JP6559775B2 - 二重ｐｉ３ｋデルタ‐ガンマキナーゼ阻害剤及びコルチコステロイドを含む治療方法及び組成物 - Google Patents

Description

本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年９月３日に出願されたインド特許出願第４２８７／ＣＨＥ／２０１４号の利益を主張する。

本発明は、自己免疫性、呼吸器、及び／または炎症性疾患ならびに状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に二重ＰＩ３Ｋデルタ／ガンマ阻害剤、及び少なくとも１つのコルチコステロイドを投与することを含む、方法に関する。好ましい実施形態において、本方法は、乾癬、リウマチ性関節炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及びそれらの任意の組み合わせの治療に関する。

自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患、例えばリウマチ性関節炎（ＲＡ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＣＯＰＤ、及び喘息は、それぞれ、調節不全のまたは過剰な免疫系に関連する、慢性及びしばしば進行性の疾患である。これらの疾患の原因及び動因は依然として不確定である。それらは、典型的には、先天的及び適応免疫系の複数の炎症細胞間の複雑な細胞相互作用によって特徴付けられる。したがって、これらの状態の病因の異質性及び複雑性により、細胞の浸潤において、「無害な」バイスタンダーと対比して、何が病変の主要なプレイヤーであるのかが明確でないため、新しい適切な細胞標的の探索が困難になる。したがって、複数の免疫細胞の活性化のために必要とされるシグナル伝達分子を標的とすることは、これらの慢性の免疫細胞媒介疾患との戦いにおいて成功する可能性が高い。

リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、疲労などの関連全身症状を伴う複数の関節の慢性炎症を特徴とする進行性の全身性自己免疫疾患である。この炎症は、関節疼痛、硬直、及び腫脹を引き起こし、骨及び軟骨の破壊による関節機能の喪失をもたらし、しばしば進行性の障害に至る。ＲＡ患者は、骨粗鬆症、貧血、ならびに肺及び皮膚に影響を及ぼすその他など、他の全身性合併症を発症する可能性も増加する。

ＲＡは、自己免疫疾患の最も一般的な形態の１つであり、世界中で２１００万人を超える人々に影響を及ぼす。リウマチ性関節炎は、世界的に分布しており、推定罹患率は１〜２％である。罹患率は年齢とともに増加し、５５歳を超える女性では５％に近づいている。米国における平均年間発症率は、年間１０万人あたり約７０人である。リウマチ性関節炎の発症率及び罹患率はいずれも、男性よりも女性で２〜３倍高い。リウマチ性関節炎はどの年齢でも存在し得るが、患者は最も一般的に２０代〜５０代の間に最初に侵される。ＲＡは生活の質に影響を与えることが知られており、身体的な問題だけでなく生活の質への重大な悪影響も引き起こす。ＲＡは平均余命にも影響を与え、３〜７年短縮する。１０年後、ＲＡの患者の５０％未満が日常的に正常に働いたり機能したりすることができる。ＲＡは、病院の入院、医療費、生産性の喪失などにより、国民経済に経済的負担をかけることも報告されている。ＲＡは、毎年９００万人を超える英国のプライマリケア医師の訪問の原因であり、８億３３００万ポンドの生産喪失に相当する。また、２０００年には英国経済に５５億ポンドの費用がかかると推定されている。米国では、専門家は、ＲＡは他のいかなる疾患よりもビジネスや産業にとって多くの費用がかかると推定しており、年間５０万件の入院があり、関節炎（全体として）に関する経済上の病気の負担は１２８０億ドルと推定されている。

ＲＡを管理するために利用できる治療がいくつかある。ＲＡの徴候や症状に対処するものもあれば、疾患の経過を修正し、疲労や貧血等の、ＲＡの全身性作用に積極的に影響を与えるものもある。

現在の治療には、例えば以下の使用が含まれる。
・生物製剤：これらは、炎症反応の間に他の細胞を調節するために細胞によって産生される、サイトカインと呼ばれる免疫系における特異的細胞表面マーカーまたはメッセンジャー物質を標的とする、遺伝子操作された薬物である。生物製剤によって標的とされる特異的サイトカインの例は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）である。
・伝統的な疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）：これらは非特異的免疫抑制薬であり、ＲＡの徴候や症状と戦うとともに進行性関節破壊を遅らせることを意図するものである。これらの治療は、しばしば、患者の反応を改善するために、互いに組み合わせて、または生物剤と組み合わせて使用される
・グルココルチコイド（コルチコステロイド）：これらは、炎症に対抗することによって働く、体内で自然に産生されるステロイドである、コルチゾールに関連する抗炎症薬である。しかしながら、高血糖、骨粗鬆症、高血圧、体重増加、白内障、睡眠障害、筋肉喪失、及び感染症に対する感受性を含む、グルココルチコイドの副作用は、それらの使用を制限する。
・非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）：これらは、疼痛、腫脹、炎症等のＲＡの徴候や症状を管理するが、疾患の経過を変えたり、関節破壊の進行を遅らせることはない。

また、免疫系の他の成分を標的としたいくつかのＲＡ療法がある。これらには、炎症、ならびに関節及び全身におけるＲＡの進行を軽減するのに役立つ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）等の代替サイトカインを標的とした生物学的治療が含まれる。

喘息は子供の間で最も一般的な慢性疾患であり、また何百万人もの成人に影響を及ぼす。世界中で約２億３，５００万人がこの病気に苦しんでいる。喘息の原因は十分には理解されていないが、治療できる有効な医薬品が入手可能であり、したがって、それがもたらし得る命の減少、障害、及び死亡を大幅に回避する。残念なことに、喘息を有する多くの人々、特に貧しい人々にとって、これらの有効な治療は費用がかかりすぎるか、または全く利用できない。

慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、非常に一般的な状態であり、世界中で罹患率及び死亡率の主要な原因である。病気が進行するにつれて、ＣＯＰＤ患者は頻繁に増悪する傾向があり、患者の不安、健康状態の悪化、肺機能低下、死亡率の上昇をもたらす。これらの呼吸機能の悪化のエピソードは、医療利用、入院、及び費用の増加につながる。さらに悪いことに、頻繁な増悪がより速い肺機能の低下と関連しており、それによって平均余命が短縮される。

慢性閉塞性肺疾患に関するグローバルイニシアチブ（ＧＯＬＤ）の勧告によれば、ＣＯＰＤの第一選択療法は、長時間作用性β−アゴニスト、長時間作用性ムスカリンアンタゴニスト及び吸入コルチコステロイドである。しかし、これらの薬物は、その分子的及び細胞的基盤を標的とするのではなく、疾患に伴う症状及び増悪を減少させる。したがって、ＣＯＰＤ療法の更なる改善が依然として必要である。

ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、ホスホイノシチド脂質（ＰＩ）のイノシトール環３位のヒドロキシル基をリン酸化して脂質セカンドメッセンジャーを産生する、細胞内脂質キナーゼのクラスに属する。アルファ及びベータアイソフォームがそれらの分布において遍在性である一方で、デルタ及びガンマの発現は循環する血行性細胞及び内皮細胞に限定される。ＰＩ３Ｋアルファまたはベータとは異なり、ガンマまたはデルタの発現を欠如するマウスは、いかなる有害な表現型も示さず、これらの特定のアイソフォームの標的化が明らかな毒性につながることはないであろうことが示される。

近年、ホスホイノシチド−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路の標的化阻害剤が、免疫調節剤として示されている。この関心は、ＰＩ３Ｋ経路が、主に膜結合セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン酸（ＰＩＰ３）の生成を通して、免疫細胞における複数の機能を果たすという事実に由来する。ＰＩＰ３は、タンパク質キナーゼ及びＧＴＰアーゼを含むタンパク質を脂質二重層の細胞質側に対して動員し、免疫細胞接着、遊走、及び細胞間情報伝達の制御において重要な下流のシグナル伝達カスケードの複雑なネットワークを開始する。

４つのクラスＩ ＰＩ３Ｋアイソフォームは、それらの組織分布において著しく異なる。ＰＩ３Ｋα及びＰＩ３Ｋβは、遍在性であり、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の下流で活性化される一方で、ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγは、主に造血性及び内皮細胞に限定され、それぞれＲＴＫの下流及びＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の下流で活性化される。マウス遺伝子研究は、ＰＩ３Ｋα及びＰＩ３Ｋβが、正常な発達のために必須である一方で、ＰＩ３Ｋδ及び／またはＰＩ３Ｋγの喪失が、選択的免疫欠損を有する生存可能な子孫をもたらすことを明らかにしている。

ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγの発現パターン及び機能は、リウマチ性関節炎、アレルギー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、及び多発性硬化症を含む多くの疾患のための薬剤としての、ＰＩ３Ｋδ／γ阻害剤の開発において大きな関心を生み出した（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１１８，１９２−２０５，２００８、Ｍａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１７８４，１５９−１８５，２００８、Ｒｏｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７，１９１−２０１，２００７、Ｒｕｃｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，５，９０３−９１８，２００６）。薬理的及び遺伝子的方法の両方を使用する研究は、これらの２つのアイソフォームが、しばしば互いとの相乗的な相互作用を実証することを示している（Ｋｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３，３３２９６−３３３０３，２００８、Ｌａｆｆａｒｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１，２００２）。

