JP6538331B2 - 肝細胞癌の治療のための治療用生物製剤 - Google Patents
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Description
本願は、2013年11月15日に出願された米国特許仮出願第61/904,951号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に援用される。
本願は、本明細書と同時に提出された以下のASCII textファイルに含まれる配列表を、参照により援用する:
a) ファイル名:SEQUENCELISTING.txt;2014年10月28日に38KBのサイズで作成。
原発性肝臓癌は、世界的に、男性で5番目によくある癌であり、女性で7番目によくある癌である。世界的に、原発性肝臓癌は、男性において2番目の主要な癌の死亡原因であり、女性では6番目の癌の死亡原因である。肝細胞癌(HCC)は、原発性肝臓癌の85%の原因である。HCCは、東南アジアおよびサハラ以南のアフリカに固有のものである。西洋諸国における発病率は近年増加しており、増加し続けることが予想される。HCCは、米国において、男性で5番目、女性で9番目の主要な癌の死亡原因である。HCCについての5年間の生存(5 years overall survival)は、わずか15%である。
i) 配列番号:3のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域および配列番号:4のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3または4個までの保存性アミノ酸置換を有する、または
ii) 配列番号:5のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域および配列番号:6のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3または4個までの保存性アミノ酸置換を有する
を含む免疫グロブリンである。
i) 配列番号:7、8、9、10もしくは11から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:11である、および配列番号:12、13もしくは14から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:13である、または
ii) 配列番号:15、16、17、18もしくは19から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:19である、および配列番号:20、21もしくは22から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:22である
で与えられる。
[1]抗体に共役した凝固剤を含むコンジュゲートであって、該抗体が哺乳動物PLVAPの細胞外ドメインエピトープに特異的に結合する、コンジュゲート、
[2]凝固剤が凝固タンパク質である、前記[1]記載のコンジュゲート、
[3]凝固タンパク質が組織因子である、前記[2]記載のコンジュゲート、
[4]組織因子が、配列番号:1と少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、より好ましくは、配列番号:1と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、さらに好ましくは、配列番号:1と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、前記[3]記載のコンジュゲート、
[5]配列番号:1と少なくとも40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を有する組織因子を含む、ペプチド結合により抗体にコンジュゲートされたコンジュゲートであって、該抗体が、ヒトPLVAPタンパク質の細胞外ドメイン中のエピトープに特異的に結合する、コンジュゲート、
[6]哺乳動物PLVAPタンパク質が、配列番号:2と少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、より好ましくは、配列番号:2と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であり、さらに好ましくは、配列番号:2と少なくとも95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、前記[1]〜[5]いずれか記載のコンジュゲート、
[7]該抗体が、PPAGIPVAPSSGまたはLAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPMから選択されるエピトープに特異的に結合する、前記[1]〜[6]いずれか記載のコンジュゲート、
[8]該抗体が、エピトープPPAGIPVAPSSGに特異的に結合する、前記[7]記載のコンジュゲート、
[9]凝固タンパク質と抗体が化学的に架橋している、前記[1]〜[8]いずれか記載のコンジュゲート、
[10]凝固タンパク質と抗体がペプチド結合により結合している、前記[1]〜[9]いずれか記載のコンジュゲート、
[11]該抗体が、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む免疫グロブリンであり、該凝固剤が凝固タンパク質である、前記[1]〜[10]いずれか記載のコンジュゲート、
[12]凝固タンパク質と抗体が、重鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、凝固タンパク質のアミノ末端の間のペプチド結合により結合している、前記[11]記載のコンジュゲート、
[13]凝固タンパク質と抗体が、軽鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、凝固タンパク質のアミノ末端の間のペプチド結合により結合している、前記[11]記載のコンジュゲート、
[14]凝固剤が凝固タンパク質であり、凝固タンパク質と抗体が、リンカーペプチドによるペプチド結合により結合している、前記[1]〜[13]いずれか記載のコンジュゲート、
[15]リンカーペプチドが、(Gly4-Ser)n(式中、nは、1、2、3、4、5または6;より好ましくはnは3である)を含む、前記[14]記載のコンジュゲート、
[16]抗体が、
i) 配列番号:3のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域、および配列番号:4のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3もしくは4個までの保存性アミノ酸置換を有する;または
ii) 配列番号:5のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む重鎖可変領域、および配列番号:6のアミノ酸配列を含む可変領域のCDRを含む軽鎖可変領域、ここで任意に、可変軽鎖および可変重鎖は、各CDR中に1、2、3もしくは4個までの保存性アミノ酸置換を有する
