KR20170048763A - 세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법 - Google Patents

세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170048763A
KR20170048763A KR1020150149253A KR20150149253A KR20170048763A KR 20170048763 A KR20170048763 A KR 20170048763A KR 1020150149253 A KR1020150149253 A KR 1020150149253A KR 20150149253 A KR20150149253 A KR 20150149253A KR 20170048763 A KR20170048763 A KR 20170048763A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
substrate
sebacic acid
cell line
methyl
fatty acid
Prior art date
Application number
KR1020150149253A
Other languages
English (en)
Inventor
안정오
이홍원
박규연
전우영
김천석
이희석
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020150149253A priority Critical patent/KR20170048763A/ko
Publication of KR20170048763A publication Critical patent/KR20170048763A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12R1/74—

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세바식산 생산용 미생물은 기질의 세포독성에 대한 내성이 강할 뿐만 아니라, 종래 세바식산 생산용 균주와 비교하여 현저한 세바식산 생산 효율을 나타내므로, 특히 산업적인 규모로 세바식산을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법{Microorganism for Production of Sebacic Acid and Method of Producing Sebacic Acid Using the Same}
본 발명은 세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기질의 세포독성에 대한 내성이 강할 뿐만 아니라, 종래 세바식산 생산용 균주와 비교하여 현저한 세바식산 생산 효율을 나타내는 세바식산 생산용 돌연변이 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법에 관한 것이다.
양쪽 말단에 2개의 카르복시기를 갖는 유기 화합물을 디카르복시산이라 부르며, 이들 디카르복시산은 주로 폴리아미드나 폴리에스테르 수지의 제조에 사용된다. 상기 디카르복시산은 포함되는 탄소의 수에 따라 아디프산(C6), 피멜산(C7), 수베르산(C8), 아젤라산(C9), 세바식산(C10), 도데칸디오산(C12) 등으로 구분한다.
세바식산은 HO2C(CH2)8CO2H의 화학식을 갖는 중쇄 디카르복시산으로서, 나일론 1010, 나일론 610 등의 엔지니어링 플라스틱의 제조에 주로 사용되며, 내광 안정제, 에폭시 수지 경화제, 고온 윤활제의 제조에도 사용되고 있다. 세바식산은 피마자유 또는 리시놀산을 수산화 알칼리 수용액과 가압하여 가열하거나, 아디프산 모노에틸칼륨염을 전해함으로써 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 세바식산은 특히 알키드 수지, 폴리아미드, 가소제 등의 합성 원료로 사용된다.
이와 같은 화학적 합성법 이외에도, 세바식산은 ω-산화가 우수하고 β-산화가 차단된 미생물을 이용함으로써 생물학적으로 생성할 수 있다. 예컨대, 이와 같이 ω-산화가 우수하고 β-산화가 차단된 효모인 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) ATCC 20962 돌연변이주를 이용하여 지방산 또는 알칸 화합물로부터 세바식산과 같은 α,ω-디카르복시산을 생산하는 방법이 종래 공개되어 있다(비특허문헌 1 참조).
그러나, 상기와 같은 종래 세바식산 생산 미생물은 세바식산을 생산하기 위한 기질로서 사용되는 메틸 에스테르 데칸산 등의 세포독성에 대한 내성이 강하지 않기 때문에, 세바식산을 높은 효율로 생산하기가 어려웠고, 특히 산업적인 규모로 세바식산을 생산하기에는 많은 한계가 있었다.
