KR102240342B1 - 간세포 암종의 치료를 위한 치료 생물학적 약제 - Google Patents

간세포 암종의 치료를 위한 치료 생물학적 약제 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 특히, 항체에 컨쥬게이션된 응고 작용제를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하고, 여기서 항체는 포유동물 PLVAP 단백질의 세포외 도메인 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이러한 작용제는 HCC 종양을 특이적으로 표적화하여 HCC를 치료한다. 본 발명은 또한 이러한 컨쥬게이트를 이용하는 방법, 예컨대 약학적 조성물과 같이, 본 발명에 의해 제공된 조성물 또는 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트를 투여함에 의해 HCC를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

간세포 암종의 치료를 위한 치료 생물학적 약제{THERAPEUTIC BIOLOGIC FOR TREATMENT OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA}
관련 출원
본 출원은 2013년 11월 15일에 출원된 미국 가출원 번호 61/904,951호의 이익을 주장한다. 상기 출원의 전체 교시내용은 참조로서 본원에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일의 참조 자료로서의 포함
본 출원은 본 출원과 동시에 제공되는 하기 ASCII 파일에 함유된 서열 목록을 참조로서 포함한다:
a) 파일명: SEQUENCELISTING.txt; 2014년 10월 28일에 생성됨, 38 KB 크기.
발명의 배경
원발 간암은 전세계적으로 남성에서 다섯번째로 가장 흔하고, 여성에서 일곱번째로 가장 흔한 암이다. 전세계적으로, 이는 남성에서 암 사망의 두번째 주요 요인이고, 여성에서 암 사망의 여섯번째 주요 원인이다. 간세포 암종(HCC)은 원발 간암의 85%의 원인이다. HCC는 동남아시아 및 사하라 사막 이남 아프리카에서 풍토병이다. 서방 국가에서의 발병률은 최근 수년간 증가되고 있으며, 지속적으로 증가할 것으로 예상된다. HCC는 미국에서 남성 및 여성에 대해 다섯번째 및 아홉번째의 주요 암 사망 원인이다. HCC에 대한 5년 전체 생존은 단지 15%이다.
상기 질병의 현저한 발병률, 및 이의 환자에서의 막대한 비용에 비추어, 이들의 일반적인 지원 체계 및 단체, 중간 및 진행 단계 질병을 갖는 HCC 환자의 치료에서의 추가 개선이 시급히 필요하며, 더욱 특히, HCC 종양을 특별히 표적으로 할 수 있고, 예컨대, HCC를 치료하고/하거나 종양을 제거하기 위한 종양의 부피를 감소시킬 수 있는 작용제, 뿐만 아니라 상기 작용제를 제조하고 이용하는 방법이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 특히 HCC 종양의 혈관 내피 세포를 특별히 표적으로 하고, HCC를 치료하는 작용제와 함께 상기 작용제를 이용하는 관련 방법을 제공한다. 제 1 양태에서, 본 발명은 항체에 컨쥬게이션된 응고 작용제를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 항체는 포유동물 PLVAP 단백질의 세포외 도메인 에피토프에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 응고 작용제는 응고 단백질이다. 보다 특정의 구체예에서, 응고 단백질은 조직 인자이다. 또한 더욱 특정의 구체예에서, 조직 인자는 SEQ ID NO: 1과 적어도 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일하고, 예컨대, SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일하고, 예컨대, SEQ ID NO: 1과 적어도 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
관련 양태에서, 본 발명은 펩티드 결합에 의해 항체에 컨쥬게이션된 SEQ ID NO: 1과 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일한 아미노산 서열을 갖는 조직 인자를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 항체는 인간 PLVAP 단백질의 세포외 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
전술한 임의의 양태 및 구체예에서, 포유동물 PLVAP 단백질은 SEQ ID NO: 2와 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일하고, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일하고, 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 2와 적어도 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
전술한 임의의 양태 및 구체예의 경우, 항체는 PPAGIPVAPSSG (SEQ ID NO: 25) 또는 LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM(SEQ ID NO: 26)으로부터 선택된 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 보다 특정의 구체예에서, 항체는 에피토프 PPAGIPVAPSSG (SEQ ID NO: 25)에 특이적으로 결합한다.
전술한 임의의 양태 및 구체예의 컨쥬게이트의 경우, 일부 구체예에서, 응고 단백질 및 항체는 화학적으로 가교된다. 다른 구체예에서, 응고 단백질 및 항체는 펩티드 결합에 의해 연결된다.
전술한 양태 및 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트에서, 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린일 수 있다. 보다 특정의 구체예에서,응고 단백질 및 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단백질의 카르복시 말단과 응고 단백질의 아미노 말단 사이의 펩티드 결합에 의해 연결된다. 다른 구체예에서, 응고 단백질 및 항체는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단백질의 카르복시 말단과 응고 단백질의 아미노 말단 사이의 펩티드 결합에 의해 연결된다.
일부 구체예에서, 전술한 양태 또는 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트에서, 응고 단백질 및 항체는 링커 펩티드에 의한 펩티드 결합에 의해 연결된다. 더욱 특정의 구체예에서, 링커 펩티드는 (Gly4-Ser)n을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고, 더욱 바람직하게는 n은 3이다.
특정의 구체예에서, 상기 양태 또는 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트에서, 항체는 하기를 포함하는 면역글로불린이다:
i) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역 (임의로, 여기서 가변 경쇄 및 가변 중쇄는 각각의 CDR에 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 지닌다); 또는
ii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역 (임의로, 여기서 가변 경쇄 및 가변 중쇄는 각각의 CDR에 최대 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 지닌다).
보다 특정의 구체예에서, 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역은 인간화된 것이다. 또한 더욱 특정의 구체예에서, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역은 하기에 의해 제공된다:
i) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 또는 11로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (보다 특히 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 11이다); 및 SEQ ID NO: 12, 13, 또는 14로부터 선택된 경쇄 가변 영역 (보다 특히 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 13이다); 또는
ii) SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 또는 19로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (보다 특히 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 19이다); 및 SEQ ID NO: 20, 21, 또는 22로부터 선택된 경쇄 가변 영역 (보다 특히 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 22이다).
전술한 임의의 양태 및 구체예의 특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
관련 양태에서, 본 발명은 전술한 임의의 양태 및 구체예의 컨쥬게이트를 엔코딩하는 핵산을 제공한다. 특정의 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 핵산은 벡터 내에 함유된다. 관련 구체예에서, 벡터는 숙주 세포 내에 존재할 수 있고, 특정 구체예에서, 숙주 세포는 박테리아(예컨대, 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli))이다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포(예컨대, 진균류, 예컨대 발아 효모를 포함하는 효모; 곤충 세포, 예컨대 Sf0, Sf21, 또는 하이 파이브 세포 (high five cell); 또는 포유동물 세포, 예컨대 CHO, VERO, 또는 COS 세포)이다.
또 다른 관련 양태에서, 본 발명은 임의의 전술한 양태 및 구체예의 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 적합한 담체, 부형제, 또는 조영제를 추가로 포함한다. 더욱 특정의 구체예에서, 조성물은 피검체로의 투여에 적합한 투여 형태로 존재한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 전술한 양태 및 구체예 중 어느 하나의 숙주 세포를 상기 숙주에 의한 컨쥬게이트의 발현을 지지하는 조건하에 배양시키고 발현된 컨쥬게이트를 단리시킴에 의해 전술한 양태 및 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양을 치료하거나, 간세포 암종 (HCC)을 치료하거나, PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양의 부피를 감소시키거나, PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양의 혈전증 및 종양 괴사를 유도하는 방법을 필요로 하는 포유동물 피검체에서 PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양을 치료하거나, 간세포 암종 (HCC)을 치료하거나, PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양의 부피를 감소시키거나, PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양의 혈전증 및 종양 괴사를 유도하는 방법을 제공한다. 이들 방법에서, 치료적 유효량의 전술한 양태 및 구체예 중 어느 하나의 컨쥬게이트 또는 전술한 양태 및 구체예 중 어느 하나의 약학적 조성물이 대상체(예컨대, 인간)에 제공(예컨대, 임의의 적합한 수단에 의해 투여)된다.