を含む免疫グロブリンである、前記[1]〜[15]いずれか記載のコンジュゲート、
[17]軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域がヒト化される、前記[16]記載のコンジュゲート、
[18]軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、
i) 配列番号:7、8、9、10もしくは11から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:11である;および配列番号:12、13もしくは14から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:13である、または
ii) 配列番号:15、16、17、18もしくは19から選択される重鎖可変領域、ここでより具体的には、重鎖可変領域は配列番号:19である;および配列番号:20、21もしくは22から選択される軽鎖可変領域、ここでより具体的には、軽鎖可変領域は配列番号:22である
で与えられる、前記[17]記載のコンジュゲート、
[19]配列番号:23と少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99%以上同一であるアミノ酸配列を含む、前記[14]記載のコンジュゲート、
[20]前記[1]〜[19]いずれか記載のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、適切な担体、賦形剤および/または造影剤をさらに含む、医薬組成物、
[21]被験体への投与に適した剤型である、前記[20]記載の医薬組成物または前記[1]〜[19]いずれか記載のコンジュゲート、
[22]前記[1]〜[8]または[10]〜[19]いずれか記載のコンジュゲートをコードする核酸、
[23]前記[22]記載の核酸を含むベクター、
[24]前記[23]記載のベクターまたは前記[22]記載の核酸を含む宿主細胞、
[25]宿主細胞が細菌細胞であり、より具体的には細菌細胞が大腸菌である、前記[24]記載の宿主細胞、
[26]発芽酵母を含む酵母などの真菌;Sf0、Sf21もしくはハイファイブ(high five)細胞などの昆虫細胞;またはCHO、VEROもしくはCOS細胞などの哺乳動物細胞から選択される真核生物細胞である、前記[24]記載の宿主細胞、
[27]前記[24]〜[26]いずれか記載の宿主細胞を、宿主によるコンジュゲートの発現を支持する条件下で培養する工程、および発現されたコンジュゲートを単離する工程を含む、前記[1]〜[8]または[10]〜[19]いずれか記載のコンジュゲートを作製する方法、
[28]PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の治療、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積の低減、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死の誘導を必要とする哺乳動物被験体において、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療する、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減する、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導する方法であって、前記[1]〜[19]いずれか記載のコンジュゲートまたは前記[20]または[21]記載の医薬組成物の治療有効量を該被験体に投与する工程を含む、方法、
[29]腫瘍がHCCであり、HCC腫瘍体積が、コンジュゲートの投与後の血栓症および腫瘍壊死により低減される、前記[28]記載の方法、
[30]該被験体がヒトである、前記[28]または[29]記載の方法、
[31]コンジュゲートが、被験体の腫瘍に静脈内投与される、前記[28]〜[30]いずれか記載の方法、
[32]コンジュゲートが、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、前記[28]〜[31]いずれか記載の方法、
[33]前記[1]〜[19]いずれか記載のコンジュゲートまたは前記[20]または[21]記載の医薬組成物の治療有効量を、HCCの治療を必要とするヒト被験体に投与する工程を含む、該被験体においてHCCを治療する方法であって、該コンジュゲートまたは組成物が1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、方法、
[34]被験体が、1つ以上の化学療法剤、放射線療法、腫瘍内アルコール注入、手術、寒冷療法、高周波切除または前述の1つ以上の組み合わせによる同時または連続の治療を受けている、前記[28]〜[33]いずれか記載の方法、
[35]コンジュゲートが、1つ以上の化学療法剤と一緒に被験体に投与される、前記[34]記載の方法、
[36]1つ以上の化学療法剤が、ソラフェニブ、ベバシズマブまたは他の抗脈管形成治療薬の治療有効量を含む、前記[35]記載の方法、
[37]コンジュゲートが、1つ以上の化学療法剤をさらに含む医薬組成物中で被験体に投与される、前記[35]記載の方法、
[38]PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍が神経膠芽腫である、前記[28]〜[37]いずれか記載の方法、
[39]コンジュゲートが、腫瘍1cm3あたり約5〜約200μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約10〜約150μg、より具体的には腫瘍1cm3あたり約15〜約100μgの用量で投与される、前記[28]〜[38]いずれか記載の方法、
[40]コンジュゲートが単一用量で投与される、前記[28]〜[38]いずれか記載の方法、
[41]コンジュゲートが、2、3、4、5、6、7、8、9、10用量以上で投与される、前記[28]〜[39]いずれか記載の方法、
[42]該用量が、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10日、または1、2、3、4、5もしくは6週、または1、2、3、4、5もしくは6か月以上の期間にわたり投与される、前記[40]記載の方法、
[43]前記[1]〜[19]いずれか記載のコンジュゲートを含む、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療するため、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減するため、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導するための医薬組成物、