David L. Craft, et al., Applied and Environmental Microbiology, 69(10):5983-5991, 2003
본 발명은 ω-산화가 우수하고 β-산화가 차단된 캔디다 트로피칼리스 세포주에 추가로 돌연변이를 도입함으로써, 원래의 세포주에 비해 기질의 세포독성에 대한 내성이 강할 뿐만 아니라 세바식산에 대한 생산 효율이 현저하게 증가된 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주 및 상기 돌연변이 세포주를 이용하여 세바식산을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 캔디다 트로피칼리스 ATCC 20962 세포주에 돌연변이를 도입하여 유도되고, 상기 세포주에 비해 기질의 세포독성에 대한 내성이 강하며, 세바식산에 대한 생산 효율이 증가된 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 캔디다 트로피칼리스 ATCC 20962 세포주(이하, "모세포주"라 함)는 야생형 캔디다 트로피칼리스에 β-산화와 관련된 유전자를 차단함으로써 디카르복시산의 생산성을 높인 균주이다(비특허문헌 1 참조). 본 발명의 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주는 상기 모세포주에 추가로 돌연변이를 도입함으로써, 기질에 대한 내성과 세바식산에 대한 생산성이 모 세포주보다 더 향상된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, "ω-산화"란 용어는 지방산의 메틸기 말단이 산화되어 디카르복시산이 형성되는 대사 과정을 의미하고, "β-산화"란 용어는 카르복시기에서 β-자리의 탄소원자가 산화되어 아세틸 CoA를 방출하면서 그때마다 탄소 원자수가 2개 적은 지방산이 되면서 점차 분해되어 가는 대사 과정을 의미한다. 상기 ω-산화 및 β-산화의 개념과 이러한 대사 과정에 관여하고 있는 효소들에 대해서는 생화학 분야의 통상의 기술자에게 있어서 널리 알려져 있다. 예컨대, ω-산화에 있어서, 지방산이 기질로 이용될 경우에는 먼저 시토크롬 P450 및 NADPH-시토크롬 P450 리덕타아제(reductase)의 작용에 의해 ω-히드록시 지방산이 생성되고, 상기 ω-히드록시 지방산은 지방 알코올 디하이드로게나아제 및 지방 알코올 옥시다아제의 작용에 의해 ω-알데히드 지방산이 생성되며, 상기 ω-알데히드 지방산은 지방 알데히드 디하이드로게나아제의 작용에 의해 디카르복시산이 제조된다. 또한, β-산화에 있어서는 아실-CoA 옥시다아제에 의해 탄소 원자수가 2개 적은 지방산이 생성된다.
또한, 본 발명에 있어서, "돌연변이"란 용어는 유전정보가 기록된 DNA 분자가 여러가지 요인에 의하여 원래의 DNA와 달라지는 것을 의미하는 것으로서, 돌연변이가 일어나면 그 유전자에 의해 생산되는 단백질에 변화가 생기고, 이는 유전형질의 변화를 불러오게 되어, 해당 개체의 생물학적 특징 등에 변형시킬 수 있다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 돌연변이는 본 기술분야에서 돌연변이를 유발할 수 있는 것으로서 알려져 있는 임의의 화학적 수단 및/또는 물리적 수단을 상기 모세포주에 처리함으로써 도입될 수 있다. 상기 화학적 수단으로는 돌연변이를 유발하는 물질(돌연변이원)로서 유효한 구아니딘 유도체인 NTG(nitrosoguanidine), MMS(methyl methanesulfonate), EMS(ethyl methanesulfonate), 벤조피렌 등과 같은 화학물질을 들 수 있고, 상기 물리적 수단은 자외선, X-선, γ-선 등과 같은 방사선을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 기질은 탄소수 5 내지 30, 바람직하게는 8 내지 16을 갖는 알칸, 알코올, 알데히드, 케톤 및 카르복시산으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기질은 직쇄상 형태뿐만 아니라 분지상의 형태 및 임의의 치환체로 치환된 형태인 것도 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 치환체는 알킬, 알콕시, 아릴, 할로겐 등의 임의의 치환체가 제한없이 사용될 수 있다. 상기 알킬, 알콕시, 아릴, 할로겐 등의 치환체는 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 관용어로서, 그 정의는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 자명하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 기질로서 임의의 지방산 메틸 에스테르(FAME, fatty acid methyl ester), 예컨대 메틸 카프레이트(Methyl caprate, C11H22O2), 메틸 카프릴레이트(Methyl caprylate, C9H18O2) 또는 메틸 라우레이트(Methyl laurate, C13H26O2)를 이용할 수 있고, 메틸 카프레이트를 이용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구현예에 따르면, ATCC 20962로서 기탁된 캔디다 트로피칼리스 세포주에 돌연변이를 도입하여 유도된 본 발명에 따른 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주는 화학적 수단, 예컨대 NTG의 처리에 의해 돌연변이가 도입된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주는 모세포주에 비해 세바식산의 생산 효율이 1.7배 현저하게 증가된다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 세바식산의 생산능이 뛰어난 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주를 "캔디다 트로피칼리스 AP1"로 명명하고, 2015년 10월 14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KCTC18412P).