일부 구체예에서, HCC 종양 부피는 컨쥬게이트에 의해 유도된 혈전증 및 종양 괴사 후에 감소된다.
특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 대상체의 종양, 예컨대, HCC에 혈관내 투여된다. 보다 특정의 구체예에서, 컨쥬게이트는 하나 이상의 종양-영양 동맥에 직접 주입된다.
일부 구체예에서, 대상체는 하나 이상의 화학요법 작용제, 방사선요법, 종양내 알코올 주입, 수술, 냉동요법, 고주파절제, 또는 상기 중 하나 이상의 조합으로 동시 또는 단계적 치료를 받는다. 보다 특정의 구체예에서, 컨쥬게이트는 하나 이상의 화학요법 작용제와 함께 대상체에 투여된다. 보다 더 특정의 구체예에서, 하나 이상의 화학요법 작용제는 치료적 유효량의 소라페닙(sorafenib)(예컨대, PubChem 216239 참조), 베바시주맙(bevacizum)Ab, 또는 다른 항혈관형성 치료적 약물을 포함한다. 특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 하나 이상의 화학요법 작용제를 추가로 포함하는 약학적 조성물로 대상체에 투여된다.
일부 구체예에서, 컨쥬게이트는 약 5 내지 약 200 ㎍/종양 cm3, 더욱 특히 약 10 내지 약 150 ㎍/종양 cm3, 및 더욱 특히 약 15 내지 약 100 ㎍/종양 cm3의 용량으로 투여된다.
특정 구체예에서, 컨쥬게이트는 단일 용량으로 투여된다. 다른 구체예에서, 컨쥬게이트는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회, 또는 그 초과의 용량으로 투여된다. 보다 특정의 구체예에서, 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6주; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월, 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 투여된다.
본 특허 또는 출원 파일은 색깔을 넣어 제조된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색깔이 있는 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 카피는 요청시 오피스에 의해 필요한 요금의 지불과 함께 제공될 것이다.
전술한 내용은 수반하는 도면에 예시된 바와 같이 본 발명의 예시적 구체예의 하기 더욱 특정한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 정제된 GST-태깅된 인간 조직 인자 단백질의 SDS-PAGE 분석을 나타내는 전기영동 젤의 도면이다. 10 퍼센트 폴리아크릴아미드 젤이 사용되었다. GST (GST-hTF)와 태깅된 3 마이크로그램의 재조합 인간 조직 인자가 젤 상에 로딩되었다.
도 2는 단백질 농도의 함수로서의 OD405nm의 그래프이며, 이는 효소-결합 면역검정에 의한 인간 PLVAP로의 인간 조직 인자와 화학적으로 컨쥬게이션된 MECA32 (MECA32-hTF)의 결합을 예시한다. 검정 플레이트의 각각의 웰은 마우스 PLVAP 단백질의 수용성 세포외 도메인으로 코팅되었다. 블로킹 후, 코팅된 웰은 증가하는 농도의 MECA32-hTF와 함께 인큐베이션되었다. 하나의 웰은 인간 조직 인자 (hTF)와 함께 인큐베이션되었다. PLVAP로의 MECA32-hTF의 결합은 R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)로부터의 바이오티닐화된 항-hTF 항체 및 Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL)로부터의 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트로 검출되었다. 결과는 MECA32-hTF가 마우스 PLVAP에 결합하고, 항-hTF 항체를 이용하여 검출가능한 hTF를 갖는 것을 나타내었다. 항체가 없는 대조군 가용성 hTF (속이 채워진 원)는 PLVAP에 결합할 수 없었고, 검출될 수 없었다.
도 3a 및 3b는 MECA32-Fab-TF 발현 벡터의 작제를 나타내는 도표이다.
도 4는 CSRO2-Fab-TF에 대한 발현 작제물의 도표이다.
도 5는 재조합 인간 PLVAP 및 마우스 PLVAP의 SDS-PAGE의 도면이다. 재조합 인간 PLVAP (5㎍) 및 마우스 PLVAP (2.5㎍)가 12% 아크릴아미드 젤로 분석되었다.
도 6A 및 6B는 SCID 마우스에서의 Hep3B 종양 이종이식편의 혈관 내피 세포에서의 PLVAP 발현의 면역조직화학 (IHC) 염색을 예시하는 현미경사진이다. MECA32 항-마우스 PLVAP 모노클로날 항체 (10㎍/ml)가 IHC 염색에 사용되었다(패널 B). 좌측 패널은 음성 대조군 (패널 A)과 동일한 농도의 정상 래트 IgG로 염색된 동일 블록의 섹션이었다. 결과는 인간 HCC와 같은 Hep3B 종양 이종이식편에서의 혈관 내피 세포가 PLVAP 발현에 대해 양성적으로 염색된 것을 나타낸다(패널 B에서 화살표에 의해 표시된 어두운 갈색 침전물). 따라서, 종양 혈관 내피 세포에 의해 발현된 PLVAP는 MECA32-TF 및 MECA32-Fab-TF의 치료 효과를 평가하기 위해 표적화될 수 있다. 동일 혈관은 대조군 래트 IgG로 염색될 수 없었다(패널 A의 화살표).
도 7은 초음파촬영술에 의한 종양 내의 혈류의 사진을 도시하며, 이는 종양 혈류 상에서 재조합 인간 조직 인자와 컨쥬게이션된 항-PLVAP MECA32 모노클로날 항체(mAb) (MECA32-TF)의 효과를 예시한다. 종양 혈류는 3D Power Doppler 초음파촬영술로 평가되었다. Power Doppler는 치료 48시간 전 및 48시간 후에 수행되었다. 결과는 혈류가 20㎍ MECA32-TF (백색 화살표)로 처리된 군에서 유의하게 감소되었으나, 24㎍ MECA32 mAb로 처리된 대조군에서는 그렇지 않은 것을 나타낸다. 적색 혈류 신호가 치료 전에 종양 내에 존재하였다.
도 8은 시간 경과에 따른 종양 부피의 선 그래프이며, 이는 종양 성장에 대한 MECA32-TF 주입의 효과를 예시한다. 상기 도면에 제시된 결과는 도 7에 기재된 것과 동일한 실험으로부터의 결과이다. Hep3B 종양 이종이식편을 갖는 SCID 마우스는 종양 영양 동맥으로의 20㎍ MECA32-TF 주입에 의해 처리되었다. 대조군은 24㎍ MECA32 mAb로 처리되었다. 종양 부피는 0일째에 처리 전 및 후에 3D 초음파촬영술을 이용하여 모니터되었다. 대조군 내의 마우스 중 한마리가 신속한 진행성 종양 성장으로 인해 최초 치료 20일 후에 죽었다(†). 선형 혼합-효과 모델을 이용하여 치료군 및 대조군의 성장 속도가 비교되었고, 유의하게 상이하였다(p=0.0002). 상기 연구의 결과 (도 7 및 8)는 조직 인자와 컨쥬게이션된 항-PLVAP 항체가 종양 혈류를 차단할 수 있고, 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있는 것을 입증하였다. 속이 채워진 원(●): MECA32 mAb 대조군 (n=3); X표(x): MECA32-TF 치료군 (n=3).
도 9는 재조합 항-마우스 PLVAP MECA32-Fab-TF 및 항-인간 PLVAP CSRO2-Fab-TF 컨쥬게이트의 구조의 도표를 제공하는 사진이다. 2개의 항-PLVAP Fab-TF 사이의 주요 차이는 MECA32-Fab-TF의 카파 경쇄의 C-말단에 히스티딘-태그(His-태그)가 존재한다는 것이다. 히스티딘-태그는 정제 목적을 위해 도입되었다. CSRO2-Fab-TF는 정제를 위해 히스티딘-태그를 필요로 하지 않는다.