[44]前記[1]〜[19]いずれか記載のコンジュゲートを含む、HCCを治療するための医薬組成物であって、該コンジュゲートが、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、医薬組成物
に関する。
前述の記載は、添付の図面において説明される以下の本発明の例示態様のより具体的な記載から明らかとなろう。
本発明の例示態様の説明を以下に示す。特定の用語の定義は、本願を通じて一貫するものである。
本発明は、抗体に共役した凝固剤を含むコンジュゲートを提供し、ここで、該抗体は哺乳動物PLVAPタンパク質の細胞外ドメインエピトープに特異的に結合する。かかるコンジュゲートは、「本発明により提供されるコンジュゲート(1つまたは複数)」、「本発明のコンジュゲート(1つまたは複数)」などのことをいうが、それらを含む医薬組成物などの組成物は、「本発明により提供される組成物(1つまたは複数)」などとして知られる。本願はまた、「本発明により提供されるコンジュゲート(1つまたは複数)」および「本発明により提供される組成物(1つまたは複数)」を記載するために、「本発明により提供されるコンジュゲート(1つまたは複数)および組成物(1つまたは複数)」のこともいい得る。
本発明により提供されるコンジュゲートおよび組成物は、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍(例えばHCCまたは神経膠芽腫)の治療、肝細胞癌(HCC)の治療、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の腫瘍体積の低減、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死の誘導を必要とする哺乳動物被験体において、例えばPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍(例えばHCCまたは神経膠芽腫)を治療する、肝細胞癌(HCC)を治療する、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の腫瘍体積を低減する、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導する方法に使用され得る。これらの方法は、該被験体に、本発明により提供されたコンジュゲートまたは本発明により提供された組成物の治療有効量を投与する工程を含む。
PLVAP遺伝子発現は、HCCの脈管内皮細胞に限定され、非腫瘍性肝臓組織にはない。PLVAPタンパク質は、脈管内皮の窓および小胞の構造タンパク質である。PLVAPは、シグナル伝達に関与することは知られていない。最近、抗PLVAP抗体処理が、マウスにおける白血球の脈管内皮細胞の通過に影響することが報告された。
ラット抗マウスPLVAP MECA32モノクローナル抗体(mAb)
University of IowaのDevelopmental Studies Hybridoma Bank(Iowacity, IA)からMECA 32ハイブリドーマを得た。該ハイブリドーマ細胞を、10%低IgGウシ胎児血清、1% GLUTA-Max (Life Technologies, Carlsbad, CA)、1%抗生物質-抗真菌剤(Life Technologies)および1% HEPES(Life Technologies)を含むRPMI培地中で培養した。製造業者の指示書に従ってGE Healthcare Life SciencesのHiTrapプロテインGカラムを使用して、MECA 32ハイブリドーマ細胞の濁った培養上清からラット抗マウスPLVAP MECA32 mAbを精製した。精製した抗体をリン酸緩衝化食塩水(PBS)、pH7.4に透析した。1mg/mlに対して1.37の励起係数を使用して、280nmの波長での吸光度により抗体の濃度を測定した。
ヒト組織因子タンパク質(hTF)の組み換え水溶性細胞外部分を産生するために、ヒト組織因子の全長cDNAクローン(NM001993.2) (OriGene Corp., Rockville, MD)からヒト組織因子cDNAの細胞外ドメイン(アミノ酸残基33〜251)についてのPCR断片を調製した。PCRに使用したプライマーは、フォワードプライマーおよびバックワードプライマーそれぞれの両方の5'末端にBamH1およびSalIについての制限配列を含んでいた。増幅したcDNA断片を、pGEX(登録商標)-6P-1プラスミド(GE Heathcare Life Sciences)に挿入して、グルタチオントランスフェラーゼ(GST)でタグ付加した。上述の発現構築物をDNA配列決定により確認して、hTFの産生のために大腸菌株SHuffleTM T7 Express (New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA)に形質転換した。大腸菌形質転換体を選択培地に播種した。その後、1〜2mmのコロニーを無作為に選択して、100μg/mlアンピシリンを含む4mlの2xYT培地に30℃で接種して、230rpmインキュベーター振盪器中で一晩インキュベートした。翌日、一晩培養物を100μg/mlアンピシリンを含む400mlの2xYT培地に接種して、230rpmインキュベーター振盪器で一晩、30℃で増殖を続けた。600nmでの吸光度が約0.6〜0.8に達したところで、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.4mMの終濃度まで添加して、タンパク質産生を誘導した。30℃で約20時間振盪を続けた。IPTGでの誘導後、遠心分離(10,000xg、20分)により細胞を回収して、室温で2時間、ライソザイムおよびベンゾナーゼヌクレアーゼ(Novagen)を含む0.2% Tween80を有する1xPBS中の溶解に供した。細胞溶解物を10,000rpmで4℃、30分間遠心分離した。上清を回収して可溶性画分としてろ過した。
第1に、精製したMECA32 mAbを、0.5M NaClを含む0.1M MESバッファ、pH6.0中で透析した。MESは、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸である。同じMESバッファを使用して、抗体を1mg/mlに調整した。1mlのMECA32 mAbに、1.2mg EDC(1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロライド)および3.3mgのスルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)を添加した。緩やかにボルテックスにかけて添加した試薬を溶解した後、混合物を室温で1時間インキュベートした。PBSカップリングバッファで予め平衡化したZeba脱塩カラムを使用して、活性化MECA32 mAbを回収した。PBSカップリングバッファは、140mM NaCl、10mMリン酸ナトリウムおよび3mM KCl、pH7.4〜7.5で構成された。次いで、等しい数のGST-hTF(0.66ml中0.33mg)を活性化MECA32-mAbに添加した。混合物を、回転式混合器で、室温で3時間インキュベートした。次いで10mMの終濃度までヒドロキシルアミンを添加して反応をクエンチした。ヒト組織因子タンパク質と共役した抗体を、1xリン酸緩衝化食塩水に対して透析し、全ての小有機化学物質を完全に除去した。280nmでの吸光度により抗体の濃度を測定した。1mg/mlについて1.37の励起係数を、抗体濃度の測定に使用した。ヒト組織因子に共役した抗体を、比色アッセイを使用して組織因子活性について測定した。R&D Systems (Minneapolis, MN)から購入した組み換えヒト組織因子をアッセイの標準として使用した。精製したMECA32モノクローナル抗体のTFコンジュゲート(MECA32-TF)を、マウスPLVAPに対する結合およびマウスPLVAPに結合した抗体上のヒト組織因子の存在についてアッセイした(図2)。