例えば、マスト細胞において、ＰＩ３ＫδはＦｃ受容体のＩｇＥ架橋に反応する脱顆粒のために必須であるが（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８０，２５３８−２５４４．２００８）、ＰＩ３Ｋγは反応の増幅において重要な役割を果たす（Ｌａｆｆａｒｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１ ２００２）。同様の効果が、ＰＩ３Ｋγが重要な役割を果たし、ＰＩ３Ｋδが各プロセスを増幅する、リンパ球ホーミング及び好中球呼吸バーストを含む他の細胞機能において見られている。ＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγの非冗長性であるが関連する役割は、２つのアイソフォームのうちのどちら（単独または組み合わせ）が特定の炎症性障害において最良に標的化されるかを決定することを困難にしている。ＰＩ３Ｋδ及び／もしくはＰＩ３Ｋγが欠如するか、またはＰＩ３Ｋδ及びＰＩ３Ｋγのキナーゼ死（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ）バリアントを発現するマウスを使用する研究は、それらの役割を理解することにおいて貴重な手段となっている。例えば、ＰＩ３Ｋδノックアウトマウスは、減少した好中球走化性、減少した抗体生成（Ｔ細胞依存及び非依存の両方）（Ｊｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１．２００２）、及びより少ない数の成熟Ｂ細胞（Ｃｌａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９６，７５３−７６３．２００２、Ｊｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１．２００２）、及びそれらの抗ＩｇＭに反応する増殖における減少（Ｊｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２２，８５８０−８５９１．２００２）を実証した。この表現型は、ＰＩ３Ｋδキナーゼ死バリアントにおいて、ＰＩ３Ｋδ選択的阻害剤及び減弱したアレルギー反応とともに、減少した数のマスト細胞及びマスト細胞の増殖とともに複製された。ＰＩ３Ｋγノックアウトは、より多い数の、しかしより反応性でない好中球、より少ない数かつより反応性でないマクロファージを含有し、樹状細胞は、減少したマスト細胞脱顆粒（（Ｌａｆｆａｒｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１６，４４１−４５１ ２００２）、より高い比のＣＤ４＋〜ＣＤ８＋Ｔ細胞）、増加した胸腺細胞アポトーシス、活性化Ｔ細胞上へのＣＸＣＲ３の減少した誘導、及び減少した心臓収縮力を示した。心臓組織に対するこの後者の効果は、ＰＩ３Ｋγ阻害剤を有する患者の慢性投薬に対する懸念であった。しかしながら、この懸念は、（タンパク質の喪失よりもむしろキナーゼの阻害をより良く模倣する）ＰＩ３Ｋγキナーゼ死バリアントが同様の免疫細胞表現型を示したが、重要なことに心臓異常を有さなかったとき、大きく軽減された。心臓効果は、その後ＰＩ３Ｋγの触媒活性よりもむしろ足場効果によるものであることが示された。二重ＰＩ３Ｋδ／ＰＩ３Ｋγノックアウトは生存可能であるが、Ｔ細胞の発達及び胸腺細胞の生存において深刻な異常を呈した。ＰＩ３Ｋγノックアウト／ＰＩ３Ｋδキナーゼ死の組み合わせは、少なくとも免疫系において、ＰＩ３Ｋδの役割が触媒的なもののみであることを示す同様の表現型を生成した。ノックアウト及びキナーゼ死マウスを使用する研究の解釈は、これらのモデルは免疫系の定常状態の描写のみを提供し、経時的及び用量対照を欠如し、動的免疫反応が可逆的阻害に対してどのように反応するのかについての完全な理解を許容しないため、困難であり得る。異なるプロファイル（ＰＩ３Ｋδ、ＰＩ３Ｋγ、及びＰＩ３Ｋδ／γ）を有する選択的阻害剤が、免疫細胞活性化に対するそれぞれのＰＩ３Ｋの相対的な寄与を評価するための、白血球シグナル伝達の研究のために必要である。（Ｏｌｕｓｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１，１２３−１３４を、その中で引用される参考文献を含めて参照されたい）。

ＰＩ３Ｋ δ／γの二重阻害は、気道のアレルギー性炎症及び非アレルギー性炎症、ならびに他の自己免疫疾患における介入計画と強く関係付けられる。喘息及びＣＯＰＤの根底にある、様々な細胞プロセスにおけるＰＩ３Ｋ−δ及びγガンマの関与の科学的根拠は、阻害剤研究及び遺伝子標的化アプローチに由来する。また、幾人かのＣＯＰＤ患者におけるコルチコステロイド等の従来の治療法に対する耐性は、ＰＩ３Ｋ δ／γ経路の上方制御に帰するとされている。したがって、ＰＩ３Ｋ δ／γシグナル伝達の破壊は、免疫炎症反応に対抗することを目的とする新規の計画を提供する。白血球遊走及び活性化等の炎症性細胞の機能性を媒介することにおける、ＰＩ３Ｋ δ及びγによって果たされる中心的な役割、ならびにマスト細胞脱顆粒のために、これらのアイソフォームを遮断することもまた、リウマチ性関節炎の治療のための有効な計画であり得る。免疫監視におけるこれらのアイソフォームの確立された重要性を考慮すると、デルタ及びガンマアイソフォームを特異的に標的化する阻害剤は、気道炎症及びリウマチ性関節炎において遭遇される免疫反応の進行を減弱することが期待される。免疫監視におけるこれらのアイソフォームの確立された重要性を考慮すると、δ及びγアイソフォームを特異的に標的化する阻害剤は、気道炎症及びリウマチ性関節炎において遭遇される免疫反応の進行を減弱することが期待される（Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ．ａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１２３−１３４，２０１０、及びＴｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１０１−１０２，２０１０）ＰＩ３Ｋ及び関連するタンパク質キナーゼ経路に関する再考察及び研究は、Ｐｉｘｕ Ｌｉｕ ｅｔ．ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００９，８，６２７−６４４）、Ｎａｔｈａｎ Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２００９；８（１）Ｊａｎ．，２００９）、Ｒｏｍｉｎａ Ｍａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ．，１７８４（２００８）１５９−１８５）及び２００９年８月に公開されたＭａｒｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅ Ａｃｃｅｓｓ）によって示されている。同様に、ＰＩ３Ｋ δ及びγの役割に関する再考察及び研究は、Ｗｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７：１２３−１３４，２０１０及びＴｉｍｏｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（ウェブ公開２０１２年８月２７日）によって示されている。これらの文献開示の全ては、参照としてそれらの全体が全目的で本明細書に組み込まれる。

ＩＰＩ−１４５及びＣＡＬ１３０等の、最近開発された化合物は、Ｐｉ３Ｋ δ／γの二重阻害剤として報告されている。ＩＰＩ−１４５は、癌に対して、ならびに喘息に対して臨床研究下にある。ＣＡＬ−１３０がいずれの臨床目的でも研究されているという報告は現在のところ存在しない。

本明細書において、２０１０年１１月３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００２８０４号、及び２０１２年５月４日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３６５９４号、米国特許出願第１２／９３８，６０９号、及び２０１２年５月４日に出願された同第１３／４６４，５８７号に開示される化合物、ならびに国際公開第ＷＯ ２００９／０８８９８６号、同第ＷＯ ２００９／０８８９９０号、同第ＷＯ ２０１１／００８３０２号、及び同第ＷＯ ２０１２／０９７０００号に開示される化合物をさらに参照し、これらの文献の各々は、参照によりその全体が全目的で本明細書に組み込まれる。

コルチコステロイドは強力な抗炎症剤であり、炎症細胞の数、活性、及び動きを減少させることができる。コルチコステロイドは、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、及び自己免疫疾患を含む、広範な慢性及び急性炎症状態を治療するために一般的に使用される。コルチコステロイドは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）を介してその効果を媒介する。コルチコステロイドのＧＲへの結合は、その核移行を誘導し、これは順に、ＤＮＡ結合依存性（例えば、トランス活性化）及び非依存性（例えば、トランス発現）メカニズムを介して、いくつかの下流経路に影響を及ぼす。

肺の慢性炎症状態（例えば、喘息及びＣＯＰＤ）を治療するためのコルチコステロイドは、現在、吸入によって投与されている。吸入コルチコステロイド（ＩＣＳ）を使用する利点の１つが、作用部位に薬物を直接送達し、それにより全身性の副作用を制限し、より迅速な臨床応答及びより高い治療可能比をもたらす可能性である。

ＩＣＳ治療は、特に喘息において重要な利益をもたらすことができるが、慢性投与に関連し得る望ましくない副作用の発生及び重症度をもたらすＩＣＳ全身性曝露を最小限に抑えることが重要である。さらに、臨床現場で現在利用可能なＩＣＳの作用期間の制限が、この疾患の最適以下の管理に寄与している。吸入器技術は肺を標的とする重要な点であるが、コルチコステロイド分子骨格上の置換基の調節は、経口バイオアベイラビリティを低下させるために薬物動態学的及び薬力学的特性を最適化するために重要であり、肺においてのみ薬学的活性を制限し（プロドラッグ及びソフトドラッグ）、全身クリアランスを増加させる。さらに、ＩＣＳの１日１回の投与が投与頻度の減少を可能にし、したがって、患者のコンプライアンスを実質的に改善し、結果として疾患の管理及び制御を可能にするので、肺における長期にわたるＩＣＳ活性が非常に望ましい。要するに、改善された薬物動態学的及び薬力学的特性を有するＩＣＳを開発するための緊急の医学的必要性がある。

グルココルチコイドイソオキサゾリジン誘導体は、例えば、第ＷＯ２００６／００５６１１号、第ＧＢ １，５７８，４４６号、及び“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｏｍｅ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ［１６α，１７α−ｄ］ ｉｓｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｓ”，Ｍ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２５，１４９２−１４９５，１９８２、に記載され、これらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。更なるグルココルチコイドイソオキサゾリジン誘導体また、第ＷＯ ２０１１／０２９５４７号、及び第ＷＯ ２０１２／１２３４８２号に記載されている。