도 10은 경쟁 항체의 농도에 대한 OD405nm의 선형 그래프이며, 이는 경쟁 효소-결합 면역검정에 의한 마우스 PLVAP에 결합하는 MECA32-Fab-TF를 예시한다. ELISA 플레이트 웰은 밤새 재조합 수용성 마우스 PLVAP (2.5㎍/ml)로 코팅되었다. 소 혈청 알부민을 함유하는 완충제를 이용하여 웰을 블로킹시킨 후, 증가하는 농도의 래트 IgG (0.5㎍/ml 내지 50㎍/ml), MECA32-Fab-TF (0.5㎍/ml 내지 50㎍/ml) 또는 MECA32 mAb (0.05㎍/ml 내지 5㎍/ml)는 0.25㎍/ml의 바이오티닐화된 MECA32 mAb와 함께 인큐베이션되었다. PLVAP로의 바이오티닐화된 MECA32 mAb의 결합을 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 컨쥬게이트 및 색소 기질을 이용하여 측정하였다. 결과는 MECA32 mAb 및 MECA32-Fab-TF 둘 모두가 마우스 PLVAP로의 결합에 대해 바이오티닐화된 MECA32 mAb와 경정할 수 있으나, 래트 IgG 대조군은 그렇지 않은 것을 나타낸다. 예상되는 바와 같이, MECA32 mAb는 이들의 마우스 PLVAP로의 결합에 대해 MECA32-Fab-TF보다 약 1 log 더 효능이 있었는데, 이는 MECA32-Fab-TF의 결합 친화성이 MECA32 mAb보다 1 log 더 낮기 때문이다.
도 11은 MECA32-Fab-TF (3, 6 및 12㎍) 및 대조군 MECA32 모노클로날 항체 (12㎍)에 의한 Hep3B 종양 이종이식편 종양 괴사의 유도를 예시하는 현미경사진 세트이다. 종양 영양 동맥으로의 MECA32-Fab-TF 또는 MECA32 mAb의 주입 후, 종양 이종이식편이 처리 72시간 후에 수거되었고, 조직학적 섹션에 제공되었다. 제시된 현미경사진은 MECA32-Fab-TF의 3개 모두의 상이한 용량에 대해 종양의 대량의 괴사(분홍색으로 강조된 영역)를 나타낸다. 가시적인 종양 조직의 남은 영역은 청색으로 강조된다. 대조군으로부터의 3개 모두의 종양은 우측 컬럼에 제시되는 바와 같이 100% 생존가능하였다. 처리된 종양의 괴사 영역은 전체 종양 이미지 및 괴사 영역의 컷아웃(cutout)을 칭량하여 계산되었고, 백분율로 표현되었다. 종양 경계는 적색 및 청색 선으로 윤곽 표시된다. 각각의 처리된 군에서 3마리의 마우스가 있었다.
도 12는 MECA32-Fab-TF (2.5, 5 및 10㎍) 및 대조군 MECA32 모노클로날 항체 (10㎍)에 의한 Hep3B 종양 이종이식편 종양 괴사의 유도를 예시하는 현미경사진 세트이다. 상기 연구는 도 11에 제시된 것과 유사하였다. 주요 차이는 Hep3B 종양 이종이식편을 치료하기 위해 이용된 용량이었다. 다시, 종양은 종양 영양 동맥으로의 주입 72시간 후에 수거되었고, 조직학적 섹션에 제공되었다. 각 군에 2마리의 마우스가 있었다. 다시, 결과는 처리 후에 3개 모두의 용량에서 유의한 종양 괴사를 나타내었다. 분홍색으로 강조된 각각의 처리된 용량에서의 괴사 영역은 도 11에 기재된 바와 같이 전체 종양 섹션의 백분율로 결정되었다. 종양 경계는 적색 및 청색 선으로 윤곽 표시된다. 사각형 영역이 확대(40x 및 100x)되었고, 잔여 생존가능 종양 세포(화살표)를 나타내기 위해 우측 상에 제시되었다. 각각의 종양에 제시된 백분율은 전체 종양 횡단면에 비한 상대 괴사 영역이다.
도 13a 및 13b는 10㎍ MECA32-Fab-TF의 주입 2, 4, 24, 48 및 72시간 후의 종양 조직학의 변화를 예시하는 현미경사진 세트이다. 섹션은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었다. 도 13a에서, 혈관 내의 섬유소 혈전(화살표)의 출현이 주입 2시간 후에 인지되었다. 섬유소 혈전을 함유하는 혈관의 수는 이후에 더 현저해졌다(화살표). 섬유소 혈전은 처리 전 (0시간)에 종양 혈관에서 관찰되지 않았다. 종양 조직은 48 및 72시간에서 완전히 괴사되었다. 현미경사진은 100x 배율에서 찍었다. 도 13b에서, 종양 세포는 처리 4시간 후에 서로 간에 증가된 명백한 공간을 갖는 약간의 분리를 나타낸다. 이러한 변화는 24시간에서 더 현저해졌다. 청색 핵 염색의 손실을 갖는 Frank 괴사는 처리 48시간 후에 명백해졌고, 72시간에서 더욱 현저해졌다. 현미경사진은 200x 배율에서 찍었다.
도 14는 초음파촬영술에 의한 종양 혈류의 사진의 세트이며, 이는 10㎍ MECA32-Fab-TF의 주입 후의 다양한 시점에서의 종양 혈류의 변화를 예시한다. 종양 혈류는 처리 전 및 후에 3D power Doppler에 의해 평가되었다. 각 시점에서 2마리의 마우스가 있었다. 마우스는 전-처리 3D power Doppler 연구 직후에 안락사되었다. 처리 전 및 후의 각 시점에서 2마리의 마우스 중 1마리로부터의 power Doppler 신호 (적색)를 이용한 초음파촬영술이 여기에 제시되었다. 처리 48시간 전에 수거된 종양의 초음파촬영이 좌측에 제시된다. 처리 후가 좌측 상에 제시되며, 여기서 종양 혈류 신호는 2시간에서 소실되었고, 처리 후 72시간까지 지속되었다.
도 15는 시간 경과에 따른 종양의 선형 그래프이며, 이는 Hep3B 종양 이종이식편의 성장에 대한 MECA32-Fab-TF의 동맥내 주입의 효과를 예시한다. Hep3B 인간 간세포 암종 이종이식편을 갖는 SCID 마우스는 0일에 10㎍ 대조군 MECA32 모노클로날 항체 (mAb) 및 5 또는 10㎍의 MECA32-Fab-TF의 단일 주입으로 처리되었다. 종양 부피는 0일의 처리로부터 -2, 9, 및 24일에 3D 초음파촬영술을 이용하여 측정되었다. MECA32 mAb 대조군 및 2개의 MECA32-Fab-TF 치료군(10 및 5㎍) 에 대해 -2일에 측정된 평균 최초 종양 부피는 각각 26.8, 29.0 및 23.1 mm3였다. 각 군의 종양 부피는 mm3 단위의 평균 ± SD로 표현된다. 치료군 및 대조군의 다양한 성장 속도가 선형 혼합-효과 모델을 이용하여 비교되었다. P 값은 5㎍ 치료군과 대조군 사이의 비교, 및 10㎍ 치료군과 대조군 사이의 비교를 위해 각각 0.0003 및 0.0001이었다.
도 16a는 MECA32 mAb 또는 MECA32-Fab-TF (패널 A)를 이용한 최초 처리 25일 후의 절제된 Hep3B 종양의 사진 및 중량을 도시한다. 각각의 치료군 및 대조군의 평균 종양 중량(평균±SEM)은 막대 그래프로서 도 16b에 제시된다. 각각의 MECA32-Fab-TF 치료군의 종양 중량은 t-검정에 의해 대조군의 종양 중량과 비교되었다. P 값은 10 ㎍ 및 5 ㎍ MECA32-Fab-TF 치료군에 대해 각각 0.01 및 0.03이었다.
