号１４及び配列番号４でそれぞれ記載された重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２及び重鎖ＣＤＲ３、及び配列番号５、配列番号１６及び配列番号７でそれぞれ記載された軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその断片。
  4. 前記ヒト化抗体が、それぞれ配列番号１０及び配列番号１２；配列番号３２及び配列番号３４；配列番号３６及び配列番号３８；配列番号４０及び配列番号４２；配列番号４４及び配列番号４６；配列番号４８及び配列番号５０；配列番号５２及び配列番号５４；配列番号５６及び配列番号５８；配列番号６０及び配列番号６２；配列番号６４及び配列番号６６；配列番号６８及び配列番号７０；配列番号７２及び配列番号７４；配列番号７６及び配列番号７８；または、配列番号８０及び配列番号８２で記載された重鎖及び軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載のヒト化抗体またはその断片。
  5. 配列番号１のペプチドに特異的に結合するマウス抗体またはその断片であって、前記ペプチドはウイルス感染細胞の細胞外部位に現れるものであり、前記マウス抗体が、配列番号１３７で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１３８で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３９で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１３４で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１３５で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３６で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、マウス抗体またはその断片。
  6. 前記マウス抗体が、配列番号９で記載された重鎖可変領域及び配列番号８で記載された軽鎖可変領域を含む、請求項５に記載のマウス抗体またはその断片。
  7. 配列番号１のペプチドに特異的に結合するキメラ抗体またはその断片であって、前記ペプチドはウイルス感染細胞の細胞外部位に現れるものであり、前記キメラ抗体が、配列番号１４１または配列番号１４２で記載された重鎖可変領域及び配列番号１４０で記載された軽鎖可変領域を含む、キメラ抗体またはその断片。
  8. 配列番号１のペプチドに特異的に結合する断片であって、前記ペプチドはウイルス感染細胞の細胞外部位に現れるものであり、前記断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、これらの二量体、ミニボディー（minibodies）、ダイアボディー（diabodies）、多量体（multimer）、または二重特異性抗体断片であり、前記ｓｃＦｖは、配列番号１３１で記載された重鎖可変領域及び配列番号１３３で記載された軽鎖可変領域がリンカーで連結されたものである、断片。
  9. 前記ｓｃＦｖは、配列番号１３０の塩基配列でコードされる重鎖可変領域及び配列番号１３２の塩基配列でコードされる軽鎖可変領域がリンカーで連結されたものである、請求項８に記載の断片。
  10. 前記抗体またはその断片が、配列番号１のペプチドの９番目、４５番目、５４番目、７６番目、９４番目または１２９番目のアミノ酸残基に特異的に結合するものである、請求項１，５，８のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
  11. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド。
  12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  13. 請求項１２に記載のベクターが導入された細胞。
  14. 請求項１３に記載の細胞を用いた抗体またはその断片の生産方法。
  15. 請求項１４に記載の生産方法により生産された抗体またはその断片。
  16. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む、抗ウイルス用組成物。
  17. 前記組成物が、抗ウイルス作用によるウイルス感染性疾患の予防または治療を行うものである、請求項１６に記載の組成物。
  18. 前記組成物が、ウイルス感染細胞に特異的に作用するものである、請求項１６に記載の組成物。
  19. 前記組成物が、免疫細胞の浸潤を抑制するものである、請求項１６に記載の組成物。
  20. 前記組成物が、炎症反応を抑制するものである、請求項１６に記載の組成物。
  21. 前記ウイルスが、ウイルス感染により宿主細胞のビメンチン（vimentin）の一部が宿主細胞膜の外部に露出されることを特徴とするウイルスである、請求項１６に記載の組成物。
  22. 前記ウイルスが、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）に属するウイルス、ピコルナウイルス科（Picorna viridae）に属するウイルス、レトロウイルス科（Retroviridae）に属するウイルス、ヘルペス（Herpes）属ウイルス、フィロウイルス科（Filoviridae）に属するウイルス、コロナウイルス科（Coronaviridae）に属するウイルス、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）に属するウイルス、フラビウイルス科（Flaviviridae）に属するウイルス、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）に属するウイルスで構成される群から選択されたものである、請求項１６に記載の組成物。
  23. 前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、脳心筋炎ウイルス、メンゴウイルス（Mengovirus）、レオウイルス（Reovirus）、ＨＩＶ（human immunodeficiency virus）、エボラウイルス（Ebolavirus）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus；SARS）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus；MERS）、ＨＣＭＶ（human cytomegalovirus）及びハンタンウイルス（Hantaan virus）からなる群から選択されたウイルスである、請求項１６に記載の組成物。
  24. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその断片を含む、炎症性疾患の予防または治療用組成物。
  25. 前記炎症性疾患が、ウイルス感染によるものである、請求項２４に記載の組成物。
  26. 請求項１６に記載の組成物をウイルスに感染されたヒトを除いた個体に投与する段階を含む、ウイルス感染疾患の治療方法。
  27. 請求項２４に記載の組成物を炎症性疾患にかかったヒトを除いた個体に投与する段階を含む、炎症性疾患の治療方法。
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