또한, 본 발명은
(1) 상기 세바식산의 생산능이 뛰어난 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주를 배지 내에 준비하는 단계; 및
(2) 상기 배지에 기질을 처리하여 상기 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 세바식산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배지는 세포 배양용으로 통상적으로 사용되는 임의의 배지가 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 배지는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 포함할 할 수 있고, 필요에 따라 생리활성물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 탄소원으로는 전분, 포도당, 설탕 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤 등의 단백질, 아미노산, 요소 등의 유기 질소원과 질산염, 암모늄염 등의 무기 질소원이 사용될 수 있으며, 상기 무기염류에는 Na+, K+, Ca2+, Mg2 +, Cl- 등이 사용될 수 있고, 상기 생리활성물질에는 비타민 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 배지에는 효모 추출물, 맥아(malt) 추출물 등이 포함될 수 있고, 세포 배양용으로 시판되는 RPMI(Rosewell Park Memorial Institute), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimum Essential Medium) 등의 배양 배지들도 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 기질은 탄소수 5 내지 30, 바람직하게는 8 내지 16을 갖는 알칸, 알코올, 알데히드, 케톤 및 카르복시산으로부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기질은 직쇄상 형태뿐만 아니라 분지상의 형태 및 임의의 치환체로 치환된 형태인 것도 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 치환체는 알킬, 알콕시, 아릴, 할로겐 등의 임의의 치환체가 제한없이 사용될 수 있다. 상기 알킬, 알콕시, 아릴, 할로겐 등의 치환체는 본 기술분야에서 통상적으로 사용되는 관용어로서, 그 정의는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 자명하다. 본 발명의 한 구현예에 따르면, 상기 기질로서 임의의 지방산 메틸 에스테르, 예컨대 메틸 카프레이트, 메틸 카프릴레이트 또는 메틸 라우레이트를 이용할 수 있고, 메틸 카프레이트를 이용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 배양은 소정의 온도 및 pH 조건하에 배양될 수 있다. 상기 온도는 20 내지 50℃, 바람직하게는 25 내지 40℃, 보다 바람직하게는 28 내지 35℃일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 pH는 4 내지 9의 범위, 바람직하게는 5 내지 8의 범위일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주는 성장하는데 있어 기질의 저해를 받지 않을 뿐만 아니라, 생성물인 세바식산을 현저하게 더 많이 생산할 수 있다(도 5 참조).
또한, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주는 배양되는 동안 기질의 독성으로 인해 생성되는 배양기 내의 기포 발생 현상도 실질적으로 나타나지 않는다(도 6 참조).
또한, 본 발명의 다른 바람직한 구현예에 따르면, 종래 세바식산 생산 균주는 기질의 공급 속도가 증가하면 기질의 독성으로 인해 균체의 성장이 저하되고, 기질 및 포도당의 축적 현성이 일어나서 일정 수준 이상의 세바식산의 생산이 이루어지지 않지만, 본 발명에 따른 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주는 기질의 공급 속도가 증가하더라도 균체의 성장에 크게 영향을 받지 않고, 결과적으로 종래 세바식산 생산 균주와 비교하여 세바식산의 생산량이 현저하게 증가된다(도 7 참조).
본 발명에 따른 세바식산 생산용 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주는 기질의 세포독성에 대한 내성이 강할 뿐만 아니라, 종래 세바식산 생산용 균주와 비교하여 현저한 세바식산 생산 효율을 나타내므로, 특히 산업적인 규모로 세바식산을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 기질의 세포독성 분석 절차를 나타내는 순서도이다.
도 2는 기질에 따른 생산 균주의 성장 저해 영향을 보여주는 그래프이다.
도 3은 내성 균주의 탐색 및 선별 과정을 나타내는 순서도이다.
도 4는 돌연변이 유발 전후 균주의 플레이트 배양 결과를 비교한 사진이다.
도 5는 후보 내성 균주들의 플라스크 배양 결과를 보여주는 사진 및 그래프이다.