現在利用可能な介入療法にもかかわらず、ＲＡ、乾癬等の自己免疫性疾患、ならびに喘息及びＣＯＰＤ等の呼吸器疾患は、重大な満たされていない医学的必要性を伴う疾患クラスのままである。

したがって、本発明の目的は、呼吸器疾患及び／または炎症性疾患ならびに高活性を有する状態を治療するための方法及び薬学的組成物を提供することである。薬学的組成物は、より少量の活性化合物（複数可）で自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患ならびに状態を治療することを可能にし、ならびに／または、より効率的な方法で自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患ならびに状態を治療することを可能にし、したがって高用量及び／または長い期間の活性化合物による、任意の種類の治療に一般的に関連する既存の副作用をおそらく最小限にするか、回避する。

本明細書に記載されるように、いずれかの阻害剤単独のものと比較してより低い用量で有効であるために、２つの多様であるが相補的な経路に影響を及ぼす薬物を組み合わせることによって、本目的が達成され得る。したがって、本発明は、ともに組み合わせた場合に有意な治療可能性を保持する２つの異なるシグナル伝達経路を組み合わせる有効なアプローチを提供する。特に、組み合わせは、コルチコステロイド、及び二重ＰＩ３Ｋデルタ−ガンマ阻害剤のいずれかまたは両方の、必要とされる治療有効濃度を低下させるのに治療上有益である。

第ＷＯ２００６／００５６１１号 第ＧＢ １，５７８，４４６号 第ＷＯ ２０１１／０２９５４７号 第ＷＯ ２０１２／１２３４８２号

"Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｏｍｅ ｓｔｅｒｏｉｄａｌ［１６α，１７α−ｄ］ ｉｓｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｅｓ"，Ｍ．Ｊ．Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２５，１４９２−１４９５，１９８２、

本発明は、自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患ならびに状態を治療するための、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ二重阻害剤、ならびに少なくとも１つのコルチコステロイドを含む、薬学的組成物、ならびにそのような薬学的組成物の使用に関する。
一実施形態は、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ二重阻害剤、ならびに少なくとも１つのコルチコステロイドを含む、薬学的組成物である。
別の実施形態は、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびに少なくとも１つのコルチコステロイドを患者に投与することを含む、自己免疫性、呼吸器、及び／もしくは炎症性疾患または状態に苦しむ患者を治療するための方法である。好ましい一実施形態において、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ二重阻害剤、ならびに少なくとも１つのコルチコステロイドは、単一の薬学的組成物においてともに投与される。好ましい一実施形態において、疾患または状態は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、喘息、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、またはＣＯＰＤである。

さらに別の実施形態は、喘息、ＲＡ、またはＣＯＰＤ等の、自己免疫性、呼吸器及び／もしくは炎症性疾患または状態の患者における治療のための、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ二重阻害剤、ならびに少なくとも１つのコルチコステロイドの組合せの使用である。

好ましい実施形態において、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ二重阻害剤は、式Ａの化合物（以下に示す）またはその薬学的に許容可能な塩である。

好適なコルチコステロイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、コルチゾン、ナフロコート、デフラザコート、酢酸ハロプレドン、ブデソニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、ピバリン酸クロコルトロン、アセポン酸メチルプレドニゾロン、パルミチン酸デキサメタゾン、チプレダン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、プレドニカルベート、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、ハロメタゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、リメキソロン、ファルネシル酸プレドニゾロン、シクレソニド、プロピオン酸デプロドン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸ハロベタゾール、エタボン酸ロテプレドノール、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、フルニソリド、プレドニゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、トリアムシノロン、１７−吉草酸ベタメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酪酸プロピオン酸（ｐｒｏｂｕｔａｔｅ）ヒドロコルチゾン、及びその薬学的に許容可能な塩を含むが、これに限定されない。

好ましい実施形態では、該コルチコステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、コルチゾン、及び前述のいずれかの任意の組み合わせから選択される。

一実施形態は、式Ａの化合物またはその薬学的に許容可能な塩、及びコルチコステロイドを含む薬学的組成物である。好ましい一実施形態において、薬学的組成物は、治療有効量の化合物式Ａまたはその薬学的に許容可能な塩、及び治療有効量のコルチコステロイド（例えば、喘息、ＲＡ、またはＣＯＰＤを治療するため）を含む。

別の実施形態は、喘息、ＲＡ、またはＣＯＰＤ等の、自己免疫性、呼吸器、及び／もしくは炎症性疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に式Ａ、

またはその薬学的に許容可能な塩、及びコルチコステロイドを投与することを含む。好ましい一実施形態において、式Ａの化合物またはその薬学的に許容可能な塩、及び少なくとも１つのコルチコステロイドは、単一の薬学的組成物においてともに投与される。一実施形態において、疾患または状態は喘息である。別の実施形態において、疾患または状態はＲＡである。さらに別の実施形態において、疾患または状態はＣＯＰＤである。

さらに別の実施形態は、喘息、ＲＡ、またはＣＯＰＤ等の、自己免疫性、呼吸器、及び／もしくは炎症性疾患または状態に苦しむ患者を治療する方法であって、患者に式Ａの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、ならびにデキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、もしくはコルチゾン、ならびにそれらの任意の組み合わせを投与することを含む。好ましい一実施形態において、式Ａの化合物またはその薬学的に許容可能な塩、及び少なくとも１つのコルチコステロイドは、単一の薬学的組成物においてともに投与される。

実施例１の手順に従って、ＴＧＦ−β１処理Ａ５４９細胞におけるデキサメタゾン（Ｄｅｘ）のＩＣ_５０への化合物Ａの効果を描写する棒グラフである。 実施例２の手順に従って、Ｈ_２Ｏ_２処理Ｕ９３７細胞におけるＩＬ−８濃度についてデキサメタゾン（Ｄｅｘ）のＩＣ_５０への化合物Ａの効果を描写する棒グラフである。 実施例３の手順に従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＢＡＬＦ中のタバコ煙誘導免疫細胞浸潤への化合物Ａの効果を描写する棒グラフである。 実施例３の手順に従って、ＢＡＬＦ中のサイトカインへの化合物Ａの効果を描写する棒グラフである。 実施例４の手順に従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＢＡＬＦ中のタバコ煙誘導マクロファージ浸潤への化合物Ａ及びフルチカゾンの効果を描写する棒グラフである。 実施例４の手順に従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＢＡＬＦ中のタバコ煙誘導マクロファージ浸潤への化合物Ａ及びフルチカゾンの組み合わせの効果を描写する棒グラフである。 実施例６の手順に従って、化合物Ａ（０．０１ｎＭ〜１００μＭ）またはデキサメタゾンの存在下でＣＳＥ５％で刺激した健常者及びＣＯＰＤ患者の好中球に対するＩＬ−８濃度依存性阻害曲線を描写する棒グラフである。 実施例６の手順に従って、０．１ｎＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭの濃度の化合物Ａに、１ｎＭの一定濃度のデキサメタゾンを添加することにより、ＣＯＰＤ患者の好中球におけるＣＳＥ誘導性ＩＬ−８放出の阻害を描写する棒グラフである。 実施例７の手順に従って、ＣＳＥ５％単独、または１０ｎＭもしくは１００ｎＭの化合物Ａの存在下で刺激した相対ＭＫＰ１ ｍＲＮＡ発現を描写する棒グラフである。 実施例７の手順に従って、ＣＳＥ５％単独、または１０ｎＭもしくは１００ｎＭの化合物Ａの存在下で刺激した相対ＰＩ３Ｋγ ｍＲＮＡ発現を描写する棒グラフである。 は、ＣＳＥ５％単独、ＣＳＥ５％及び１０ｎＭの化合物Ａ、または１０ｎＭの化合物Ａ単独の存在下でのＰＩＰ３産生を描写する棒グラフである。

一態様では、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤（例えば、式Ａの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩）を、本明細書の実施形態のいずれかに記載のコルチコステロイドと組み合わせる方法は、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、またはコルチコステロイド単独の個々の活性に基づいて期待される活性よりも有意に高い活性（すなわち、相乗活性）を呈する。

別の態様では、コルチコステロイド単独では単一の薬剤として感受性でない場合でも、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤（例えば、式Ａの化合物またはその薬学的に許容可能な塩）をコルチコステロイドと組み合わせる方法は、活性を呈する。

したがって、本明細書に記載の方法は、より少量の活性化合物（複数可）で、自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患ならびに状態を治療することを可能にし、ならびに／または、より効率的な方法でより長い期間にわたって、自己免疫性、呼吸性、及び炎症性疾患ならびに状態を治療することを可能にする。

別の実施形態は、自己免疫性、呼吸器及び／または炎症性疾患ならびに状態の治療に使用するための、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤（例えば、式Ａの化合物またはその薬学的に許容可能な塩）と、コルチコステロイドとを含む、薬学的組成物である。

さらに別の実施形態は、自己免疫性、呼吸器、及び／もしくは炎症性疾患または状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明に従う治療有効量の薬学的組成物を投与することを含む。

さらに別の実施形態は、自己免疫性、呼吸器、及び／もしくは炎症性疾患または状態を治療するのに有用な薬物を製造するための、本明細書に記載の任意の実施形態に従う薬学的組成物の使用である。

本明細書に記載の医薬組成物において、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ二重阻害剤（例えば、式Ａの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩）は、薬学的に許容可能な酸もしくは塩基との溶媒和物、水和物、及び／または塩から選択される形態であり得る。

