JP6616328B2 - エルゴチオネインの産生方法 - Google Patents
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Description
1.C1化合物資化性細菌及び/又は酵母を、炭素源を含む培地を用いて培養し、エルゴチオネインを産生する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
2.C1化合物資化性細菌及び/又は酵母を、炭素源としてメタノール、メチルアミン及び/又はグリセリンを含む培地を用いて培養し、エルゴチオネインを産生する工程を含む、前項1に記載のエルゴチオネインの製造方法。
3.C1化合物資化性細菌が、Methylobacterium属細菌である、前項1または2に記載の製造方法。
4.酵母が、Rhodotorula属の酵母である、前項1〜3のいずれか1に記載の製造方法。
5.培地中の炭素源が、0.1〜5 %の濃度で含有される、前項1〜4のいずれか1に記載の製造方法。
6.培地中にアンモニウム塩が、0.2〜2.0 g/Lの濃度で含有される、前項1〜5のいずれか1に記載の製造方法。
7.培地中にアンモニウム塩として、塩化アンモニウム又はリン酸二水素アンモニウムが含有される、前項1〜6のいずれか1に記載の製造方法。
8.以下の工程を含む、エルゴチオネインの製造方法:
1)前項1〜7のいずれか1に記載の方法でC1化合物資化性細菌及び/又は酵母を培養する工程;
2)前記培養したC1化合物資化性細菌及び/又は酵母を熱処理し、産生したエルゴチオネインをC1化合物資化性細菌菌及び/又は酵母から抽出する工程。
9.C1化合物資化性細菌が、受託番号NITE BP-02088、NITE BP-02089、およびNITE BP-02090としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属のC1化合物資化性細菌より選ばれたものである、前項1〜8のいずれか1に記載のエルゴチオネインの製造方法。
10.酵母が、受託番号NITE BP-02171、およびNITE BP-02172としてそれぞれ寄託されたRhodotorula属の酵母より選ばれたものである、前項1〜9のいずれか1に記載のエルゴチオネインの製造方法。
まず初めに、Methylobacterium属細菌のうちゲノム情報が公知の各菌株について、EGTの産生を確認した。
Methylobacterium属細菌ではM. oryzae DSM18207、M. aquaticum strain MA-22A(国際受託番号FERM BP-11078)、M. extorquens (NRBC15687T)、M. radiotolerans (IAM12098T)、及びM. extorquens strain AM1 (ATCC14718)について、EGTの産生能を確認した。
メタノール・ミネラル培地は、ミネラル塩溶液(200 mL)、緩衝液(300 mL)、鉄溶液(0.33 mL)、TE溶液(1 mL)、ビタミン溶液(10 mL)と、メタノール及び水からなり、各溶液を各々殺菌した後混合して調製した。各溶液の組成は、以下の通りである。
・ミネラル塩溶液:1 L当たりNH4Cl 8.09 g及びMgSO4・7H2O 1.0 g
・緩衝液:1 L当たりK2HPO4 8.0 g及びNaH2PO4・H2O 3.6 g
・鉄溶液:1 L当たりFeSO4・7H2O 13.9 gを1 M塩酸に溶解
・ビタミン溶液:1 L当たりパントテン酸カルシウム0.4 g、イノシトール0.2 g、ナイアシン0.4 g、p-アミノ安息香酸0.2 g、塩酸ピリドキシン0.4 g、塩酸チアミン0.4 g、ビオチン0.2 g及びビタミンB12 0.2 g
・メタノールは異なる濃度で用いた。
・エタノール、コハク酸、グルコースを用いるときはメタノールの代わりに所定の濃度用いた。
各菌株のうち、Methylobacterium属細菌は、3 容量%のメタノールを含むメタノール・ミネラル培地を用い、7日間培養した。M. aquaticum strain MA-22Aは、0.5 容量%のメタノールを含むメタノール・ミネラル培地を用い、28℃で7日間培養した。