도 17은 시간 경과에 따른 종양 부피의 선형 그래프이며, 이는 Hep3B 종양 이종이식편의 성장에 대한 MECA-32-Fab-TF의 전신 투여의 효과를 예시한다. 꼬리 정맥을 통해 처리를 위한 MECA32-Fab-TF 및 대조군을 위한 포스페이트 완충된 염수의 전신 투여로 마우스가 처리되었다. 종양 성장이 0일에서 처리 전 및 후에 측경기를 이용한 3개의 수직 치수의 측정에 의해 모니터되었다. 3개 모두의 군의 최종 종양 부피가 ANOVA에 의해 비교되었다. 결과는 0.96의 p 값으로 3개 모두의 군에서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 상기 3개의 군의 평균 종양 부피(평균±SEM)는 1844±840 mm3 (대조군), 1867±602 mm3 (20 ㎍ MECA32-Fab-TF) 및 1617±559 mm3 (10 ㎍ MECA32-Fab-TF)였다.
도 18은 현미경사진 세트이며, 이는 바이오티닐화된 CSRO2-Fab-TF를 이용한 인간 간세포 암종 (HCC) 및 인접한 비-종양성 간 조직의 3개의 상이한 경우로부터의 섹션의 면역조직화학 염색을 예시한다. 좌측 컬럼 상에 제시된 3개의 HCC 섹션 내의 모든 혈관은 혈관 내피 세포 내의 갈색 색 침전으로 PLVAP에 대해 양성적(화살표)으로 염색되었다. 대조적으로, 내피세포 내막 간 굴모양혈관, 간문맥 및 간정맥(다이아몬드)은 검출가능한 PLVAP 발현이 없는 음성적 염색을 나타내었다.
도 19는 SEQ ID NO: 2의 주석이 달린 서열이며, 여기서 완전한 NP_112600.1 (hPLVAP)의 세포외 영역은 밑줄로 표시된다.
도 20은 SEQ ID NO: 3 >KFCC-GY4_VH_도메인_4의 주석이 달린 서열이며, 여기서 CDR은 밑줄로 표시된다.
도 21은 SEQ ID NO: 4 >KFCC-GY4_VL_도메인_9의 주석이 달린 서열이며, 여기서 CDR은 밑줄로 표시된다.
도 22는 SEQ ID NO: 5 >KFCC-GY5_VH_14의 주석이 달린 서열이며, 여기서 CDR은 밑줄로 표시된다.
도 23은 SEQ ID NO: 6 >KFCC-GY5_VL_19의 주석이 달린 서열이며, 여기서 CDR은 밑줄로 표시된다.
도 24는 재조합 CSR02-Fd-TF 삽입물인 SEQ ID NO: 23의 주석이 달린 서열이며, 여기서 Fd의 VH 도메인 (1-114)은 밑줄로 표시되고, Fd의 CH1 도메인은 굵은 글씨로 표시되고, 힌지 (217-225)는 이중선으로 표시되고, 링커 (226-239)는 소문자로 표시되고, 인간 조직 인자의 세포외 도메인 (240-458)은 이탤릭체로 표시된다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 예시적 구체예의 설명이 하기에 제공된다. 특정 용어의 정의는 출원 전체에 걸쳐 고수될 것이다.
본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 및 조성물
본 발명은 항체에 컨쥬게이션된 응고 작용제를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하며, 상기 항체는 포유동물 PLVAP 단백질의 세포외 도메인 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이러한 컨쥬게이트는 "볼 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트(들)", "본 발명의 컨쥬게이트(들)" 등으로 언급되는 한편, 이를 함유하는 조성물, 예컨대 약학적 조성물은 "본 발명에 의해 제공되는 조성물(들)" 등으로 공지된다. 본 출원은 또한 "본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트(들)" 및 "본 발명에 의해 제공된 조성물(들)"을 기재하기 위해 "본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트(들) 및 조성물(들)"을 언급할 수 있다.
"응고 작용제"는 포유동물의 순환계에서, 즉, 기능적 응고 캐스케이드 및 혈소판 활성화 경로의 존재하에서 생체내에서의 혈전의 형성을 촉진한다. 펩티드 "응고 작용제"는 "응고 단백질"이다. 응고 캐스케이드의 예시적 구성요소는, 예컨대, 조직 인자, 하게만 인자 (인간 GeneID No. 2161), 혈장 트롬보플라스틴 (인간 GeneID No. 2160), 트롬빈 (인간 GeneID No. 2147), 크리스마스 인자 (인간 GeneID No. 2158), 안정 인자 VII (인간 GeneID No. 2155), 및 섬유소 안정 인자 (인간 GeneID Nos. 2162, 2165)를 포함한다; 또한 인간 GeneID Nos. 2156, 2157, 및 2159를 참조하라. 혈소판 활성화 경로의 예시적 구성요소는, 예컨대, ADP, 세로토닌, 혈소판-활성 인자 (PAF; 인간 GeneID No. 7941), 폰 빌레브란드 인자 (vWF; 인간 GeneID No. 7450), 혈소판 인자 4 (인간 GeneID No. 5196), 및 트롬복산 A2 (TXA2))를 포함한다. 응고 작용제는 응고 캐스케이드 (즉, 내인성, 외인성, 또는 통상적 경로의 성분) 또는 혈소판 활성화 경로의 구성요소 또는 생성물, 뿐만 아니라 이종성 단백질, 예를 들어, 응고 독, 예를 들어, convulxin (예컨대, α 및 β 서브유닛 각각에 대한 단백질 서열 참조를 위해 uniprot IDs O93426 및 O93427 참조) 및 Russellysin (예컨대, uniprot Q7LZ61 참조)일 수 있으나, 단, 상기 작용제가, 예컨대, 기능적 응고 캐스케이드 및 혈소판 활성화 경로의 존재하에서 혈전형성을 촉진하는 것을 조건으로 한다.
특정의 구체예에서, 응고 작용제는 응고 단백질이다. 응고 단백질은 컨쥬게이트 내에서 단량체, 또는 올리고머, 예를 들어, 이합체, 또는 삼합체; 또는 더 고등한 순서의 구조의 중합체로 존재할 수 있다. 보다 특정의 구체예에서, 응고 단백질은 조직 인자이다. 인자 III, 트롬보플라스틴, 및 CD142로도 공지된 "조직 인자"는 혈전형성을 촉진하는 인자 VII에 대한 수용체이다. 조직 인자는 인간 GeneID No. 2152에 의해 예시되며, 인간: NP_001984.1, 마우스: NP_034301.3, 침팬지: XP_001156450.1, 및 개 NP_001019811.1로부터의 단백질 포함하는 다수의 동족체가 공지되어 있다(HomoloGene ID 1511 참조). 인간 단백질은 동족체 사이에서 보존된 섬유결합소 타입 3 도메인의 쌍 (cl00065), 뿐만 아니라 WKS 모티프의 쌍 (Uniprot P13726.1), 및 인터페론-결합 영역 (보존된 도메인 CDD:204189)과 같은 모티프를 포함한다. 특정의 구체예에서, 조직 인자는 NP_001984.1의 아미노산 33-251인 SEQ ID NO: 1에 의해 예시되는 조직 인자의 가용성, 세포외 부분, 및 다른 유기체로부터의 상동성 서열과의 정렬에 의해 식별가능한 상응하는 서열, 뿐만 아니라 이의 기능적 변이체, 예를 들어, 치환 및 트렁케이션 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 잔기)이다. 일부 구체예에서, 조직 인자는 SEQ ID NO: 1과 적어도 적어도 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일하고; 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 1과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일하고; 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 1과 적어도 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 변경된 수준의 활성을 갖는 변이체 조직 인자가 단량체, 또는 일부 구체예에서, 다합체, 예를 들어, 이합체로서 본 발명에서 또한 사용될 수 있다. 이들은, 예를 들어, 활성 인자 VII와 관련하여 자연 조직 인자보다 100배 또는 그 초과로 활성이 덜한, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,156,321호에 기재된 바와 같은 "응고-결핍성" 조직 인자를 포함한다.