本明細書に記載の薬学的組成物において、コルチコステロイドは、薬学的に許容可能な酸もしくは塩基との溶媒和物、水和物、または塩から選択される形態であり得る。

本発明のさらに別の実施形態は、免疫系関連疾患（例えば、自己免疫疾患）、炎症を伴う疾患もしくは障害（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、糸球体腎炎、神経炎症性疾患、多発性硬化症、ブドウ膜炎、及び免疫系の障害）、癌もしくは他の増殖性疾患、肝臓疾患もしくは障害、または腎臓疾患もしくは障害を治療する方法である。本方法は、有効量の本発明の１つ以上の組成物を投与することを含む。

本明細書に記載される方法及び組成物によって治療され得る免疫障害の例は、乾癬、リウマチ性関節炎、脈管炎、炎症性腸疾患、皮膚炎、骨関節炎、喘息、炎症性筋肉疾患、アレルギー性鼻炎、腟炎、間質性膀胱炎、強皮症、骨粗鬆症、湿疹、同種または異種移植片（臓器、骨髄、幹細胞、ならびに他の細胞及び組織）拒絶、移植片対宿主病、ループスエリテマトーデス、炎症性疾患、Ｉ型糖尿病、肺線維症、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、甲状腺炎（例えば、橋本甲状腺炎及び自己免疫甲状腺炎）、重症筋無力症、自己免疫溶血性貧血、多発性硬化症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性再発肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アレルギー性結膜炎ならびにアトピー性皮膚炎を含むが、これに限定されない。

本明細書に記載されるような、薬学的に許容される塩は、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、及びＭｎ等の無機塩基に由来する塩；Ｎ，Ｎ’−ジアセチルエチレンジアミン、グルカミン、トリエチルアミン、コリン、水酸化物、ジシクロヘキシルアミン、メトホルミン、ベンジルアミン、トリアルキルアミン、及びチアミン等の有機塩基の塩；アルキルフェニルアミン、グリシノール、フェニルグリシノール等のキラル塩基の塩；グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、チロシン、シスチン、システイン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、ヒスチジン、オミチン、リジン、アルギニン、及びセリン等の天然アミノ酸の塩；ＭｅＩ（ヨウ化メチル）及び（Ｍｅ）_２ＳＯ_４等のハロゲン化アルキル、硫酸アルキルとの、本発明の化合物の四級アンモニウム塩；Ｄ異性体または置換アミノ酸等の非天然アミノ酸の塩；グアニジンの塩；ならびに置換基が、ニトロ、アミノ、アルキル、アルケニル、アンモニウム、または置換アンモニウム塩及アルミニウム塩から選択される、置換グアニジンの塩を含む。塩は、適切な場合、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、過塩素酸塩、ホウ酸塩、ハロゲン化水素酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、パルモ酸塩、メタンスルホン酸塩、安息香酸塩、サリチル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、アスコルビン酸塩、グリセロリン酸塩、及びケトグルタル酸塩である、酸付加塩を含み得る。

本明細書で範囲が使用される場合、その中の範囲及び特定の実施形態の全ての組み合わせ及び部分的組み合わせが含まれることが意図される。数または数の範囲に言及する場合の「約」という用語は、言及される数または数の範囲が、実験のばらつき内（または統計的な実験誤差内）の近似値であり、したがって、数または数の範囲が、例えば、記載される数または数の範囲の１％〜１５％変動し得ることを意味する。「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「有している（ｈａｖｉｎｇ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の関連する用語）は、説明される特徴から「なる」または「本質的になる」実施形態、例えば、任意の組成物、組成、方法、またはプロセス等の実施形態を含む。

以下の略語及び用語は、本明細書を通して示された意味を有する：ＰＩ３−Ｋ＝ホスホイノシチド３−キナーゼ、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール。

本明細書で使用される略語は、別段示されない限り、化学及び生物学分野内でのそれらの従来の意味を有するものとする。

「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」または「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、後に定義されるような疾患の治療を含むが、これらに限定されない、意図する用途を達成するのに十分な、本明細書に説明される化合物の量を指す。治療有効量は、意図する用途（インビトロもしくはインビボ）、または治療を受ける対象及び状態、例えば、対象の体重及び年齢、状態の重症度、及び投与様式等に応じて変化してもよく、それは当業者によって容易に判定され得る。またこの用語は、標的細胞における特定の反応、例えば、血小板粘着及び／または細胞遊走の減少を誘導する用量にも適用される。特定の用量は、選択される具体的な化合物、従うべき投与計画、他の化合物と併用投与されるかどうか、投与のタイミング、投与される組織、及び運ばれる物理的な送達系に応じて変化する。

本明細書で使用される場合、用語「治療」及び「治療すること」は、治療的有益性及び／または予防的有益性を含むが、これに限定されない、有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的有益性とは、治療される基礎疾患の根絶または寛解を意味する。また、治療的有益性は、基礎疾患に関連する生理的症状のうちの１つ以上の根絶または寛解によって得られるため、患者が依然として基礎疾患に苦しめられている場合でも、その患者において改善が観察される。予防的有益性の場合、たとえこの疾患の診断が下されていない場合であっても、特定の疾患を発症するリスクのある患者、または疾患の生理的症状のうちの１つ以上を報告する患者に、組成物を投与することができる。

本明細書で使用される場合の「治療効果」は、前述の治療的有益性及び／または予防的有益性を包含する。予防効果は、疾患もしくは状態の出現を遅延させるもしくは排除すること、疾患もしくは状態の症状の発現を遅延させるもしくは排除すること、疾患もしくは状態の進行を遅らせる、停止する、もしくは逆転させること、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

用語「対象」または「患者」は、哺乳動物等の動物、例えばヒトを指す。本明細書に説明される方法は、ヒトの治療用途及び獣医学的用途の両方において有用であり得る。いくつかの実施形態において、患者は哺乳動物であり、いくつかの実施形態において、患者はヒトである。獣医学的目的では、用語「対象」及び「患者」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヤギを含む家畜動物；イヌ及びネコ等の伴侶動物；エキゾチックな及び／または動物園の動物；マウス、ラット、ウサギ、モルモット、及びハムスターを含む実験動物；ならびにニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ等の家禽類を含むが、これらに限定されない。

生物学的に活性な薬剤に対して適用される用語「選択的阻害」または「選択的に阻害する」は、標的との直接的または間接的な相互作用を介して、非特異的なシグナル伝達活性と比較して標的シグナル伝達活性を選択的に減少させる薬剤の能力を指す。

本明細書で使用される場合、用語「二重ＰＩ３−キナーゼデルタ（δ）及びガンマ（γ）阻害剤（ｄｕａｌ ＰＩ３−ｋｉｎａｓｅ Ｄｅｌｔａ （δ） ａｎｄ Ｇａｍｍａ （γ） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、ＰＩ３−キナーゼδ及びγアイソザイム両方の活性をＰＩ３Ｋファミリーの他のアイソザイムよりも効果的に阻害する化合物を一般的に指す。したがって、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ二重阻害剤化合物は、「非選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤」であるＣＡＬ−１３０、ワートマニン、及びＬＹ２９４００２等の従来のＰＩ３Ｋ阻害剤よりもＰＩ３−キナーゼδ及びγに対してより選択的である。「二重ＰＩ３−キナーゼデルタ（δ）及びガンマ（γ）阻害剤」の例は、ＩＰＩ−１４５等の化合物、ならびに２０１０年１１月３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００２８０４号、及び２０１２年５月４日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３６５９４号、米国特許出願第１２／９３８，６０９号、及び２０１２年５月４日に出願された同第１３／４６４，５８７号に開示される化合物、ならびに国際公開第ＷＯ ２００９／０８８９８６号、同第ＷＯ ２００９／０８８９９０号、同第ＷＯ ２０１１／００８３０２号、及び同第ＷＯ ２０１２／０９７０００号に開示される化合物を含むが、これらに限定されず、これらの文献の各々は、参照によりその全体が全目的で本明細書に組み込まれる。

例えば、二重ＰＩ３−キナーゼδ及びγ選択的阻害剤は、他の型のＰＩ３キナーゼ（すなわちアルファ及びベータ）に対する阻害剤の５０％阻害濃度（ＩＣ_５０）よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍低い、デルタ及びガンマＩ型ＰＩ３−キナーゼに対するＩＣ_５０を示す化合物を指し得る。

ＰＩ３−キナーゼδ及びγの阻害は、種々の状態、例えば、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、及び関節炎疾患を含むが、これに限定されない炎症反応を特徴とする状態の治療において、治療的に有用であり得る。重要なことに、ＰＩ３−キナーゼδ及びγ機能の阻害は、生存能及び受精能等の生物学的機能に影響を及ぼさないようである。

「炎症反応」は、本明細書で使用される場合、赤み、熱、腫脹、及び疼痛（すなわち、炎症）を特徴とし、典型的には組織損傷または組織破壊を伴う。炎症反応は、通常、組織の損傷または破壊によって誘発される局所的な防御反応であり、傷害性物質及び損傷組織の両方を破壊するか、希釈するか、または囲む（隔絶する）役割を果たす。炎症反応は、とりわけ、白血球の流入及び／または白血球（例えば、好中球）の走化性の流入に関連している。炎症反応は、病原体及びウイルスによる感染、心筋梗塞または脳卒中後の外傷または再灌流等の非感染性手段、外来抗原に対する免疫応答、ならびに自己免疫疾患等に起因し得る。本発明による方法及び化合物を用いた治療に適した炎症反応は、特定の防御システムの反応に関連する状態だけでなく、非特定の防御システムの反応に関連する状態も包含する。