液体培地中で培養した各菌を25℃で12000×g、10分間遠心処理を行い、得られた菌体を0.85 重量% NaClを用いて洗浄した。菌の湿重量を計測し、記録した。菌の湿重量10〜50 mgあたりに1 mLの水を加え、95℃で10分間処理し、菌体内のEGTを抽出した。細胞の懸濁液をミキサー(Vortex)を用いて1600rpmで30分処理し、その後25℃で14000×g、10分間遠心処理して上清を得、細胞片を除去した。得られた上清を0.2μmフィルターで膜ろ過し、ろ過物についてEGTの産生量を測定した。
M. aquaticum strain MA-22Aについて、培地中の炭素源及びその濃度を変えた場合のEGTの産生能を確認した。
M. aquaticum strain MA-22Aについて、培地中のメタノール濃度を変えたときのEGTの産生能を確認した。培養は実施例1に示すメタノール・ミネラル培地に各濃度のメタノール(0.5 容量%、1 容量%、2 容量%又は3 容量%)を含む培地を100 mL用い、28℃で38日間行なった。EGT産生量は実施例1に示す方法でHPLCにより定量した。
M. aquaticum strain MA-22Aについて、培地中の窒素原を変えた場合のEGTの産生能を確認した。
M. aquaticum strain MA-22Aについて、培地中のNH4Cl濃度を変えたときのEGTの産生能を確認した。実施例1に示すメタノール・ミネラル培地に各濃度のNH4Cl(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、2.0、4.0又は6.0 g/L)を含む培地を5 mL用い、28℃で7日間培養した。EGT産生量は実施例1に示す方法でHPLCにより定量した。培地中のNH4Cl濃度の違いによりEGT産生量の違いが認められ、0.4〜1.2 g/Lの場合に培地5 mL当たりの産生量が最も高かった(図6)。
M. aquaticum strain MA-22Aについて、培地に様々な濃度のアミノ酸を添加したときのEGTの産生能を確認した。実施例1に示すメタノール・ミネラル培地に各濃度のヒスチジン(His)及び/又はシステイン(Cys)を含む培地を5 mL用い、28℃で7日間培養した。EGT産生量は実施例1に示す方法でHPLCにより定量した。ヒスチジン及びシステインは、EGTの前駆体である。ヒスチジン及びシステインをそれぞれ10 mM含む場合に培地5 mL当たりの産生量が最も高かった(図7)。
M. aquaticum strain MA-22Aについて、培養中に炭素源であるメタノールと窒素源である塩化アンモニウムを消費してしまうと、さらなる増殖が期待できないこと及び培地のpHが下がり増殖を妨げることが考えられたため、培養4、8及び11日目にアンモニアとメタノールを追加する検討を行った。実施例1に示すメタノール・ミネラル培地100 mLでM. aquaticum strain MA-22Aを培養し、10 容量%水酸化アンモニウム水溶液を1 mL(終濃度窒素源として0.1 容量%)及び2 mL のメタノール(終濃度2 容量%)を追加してEGT量と培地pHを測定した。28℃で15日間培養した。EGT産生量は実施例1に示す方法でHPLCにより定量した。添加した場合はpHを中性付近に維持できるがEGT産生量は培養8〜11日目をピークとし、その後低下傾向を示したのに対し、添加しない場合はpHが5以下に下がるものの培養期間が15日であってもEGT産生量は増加し続けた(図8)。
MycobacteriumにおけるegtABCDE遺伝子と相同性を持つ遺伝子を、M. aquaticum strain MA-22Aゲノム中にBLAST解析によって探索した。M. aquaticum strain MA-22AにおいてegtBD(contig 199)が直列でコードされ、egtA、C及びEが異なる位置でコードされていることが確認された(図1)。M. aquaticum strain MA-22Aの中のEGTの機能を解明するために、相同組換えによってergBD-欠損変異株(ΔergBD)を構築した。ΔergBDのEGT産生能を実施例1に示す方法でEGTの抽出処理を行い、HPLCにより定量した。その結果を図9に示した。波長254nmの吸光度測定によるHPLC解析において、標準EGT(100μM)及び野生型M. aquaticum strain MA-22Aの抽出物では6.2分の位置でEGTが検出されたが、ΔergBDの抽出物ではEGTは認められなかった。このことより、egtBD遺伝子はEGT産生に必要な遺伝子であると考えられた。