MECA32-Fab-TFを産生するためのプラスミド構築物の調製は、4工程で達成した。第1の工程は、MECA32 mAb軽鎖の可変ドメイン(VL)およびMECA32 mAb重鎖の可変ドメイン(VH)のcDNAを調製すること、ならびに第2の工程に使用するプライマーの調製のためにそれらのDNA配列を決定することであった。第2の工程は、カルボキシル末端にHis-タグを有するMECA32 mAbのκ軽鎖についての全長cDNAを調製して、pET26bプラスミドベクターに挿入することであった。第3の工程は、VH1およびCH1ドメイン(Fd)+3'末端にリンカー配列を有するMECA32 mAb重鎖のヒンジ領域のcDNA、ならびにhTFおよび5'末端のリンカー配列についてのcDNAを調製することであった。次いで、オーバーラップPCRを使用して、2つのcDNAを一緒に縫い合わせた(sticth)。MECA32-Fd-ヒンジ-リンカー-TFのこのcDNAをpET26bプラスミドベクターに挿入した。第4の工程は、第2および第3の工程から調製したプラスミドからバイシストロニック(bicistronic)プラスミドベクターを構築することであった。これらの4つの工程を以下により詳細に記載し、図3Aおよび3Bに要約する。
MECA32 mAb軽鎖の可変ドメイン(VL)および重鎖の可変ドメイン(VH)をコードするcDNAを、FirstChoice RLM-RACEキット(Ambion, Inc., Austin, TX)を使用して、製造業者の指示書に従って調製した。簡潔に、MECA32ハイブリドーマから単離した全RNAを鋳型として使用して、VLドメインに続くκ軽鎖の定常ドメインのヌクレオチドに相補的なプライマー(5'TGTCCTGATCAGTAACACTGTCC3')(配列番号:27)およびVHドメインに続く重鎖のCH1ドメインのヌクレオチドに相補的なプライマー(5'TGAGAGTGTAGAGTCCAGACTGCAGG3')(配列番号:28)のそれぞれを用いて逆転写PCRにより軽鎖の可変ドメイン(VL)および重鎖の可変ドメイン(VH)を増幅した。
第1の工程由来のVL鎖の配列を使用して、MECA32抗体の全長κ軽鎖cDNA配列を得るための適切なプライマーを設計した。第1に、MECA32ハイブリドーマ細胞の全RNAから、以下に記載のプライマー:
フォワードプライマー:5'GATCCTGACATCCAGATGACCCAGACTCC3'(配列番号:29)および
リバースプライマー:5'CACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG3'(配列番号:30)
を使用して、RT-PCRによりMECA32 mAbの全長κ鎖cDNAを作製した。
本発明者らは最初に、MECA32 mAb Fd、ヒンジ領域およびリンカー配列で構成されるcDNAを、MECA32ハイブリドーマ細胞由来のcDNA鋳型ならびに以下のプライマーペア:
フォワードプライマー:5'GACATCCAGATGACCCAGACTCC3'(配列番号:31)および
ヒンジリンカーリバースプライマー:
5'AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGTACATCCACAAGGATTGCATTCC3'(配列番号:32)
を使用してPCRにより調製した。
hTFリンカーフォワードプライマー:
5'GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG3'(配列番号:33)および
TFリバースプライマー:5'CAGTGTGAGGTGCAACTGGTGGAG3'(配列番号:34)
を使用してPCRにより調製した。
本発明者らは、鋳型としてpET26b-M32-Fd-TFならびに以下のプライマーペア:
26b-RBS-F:5' ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3'(配列番号:35)および
26b-終結-R:5' CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3'(配列番号:36)を使用してPCRによりDNA断片を作製した。
MECA32-Fab-TFを作製するために、新しい大腸菌培養物のコロニー(1〜2mm)を、30μg/mlカナマイシンを含む4mlの2xYT培地に30℃、230rpmで一晩接種した。翌朝、一晩培養物を、30μg/mlカナマイシンを含む400mlの2xYT培地に接種して、30℃、250rpmで増殖を継続した。600nmでの吸光度が約0.6〜0.8に達した際に、組み換えタンパク質産生の誘導のために、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.4mMの終濃度まで添加した。30℃で約20時間振盪を継続した。
本発明者らは、MECA32-Fab-TFと同様の組み換え抗ヒトPLVAP CSRO2-Fab-TFタンパク質も作製した。このタンパク質は、抗ヒトPLVAP mAb CSRO2を基に開発した。この組み換えタンパク質の構造は、異なるAbドメインを有し、κ軽鎖のカルボキシル末端にHis-タグを有さないこと以外は、実質的に上述のMECA32-Fab-TFと同様であった。His-タグは、CSRO2-Fab-TFの精製には必要なかったので除去した。抗ヒトκ軽鎖KappaSelectアフィニティーカラムクロマトグラフィー(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)を使用して、CSRO2-Fab-TFを精製した。CSRO2 mAbは、ヒトPLVAPに対するヒト化モノクローナル抗体である。
CSRO2 mAbを産生するNS0細胞株由来の全RNAを、プライマーとしてオリゴdTを使用してcDNAに逆転写した。CSR02のκ軽鎖cDNAを、鋳型としてオリゴdTプライマーcDNAおよび以下に示すプライマーペア:
CSR02-VK3F-26b F Nde I フォワードプライマー:
5' TATGGATGTTGTGATGACCCAATCTCCA 3'(配列番号:37)
κ-R-26b-Not Iリバースプライマー:5' GGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTG 3'(配列番号:38)
を使用してPCRにより作製した。