本発明の治療方法は、炎症性細胞の活性化に関連する状態の治療のための方法を含む。「炎症性細胞の活性化」は、増殖細胞応答の刺激（サイトカイン、抗原、もしくは自己抗体を含むが、これに限定されない）、可溶性メディエーター（サイトカイン、酸素ラジカル、酵素、プロスタノイド、もしくは血管作動性アミンを含むが、これに限定されない）の産生、または炎症細胞（単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球（好中球、好塩基球、及び好酸球を含む多形核白血球）、マスト細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、及び内皮細胞を含むが、これに限定されない）中の新しいまたは数の増加したメディエーター（主要組織適合抗原もしくは細胞接着分子を含むが、これに限定されない）の細胞表面発現による誘導を指す。当業者は、これらの細胞におけるこれらの表現型のうちの１つまたは組み合わせの活性化が、炎症性状態の開始、永続化、または増悪に寄与し得ることを理解するであろう。

「自己免疫疾患」は、本明細書で使用される際、組織損傷が体自身の成分に対する液性反応または細胞媒介反応と関連する障害の任意の群を指す。

「移植拒絶」は、本明細書で使用される場合、移植された細胞（移植された組織及び周囲の組織の機能の喪失、疼痛、腫、白血球増加症、及び血小板減少症を特徴とする臓器または細胞（例えば、骨髄）を含む）に対して向けられる免疫反応を指す。

「アレルギー性疾患」は、本明細書で使用される場合、アレルギーに起因するあらゆる症状、組織損傷、または組織機能の喪失を指す。

「関節炎疾患」は、本明細書で使用される場合、様々な病因に起因する関節の炎症性病変を特徴とするあらゆる疾患を指す。

「皮膚炎」は、本明細書で使用される場合、様々な病因に起因する皮膚の炎症を特徴とする大きな一群の皮膚疾患のいずれかを一般的に指す。

一実施形態は、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤（例えば、式Ａの化合物またはその薬学的に許容可能な塩）、ならびに少なくとも１つのコルチコステロイド、ならびに任意に１つ以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、薬学的組成物である。

一実施形態において、薬学的組成物は、治療有効量の二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤（例えば、式Ａの化合物またはその薬学的に許容可能な塩）、及び少なくとも１つのコルチコステロイド、及び任意に１つ以上の薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。薬学的組成物は、本明細書に説明されるような１つ以上の追加の活性成分を含み得る。

薬学的担体及び／または賦形剤は、希釈剤、充填剤、塩、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、湿潤剤、制御放出マトリックス、着色剤、香味剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、及びそれらの組み合わせから選択され得る。

本発明の薬学的組成物は、単独で、または１つ以上の他の活性剤と組み合わせて投与され得る。所望される場合、対象化合物及び他の薬剤（複数可）は調製物内に混合され得るか、または両方の成分はそれらを組み合わせで別個に、もしくは同時に使用するために、別個の調製物内に製剤化され得る。

二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびにコルチコステロイドは、１つ以上の他の活性薬剤とともにまたは順次的様式で投与することができる。所望される場合、対象化合物及び他の薬剤（複数可）を同時投与してもよく、または両方の成分を組み合わせてそれらを使用する順序で投与してもよい。

本発明の化合物及び薬学的組成物は、経口的に、鼻腔内に、局所的に（例えば、経皮的に）、十二指腸内に、非経口的に（静脈内に、動脈内に、筋肉内に、血管内に、腹腔内に、または注射もしくは注入によるものを含む）、皮内に、乳房内に、髄腔内に、眼内に、眼球後に、肺内に（例えば、エアロゾル化した薬物）、または皮下に（例えば、脾膜下、脳、または角膜内に埋め込まれた長期放出のためのデポー投与を含む）、舌下に、経肛門的に、経直腸的に、経膣的に、または外科的移植によって（例えば、脾膜下、脳、または角膜内に埋め込まれる）によって等、作用部位に化合物を送達することができる任意の経路によって投与され得る。

組成物は、固体、半固体、液体、もしくは気体の形態で投与することができるか、または凍結乾燥形態等の乾燥粉末として投与されてもよい。薬学的組成物は、例えば、カプセル剤、サシェ剤、カシェ剤、ゼラチン剤、シート剤、錠剤、坐剤、ペレット剤、丸剤、トローチ剤、及びロゼンジ剤等の個体剤形を含む、送達に都合のよい形態に充填することができる。包装のタイプは、一般的に、所望の投与経路に依存する。移植可能な徐放製剤、同様に経皮製剤もまた企図される。

本化合物の投薬頻度は様々であり得る。例えば、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤は、１日２回から３週間に１回の範囲の頻度で投与されてもよい。コルチコステロイドは、１日２回から３週間に１回の範囲の頻度で投与されてもよい。

投与される化合物の量は、治療される哺乳動物、障害または状態の重症度、投与速度、化合物の処分、及び処方する医師の裁量に依存する。しかしながら、有効投与量は、単回用量または分割用量で、１日に体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約１００ｍｇ、好ましくは約１〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内である。７０ｋｇのヒトにおいて、これは約０．０５〜７ｇ／日、好ましくは約０．０５〜約２．５ｇ／日に達する。本発明の化合物の有効量は、単回用量または複数用量（例えば、１日２回または３回）で投与され得る。

一実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば、約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、もしくは約０．０１０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、もしくは約０．０３０ｍｇ〜約１２５ｍｇの二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤（例えば、式Ａの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩）、ならびに／または約０．００１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、例えば約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、もしくは約０．０１０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、もしくは約０．０１０ｍｇ〜約１２５ｍｇ、もしくは約０．０３０ｍｇ〜約５０ｍｇの少なくとも１つのコルチコステロイドを含む。

一実施形態では、本明細書に記載の薬学的組成物は、約１００：１〜約１：１００の重量比、例えば約５０：１〜約１：５０の重量比、または約１：１０〜約１０：１の重量比、または約１：５〜約５：１の重量比で、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびにコルチコステロイドを含む。

本明細書で使用される場合、用語「同時投与」、「との組み合わせで投与される」及びそれらの文法的等価物は、薬剤及び／またはそれらの代謝物の両方が同時に動物内に存在するための、２つ以上の薬剤（例えば、二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびにコルチコステロイド）の動物に対する投与を包含する。同時投与は、別個の組成物における同時投与、別個の組成物における異なる時間の投与、または両方の薬剤が存在する組成物における投与を含む。

本明細書に記載される薬学的組成物は、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニドまたはコルチゾンプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ナフロコート、デフラザコート、酢酸ハロプレドン、ブデソニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、ピバリン酸クロコルトロン、アセポン酸メチルプレドニゾロン、パルミチン酸デキサメタゾン、チプレダン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、プレドニカルベート、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、ハロメタゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、リメキソロン、ファルネシル酸プレドニゾロン、シクレソニド、プロピオン酸デプロドン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸ハロベタゾール、エタボン酸ロテプレドノール、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、フルニソリド、プレドニゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、トリアムシノロン、１７−吉草酸ベタメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸プレドニゾロンナトリウム、及び酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、ならびに前述のいずれかの任意の組み合わせから選択される、１つ以上のコルチコステロイドを含有し得る。

特定の実施形態において、コルチコステロイドは、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、またはコルチゾン、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。

本発明の特定の一実施形態は、コルチコステロイドがフルチカゾンである薬学的組成物に関する。

本発明の別の特定の実施形態は、コルチコステロイドがブデソニドである薬学的組成物に関する。

本発明のさらに別の特定の実施形態は、コルチコステロイドがプレドニゾロンである薬学的組成物に関する。

本発明のさらに別の特定の実施形態は、コルチコステロイドがデキサメタゾンである薬学的組成物に関する。

本発明の更なる実施形態は、急性気管支炎、慢性気管支炎、慢性閉塞性気管支炎（ＣＯＰＤ）、咳、肺気腫、アレルギー性または非アレルギー性鼻炎または副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎または鼻炎、鼻ポリープ症、慢性鼻副鼻腔炎、急性鼻副鼻腔炎、喘息、アレルギー性気管支炎、肺胞炎、ファーマー病、過敏性気道、例えばバクテリアまたはウイルスまたはヘルミントまたは真菌または原虫または他の病原体等による感染によって引き起こされる気管支炎または肺炎、小児喘息、気管支拡張症、肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、気管支及び肺水腫、例えば有毒ガス、蒸気の吸引、吸入等の異なる起源によって引き起こされる気管支炎または肺炎または間質性肺炎、心不全、Ｘ線、放射線、化学療法によって引き起こされる気管支炎または肺炎または間質性肺炎、ループスエリテマトーデス、全身性強皮症、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の膠原病に関連する気管支炎または肺炎または間質性肺炎、甲状腺腫またはサルコイドーシス、肉芽腫症、嚢胞性線維症またはムコビシドーシス、またはα−１−抗トリプシン欠乏症を含む異なる起源の間質性肺疾患または間質性肺炎のような、粘液の産生増加もしくは変更ならびに／または気道の炎症性ならびに／または閉塞性疾患を伴う気道及び肺の疾患のような、呼吸器疾患及び状態から選択されるか、炎症性偽ポリープ、クローン病、潰瘍性大腸炎のような例えば種々の起源の胃腸管の炎症性疾患、リウマチ様関節炎のような例えば関節の炎症性疾患、またはアトピー性皮膚炎、季節性及び多年性、慢性尿道炎、原因不明の蕁麻疹及びアレルギー性結膜炎のような例えば鼻咽頭、皮膚または眼のアレルギー性炎症性疾患等、炎症性疾患ならびに状態から選択され、そして特に、喘息、アレルギー性及び非アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、及びアトピー性皮膚炎から選択される、徴候を治療する方法であり、本発明に従う薬学的組成物の治療有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む。