도 6은 발효조를 이용한 기존 생산 균주와 본 발명의 내성 균주의 기질독성 비교 실험을 보여주는 사진 및 그래프이다.
도 7은 기존의 세바식산 생산 균주와 본 발명의 내성 균주의 세바식산 생산 속도 및 양을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 내성 균주 탐색
<1-1> 기질의 세포독성
세바식산의 생산을 위해서 사용되는 기질인 메틸 카프레이트의 세포독성을 알아보기 위해서, 도 1과 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, 종래의 세바식산 생산 균주인 캔디다 트로피칼리스 ATCC 20962 세포주를 메틸라우레이트(Methyl laurate, C13H26O2), 메틸 카프레이트(Methyl caprate, C11H22O2), 메틸카프릴레이트(Methyl caprylate, C9H18O2)의 농도가 10 g/L로 각각 첨가된 YM 배지(효모 추출물 0.3%, 맥아 추출물 0.3%, 덱스트로오스 1%, 펩톤 0.5%)를 이용하여 인피니트 200 PRO 멀티모드 판독기(Tecan, Switzerland)에 배양하면서 실시간으로 균체 농도를 측정하였다. 균체의 성장곡선 모델로 널리 사용되는 곰페르츠 모델(Gompertz model)(Modeling of the bacterial growth curve, Zwietering MH, Appl Environ Microbiol, 1990) 식을 이용하여 기질에 따른 균체의 최대 성장 속도를 유추하였고, 균체량은 UV 분광광도계(spectrophotometer)(Uvikon XL, Secomam, France)를 이용하여 600 ㎚ 파장에서 분석하였으며, 잔여 당량은 균체가 제거된 상등액으로부터 글루코오스 분석기(YSI 2900 Biochemistry Analyzer, Yellow Springs, USA)를 이용하여 분석하였다. 이 때, 배양 온도는 30℃이고, 200 rpm에서 24시간 동안 배양하였다.
그 결과, 지방산이 들어가지 않은 대조군에 비해 지방산을 첨가한 경우 캔디다 트로피칼리스 ATCC 20962 균주의 성장 속도가 떨어졌고, 특히 세바식산 생산을 위해 사용하는 기질인 메틸 카프레이트가 첨가된 배지에서 균주가 전혀 생장하지 못하는 것을 확인하였다(도 2). 상기 결과로부터, 기질인 메틸 카프레이트에 대한 내성이 있는 균주 확보가 필요함을 확인하였다.
<1-2> 내성 균주의 선별
다음으로, 메틸 카프레이트에 대한 내성을 갖는 균주를 선별하기 위하여 돌연변이 유발을 위한 NTG 처리 후, 도 3과 같은 순서로 우수 균주를 선별하는 실험을 수행하였다. 구체적으로, NTG 처리를 위한 캔디다 트로피칼리스 ATCC 20962 균주를 YM 배지 20 ㎖에 30℃, 200 rpm 조건 하에서 24시간 배양한 뒤 균주를 회수하여 TM 완충 용액(A:B=50:26, pH 6.00 (A: 0.2 M 트리아미노메탄, 0.2 M 말레산; B: 0.2 M NaOH))으로 세척하였다. 세척된 균주를 300 ㎍/㎖ NTG에 30℃, 200 rpm에서 1시간 동안 배양한 후, 다시 회수하여 TM 버퍼로 2회 세척하였다. 그 후, pH 7.00의 인산완충용액으로 2번 더 세척하고, 식염수 완충액에 재부유한 후, YM 플레이트에 도말하여 30℃에서 배양하였다.
그 결과, 메틸 카프레이트가 30 g/L 포함된 배지에서 NTG 처리 전과 달리 처리 후에 많은 균주들이 자라는 것을 확인하였다(도 4). 자라난 여러 개의 균주들 중에서 임의로 10개의 콜로니를 선별한 후 우수 균주 선별을 위한 테스트를 진행하였다.
실시예 2. 내성 균주 선정
<2-1> 플라스크 배양
10개의 후보 내성 균주를 30℃, 200 rpm에서 플라스크 배양을 진행하였다. 이때, 플라스크 배양용 배지의 조성은 표 1과 같다. 균주가 초기 당을 다 소모하였을 때 메틸 카프레이트를 첨가하여 균주 성장 및 세바식산 생산량을 비교하였다.