M. aquaticum strain MA-22Aの野生型株及びΔergBDについて、培地中のメタノール濃度を変えたときの菌の増殖を確認した。実施例1に示すメタノール・ミネラル培地に各濃度のメタノール(0.5 容量%、1 容量%、2 容量%又は3 容量%)を含む培地を200μL用い、各菌株について96ウェルプレートで28℃で300時間培養した。菌体量は波長600nmでの吸光度(OD600)測定により定量した。その結果、ΔergBDは1 容量%-3 容量%のメタノールを含む培地で野生株よりも良好な生育を示した(図10)。
M. aquaticum strain MA-22Aを、実施例1と同様にして、0.5 容量%メタノールを含むメタノール・ミネラル培地100 mLを用いて7日間培養した。培養液の内10 mLについてEGT産生量を実施例1に示す方法でHPLCにより定量した。残りの培養液は、細胞中のアミノ酸含量測定のために用いた。菌体をメタノールで抽出し、抽出物をAmberliteTM CR1310NA(4 mL 樹脂)を用いて精製した後乾燥させ、再度水に溶解した試料について、高速アミノ酸分析計(Hitachi L-8500B)を用いてアミノ酸含量を分析した。その結果、M. aquaticum strain MA-22A菌体中に占めるEGT量はアルギニン量とほぼ同等量含まれていることが確認された(図11)。
M. aquaticum strain MA-22Aを、実施例1と同様にして、0.5 容量%メタノールを含むメタノール・ミネラル培地200 mLを用いて7日間予備培養した後、2 容量%メタノールを含むメタノール・ミネラル培地10 Lを用いて28℃で66日間培養した。通気量440 mL/分で100rpm撹拌しつつ培養を行った。pHは調整しなかった。培養液20 mL又は50 mLを時折採取し、菌の湿重量及びEGT産生量を定量した。EGT産生量は、培養31日目がピークで15.8 mg/10 Lに達した。EGTの産生量は徐々に低下したが、菌体量はあまり減少しなかった。実施例3の結果に比べて生産性が低かったが、スケールアップによる培養槽の空気の撹拌等の影響があったと考えられた(図12)。しかしながら、培養条件の改善により大量培養によるEGT産生量の向上が期待できる。
M. aquaticum strain MA-22Aを、実施例1と同様にして、2 容量%メタノール及び0, 10μM, 100μM, 1 mMのメチオニンを含むメタノール・ミネラル培地5 mLを用いて28℃で7日間培養し、実施例1に示す方法でEGT産生量をHPLCにより定量した。
その結果、1 mMのメチオニン添加によりEGT産生量の増加が見られた(図13)。本発明においては、培地にメチオニンの添加しない場合であってもEGTを生産可能であるが、メチオニンを好適な濃度で添加することにより、EGTをより良好に生産できることがわかった。
実施例10に示したアミノ酸含量は菌体内のアミノ酸をメタノールで抽出したものである。本実施例では、培養菌体から実施例1に示す熱抽出により得られたEGT含有溶液について、アミノ酸組成を調べた。培養した菌、培地、および培養条件は実施例10と同様である。熱抽出は実際の菌体からのEGT精製に適していると考えられる。アミノ酸組成の分析方法は、実施例10と同様である。
その結果、菌体中にはEGT以外にも通常のアミノ酸が含まれており、メタノールで抽出したものより組成は少し異なるものの、EGTが最も多く含まれる点は共通していた(図14)。また上記方法による熱抽出により、菌体からアミノ酸だけでなく、タンパク質も抽出されると考えられたことから、SDS-PAGE法によりタンパク質を分析した。その結果、サンプルは約0.28 mg/mlのタンパク質を含み(牛血清アルブミンをスタンダードとしたBradford法による)、その分子量の多くは10 kDa以下の低分子量のタンパク質を含むことが分かった(図15)。
実際のEGT生産を考慮し、メタノール以外の炭素源としてグリセリンを用いた。実施例1に示す方法で、メタノールを0.5, 1, 2容量%グリセリンに変更し、M. aquaticum strain MA-22Aを同様に培養、EGT抽出を行った。
その結果、2容量%グリセリンを用いるとメタノールを用いた際の生産性とほぼ同量の生産性を示した(図16)。
自然界から分離したMethylobacterium属細菌のライブラリ(PLoS ONE 7(7): e40784. doi:10.1371/journal.pone.0040784 (2012))を用い、2容量%メタノールまたは2容量%グリセリンを炭素源として実施例1に示す方法で培養、EGT抽出を行った。