発明のさらなる実施形態は、呼吸器及び／または炎症性疾患ならびに状態を治療する薬物を製造するため、特に、呼吸器及び／または炎症性疾患ならびに状態が、喘息、アレルギー性及び非アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、ならびにアトピー性皮膚炎である、本発明に従う薬学的組成物の使用に関する。

本発明のさらなる実施形態は、呼吸器及び炎症性疾患ならびに状態の治療に使用するため、特に、呼吸器及び炎症性疾患または状態が、喘息、アレルギー性及び非アレルギー性鼻炎、ＣＯＰＤ、ならびにアトピー性皮膚炎である、本明細書の任意の実施形態に従う薬学的組成物に関する。

本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに例証する。

以下に、ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ二重阻害剤、ならびにコルチコステロイドの組み合わせの例証となる実施例を示す。

実施例１：Ａ５４９細胞におけるＴＧＦ−β１誘導コルチコステロイド不感受性
試験手順
Ａ５４９細胞をトリプシン処理し、１ウェルあたり２×１０４細胞を９６ウェルプレート内に播種し、３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。

培地を除去し、０．１μＭの化合物Ａを含む１００μｌの無血清培地を加え、３０分間インキュベートした。

最終濃度が４００ｐＭとなるように、０．５％ＢＳＡを含むＦ１２Ｋ中に５０μｌの３Ｘ ＴＧＦ−β１を添加し、３７℃及び５％ＣＯ_２で４時間インキュベートした。

５０μｌの４Ｘの所望の濃度のデキサメタゾンを添加し、３７℃及び５％ＣＯ_２で４５分間インキュベートした。

最終濃度が１ｎｇ／ｍｌとなるように、５０μｌの５Ｘ濃度のＴＮＦ−αの添加しＩＬ−８を誘導して２４時間インキュベートした。

上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−８を推定した。

サイトカインアッセイ
ＩＬ−８ストリップを新鮮なまたは解凍上清で播種し、室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。

内容物を捨て、ストリップを１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝剤で１５秒間合計５回洗浄した。

ストリップを乾燥させてブロットし、１ウェル当たり１００μｌの１Ｘ検出抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。

内容物を捨て、ストリップを１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝剤で１５秒間合計５回洗浄した。

ストリップを乾燥させてブロットし、１ウェル当たり１００μｌの１Ｘ Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ抗体を加え、室温で３０分間インキュベートした。

内容物を捨て、ストリップを１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝剤で１５秒間合計５回洗浄した。

１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質を添加し、室温で５〜１５分間インキュベートした。

１ウェル当たり５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより反応を停止させた。

Ａ４５０ｎｍ及びＡ５７０ｎｍで、プレートリーダー上で吸光度を読み取った。

ブランク減算吸光度値の％阻害を、対照ウェルに基づいて決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ５．０２）を使用して、データをプロットした。

結果
結果を図１Ａに描写する。化合物Ａ（Ｃｐｄ Ａ）は、ＴＧＦ−β１処理Ａ５４９細胞におけるＩＬ−８濃度についてデキサメタゾンのＩＣ_５０を減少させ、デキサメタゾン活性の有意な増強を示した。

実施例２：Ｕ９３７細胞におけるＨ_２Ｏ_２誘導コルチコステロイド不感受性
試験手順
Ｕ９３７細胞を、１５ｍＭグルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。１２ｍｌの新鮮な培地を含むＴ−２５フラスコに６×１０^６個の細胞を入れ、１μＭの化合物Ａで処理し、３７℃及び５％ＣＯ_２ で３０分間インキュベートした。

２００μＭの最終濃度でＨ_２Ｏ_２を上記の細胞に添加し、２時間インキュベートした。

細胞をペレット化し、無血清培地に再懸濁し、１００μｌ中に１ウェルあたり０．１５×１０^６個／μｌの細胞で９６ウェルプレートに播種した。

所望の濃度の５０μｌの３Ｘデキサメタゾンを添加し、４５分間インキュベートした。

最終濃度が１０ｎｇ／ｍｌであるように、５０μｌの４Ｘ濃度のＴＮＦ−αの添加し、ＩＬ−８を誘導して１８時間インキュベートした。

上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−８を推定した。

サイトカインアッセイ
ＩＬ−８ストリップを新鮮なまたは解凍上清で播種し、室温で２時間または４℃で一晩インキュベートした。

内容物を捨て、ストリップを１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝剤で１５秒間合計５回洗浄した。

ストリップを乾燥させてブロットし、１ウェル当たり１００μｌの１Ｘ検出抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。

内容物を捨て、ストリップを１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝剤で１５秒間合計５回洗浄した。

ストリップを乾燥させてブロットし、１ウェル当たり１００μｌの１Ｘ Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ抗体を加え、室温で３０分間インキュベートした。

内容物を捨て、ストリップを１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝剤で１５秒間合計５回洗浄した。

１ウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質を添加し、室温で５〜１５分間インキュベートした。

１ウェル当たり５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することにより反応を停止させた。

Ａ_４５０ｎｍ及びＡ_５７０ｎｍで、プレートリーダー上で吸光度を読み取った。

結果
図１Ｂに描写するように、化合物Ａ（Ｃｐｄ Ａ）は、Ｈ_２Ｏ_２処理Ｕ９３７細胞におけるＩＬ−８濃度についてデキサメタゾンのＩＣ_５０を減少させ、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）活性の有意な増強を示した。

実施例３：雄のＢａｌｂ／ｃマウスにおける慢性タバコ煙誘導細胞浸潤
動物を、実験の開始前に７日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて種々の群にランダムに割り付けた。マウスは、１日目から１１日目まで、２本のタバコの主流煙に曝露された。各タバコの煙への曝露は１０分間継続し（各タバコは最初の２分間に完全に燃焼し、続いて動物用換気装置を用いた気流を発生させた）、新鮮な室内の空気で次の２０分間曝露した。２本のタバコごとに室内の新鮮な空気に曝露することでさらに２０分間休憩させた。対照動物は、室内空気室に曝露した。試験化合物は、全身喫煙曝露３０分前の１２日目から１４日目までの懸濁液として、鼻腔内経路によって投与した。マウスは、１２日目から１４日目まで、１本のタバコの主流煙に曝露された。１５日目に、最後のタバコ煙（ＣＳ）曝露の２４時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の０．５ｍｌアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄した（総体積２ｍｌ）。採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）は、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保存した。ＢＡＬ液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁した。血液細胞計数器を使用してＢＡＬ液及び血液中の白血球の総数を決定し、１×１０^６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算した。サイトスピン３を使用して４０マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製した。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、その形態学的特徴に従って各細胞を同定することにより顕微鏡的に観察した。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を決定してパーセンテージとして表し、各ＢＡＬ液中の好中球及びマクロファージの数を計算した。さらに、ＢＡＬ上清をＥＬＩＳＡアッセイを用いて種々のサイトカインについて分析した。

結果を表１及び図２Ａ及び図２Ｂに示す。

全ての動物が予定終了まで生存した。化合物Ａは、確立されたマウス慢性ＣＯＰＤモデルにおいて、ＢＡＬにおける細胞数の評価によって決定されるような、有意な有益な治療効果を示した。処理動物のＢＡＬ液におけるマクロファージの浸潤は、用量依存的に化合物Ａ（０．００３〜３ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスに見られるＢＡＬ細胞数の有意な減少（正常値に向かって）を伴う疾患対照とは有意に異なった。マクロファージ数は、０．００３〜３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａを与えられたマウスについて正常値に向かって有意に減少した。サイトカインの阻害パーセントを表１に示す。

実施例４：雄のＢａｌｂ／ｃマウスにおける慢性タバコ煙誘導細胞浸潤におけるコルチコステロイド不感受性の逆転
動物を、実験の開始前に７日間気候順応させた。動物をそれらの体重に基づいて種々の群にランダムに割り付けた。マウスは、１日目から１１日目まで、２本のタバコの主流煙に曝露された。各タバコの煙への曝露は１０分間継続し（各タバコは最初の２分間に完全に燃焼し、続いて動物用換気装置を用いた気流を発生させた）、新鮮な室内の空気で次の２０分間曝露した。２本のタバコごとに室内の新鮮な空気に曝露することでさらに２０分間休憩させた。対照動物は、室内空気室に曝露した。コルチコステロイド、フルチカゾンは、全身喫煙曝露３０分前の６日目から１１日目まで、鼻腔内経路によって投与した。マウスは、１２日目から１４日目まで、１本のタバコの主流煙に曝露された。試験化合物は、全身喫煙曝露３０分前の１２日目から１４日目までの懸濁液として、鼻腔内経路によって投与した。１５日目に、最後のタバコ煙（ＣＳ）曝露の２４時間後に、動物を麻酔下で失血させ、気管にカニューレを挿入し、ヘパリン処理したＰＢＳ（１ユニット／ｍｌ）の０．５ｍｌアリコートで気管カニューレを通して４回肺を洗浄した（総体積２ｍｌ）。採取した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）は、総細胞数及び白血球分画数についてアッセイするまで２〜８℃で保存した。ＢＡＬ液を遠心分離し（５００×ｇで１０分間）、得られた細胞ペレットをヘパリン処理した０．５ｍｌの食塩水に再懸濁した。血液細胞計数器を使用してＢＡＬ液及び血液中の白血球の総数を決定し、１×１０^６個の細胞／ｍｌに調節した。細胞分画数を手動で計算した。サイトスピン３を使用して４０マイクロリットルの細胞懸濁液を遠心分離して、細胞スメアを調製した。細胞スメアを鑑別用血液染色液で染色し、その形態学的特徴に従って各細胞を同定することにより顕微鏡的に観察した。細胞スメア中の３００個の白血球の間で各細胞型の数を決定してパーセンテージとして表し、各ＢＡＬ液中の好中球及びマクロファージの数を計算した。さらに、ＢＡＬ上清をＥＬＩＳＡアッセイを用いて種々のサイトカインについて分析した。