성분 배지(g/L)
글루코오스 10
효모 추출물 3
맥아 추출물 3
펩톤 5
그 결과, 대조군인 캔디다 트로피칼리스 ATCC 20962 균주 대비 8번 내성 균주는 기질을 첨가하였을 때 성장하는 데 있어 기질의 저해를 받지 않았고, 세바식산은 약 1.7배로 더 많이 생산하였다(도 5). 상기 결과로부터, 8번 내성 균주를 우수 균주로 선별하여 5 L 발효조 배양 실험을 수행하였다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 세바식산의 생산능이 뛰어난 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주를 "캔디다 트로피칼리스 AP1"로 명명하고, 2015년 10월 14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KCTC18412P).
<2-2> 발효조를 이용한 기질독성 비교 실험
5 L 발효조에 표 2에 나타나 있는 조성의 회분식 배양용 배지 2 L에 접종량 10%로 세바식산에 내성이 있는 균주를 접종한 후, 30℃에서 배양하였고, pH는 5.5로 배양 동안 유지되도록 10 N NaOH를 공급하였다. 초기 당이 소모된 후 기질인 메틸 카프레이트 30 g/L를 첨가하고, pH는 세바식산 전환의 최적인 7.5로 유지시켜 주었다.
성분 배지(g/L)
글루코오스 50
MgSO4·7H2O 1.5
효모 추출물 20
(NH4)2SO4 8
KH2PO4 5
NaCl 0.1
CaCl2·2H2O 0.1
미량 성분* 1 ㎖/L
소포제 0.5 ㎖/L
미량 성분*: 1 L의 1 M HCl 내의 8.4 g의 FeSO4·7H2O, 2.4 g의 ZnSO4·7H2O, 0.48 g의 CuSO4·5H2O, 13.2 g의 CaCl2·2H2O, 2.4 g의 MnSO4·4H2O, 0.24 g의 Na2MoO4·2H2O, 0.48 g의 CoCl2·6H2O 및 0.06 g의 K2B4O7·XH2O.
그 결과, 기존 생산 균주와 달리 8번 내성 균주는 기질을 첨가하였을 때 기질의 저해를 받지 않고 성장을 유지하였으며, 또한 배양되는 동안 기질의 독성으로 인해 생성되는 배양기 내의 기포 발생 현상도 실질적으로 나타나지 않았다(도 6).
실시예 3. 대조군과 지방산 내성을 갖는 변이주의 세바식산 생산 비교
5 L 발효조에 표 3에 나타나 있는 조성의 유가식 배양용 배지 2 L에 접종량 10%로 세바식산에 내성이 있는 균주를 접종한 후 30℃에서 배양하였고, pH는 5.5로 배양 동안 유지되도록 10 N NaOH를 공급하였다. 초기 당이 소모된 후 메틸 카프레이트 30 g/L를 첨가하고, pH는 세바식산 전환의 최적인 7.5로 유지시켜주었으며, 추가적인 포도당을 3 g/L/hr, 기질인 메틸 카프레이트를 0.2∼1 ㎖/L/hr의 속도로 각각 공급하였다. 기질과 생성물은 GC(기기: DANI Master GC (DANI Instruments SpA, Milano, Italy); 컬럼: Rtx-5 (Restek, Bellefonte, PA, USA); 검출기: Flame Ionization Detector; 캐리어 가스 및 유량: 질소, 1 ㎖/분; 온도: 오븐 130-250℃, 검출기 280℃; 주입량: 1 ㎕; 내부표준물질: 메틸미리스테이트)를 이용하여 확인하였고, 기질인 메틸 카프레이트는 배양액으로부터 용매(Diehtyl ether; 1:1, v/v) 추출을 통해 분석하였으며, 생산된 세바식산은 배양액 100 ㎕에 6 N 황산 400㎕, 디에틸에테르 500 ㎕를 첨가하여 추출한 뒤, 추출된 용매 200 ㎕, 내부표준물질 100 ㎕, BSTFA (SIGMA) 200 ㎕를 60℃에서 20분 동안 반응시킨 뒤 분석하였다.