その結果、M. aquaticum strain MA-22Aは実施例14に示した結果と同様に、どちらの炭素源でもEGT生産性は変わらなかった(図17)。メタノールを用いるとM. aquaticum strain MA-22Aよりも生産性の高い菌株が見つかったが、それらのグリセリンによる生産性はM. aquaticum strain MA-22Aに及ばなかった(図18及び図19)。図18及び図19において、棒グラフがEGT産生性、ひし形が細胞湿重量を示す。なお、Methylobacterium属細菌のライブラリのうち、M. brachiatum strain 99d、M. brachiatum strain z1b、M. brachiatum strain z1eについて、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 112号室)に、NITE P-02088、NITE P-02089、NITE P-02090の受託番号にて国内寄託を行い(国内受託日:平成27年7月15日)、ブダペスト条約に基づき国際寄託に移管を行った(受託番号NITE BP-02088、NITE BP-02089、NITE BP-02090)。
自然界から分離した酵母であるRhodotorula mucilaginosa z41c、Rhodotorula mucilaginosa z41d、Cryptococcus flavescens z64b(PLoS ONE 7(7): e40784. doi:10.1371/journal.pone.0040784 (2012))について、EGTの産生能を確認した。これらの酵母を2%メタノールまたは2%グリセリンを炭素源として、実施例1に示す方法で培養、EGT抽出を行った。
Rhodotorula mucilaginosa z41c, Rhodotorula mucilaginosa z41dについて、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 112号室)に、NITE BP-02171、NITE BP-02172の受託番号にて国際寄託を行った(受領日:平成27年12月4日)
Claims (8)
- エルゴチオネイン産生能を有する、Methylobacterium属の細菌、Rhodotorula属の不完全酵母、及び/又はCryptococcus属の不完全酵母を、炭素源を含む培地を用いて培養し、エルゴチオネインを産生する工程を含む、エルゴチオネインの製造方法。
- 培地中の炭素源が、メタノール、メチルアミン及び/又はグリセリンであることを特徴とする、請求項1に記載のエルゴチオネインの製造方法。
- 培地中の炭素源が、0.1〜5%の濃度で含有される、請求項1又は2に記載のエルゴチオネインの製造方法。
- 培地中に、アンモニウム塩が、0.2〜2.0g/Lの濃度で含有される、請求項1〜3のいずれか1に記載のエルゴチオネインの製造方法。
- 培地中に、アンモニウム塩として、塩化アンモニウム又はリン酸二水素アンモニウムが含有される、請求項1〜4のいずれか1に記載のエルゴチオネインの製造方法。
- 以下の工程を含む、エルゴチオネインの製造方法:
1)請求項1〜5のいずれか1に記載の方法で、エルゴチオネイン産生能を有する、Methylobacterium属の細菌、Rhodotorula属の不完全酵母、及び/又はCryptococcus属の不完全酵母を培養する工程;
2)前記培養したMethylobacterium属の細菌、Rhodotorula属の不完全酵母、及び/又はCryptococcus属の不完全酵母を熱処理し、産生したエルゴチオネインをMethylobacterium属の細菌、Rhodotorula属の不完全酵母、及び/又はCryptococcus属の不完全酵母から抽出する工程。 - Methylobacterium属の細菌が、受託番号NITE BP−02088、NITE BP−02089、およびNITE BP−02090としてそれぞれ寄託されたMethylobacterium属の細菌より選ばれたものである、請求項1〜6のいずれか1に記載のエルゴチオネインの製造方法。
- 不完全酵母が、受託番号NITE BP−02171、およびNITE BP−02172としてそれぞれ寄託されたRhodotorula属の不完全酵母より選ばれたものである、請求項1〜7のいずれか1に記載のエルゴチオネインの製造方法。
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