"항체"는 면역글로불린 (뿐만 아니라 이의 항원-결합 단편), 및 소위 항체-모방체인 적합화되고 면역글로불린과 유사하게 사용될 수 있는 비-면역글로불린 스캐폴드 둘 모두를 포함한다. 예시적 항체 모방체는 섬유결합소 3 도메인 (Fn3 도메인; 모노바디(monobody)로도 공지됨; 예컨대, Koide and Koide, Methods Mol . Biol. 352: 95-109 참조)(2007)), 단백질 A 의 Z 도메인(항체로도 공지되어 있음; 예컨대, Nygren FEBS J. 275 (11): 2668-76 (2008) 참조), 감마-B 결정 또는 유비퀴틴 (afflins; 예컨대, Ebersbach, et al .. J. Mol . Biol . 372 (1): 172-85 (2007) 참조), 리포칼린 (anticalins; 예컨대, Skerra , FEBS J., 275 (11): 2677-83 (2008) 참조); 막 수용체의 A 도메인 (avimers; 예컨대, Silverman , et al . Nat. Biotechnol . 23 (12): 1556-61 (2005) 참조); 안키린 반복부 (darpins; 예컨대, Stumpp et al., Drug Discov . Today 13 (15-16): 695-701 (2008) 참조); Fyn의 SH3 도메인 (fynomers; 예컨대, Grabulovski et al ., J Biol Chem 282 (5): 3196-3204 (2007) 참조), 및 쿤니츠 타입 도메인 (쿤니츠 도메인 펩티드; 예컨대, Nixon and Wood CR, Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8 (2006) 참조)를 기초로 한 것을 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트에서 사용하기 위한 항체는 포유동물 PLVAP 단백질의 세포외 도메인 에피토프에 특이적으로 결합한다. 포유동물 PLVAP의 예시적인 세포외 도메인 에피토프는 PLVAP의 세포외 도메인 (대략 아미노산 49 및 SEQ ID NO: 2 상으로부터의 세포외 도메인)에 해당하는 영역 (예컨대, 디폴트 파라미터를 이용한 서열 정렬, 예컨대, BLASTp, ClustalW, COBALT 등에 의해 평가됨), 또는 대략 아미노산 238 및 SEQ ID NO: 24 (NP_115774.2, 마우스 PLVAP 참조 서열, 예컨대, SEQ ID NO: 24의 아미노산 238-413의 아미노산 서열로 구성된 펩티드), 또는 SEQ ID NO: 2의 대략 아미노산 370 내지 대략 442 내에 함유된 서열 (인간 PLVAP 참조 서열, NP_112600.1), 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 아미노산 378 내지 404 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 431 내지 442로부터와 같이 PLVAP의 C-말단 내의 영역을 포함한다. 특정의 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트에서 사용하기 위한 항체는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 378 내지 404 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 431 내지 442 내의 에피토프; 및/도는 이들 중 어느 하나의 상응하는 영장류 동족체, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) (XP_005588437.1) 및 마카카 물라타(Macaca mulatta) (AFH29537.1)로부터의 상응하는 서열에 특이적으로 결합한다.
특정의 구체예에서, 항체는 면역글로불린이다. "면역글로불린"은 전장 면역글로불린, 뿐만 아니라 면역글로불린의 항원-결합 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 항원-결합 기능을 보유하는 다른 면역글로불린 단편 모두를 나타낸다. 면역글로불린은 이들의 항원-결합 도메인 내에 적어도 3개의 CDR (상보성 결정 영역), 및 보다 특정의 구체예에서, 4, 5, 또는 6개의 CDR, 및 더욱 더 특히 항원-결합 도메인 내에 6개의 CDR을 가질 것이다. 본 발명에서 사용하기 위한 면역글로불린은, 예를 들어, 인간, 오랑우탄, 마우스, 래트, 염소, 양, 토끼 및 닭 항체를 포함한다. 면역글로불린은 폴리클로날, 모노클로날, 일특이적, 다특이적, 비특이적, 인간화, 카멜화, 단쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 또는 CDR-이식될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위한 특정 면역글로불린은 뮤린 하이브리도마 KFCC-GY4 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-9963) 또는 뮤린 하이브리도마 KFCC-GY5 (ATCC Patent Deposit Designation PTA-9964)에 의해 생성된 항체의 CDR, 또는 이의 보존적 치환을 갖는 것, 예컨대, 특정의 구체예에서, 항원-결합 도메인 내에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개 이하의 보존적 아미노산 치환 (더욱 특히, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 치환), 예컨대, 각각의 CDR 내에 약 1, 2, 3, 또는 4개 이하의 보존적 치환; 더욱 특히 각각의 CDR 내에 1 또는 2개 이하의 보존적 치환을 갖는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 면역글로불린은 인간화 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다. KFCC-GY4 및 KFCC-GY5 항체, 예를 들어, 이들의 가변 도메인 및 CDR의 아미노산 서열은 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0085973호 (마우스에서 생성된 모노클로날 항체를 처음 기재함) 및 US 2011/0262349호 (특정 키메라 및 인간화 변이체를 기재함)에 기재되어 있으며, 상기 두 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 또한, 가변성 도메인 서열, 및 상기 항체에 대해 확인된 CDR을 제공하는 SEQ ID NO: 3-22를 참조하라.
세포막 소포 관련 단백질, PV1, FELS, 및 gp68로도 공지된 "PLVAP"는 종양 혈관구조, 예를 들어, HCC 종양 혈관구조에서 발현되는 단백질이며, 인간 GeneID No. 83483에 기재되어 있다. PLVAP는 여러 유기체 (HomoloGene ID 10578 참조), 예컨대, 인간 (NP_112600.1, 또한 SEQ ID NO: 2 참조), 침팬지 (XP_512490.3), 마우스 (NP_115774.2), 및 개 (XP_541953.3)에서 확인되었고, PV-1 도메인 (pfam06637)을 포함한다. 일부 구체예에서, PLVAP, 예를 들어, 포유동물 PLVAP에 특이적으로 결합하는 항체는 SEQ ID NO: 2의 대략 아미노산 49-442 또는 51-442에 해당하는 PLVAP의 세포외 도메인에 결합한다. 특정의 구체예에서, 포유동물 PLVAP는 SEQ ID NO: 2 (또는 이의 세포외 도메인)와 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일하고; 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 (또는 이의 세포외 도메인)와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일하고; 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 2 (또는 이의 세포외 도메인)와 적어도 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, PLVAP 단백질은 SEQ ID NO: 2, 또는 이의 세포외 도메인에 비해 치환 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과의 잔기) 및/또는 트렁케이션(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 잔기)을 포함한다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 링커 펩티드는 펩티드 결합에 의해 항체 및 응고 작용제, 예컨대, 응고 단백질에 커플링될 수 있고, 예컨대, 항체 (예컨대, 면역글로불린의 가변 도메인 중 하나) 및 응고 단백질은 단일한 폴리펩티드 사슬로 발현될 수 있다. 링커 펩티드는, 예컨대, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개 또는 그 초과의 아미노산, 예컨대, 약 75, 100, 150, 200, 250, 또는 300개의 아미노산으로부터 길이가 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 항체 (예컨대, 면역글로불린)와 응고 작용제 (예컨대, 응고 단백질)를 이격시키기 위해 자연-발생 면역글로불린에서 발견되는 시스테인-풍부 및 프롤린-풍부 도메인과 유사하고, 임의로 (Gly4-Ser)3와 같이 추가의 링커 펩티드를 임의로 포함하는 힌지 영역을 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 컨쥬게이트는 임의로 라벨, 예를 들어, 검출가능한 라벨, 예를 들어, 형광, 효소, 또는 방사성 라벨을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트는 바이오티닐화된다.