성분 초기 배지(g/L) 첨가 배지(g/L)
글루코오스 50 600
MgSO4·7H2O 1.5 -
효모 추출물 20 20
(NH4)2SO4 8 -
KH2PO4 5 -
NaCl 0.1 -
CaCl2·2H2O 0.1 -
미량 성분* 1 ㎖/L -
소포제 0.5 ㎖/L -
미량 성분*: 1 L의 1 M HCl 내의 8.4 g의 FeSO4·7H2O, 2.4 g의 ZnSO4·7H2O, 0.48 g의 CuSO4·5H2O, 13.2 g의 CaCl2·2H2O, 2.4 g의 MnSO4·4H2O, 0.24 g의 Na2MoO4·2H2O, 0.48 g의 CoCl2·6H2O 및 0.06 g의 K2B4O7·XH2O.
그 결과, 기존 생산 균주는 기질의 공급 속도를 0.7 ㎖/L/hr 이상으로 공급하였을 때, 기질의 독성으로 인하여 균체의 성장이 저하되고, 기질 및 포도당의 축적 현상이 일어나서, 70시간에 세바식산이 5.65 g/L로 생산된 후 더 이상의 세바식산 생산이 이루어지지 않았다. 이와 대조적으로, 8번 내성 균주는 기질의 공급 속도를 0.7 ㎖/L/hr 이상으로 빠르게 공급하더라도 균체 성장에 크게 영향을 받지 않았으며, 결과적으로 143시간까지 세바식산의 생산량이 계속 증가하여 62.12 g/L까지 생산되었다(도 7).
한국생명공학연구원 KCTC18412P 20151014

Claims (16)

  1. 캔디다 트로피칼리스 ATCC 20962 세포주에 돌연변이를 도입하여 유도되고, 상기 세포주에 비해 기질의 세포독성에 대한 내성이 강하며, 세바식산에 대한 생산 효율이 증가된 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 돌연변이는 돌연변이를 유발할 수 있는 화학적 수단 및/또는 물리적 수단을 상기 캔디다 트로피칼리스 ATCC 20962 세포주에 처리함으로써 도입되는 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 화학적 수단은 NTG(nitrosoguanidine), MMS(methyl methanesulfonate), EMS(ethyl methanesulfonate) 및 벤조피렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 물리적 수단은 방사선인 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 방사선은 자외선, X-선 및 γ-선으로 이루어진 군으로부터 선택되는 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 기질은 탄소수 5 내지 30을 갖는 알칸, 알코올, 알데히드, 케톤 및 카르복시산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 기질은 지방산 메틸 에스테르인 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 지방산 메틸 에스테르는 메틸 카프레이트, 메틸 카프릴레이트 및 메틸 라우레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 지방산 메틸 에스테르는 메틸 카프레이트인 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  10. 청구항 1에 있어서,
    기탁번호 KCTC18412P로서 기탁된 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주.
  11. (1) 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 따른 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주를 배지 내에 준비하는 단계; 및
    (2) 상기 배지에 기질을 처리하여 상기 캔디다 트로피칼리스 돌연변이 세포주를 배양하는 단계를 포함하는 세바식산의 제조 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 기질은 탄소수 5 내지 30을 갖는 알칸, 알코올, 알데히드, 케톤 및 카르복시산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세바식산의 제조 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 기질은 지방산 메틸 에스테르인 세바식산의 제조 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 지방산 메틸 에스테르는 메틸 카프레이트, 메틸 카프릴레이트 및 메틸 라우레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 세바식산의 제조 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 지방산 메틸 에스테르는 메틸 카프레이트인 세바식산의 제조 방법.
  16. 청구항 11에 있어서,
    상기 배양은 20 내지 50℃의 온도 및 pH 4 내지 9의 범위에서 수행되는 세바식산의 제조 방법.