フルチカゾン（ＦＬＴ）との組み合わせで、化合物Ａは、マクロファージの浸潤に対し相乗効果を示すことによって、有意な有益な治療効果及びコルチコステロイド非感受性の逆転を示した。この組合せでのＥＤ_５０は、０．０９３ｍｇ／ｋｇの化合物Ａ単独のＥＤ_５０と比較して、ＢＡＬにおける細胞数の評価によって決定される確立されたマウス慢性ＣＯＰＤモデルにおいて、０．０２１ｍｇ／ｋｇであった。結果を図３Ａ及び図３Ｂにも示す。

実施例５：化合物Ａの体外試験のための患者識別、好中球単離、及びタバコ煙抽出液（ＣＳＥ）の調製に関する一般説明
Ａ．患者選択
健康な対象及びＣＯＰＤ患者を、白血球実験のために含めた。肺機能試験（強制肺活量測定）及び動脈血ガス測定はサンプリングの前日に実施した。肺活量測定結果及び喫煙習慣によれば、患者は２つのグループに分類された：Ａ）健康な対象、正常な肺機能を有する患者、及び喫煙していない患者；Ｂ）ＣＯＰＤ、１０パック‐年以上喫煙し、＜８０％予測の１秒間での努力呼気量（ＦＥＶ１）、及び＜７０％のＦＥＶ１努力肺活量（ＦＶＣ）比によって証明された、気流閉塞を有する患者。
患者の臨床的特徴を表２に示す。
表２：臨床的特徴。ＣＯＰＤ：慢性閉塞性肺疾患；ＦＥＶ１：１秒間での努力呼気量。ＦＶＣ：努力肺活量；パック‐年＝１日２０本のタバコを１年喫煙。データは平均±ＳＥである。

末梢好中球及び単球ならびに全血は、ＧＯＬＤガイドラインによって定義されたＣＯＰＤ患者８人、及び７人の健常対象から得た。患者の年齢は６５．１±１４歳、ＦＥＶ１は５８．２±３％予測であった。全ての患者は現在喫煙者であった。血液試料を採取する前の２週間以内に病気の増悪は認められなかった。

呼吸器疾患を有していない正常な肺機能（年齢６６．１±６歳、ＦＥＶ１ ９８±３％予測）を有する７人の年齢が一致した禁煙対照対象も、それぞれ正常対照として募集された。Ｖｉｔａｌｏｇｒａｐｈ（登録商標）ａｌｐｈａ ＩＩＩ肺活量計（Ｖｉｔａｌｏｇｒａｐｈ、Ｍａｉｄｓ Ｍｏｒｅｔｏｎ、ＵＫ）を用いて努力肺活量（ＦＶＣ）、努力呼気量（ＦＥＶ１）、及びＦＥＶ１／ＦＶＣ比を評価するためにルーチンの肺機能検査を行った。このプロジェクトは、スペインバレンシアの総合大学病院地域倫理委員会によって承認され、血液サンプリング及び肺機能検査を開始する前に、各患者またはボランティアから書面による同意を得た。

Ｂ．ヒト好中球の単離
好中球は、標準的な実験手順によって末梢静脈血から単離された。簡潔には、末梢静脈血を２：１の割合で３％デキストラン５００（０．９％生理食塩水中）と混合した。赤血球が沈降するまで、この混合物を室温で３０分間インキュベートした。上層を注意深く回収し、３：１の割合で、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（Ａｍｅｒｓｈａｎ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｅｓｐａｎａ）密度勾配に添加した。生成した２つの相を１５０ｇ、４℃で３０分間遠心分離した。したがって、得られたペレット（好中球と、低比率の残留赤血球と、痕跡量の好酸球及び好塩基球との混合物からなる）を赤血球溶解緩衝剤（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＵＫ）に氷中で５分間再懸濁した。細胞懸濁液をリン酸緩衝剤（ＰＢＳ）で２回洗浄した。調製物は、Ｇｉｅｍｓａ染色によって評価して、好中球で＞９７％の純度であり、トリパンブルー排除によって測定し、＞９９％の生存率を有していた。研究の異なる実験条件で、純度も生存率も影響を受けなかった。

Ｃ．タバコ煙抽出液の調製
ＣＳＥは以下のように調製した。簡潔には、人間の喫煙パターンに関連する吹き出し機構（３回のパフ／分；１パフ３５ｍｌ；フィルターの上に０．５ｃｍの長さの２秒の各パフ）を通して、呼吸ポンプ（Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｒｏｄｅｎｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒ ６８０； Ｈａｒｖａｒｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって研究タバコ（２Ｒ４Ｆ；Ｔｏｂａｃｃｏ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，ＫＹ，ＵＳＡ）の発煙を生成し、２５ｍｌの予熱した（３７℃）ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）−１６４０培地を入れたフラスコに泡立てた。ＣＳＥ溶液を０．２２μｍ酢酸セルロース滅菌システム（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を通す濾過により滅菌した。得られたＣＳＥ溶液は１００％ＣＳＥであると考えられ、３０分間の調製の範囲内で実験に使用された。ＣＳＥ １０％は、１日２パックの喫煙に関連する曝露量にほぼ相当する。調製されたＣＳＥ溶液の品質は、ペルオキシナイトライトの特異的吸収波長である３２０ｎｍでの吸光度に基づいて評価された。３．０±０．１の吸光度値を有するストック溶液を使用した。ＣＳＥの細胞傷害性を試験するために、単離された好中球を５％までのＣＳＥ濃度で２４間処理した。対照群と比較して、乳酸デヒドロゲナーゼ上清レベル（乳酸デヒドロゲナーゼ細胞毒性アッセイ；Ｃａｙｍａｎ、Ｓｐａｉｎ）の有意差は観察されなかった（データ示さず）。

実施例６
アッセイ：健康な非喫煙者及びＣＯＰＤ喫煙者患者からの末梢血好中球における、ＣＳＥ誘導による炎症性マーカーＩＬ−８の分泌に対する化合物Ａ、デキサメタゾン、及びこれらの組み合わせの効果。
健康なボランティア及びＣＯＰＤ患者由来の単離したヒト好中球を、化合物Ａ（０．０１ｎＭ〜１００μＭ）及びデキサメタゾン（０．１ｎＭ〜１μＭ）またはビヒクルと共に３０分間インキュベートした後、標準的な細胞培養条件（３７℃及び５％ＣＯ_２）において６時間、ＣＳＥ ５％と共にまたはなしでインキュベーションした。上清を回収して、異なる炎症マーカーを測定した。

市販のキットを用いてＥＬＩＳＡによりＩＬ−８を測定した。

実験は、実験条件ごとにほぼ３人の患者において３連で実施した。

健常者及びＣＯＰＤ患者からの好中球を、化合物Ａ（０．０１ｎＭ〜１００μＭ）またはデキサメタゾン（ＤＥＸ、０．１ｎＭ〜１μＭ）の存在下、ＣＳＥ５％で６時間刺激し、ＩＬ−８上清を測定した。濃度依存性阻害曲線を図４及び表３に示す。
表３健康な（Ｎ＝３）及びＣＯＰＤ患者（Ｎ＝３）の単離末梢血好中球におけるＩＬ−８放出の阻害。タバコ煙抽出物（ＣＳＥ ５％）に応答して、化合物Ａ（Ｃｐｄ Ａ、０．０１ｎＭ〜１００μＭ）またはデキサメタゾン（ＤＥＸ、０．１ｎＭ〜１μＭ）とのインキュベーションにより阻害濃度依存曲線を生成した。値は３連で実施した３回の独立した実験の平均±ＳＥＭである。半最大阻害のＩＣ_５０値を非線形回帰分析によって計算した。＊ｐ＜０．０５対健康な値。

０．１ｎＭ、１ｎＭ、及び１０ｎＭの化合物Ａの濃度を増加させることに対する１ｎＭの一定濃度のデキサメタゾンの添加は、ＣＯＰＤ患者の好中球におけるＣＳＥ誘導ＩＬ−８放出の阻害の増加を示した（図５）。

化合物Ａは、９７．４±５．３％及び８５．１４±８．２４％の最大阻害率で、健康な患者及びＣＯＰＤ患者の好中球におけるＩＬ−８分泌を濃度依存的に阻害した。参照として、抗炎症性デキサメタゾンは、８３．９±１０％の最大阻害率を有する健康な患者の好中球においてのみ、ＣＳＥ誘導ＩＬ−８放出に関して好ましい阻害プロファイルを示した。しかしながら、ＣＯＰＤ患者の好中球において、デキサメタゾンは、コルチコステロイド非感受性プロファイルを示すＩＬ−８放出を有意に阻害することができなかった。