관련 양태에서, 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 컨쥬게이트를 엔코딩하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 벡터, 및 상기 핵산 및 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 예시적 핵산은, 특정의 구체예에서, SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 갖는 컨쥬게이트를 포함하는 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트와 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% 또는 그 초과로 동일한 단백질을 엔코딩하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 핵산은 매우 엄격한 하이브리드화 조건하에서 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트를 엔코딩하는 핵산에 하이브리드화될 수 있다. "매우 엄격한 하이브리드화" 조건은 65℃에서의 적어도 약 6X SSC 및 1% SDS와 함께, 0.1X SSC 중 약 20% (v/v) 포름아미드를 이용한 약 42℃에서의 10분 동안의 첫번째 세척과 함께, 65℃에서의 0.2 X SSC 및 0.1% SDS를 이용한 이후의 세척이다. 특정의 구체예에서, 본 발명에 의해 제공되는 핵산은, 예컨대, 컨쥬게이트의 생성을 위해 사용되는 특정 숙주 세포에 대해 코돈 변형될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 핵산을 엔코딩하는 벡터는, 예컨대, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트의 발현에 필요한 추가 서열 (예컨대, 조절 서열, 프로모터, 및 인핸서), 뿐만 아니라 특정한 적합한 부수적 서열, 예를 들어, 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선택가능한 마커, 및 통합 서열 (예컨대, 표적화된 누클레아제에 의해서와 같이, 예컨대 상동성 재조합에 의한 무작위 통합, 전치 요소, 또는 부위 특이적 통합에 의한 숙주 유전체로의 통합을 위한 통합 서열)을 함유할 수 있다.
관련된 양태에서, 본 발명은 예컨대, 숙주에 의한 컨쥬게이트의 발현을 지지하는 조건 (예를 들어, 프로모터가 유도가능한 경우, 유도가능한 작용제 등을 첨가함으로써) 하에 본 발명에 의해 제공된 핵산을 함유하는 숙주 세포를 배양하고, 이어서 발현된 컨쥬게이트를 분리함으로써 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 제공한다. 적합한 숙주에는 박테리아 (예컨대, 에스체리치아 콜라이 (Escherichia coli)) 뿐만 아니라 진핵 세포 예컨대, 진균류, 예컨대, 출아 효모를 포함하는 효모; 곤충 세포 예컨대, Sf0, Sf21 또는 하이 파이브 세포 (high five cell); 또는 포유동물 세포 예컨대, CHO, VERO, 또는 COS 세포, 또는 중간엽 줄기 세포 (MSC)가 포함된다.
본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트는, 예를 들어, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트가 적합한 담체 또는 부형제와 화합되는 약학적 조성물과 같은 조성물로 유용하게 제형화될 수 있다. 임의의 적합한 약학적 담체가 본 발명에 사용될 수 있다. 특정의 구체예에서, 담체는 예컨대, 저장 또는 수송을 위해 동결건조되는 경우, 컨쥬게이트의 안정성을 증진시킬 것이며, 재구성 후 수용액과 같은 용액중에 존재하게 될 경우, 최상의 약학적 실시와 일맥상통하는, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트의 안정성을 지지할 것이다. 약학적 조성물은 완충제 (예컨대, 히스티딘, 포스페이트 또는 숙시네이트 완충제), 증량제 또는 케이킹제 (예컨대, 글리신 또는 소르비톨, 또는 당 예컨대, 수크로스, 덱스트로스, 락토스 또는 프룩토스), 긴장성 조절제 (예컨대, 무기염 예컨대, 소듐 클로라이드, 포타슘 포스페이트 또는 소듐 포스페이트), 방부제, 습식 작용제, 에멀션화제 등등 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
특정의 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트는 예컨대, 동맥경유 투여와 같은 맥관경유 투여를 통한 HCC 종양 맥관구조로의 직접 투여에 적합한 약학적 조성물로 제형화된다. 특정의 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트는 리피돌 오일로 제형화될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트는 IVALON® 함입 입자와 같은 평균 직경이 약 45 ㎛ 내지 약 90 ㎛인 미세입자로 제형화될 수 있다. 이러한 부형제의 존재하의 주입은, 처리된 종양으로 투여되는 경우, 예컨대, 주입 후 종양 혈관내에서 혈액의 정체를 유도함으로써 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트의 이용성을 증가시킬 수 있다.
일부 구체에에서, 본 발명에 의해 제공된 조성물은 예를 들어, 형광경에 의ㅎ한처리된 종양에서 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트의 분포에 대한 평가를 허용하고/거나 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트에 노출된 종양의 완전성을 평가하기 위해 양립성 수용성 조영제 (방사선 촬영, MRI 또는 초음파 적용에 있어서)를 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 약학적 조성물은 본 발명의 약학적 조성물의 하나 이상의 성분들로 충전된 하나 이상의 컨테이너를 함유할 수 있는 다중 투여 형태의 키트를 포함하는, 상기 약학적 조성물을 필요로 하는 대상체에 분포 및 투여하기 위한 투여 형태(들) (본 발명에 의해 제공된 방법에 맞는)로 제조될 수 있다. 약학적 또는 생물학적 제품의 제작, 사용 또는 판매와 관련하여 정부 기관에 의해 규정된 형태의 노티스가 선택적으로, 이러한 컨테이너(들)과 함께 제공될 수 있으며, 상기 노티스는 인간 투여를 위한 제작, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한다. 팩 또는 키트에는 투여 방식, 약물 투여 순서 (예컨대,다중-작용제 키트의 경우 개별적, 연속적 또는 동시 투여), 또는 기타 등등에 관한 정보가 표지될 수 있다. 팩 또는 키트는 또한, 환자에게 치료를 취하도록 상기시키는 수단을 포함할 수 있다. 팩 또는 키트는 조합 요법의 단일 단위 투여량일 수 있거나 복수의 단위 투여량일 수 있다. 특히, 화합물(들)은 분리될 수 있거나, 임의의 조합으로 함께 혼합되거나 단일 형태 예컨대, 바이알 또는 정제로 존재할 수 있다. 본 발명의 목적에 있어서, 단위 투여량은 각 화합물의 개별적인 약력학에 의존적인 투여량을 의미하는 것으로 의도되며, 표준 시간 경과에 따라 FDA 승인된 투여량으로 투여된다.
따라서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트, 본 발명에 의해 제공된 약학적 조성물 및 이들을 함유하는 본 발명에 의해 제공된 키트는 HCC와 같은 PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양을 갖는 대상체를 치료하는 방법 및 PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양을 시각화시키는 방법에 유용하다.
처리 방법
본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 및 조성물은 이를 필요로 하는 포유동물 대상체에서 예를 들어, PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양 (HCC 또는 아교모세포종)을 치료하거나, 간세포 암종 (HCC)을 치료하거나, PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양의 종양 부피를 감소시키거나, PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양의 혈전증 및 종양 괴사를 유도하는 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 대상체에 치료학적 유효량의 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 또는 본 발명에 의해 제공된 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
"대상체"는 포유동물, 더욱 특히, 인간 환자 (수컷 또는 암컷), 및 보다 특정의 구체예에서, HCC, 아교모세포종 또는 PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 임의의 종양을 갖는 인간 환자를 지칭한다. 대상체는 임의의 생명 시기 및 임의의 연령 예컨대, 신생아, 유아, 토들러, 소아, 청소년, 성인 또는 노인일 수 있지만; 특정의 구체예에서, 대상체는 성인 예컨대, 인간 성인 즉, 약 18 세 또는 그 초과 예컨대, 약 18-70, 20-60, 25-55, 25-50, 30-50, 25-65 세, 및 약 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 세 초과이다. 보다 특정의 구체에에서, 대상체는 60세 또는 그 초과의 노인 예컨대, 더욱 특히, 65세 또는 그 초과이다. 더욱 추가의 특정의 구체예에서, 대상체는 약 70 세 내지 약 79 세이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 의학적 상태 (예컨대, HCC 또는 PLVAP-양성 맥관구조를 갖는 종양)에 반대로 작용하여 의학적 상태가 임상적으로 허용가능한 기준에 따라 개선됨을 의미한다. 예를 들어, HCC에서의 개선은 감소된 종양 부피, 감소된 종양 혈류, 종양 괴사 및/또는 아폽토시스, 정상화된 간 기능 등을 포함한다.