このプラスミドは、鋳型としてNS0細胞株から調製されたcDNAおよびクローニングされたヒト組織因子cDNAを使用してPCRにより構築した。PCRには以下のプライマーを使用した:
VH5-pro26b-NdeI-F フォワードプライマー:
5' TATGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGG 3'(配列番号:39)および
ヒンジリンカーR:
5' AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGGGCATGATGGGCATGGGGGACC 3'(配列番号:40)。
hTFリンカーF:5' GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG 3' (配列番号:41)
hTF R-Not I:5' GGCCGCTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG 3'(配列番号:42)。
本発明者らは、鋳型としてpET-26b-VH5-Fd-TFならびに以下のプライマーペア:
26b-RBS-F:5' ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3'(配列番号:43)および
26b-終結-R:5' CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3'(配列番号:44)
を使用してPCRによりDNA断片を作製した。
組み換えCSR02-Fab-TFタンパク質の発現。コンピテント細胞とpET-26b CSR02-Fab-TFプラスミドDNAを氷上で5分間インキュベートし、42℃の水浴中で正確に30秒間加熱し、次いで氷上に2分間置くことにより、大腸菌Shuffle T7 Express(New England Biolabs)の形質転換を行った。選択培地に播種する前に、形質転換体を、250rpmで浸透しながらSOC培地(0.5%酵母抽出物;2%トリプトン;10mM NaCl;2.5mM KCl;10mM MgCl2;10mM MgSO4;20mMグルコース)で、30℃で60分間インキュベートした。0.05mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドにより、CSR02-Fab-TFの発現を30℃または37℃で16時間誘導した。誘導後、細菌細胞を、0.2% Tween80を含む1xPBS中、リゾチームおよびベンゾナーゼヌクレアーゼの存在下、室温で2時間、溶解に供した。細胞溶解物を、10000rpm、4℃で30分間遠心分離して回収した。上清を回収してろ過し、可溶性画分を単離した。
(hPLVAP)の作製。切断PLVAP(マウスPLVAPの細胞外ドメインを含むアミノ酸残基51〜442)を示すPCR断片をpGEM(登録商標)-T Easyベクター(Promega)に挿入して、プラスミドpGEM(登録商標)-T Easy-hPLVAP51-442を作製した。このPCR断片は、以下のプライマーペア:
mPLVAP CDS NdeI F:5'CATATGTATGGCAATGTGCACGCCACC3'(配列番号:47)および
mPLVAPストップXho I R:5'CTCGAGATCCACAGGTGGGCGATTCTGGC3'(配列番号:48)
を使用したPCRにより、マウスPLVAPのcDNAクローン(Invitrogen, Life Technologies Corp.)から調製した。
組み換え抗PLVAP-Fab-TFタンパク質がヒトまたはマウスのPLVAPタンパク質に結合し得るかを確認するために、ELISAアッセイを開発して使用した。第1に、ELISAプレートの各ウェルを、4℃で一晩、PBS-アジド(0.02%)中50μlの2.5μg/mlヒトまたはマウス組み換えPLVAPタンパク質でコートした。その後、アッセイは室温で行った。各ウェルを150μlの洗浄バッファ(0.2% Tween-20を含むPBS)で3回洗浄した後、各ウェルを150μlのブロッキングバッファ(2% BSAおよび0.05% Tween-20を含むPBS)で30分間ブロッキングした。3回洗浄後、50μlの抗ヒトPLVAP CSRO2-Fab-TFまたは抗マウスPLVAP MECA32-Fab-TFを、異なる濃度で二重に各ウェルに添加した。全てのウェルは45分間インキュベートして3回洗浄した。次いで、洗浄したウェルを、ブロッキングバッファ中1:500希釈で、50μlのビオチニル化抗ヒトTF抗体(R&D Systems Corp.)と共に45分間インキュベートした。3回洗浄後、各ウェルを、5000x希釈ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートと共に30分間インキュベートした。次いで各ウェルを、100μlのアルカリホスファターゼ基質と共に60分間インキュベートして、マイクロプレートリーダー中405nmで各ウェルの吸光度を測定した。
ヒトTFと架橋した組み換えCSRO2-Fab-TF、MECA32-Fab-TFおよびMECA32 mAbのTF活性を、比色アッセイを使用して測定した。このアッセイは、TFの第VIIa因子への結合およびTF/FVIIa複合体の第X因子(FX)活性化能に基づく。産生されたFXaの量により、TF活性を間接的に定量した。産生されたFXaは、405nmでの吸光度の増加に伴ったFXa特異的発色ペプチド基質からのパラニトロアミリン(para-nitroamiline)(pNA)の放出に従って速度論的に測定した。TF活性は、市販の水溶性組み換えTF標準(R&D systems Corp.)に対して決定した。比色TF活性アッセイは、Philipp et al.により報告された手法に基づいた。Philipp J, Dienst A, Unruh Maike, et al. "Soluble tissue factor induces coagulation on tumor endothelial cells in vivo if coadministered with low-dose lipopolysaccharides" Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 23:905-910 (2003)参照。
Hep3BはヒトHCC細胞株である。抗PLVAP Fab-TFの治療有効性を説明するために、本発明者らは、BALB/c C.B-17 SCIDマウスにおけるHEP3B異種移植片モデルを確立する。Hep3B HCC異種移植片は、4百万個のHep3B細胞を、イソフルランの吸入を用いた一般的な麻酔下で、5週齢の雄C.B-17 SCIDマウスの右上部内側大腿に皮下注射することにより確立された。細胞を、血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Life Technologies Corp.)に溶解した60μlの氷冷75% BD MtrigelTM(BD Bioscience Corp.)に懸濁した。29ゲージのインシュリンシリンジを使用して注射を行った。