KR1020150149253A 2015-10-27 2015-10-27 세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법 KR20170048763A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150149253A KR20170048763A (ko) 2015-10-27 2015-10-27 세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150149253A KR20170048763A (ko) 2015-10-27 2015-10-27 세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170048763A true KR20170048763A (ko) 2017-05-10

Family

ID=58743669

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150149253A KR20170048763A (ko) 2015-10-27 2015-10-27 세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20170048763A (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200068143A (ko) 2018-12-04 2020-06-15 고려대학교 산학협력단 디카르복시산 생산을 위한 미생물 및 이를 이용한 디카르복시산 생산방법
CN112680369A (zh) * 2019-10-18 2021-04-20 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种高产长链二元酸的菌株及其发酵方法
WO2021073011A1 (zh) * 2019-10-18 2021-04-22 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种生产长链二元酸的菌株及其发酵方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200068143A (ko) 2018-12-04 2020-06-15 고려대학교 산학협력단 디카르복시산 생산을 위한 미생물 및 이를 이용한 디카르복시산 생산방법
CN113748210A (zh) * 2018-12-04 2021-12-03 高丽大学校产学协力团 用于生产二羧酸的微生物及使用其生产二羧酸的方法
US20220033790A1 (en) * 2018-12-04 2022-02-03 Korea University Research And Business Foundation Microorganism for producing dicarboxylic acid, and method for producing dicarboxylic acid using same
US11873517B2 (en) * 2018-12-04 2024-01-16 Korea University Research And Business Foundation Candida tropicalis strain having improved tolerance to the cytotoxicity of substrates, and method for producing dicarboxylic acid using same
CN112680369A (zh) * 2019-10-18 2021-04-20 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种高产长链二元酸的菌株及其发酵方法
WO2021073011A1 (zh) * 2019-10-18 2021-04-22 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种生产长链二元酸的菌株及其发酵方法
CN112680369B (zh) * 2019-10-18 2024-05-03 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种高产长链二元酸的菌株及其发酵方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101796830B1 (ko) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
JP6616328B2 (ja) エルゴチオネインの産生方法
KR102163724B1 (ko) 내산성을 갖는 효모 세포 및 이의 용도
US10837032B2 (en) Candida infanticola strain, mutant strain and transformant strain thereof, and method for producing dioic acids using same
JP2017225368A (ja) エルゴチオネインの産生方法
KR20170048763A (ko) 세바식산 생산용 미생물 및 이를 이용한 세바식산의 생산 방법
EP1666584B1 (en) Method of breeding lipid-producing fungus
WO2003000913A2 (de) Verfahren zur fermentativen herstellung von pyruvat
EP0365560B1 (en) Riboflavin producing strains of microorganisms, method for selecting, and method for fermentation
KR101851898B1 (ko) Ｌ-류신 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-류신의 제조방법
Vinetsky et al. Increase in glucoamylase productivity of Aspergillus awamori strain by combination of radiation mutagenesis and plasmid transformation methods
JP6483253B2 (ja) Ｌ−グルタミンを生産する微生物、及びそれを利用したｌ−グルタミン生産方法
EP3591043A1 (en) A long-chain dibasic acid with low content of fatty acid impurity and a method of producing the same
JP2016202093A (ja) ハロモナス菌を用いたピルビン酸の製造方法
KR20130101348A (ko) 하이드록시 지방산으로부터 고수율의 감마-도데카락톤의 제조방법 및 그 조성물
KR20200077343A (ko) L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 l-트립토판의 생산 방법
US9758564B2 (en) Acid-resistant yeast cell with reduced FPS1 activity and method of producing lactate by using the yeast cell
KR102202694B1 (ko) ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주 및 이를 이용한 PHB 생산방법
US20240034983A1 (en) Asporogenous bacteria and uses thereof as a feed ingredient
KR20150117853A (ko) 미생물 변이체를 이용하여 팜슬러지 오일로부터 아디프산을 제조하는 방법
KR101887272B1 (ko) 디오익 산류를 생산하는 캔디다 인판티콜라 형질전환 균주
CN101440375A (zh) 一种乳清酸核苷-5＇-磷酸脱羧酶基因及其蛋白和应用
KR101900152B1 (ko) 캔디다 인판티콜라 균주를 이용한 디오익 산류의 생산 방법
JP4059454B2 (ja) 酒類、食品の製造方法
KR20180036222A (ko) 디오익 산류를 생산하는 캔디다 인판티콜라 형질전환 균주