"치료학적 유효량"은 투여 조건하에 요망되는 치료학적 또는 예방학적 효과를 달성하는데 충분한 양 예컨대, HCC를 치료하는데 충분한 양이다. 치료법의 유효성은 표준 측정 및 정례적 방법을 이용하여 당업자에 의해 측정될 수 있다. 특정의 구체예에서, 컨쥬게이트는 약 5 내지 약 200㎍/종양 cm3, 더욱 특히, 약 10 내지 약 150 ㎍/ 종양 cm3, 및 더욱 특히, 약 15 내지 약 100 ㎍/종양 cm3의 용량으로 투여된다. 하나의 유기체 예컨대, 본원에 제공된 마우스 사례에서 유효한 것으로 밝혀진 투여량은 공지의 방법론을 이용하여 인간과 같은 또 다른 유기체에 사용하기 위해 전환될 수 있다. 예컨대, 문헌 [Reagan-Shaw et al., FASEB J. 22:659-61 (2008); Schein et al., Clin. Pharmacol. Ther. 11: 3-40 (1970); and Freireich et al., Cancer Chemother. Reports 50(4):219-244 (1966)] 참조. 예를 들어, 동물 용량에 근거한 인간 등가 용량 (HED) (mg/kg)은 하기 식에 의해 제공될 수 있다: HED (mg/kg) = 동물 용량 (mg/kg) X (Km동물/Km인간) (여기서, Km = 중량/표면적 kg/ m2)임). 상기 식에 근거한 예시적인 전환 계수는 하기 표 A에 기록하였다.
표 A.
Figure 112014110000898-pat00001
본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 및 본 발명에 의해 제공된 조성물은, 특정의 구체예에서, 대상체의 종양으로의 맥관내로 제공되는 것을 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 대상체로 제공 (예컨대, 투여)될 수 있으며, 예컨대, 컨쥬게이트는 HCC의 하나 이상의 종양-공급 혈관에 직접 주입된다.
본 발명에 의해 제공된 방법에 의해 치료된 대상체는 하나 이상의 화학요법 작용제, 방사선요법, 종양내 알코올 주입, 수술, 냉동요법, 고주파절제, 또는 상기중 하나 이상의 조합과 동시에 또는 순차적 처리로 처리될 수 있다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 화학요법 작용제는 치료적 유효량의 소라페닙 (예컨대, PubChem 216239 참조), 베바시주맙Ab, 또는 그 밖의 항혈관형성 치료적 약물을 포함한다. 조합 방법에서, 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 (또는 본 발명에 의해 제공된 조성물)는 동시에 (단일 조성물 또는 별도의 조성물로) 또는 순차적으로 (다른 처리 전 또는 후에) 투여될 수 있다.
본 방법이 조영제를 포함하는 본 발명에 의해 제공된 조성물을 사용하는 경우, 일부 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 방법은 예컨대, 조영제를 사용하여 x-선 (CAT 스캔 포함), MRI 또는 초음파에 의해 종양 (예컨대, HCC 또는 아교모세포종)을 가시화시키는 단계를 포함한다.
대상체에는 단일 용량 또는 다른 구체예에서, 다중 용량, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 용량 또는 그 초과로 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 또는 조성물이 투여될 수 있다. 다중 용량으로 투여되는 경우, 용량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 주; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개월의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다.
HCC가 발병한 고위험군은 HBV-양성인 대상체; HCV-양성인 대상체; 손상된 간 기능을 갖는 대상체; 간 경변을 갖는 대상체; TP53 (OMIM 191170), MET (OMIM 164860), CTNNB1 (OMIM 116806), CASP8 (OMIM 601763), PIK3CA (OMIM 171834), AXIN1 (OMIM 603816), PDGFRL (OMIM 604584), 및 APC (OMIM 611731)중 하나 이상에 변이가 있는 대상체; 알파-1-항트립신 결핍 (OMIM 613490) 대상체; 혈색소증 (OMIM 235200) 대상체; 티로신혈증 (OMIM 276700) 대상체; 및 상기의 조합을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 따라서, 특정 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 방법은 이러한 돌연변이중 하나 이상을 갖는, HCC를 갖는 (또는 HCC를 갖는 것으로 의심되는) 대상체를 제공하는 단계를 수반하며, 예컨대, 대상체는 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트의 투여 전에 돌연변이 (또는 HCC의 증가된 병원성과 관련된 임의의 돌연변이)중 하나를 갖는 것으로 확인된다.
본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 및 본 발명에 의해 제공된 조성물은 임의의 적합한 경로 및 임의의 적합한 수단에 의해 대상체 (예컨대, 인간)에 투여될 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트 또는 조성물은 대상체의 HCC로 예를 들어, 하나 이상의 종양-공급 혈관 예컨대, 간 동맥 또는 고 동맥으로 직접적으로 또는 간문맥을 통해 주입됨으로써 맥관내로 투여될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 및 본 발명에 의해 제공된 조성물은 대상체에 단독으로 또는 하나 이상의 화학요법 작용제 예컨대, 소라페닙 (예컨대, PubChem 216239 참조), 베바시주맙Ab, 또는 그 밖의 항혈관형성 치료적 약물중 하나 이상과 함께 (동일한 조성물중에, 또는 동시적 또는 순차적 투여로) 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 임의의 방법에서, 컨쥬게이트는 약 5 ㎍/종양 cm3 내지 약 200 ㎍/종양 cm3, 더욱 특히, 약 10 내지 약 150 ㎍/종양 cm3, 및 더욱 특히, 약 15 내지 약 100 ㎍/종양 cm3의 용량으로 투여된다. 본 발명에 의해 제공된 컨쥬게이트 또는 본 발명에 의해 제공된 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 회 또는 그 초과 용량으로 투여될 수 있다. 다중 용량은 임의의 유용한 기간 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 주; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개월에 걸친 것일 수 있다.
실례
PLVAP 유전자 발현은 HCC의 맥관 내피 세포로 제한되며, 비-종양 간 조직에서는 제한되지 않는다. PLVAP 단백질은 맥관 내피 창 (vascular endothelia fenestrae) 및 소포 (caveolae)의 구조 단백질이다. 신호전달에 관련되는 것으로 알려지지 않았다. 항-PLVAP 항체 처리는 마우스의 혈관 내피 세포를 가로질러 운반하는 백혈구에 영향을 끼치는 것으로 최근 보고되었다.
본 특허 출원에서, 본 발명자들은 비-종양 간 조직이 아닌 HCC의 혈관 내피 세포에서 PLVAP의 구별되는 발현을 활용한, HCC의 치료를 위한 신규한 치료적 생물학제의 개발에 대해 기술하고 있다. 본 발명자들의 방법에 있어서, 본 발명자들은 항-PLVAP 항체 또는 이의 Fab 단편상에 인간 조직 인자 단백질을 공동-발현시킴으로써 이러한 치료적 생물학제를 개발하였다. 인간 조직 인자는 혈액 응고의 강력한 유발제이다. 본 발명자들에 의해 개발된 치료적 작용제의 HCC의 혈관으로의 주입은 이의 종양 맥관 내피 세포로의 결합을 유도하고, HCC의 모든 혈관에서 응고 혈액 형성을 유발시킬 수 있다. HCC 종양 혈관의 혈전증은 종양 혈액 공급의 결손 및 허혈 괴사로 이어진다. SCID 마우스에서 HCC 이종이식편 모델을 사용함으로써, 본 발명자들은 인간 조직 인자를 지닌 개발된 항-PLVAP 모노클로날 항체 또는 이의 Fab 단편의 종양 영양 동맥으로의 주입이 종양 이종이식편의 대량 허혈 괴사를 성공적으로 유도하고, 종양 성장을 억제하였음을 보여주었다. 말초혈관을 통한 이러한 치료제의 전신 투여는 비효과적이었다. 따라서, 이러한 신규한 작용제의 종양 영양 동맥으로의 주입이 치료적 효과를 달성하는데 바람직하다.