実施例７
アッセイ：健康な非喫煙者及びＣＯＰＤ喫煙者の末梢血好中球を用いたコルチコステロイド耐性メディエーター及びＰＩ３Ｋアイソフォームの基礎的ＲＮＡ発現に対する化合物Ａの効果
コルチコステロイド耐性メディエーターの基底ＲＮＡ発現の測定：基底状態及び実験条件下でＣＯＰＤ患者由来の末梢ヒト好中球から全ＲＮＡを単離した。細胞をホモジナイズし、ＴｒｉＰｕｒｅ（登録商標）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを抽出した。逆転写は、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて３００ｎｇの全ＲＮＡ中で行った。１．５μｌの結果のｃＤＮＡを、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）において、ＭＩＦ（カタログ番号Ｈｓ００２３６９８８）、ＭＫＰ−１（カタログ番号Ｈｓ００６１０２５６）、ＰＩ３Ｋデルタ（カタログ番号Ｈｓ００１９２３９９）、ＰＩ３Ｋガンマ（カタログ番号Ｈｓ００２７７０９０）、及び内因性対照としてＧＡＰＤＨ（カタログ番号４３１０８８４Ｅ）について、特異的な予め設計されたプライマーで増幅した。これらの異なる転写物の相対的定量化を２^{−ΔΔＣｔ}法で測定し、対照群に標準化した。

ＭＩＦ、ＭＫＰ−１、ＰＩ３Ｋデルタ及びＰＩ３Ｋガンマ遺伝子のｍＲＮＡ発現を、基底状態及び実験終了時に測定した。

実験は、実験条件ごとに少なくとも３人の患者において３連で実施した。

結果：ＭＩＦの発現は、ＣＳＥまたは化合物Ａの曝露によって有意に影響されなかった。対照的に、ＣＳＥはＭＫＰ１の発現を対照の約０．４倍に減少させた。化合物Ａは、ＩＬ−８放出に対する化合物Ａの阻害効果とよく相関する対照レベルに近いＭＫＰ１の発現を増加させた。図６を参照。ＰＩ３ＫデルタはＣＳＥ処理の影響を受けなかったが、化合物Ａの投与はＣＳＥ誘導ＰＩ３Ｋγ発現の有意な低下を引き起こした（図７）。

実施例８
アッセイ：健康な非喫煙者及びＣＯＰＤ喫煙者の末梢血好中球を用いたＰＩ３Ｋアイソフォームの基礎発現に対する化合物Ａ、デキサメタゾン及びその組合せの効果。
Ｐｉ３Ｋアイソフォームの測定：ＰＩ３Ｋ活性を測定するために、ＣＯＰＤ患者からの好中球を単離し、１０ｎＭで化合物Ａとともに１時間インキュベートした。次いで、細胞をＣＳＥ５％で３０分間刺激した。細胞刺激後、好中球を遠心分離し、総タンパク質を好中球から抽出した。等量を確実にするため、Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｈｅｒｔｓ、ＵＫ）を用いて、総タンパク質量を測定した。ＰＩ３Ｋ活性は、ＰＩ３−キナーゼ活性ＥＬＩＳＡ：Ｐｉｃｏ（カタログ番号ｋ−１０００ｓ、Ｅｃｈｅｌｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）を用いて製造者のプロトコールに従って測定した。簡潔には、ＰＩ３−Ｋ反応は、クラスＩ ＰＩ３−Ｋ生理学的基質ＰＩ（４，５）Ｐ２（ＰＩＰ２）を用いて行った。次いで、酵素反応、ＰＩＰ３標準及び対照を混合し、高度に特異的でＰＩＰ３に感受性のあるＰＩＰ３結合タンパク質とインキュベートした。次いで、この混合物を競合結合のためにＰＩＰ３コーティングしたマイクロプレートに移した。その後、ＰＩＰ３標準曲線と酵素反応を比較することを通して、ＰＩ３−Ｋによって産生されたＰＩＰ３の量を検出するため、ペルオキシダーゼ結合二次検出器及び比色検出が用いられた。

実験は、実験条件ごとに少なくとも３人の患者において３連で実施した。

結果：ＣＯＰＤ患者の好中球において、ＣＳＥ５％はＰＩＰ３産生として測定されたＰＩ３Ｋ活性を増加させた。１０ｎＭでの化合物Ａの添加はＰＩ３Ｋ活性を完全に抑制した（図８）。

本明細書における本発明を、特定の実施形態を参照して説明してきたが、これらの実施形態は、本発明の原則及び用途の例解に過ぎないことを理解されたい。したがって、前述の本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、例解的な実施形態に数多くの修正がなされ得ること、及び他の構成が考案され得ることを理解されたい。添付の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること、かつ、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物が、特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

本出願に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許、及び特許出願が、参照により本明細書に具体的かつ個々に組み込まれているように示されたのと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (30)

1. 自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患を治療するための組成物であって、治療有効量の（ｉ）二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびに（ｉｉ）コルチコステロイドを含み、
   前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤が、式Ａの化合物、
   

   

   またはその薬学的に許容可能な塩である、組成物。
2. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニドまたはコルチゾンプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ナフロコート、デフラザコート、酢酸ハロプレドン、ブデソニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、ピバリン酸クロコルトロン、アセポン酸メチルプレドニゾロン、パルミチン酸デキサメタゾン、チプレダン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、プレドニカルベート、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、ハロメタゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、リメキソロン、ファルネシル酸プレドニゾロン、シクレソニド、プロピオン酸デプロドン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸ハロベタゾール、エタボン酸ロテプレドノール、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、フルニソリド、プレドニゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、トリアムシノロン、１７−吉草酸ベタメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、コルチゾン、及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。
4. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、フルチカゾン、及びその薬学的に許容可能な塩から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 前記治療有効量の（ｉ）前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびに前記治療有効量の（ｉｉ）コルチコステロイドを組み合わせ製剤として同時に投与するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 前記治療有効量の（ｉ）前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびに前記治療有効量の（ｉｉ）コルチコステロイドを順次に投与するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記治療有効量の前記コルチコステロイドを、前記治療有効量の前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤の投与前に投与するための、請求項６に記載の組成物。
8. 前記治療有効量の前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤を、１日２回〜３週間に１回投与し、前記治療有効量の前記コルチコステロイドを、１日２回〜３週間に１回投与するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記自己免疫、呼吸器、及び炎症性疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、非アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患、及び特発性肺線維症（ＩＰＦ）からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびに前記コルチコステロイドが、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲の量でそれぞれ投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびに前記コルチコステロイドが、約１：１００〜約１００：１の重量比で投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. （ｉ）二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、（ｉｉ）コルチコステロイド、ならびに（ｉｉｉ）任意に、薬学的に許容可能な担体、流動促進剤、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物であって、
    前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤が、式Ａの化合物、
    

    

    またはその薬学的に許容可能な塩である、薬学的組成物。
14. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニドまたはコルチゾンプレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ナフロコート、デフラザコート、酢酸ハロプレドン、ブデソニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ヒドロコルチゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、ピバリン酸クロコルトロン、アセポン酸メチルプレドニゾロン、パルミチン酸デキサメタゾン、チプレダン、アセポン酸ヒドロコルチゾン、プレドニカルベート、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、ハロメタゾン、スレプタン酸メチルプレドニゾロン、フロ酸モメタゾン、リメキソロン、ファルネシル酸プレドニゾロン、シクレソニド、プロピオン酸デプロドン、プロピオン酸フルチカゾン、プロピオン酸ハロベタゾール、エタボン酸ロテプレドノール、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、フルニソリド、プレドニゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム、トリアムシノロン、１７−吉草酸ベタメタゾン、ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸プレドニゾロンナトリウム、酪酸プロピオン酸ヒドロコルチゾン、及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
15. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、コルチゾン、及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の薬学的組成物。
16. 前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、フルチカゾン、及びその薬学的に許容可能な塩から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
17. 前記組成物が、約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇの前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびに約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇの前記コルチコステロイドを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
18. 喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患を治療する方法における使用のための、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
19. 喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、ならびにそれらの組み合わせから選択される、自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患の治療のための薬物の製造における、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の薬学的組成物の使用。
20. 自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患を治療するためのキットであって、前記キットが、
    単一の薬学的組成物または別個の薬学的組成物のいずれかにおいて、（ｉ）二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびに（ｉｉ）コルチコステロイド、またはその薬学的に許容可能な塩と、
    （ｉｉｉ）任意に、自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患を、前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤、ならびにコルチコステロイドで治療するための指示と、
    （ｉｖ）任意に、前記薬学的組成物または複数の薬学的組成物を配置するための容器と、を含み、
    前記二重ＰＩ３Ｋデルタ及びガンマ阻害剤が、式Ａの化合物、
    

    

    またはその薬学的に許容可能な塩である、キット。
21. 喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、肺線維症、嚢胞性線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、ならびにそれらの組み合わせから選択される、自己免疫性、呼吸器、及び炎症性疾患の治療のための、請求項２０に記載のキット。
22. 前記コルチコステロイドが、フロ酸モメタゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１及び５から１２のいずれか一項に記載の組成物。
23. 前記コルチコステロイドが、フルチカゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１及び５から１２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 前記コルチコステロイドが、プロピオン酸フルチカゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１及び５から１２のいずれか一項に記載の組成物。
25. 前記コルチコステロイドが、フロ酸モメタゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１３、１７及び１８のいずれか一項に記載の組成物。
26. 前記コルチコステロイドが、フルチカゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１３、１７及び１８のいずれか一項に記載の組成物。
27. 前記コルチコステロイドが、プロピオン酸フルチカゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１３、１７及び１８のいずれか一項に記載の組成物。
28. 前記コルチコステロイドが、フロ酸モメタゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項２０または２１に記載のキット。
29. 前記コルチコステロイドが、フルチカゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項２０または２１に記載のキット。
30. 前記コルチコステロイドが、プロピオン酸フルチカゾンまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項２０または２１に記載のキット。

Images