抗PLVAP MECA32-Fab-TFを用いたHep3B腫瘍異種移植片の治療のために、MATRXTM麻酔器を使用して、イソフルランの吸入によりHep3B腫瘍異種移植片を有するマウスを麻酔した。マウスを切開用顕微鏡下で仰向けに寝かせた。注入の1日前に、Nair毛除去剤(Church & Dwight Co.)を用いて右鼠蹊領域の毛を除去した。75%アルコールで皮膚をきれいにした後、腫瘍上部の右鼠蹊領域で0.5cmの切開を行った。傷は、右大腿動脈および静脈が曝露する深さであった。次いで、右大腿動脈を6-0ナイロン糸で結んだ。動脈を緩く近位に引っ張った。引張の遠位で微小はさみを用いて動脈切開術を行い、遠位部位に、細い33ゲージの針を挿入した。MECA32-Fab-TFまたは対照抗体を、1分あたり約40μlの速度でゆっくり注入した。漏れがないことを確実にするために、注射は近位観察下で行った。注入後、針を引き抜いた。動脈切開部位をHistoacryl(TissueSeal, AnnArbor, MI)で閉じた。引張のためのナイロンを除去した。適切な止血の確認後、連続的な縫合により切開の傷を閉じた。
Vevo 2100高解像画像化システム(Visual Sonics, Inc., Toronto, Canada)を使用して、製造業者の指示書にたがって、3D腫瘍画像を得た。以下の測定を行うことにより、腫瘍の3方向の垂直寸法(three perpendicular dimensions)を決定した。最初に、腫瘍のX軸およびY軸に沿った最大切断面積上の2方向の垂直寸法を測定した。次いで、業者から提供されたソフトウェアを使用して、X軸およびY軸寸法に垂直な、Z軸に沿った最も長い寸法を測定した。長円物質についての以下の式:体積=π/6x長さx幅x高さを使用して腫瘍体積を決定した。Vevo 2100高解像画像化システムのマニュアルに従って、3Dパワードップラーを使用して腫瘍血流画像を得た。
抗PLVAP-Fab-TFと標的PLVAPの間の結合親和性を測定するために使用したアッセイは、先のセクションで記載した比色TF活性アッセイに基づいた。簡潔に言えば、ELISAプレートのそれぞれのウェルを、2.5μg/ml水溶性組み換えヒトまたはマウスPLVAPで一晩コーティングした。PLVAPに対するCSRO2-Fab-TFおよびMECA32-Fab-TF結合を試験するためのELISAについて記載したとおりに洗浄およびブロッキングした後、ヒトまたはマウスPLVAPタンパク質でコーティングしたウェルを、50μlの増加濃度の0.3125、0.625、1.25、2.5、5および10μg/mlのCSRO2-Fab-TFまたはMECA32-Fab-TFと二重にインキュベートした。室温で3時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して、比色TF活性アッセイについての先のセクションで記載したとおりのTF標準曲線を使用してウェル中の結合したTF活性の量についてアッセイした。各ウェルに添加した総CSRO2-Fab-TFまたは総MECA32-Fab-TFの濃度はわかっており、各ウェル中の結合したCSRO2-Fab-TFまたはMECA32-Fab-TFの濃度は、アッセイ結果から計算できた。次いで、スキャッチャードプロット解析を使用してこれらの数字を解析し、CSRO2-Fab-TFまたはMECA32-Fab-TFの結合親和性を決定した。例えば、Scatchard G. "The attractions of proteins for small molecules and ions" Ann NY Acad Sci. 51:660-672(1949)参照。
マウスHep3B異種移植片中のPLVAPの発現を調べるために、ホルマリン固定化パラフィン組織ブロックの切片を抗PLVAPモノクローナル抗体による免疫組織化学的染色用に処理した。常套的な手順に従った組織切片の脱パラフィンおよび再水和後、キャリア中の組織切片を有するスライドをビーカーに入れ、標的回復液(Dako, Inc. Carpinteria, CA)に浸漬した。ビーカーをオートクレーブ中に置いて、121℃で10分間加熱した。冷却後、スライドを蒸留水に移した。次いで、それぞれのスライド上の切片を、Ventana iView DAB検出キット(Ventana Medical Systems, Inc.)中で200〜400μlの過酸化水素で処理して内因性のペルオキシダーゼをクエンチした。スライドをTris緩衝化食塩水(TBS)(Dako)でリンスした後、切片を、0.1%ウシ胎仔血清アルブミン含有TBS(TBS-BSA)に希釈した5μg MECA32抗PLVAPモノクローナル抗体と共に、37℃で60分間インキュベートした。スライドをTBSバッファ中に5分間、3回浸漬して洗浄した後、切片を、業者に推奨される希釈で、ビオチニル化二次抗体(例えば、MECA32 mAbについてのビオチニル化ヒツジ抗ラットIgG)と共に、室温で15分間インキュベートした。スライド上の切片を上述と同様に洗浄した。スライド上の切片を、新たに調製したDAB基質と共に30分間キット中でインキュベートした。スライドを蒸留水で数回リンスした。ギルヘマトキシリン溶液で15秒間交差染色した後、スライドをTBS、次いで蒸留水でリンスした。切片を風乾した後、切片を、Permount培地およびカバースリップで覆った。
HCCおよびHEP3B異種移植片中のPLVAP発現
本発明者らの初期の試験により、PLVAPは、HCCの脈管内皮細胞上に差異的に発現し、非腫瘍肝臓組織の脈管内皮細胞中には発現しないことが示された。PLVAPの差異的な発現は、治療目的のためにHCCを標的化する機会を提供した。本発明者らは、HCCの治療のために、共発現する凝血誘発組織因子タンパク質の担体として機能する抗PLVAPモノクローナル抗体またはそのFab断片を使用する新規のアプローチを考え出した。かかる治療剤を腫瘍栄養動脈に注入することは、この治療抗体またはそのFab断片がHCCの脈管内皮細胞に結合して、腫瘍血管内に血栓の形成を誘発し、腫瘍の虚血性壊死を引き起こすと考えられた。
最初に、本発明者らは、HEP3B異種移植片腫瘍を有するSCIDマウスを、組み換え水溶性ヒト組織因子と化学的に共役したMECA32(MECA32-TF)で治療した。ヒトTFは、ヒトおよびマウスの両方で凝血を効果的に誘発し、かつヒトTFのcDNAが市販されていたのでヒトTFを使用した。それぞれの腫瘍保有マウスを、解剖顕微鏡下で、100μlのリン酸緩衝化食塩水(PBS)中24μg MECA32-TF(治療群)または20μg MECA32 mAb(対照群)の腫瘍栄養右大腿動脈への注入により治療した。より高分子量のMECA32-TFに合わせて、わずかに少ない量のMECA32 mAb(20μg)を使用した。3Dパワードップラーを使用して、処理の48時間前後の腫瘍血流を評価した。結果は、治療群においてMECA32-TFでの治療後に腫瘍内血流シグナルの有意な減少を示し、対照群では示されなかった(図7)。腫瘍増殖の追跡により、MECA32-TF治療群において腫瘍増殖の有意な抑制が示され、対照群では示されなかった(図8)。この試験の結果は、ヒトTFと共役した抗PLVAPモノクローナル抗体が、HCC異種移植片の治療に効果的であったことを支持するものである。
TFとMECA32 mAbの化学的共役について、MECA32 mAbに架橋するTFタンパク質分子の数および部位を一定にかつ再現可能に調節することは困難であった。化学的架橋により調製したMECA32-TFは、均一な産物を生じなかった。高分子量のMECA32-TFコンジュゲート(約170kDa)はまた、有害な副作用の発生の機会の増加を伴って、長い循環半減期をもたらす。
組み換えMECA32-Fab-TFの治療有効性を示すために、本発明者らは最初に2用量応答試験を行った。両方の試験について、MECA32-Fab-TFは、腫瘍栄養大腿動脈に注射した。治療の72時間後、治療マウスを屠殺して、組織学的検査のために腫瘍を回収した。第1の試験について、3つの異なる用量のMECA32-Fab-TF(3μg、6μgおよび12μg)を使用して、腫瘍保有マウスを治療し、対照群は、12μgの組織因子なしのMECA32モノクローナル抗体で治療した。それぞれの用量について3匹のマウスがあった。第2の試験について、使用したMECA32-Fab-TFの用量は、2.5μg、5μgおよび10μgであった。それぞれの用量について2匹のマウスがあった。これら2つの試験の結果を要約して図11および12に示した。これらの試験の結果により、MECA32-Fab-TFで治療したマウス由来の腫瘍は、全ての用量で大規模な虚血性壊死を起こしたことが明らかにされた。しかしながら、10μg以上の用量は、より一定な結果を生じた。対照群では腫瘍壊死はなかったか、または最小であった。これらの試験の結果は、抗PLVAP-Fab-TFは、完全に有力で、72時間中マウス1匹当たり2.5μgほどの低用量で、有意な虚血性腫瘍壊死を誘導し得たことを示した。
上述の試験は、治療の72時間後に腫瘍が明白な虚血性壊死を起こしたことを示した。TFを共発現する抗mPLVAP Fabでの治療後に壊死がどのように誘導されたかを調べるために、本発明者らは、腫瘍栄養動脈にMECA32-Fab-TFを注入して、10μgのMECA32-Fab-TFの注入後に、注入の2時間、4時間、24時間、48時間および72時間後にHEP3B腫瘍を回収した。それぞれの時点で2匹の腫瘍保有マウスがあった。0時間ベースライン対照として治療なしの2匹のマウスもこの実験の同日に屠殺した。
次いで、本発明者らは、腫瘍増殖に対する抗PLVAP Fab-TF治療の治療効果を試験した。2つの異なる試験を行った。第1の試験は、治療後25日間腫瘍増殖を追跡することであった。対照群における大きなサイズの腫瘍は試験を停止することを要したので、この試験は治療後25日間で終えた。腫瘍サイズは3D超音波検査を使用して追跡した。図15、16Aおよび16Bにまとめた結果は、5μgまたは10μgのMECA32-Fab-TFの単一注入により、腫瘍増殖が効果的に抑制されたが、10μgの対照TFなしMECA32抗体では抑制されなかったことを示した。
末梢静脈を介したMECA32-Fab-TFの全身投与も同様の治療効果を達成し得るかどうかを知るために、本発明者らは、10μgまたは20μgのMECA32-Fab-TFを、HEP3B腫瘍異種移植片を有するSCIDマウスの尾静脈に注射して、注射後の腫瘍増殖をモニタリングした。対照マウスにはリン酸緩衝化食塩水を注射した。それぞれの治療群には3匹のマウスがあった。図17にまとめた結果は、尾静脈を介してMECA32-Fab-TFを投与した場合に、腫瘍体積に対して統計的に有意な効果がなかったことを示した。そのため、腫瘍壊死の誘導および治療効果の達成には腫瘍栄養動脈への抗PLVAP MECA32-Fab-TFの注入が必要であった。MECA32-Fab-TFの全身投与は、注射されるMECA32-Fab-TFの希釈および腫瘍血管に到達する前の他の臓器(例えば、肺、腎臓および胃腸臓器)の脈管内皮細胞上のPLVAPに対するMECA32-Fab-TFの結合を生じる可能性がある。
ヒトPLVAPに対して同様の治療剤を開発し得るかどうかを知るために、ヒトPLVAPのカルボキシル末端のアミノ酸配列PPAGIPVAPSSに残る抗原性エピトープに対するヒト化抗ヒトPLVAPモノクローナル抗体を使用した。このヒト化抗ヒトPLVAPモノクローナル抗体は、以前に開発され、米国特許出願公開公報第US20110262349 A1に記載される。この抗ヒトPLVAP-Fab-TFコンジュゲートは、CSRO2-Fab-TFと指名した(図9)。次いで、本発明者らは、組織因子特異的活性および標的PLVAPへの結合親和性に関してCSRO2-Fab-TFとMECA32-Fab-TFを比較するための一連の試験を行った。本発明者らの試験の結果により、抗ヒトPLVAP CSRO2-Fab-TFは、抗マウスPLVAP MECA32-Fab-TFと比較して、抗PLVAP Fab-TFのミリグラムにおいてより高いTF活性を有することが明らかであり、両方のCSRO2-Fab-TFおよびMECA32-Fab-TFは同様の結合親和性を有することが示された(表1)。この所見は、MECA32-Fab-TFと同様に、CSRO2-Fab-TFは、十分な親和性をもってそのPLVAP標的に結合し得、凝血を開始させて治療効果を達成するのに十分なTF活性を有したことを示した。
Claims (40)
- 抗体にコンジュゲートされた配列番号:1と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する組織因子(TF)を含むコンジュゲートであって、該抗体が哺乳動物細胞膜小胞関連タンパク質(PLVAP)の細胞外ドメインエピトープに特異的に結合し、該抗体が、
a) 配列番号:3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)の相補性決定領域(CDR)1〜3、および配列番号:4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)のCDR1〜3;または
b) 配列番号:5のアミノ酸配列を含むHCVRのCDR1〜3、および配列番号:6のアミノ酸配列を含むLCVRのCDR1〜3
を含む、コンジュゲート。 - 組織因子が、配列番号:1と少なくとも95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上で同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のコンジュゲート。
- 哺乳動物PLVAPタンパク質が、配列番号:2と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1または2記載のコンジュゲート。
- 該抗体が、PPAGIPVAPSSG(配列番号:25)またはLAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM(配列番号:26)から選択されるエピトープに特異的に結合する、請求項1〜3いずれか記載のコンジュゲート。
- 該抗体が、エピトープPPAGIPVAPSSG(配列番号:25)に特異的に結合する、請求項4記載のコンジュゲート。
- TFと抗体が化学的に架橋している、請求項1〜5いずれか記載のコンジュゲート。
- TFと抗体がペプチド結合により結合している、請求項1〜6いずれか記載のコンジュゲート。
- 該抗体が、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む免疫グロブリンである、請求項1〜7いずれか記載のコンジュゲート。
- TFと抗体が、重鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、TFのアミノ末端の間のペプチド結合により結合している、請求項8記載のコンジュゲート。
- TFと抗体が、軽鎖可変領域を含むタンパク質のカルボキシ末端と、TFのアミノ末端の間のペプチド結合により結合している、請求項8記載のコンジュゲート。
- TFと抗体が、リンカーペプチドによるペプチド結合により結合している、請求項1〜10いずれか記載のコンジュゲート。
- リンカーペプチドが、(Gly4-Ser)n(式中、nは、1、2、3、4、5または6;より好ましくはnは3である)を含む、請求項11記載のコンジュゲート。
- 軽鎖可変領域および/または重鎖可変領域がヒト化されている、請求項1〜12いずれか記載のコンジュゲート。
- 軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、
i) 配列番号:7、8、9、10もしくは11から選択される重鎖可変領域;および配列番号:12、13もしくは14から選択される軽鎖可変領域、または
ii) 配列番号:15、16、17、18もしくは19から選択される重鎖可変領域;および配列番号:20、21もしくは22から選択される軽鎖可変領域
で与えられる、請求項13記載のコンジュゲート。 - 配列番号:23と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項11記載のコンジュゲート。
- 請求項1〜15いずれか記載のコンジュゲートを含む医薬組成物であって、適切な担体、賦形剤および/または造影剤をさらに含む、医薬組成物。
- 被験体への投与に適した剤型である、請求項16記載の医薬組成物または請求項1〜15いずれか記載のコンジュゲート。
- 請求項1〜5または7〜15いずれか1項記載のコンジュゲートをコードする核酸。
- 請求項18記載の核酸を含むベクター。
- 請求項19記載のベクターまたは請求項18記載の核酸を含む宿主細胞。
- 宿主細胞が細菌細胞である、請求項20記載の宿主細胞。
- 真菌;昆虫細胞;または哺乳動物細胞から選択される真核生物細胞である、請求項20記載の宿主細胞。
- 請求項20〜22いずれか記載の宿主細胞を、宿主によるコンジュゲートの発現を支持する条件下で培養する工程、および発現されたコンジュゲートを単離する工程を含む、請求項1〜5または7〜15いずれか1項記載のコンジュゲートを作製する方法。
- PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の治療、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積の低減、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死の誘導を必要とする哺乳動物被験体において、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療する、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減する、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導するための医薬の製造における、請求項1〜15いずれか記載のコンジュゲートまたは請求項16もしくは17記載の医薬組成物の使用。
- 腫瘍が肝細胞癌(HCC)であり、HCC腫瘍体積が、コンジュゲートの投与後の血栓症および腫瘍壊死により低減される、請求項24記載の使用。
- 該被験体がヒトである、請求項24または25記載の使用。
- コンジュゲートが、被験体の腫瘍に静脈内投与される、請求項24〜26いずれか記載の使用。
- コンジュゲートが、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、請求項24〜27いずれか記載の使用。
- 肝細胞癌(HCC)の治療を必要とするヒト被験体においてHCCを治療するための医薬の製造における請求項1〜15いずれか記載のコンジュゲートまたは請求項16もしくは17記載の医薬組成物の使用であって、該コンジュゲートまたは組成物が1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、使用。
- 被験体が、1つ以上の化学療法剤、放射線療法、腫瘍内アルコール注入、手術、寒冷療法、高周波切除または前述の1つ以上の組み合わせによる同時または連続の治療を受けている、請求項24〜29いずれか記載の使用。
- コンジュゲートが、1つ以上の化学療法剤と一緒に被験体に投与される、請求項30記載の使用。
- 1つ以上の化学療法剤が、ソラフェニブ、ベバシズマブまたは他の抗脈管形成治療薬の治療有効量を含む、請求項31記載の使用。
- コンジュゲートが、1つ以上の化学療法剤をさらに含む医薬組成物中で被験体に投与される、請求項31記載の使用。
- PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍が神経膠芽腫である、請求項24〜33いずれか記載の使用。
- コンジュゲートが、腫瘍1cm3あたり約5〜約200μgの用量で投与される、請求項24〜34いずれか記載の使用。
- コンジュゲートが単一用量で投与される、請求項24〜35いずれか記載の使用。
- コンジュゲートが、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の用量で投与される、請求項24〜35いずれか記載の使用。
- 該用量が、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10日、または1、2、3、4、5もしくは6週、または1、2、3、4、5もしくは6か月、あるいはそれ以上の期間にわたり投与される、請求項37記載の使用。
- 請求項1〜15いずれか記載のコンジュゲートを含む、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍を治療するため、PLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の体積を低減するため、またはPLVAP陽性脈管構造を有する腫瘍の血栓症および腫瘍壊死を誘導するための医薬組成物。
- 請求項1〜15いずれか記載のコンジュゲートを含む、HCCを治療するための医薬組成物であって、該コンジュゲートが、1つ以上の腫瘍栄養動脈に直接注入される、医薬組成物。
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