재료 및 방법
래트 항-마우스 PLVAP MECA32 모노클로날 항체 ( mAb )
MECA 32 하이브리도마를 Developmental Studies Hybridoma Bank ( University of Iowa (Iowacity, IA))에서 수득하였다. 이러한 하이브리도마 세포를 10% 저-IgG 소태아혈청, 1% GLUTA-Max (Life Technologies, Carlsbad, CA), 1% 항생제-항진균제 (Life Technologies) 및 1% HEPES (Life Technologies)를 함유하는 RPMI 배지에서 배양하였다. 래트 항-마우스 PLVAP MECA32 mAb를 제조업자의 지시에 따라 GE Healthcare Life Sciences의 HiTrap 단백질 G 컬럼을 사용하여 MECA 32 하이브리도마 세포의 두꺼운 배양 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 항체를 포스페이트 완충된 염수 ((PBS), pH 7.4)로 투석하였다. 항체의 농도는 1mg/ml에 대한 1.37의 흡광계수를 사용하여 280nm 파장에서의 흡광도에 의해 측정하였다.
인간 조직 인자 단백질의 수용성 세포외 도메인의 생성
인간 조직 인자 단백질 (hTF)의 재조합 수용성 세포외 부분을 생성하기 위해, 인간 조직 인자 cDNA의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 33 내지 251)에 대한 PCR 단편을 인간 조직 인자의 전장 cDNA 클론 (NM001993.2) (OriGene Corp., Rockville, MD)으로부터 제조하였다. PCR에 사용된 프라이머는 각각 정방향 및 후방향 프라이머 둘 모두의 5' 말단의 BamH1 및 SalI에 대한 제한 서열을 함유하였다. 증폭된 cDNA 단편을 pGEX®-6P-1 플라스미드 (GE Heathcare Life Sciences)로 삽입하고, 글루타티온 트랜스퍼라제 (GST)로 태깅하였다. 상기 기술된 발현 작제물은 DNA 서열분석에 의해 입증되고, hTF의 생성을 위한 에스체리치아 콜라이 균주 SHuffleTM T7 Express (New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA)로 형질전환되었다. E. 콜라이 형질전환체를 선택 배지상에 플레이팅시켰다. 후에, 1-2mm의 집락을 무작위로 선택하고, 30℃에서 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 4ml의 2xYT 배지에 접종하고, 230 rpm 인큐베이터 진탕기에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 밤새 배양한 배양물을 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 400 ml의 2xYT 배지에 접종하고, 밤새 30℃의 230 rpm 인큐베이터 진탕기에서 계속해서 성장시켰다. 600 nm에서의 흡광도가 약 0.6~0.8에 도달하는 경우, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 0.4mM의 최종 농도가 되도록 첨가하여 단백질 생성을 유도하였다. 30℃에서 약 20 시간 동안 계속해서 진탕시켰다. IPTG 도입 후, 세포를 원심분리 (10,000 x g; 20 min)하여 수집하고, 라이소자임 및 Benzonase Nuclease (Novagen)를 함유하는 0.2% Tween 80의 존재하의 1x PBS중에 실온에서 2 시간 동안 용해시켰다. 세포 용해물을 4℃에서 30분 동안 10,000 rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 모으고, 용해성 분획물로서 여과하였다.
GST (GST-hTF)이 태깅된 재조합 인간 조직 인자를 제조업자의 지시에 따라 GSTrap FF 컬럼 (GE Helathcare Life Sciences, Piscataway, NJ)으로부터 정제하였다. GST-hTF를 함유하는 용리된 분획물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)으로 확인하고, 풀링하고, PBS로 투석하였다. 정제된 단백질의 농도를 기준으로서의 소혈청 알부민 및 Bradford 단백질 검정법 (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA)을 사용하여 측정하였다. 정제된 GST-hTF는 SDS-PAGE 겔 (10% 폴리아크릴아미드)에서 예측 분자량이 50 kDa인 단백질 밴드를 나타냈다 (도 1). 정제된 단백질의 조직 인자 활성을 비색 검정법을 이용하여 통상의 인간 조직 인자에 대비하여 검정하였다. 정제된 GST-hTF을 통상의 hTF 기준에 대비하여 검정하고, 단백질 1 마이크로그램 당 3ug의 hTF 활성을 가졌다. 이러한 hTF 활성 검정의 절차는 후속 단락에서 상세히 기재되어 있다.
래트 항-마우스 PLVAP MECA32 모노클로날 항체로의 재조합 GST - hTF 의 컨쥬게이션
먼저, 정제된 MECA32 mAb를 pH 6.0의 0.5M NaCl을 함유하는 0.1 M MES 완충제에서 투석하였다. MES는 2-(N-모르폴린)에탄설폰산이다. 동일한 MES 완충제를 사용하여 항체를 1 mg/ml로 조정하였다. 1 ml의 MECA32 mAb에 1.2 mg EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드) 및 3.3 mg의 설포-NHS (N-히드록시설포숙신이미드)를 첨가하였다. 첨가된 시약을 용해시키기 위해 부드럽게 볼텍싱한 후, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS 커플링 완충제로 사전-평형화된 Zeba 탈염 컬럼을 사용하여 활성화된 MECA32 mAb를 회수하였다. PBS 커플링 완충제는 pH 7.4-7.5의 3 mM KCl, 140 mM NaCl, 및 10 mM 소듐 포스페이트로 구성된다. 그 후, 동일 수의 GST-hTF (0.66ml중 0.33mg)를 활성화된 MECA32-mAb에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 회전 혼합기에서 인큐베이션하였다. 이어서, 히드록실아민을 첨가하여 반응물을 켄칭시켜 10mM의 최종 농도가 되게 하였다. 인간 조직 인자 단백질과 컨쥬게이션된 항체를 1x 포스페이트 완충된 염수에 대해 광범위하게 투석하여 모든 작은 유기 화학물질을 제거하였다. 항체의 농도는 280nm의 흡광도에서 측정하였다. 1 mg/ml에 있어서 1.37의 흡광계수를 이용하여 항체 농도를 측정하였다. 인간 조직 인자와 컨쥬게이션된 항체를 비색 검정법을 이용하여 조직 인자 활성에 대해 측정하였다. R&D Systems (Minneapolis, MN)로부터 구입한 재조합 인간 조직 인자를 검정에 대해 기준으로 사용하였다. MECA32 모노클로날 항체의 정제된 TF 컨쥬게이트 (MECA32-TF)를 마우스 PLVAP로의 결합 및 마우스 PLVAP에 결합된 항체 상의 인간 조직 인자의 존재에 대해 검정하였다 (도 2).
hTF를 공동-발현하는 MECA32 항-마우스 PLVAP 모노클로날 항체의 Fab 단편 (MECA32-Fab-TF)을 발현시키기 위한 플라스미드 작제물의 개발
MECA32-Fab-TF를 생성하기 위해 플라스미드 작제물의 제조를 4 단계로 달성하였다. 제 1 단계는 MECA32 mAb 경쇄의 가변 도메인 (VL) 및 MECA32 mAb 중쇄의 가변 도메인 (VH)의 cDNA를 제조하고, 제 2 단계에 사용될 프라이머의 제조를 위해 이들의 DNA 서열을 결정하는 것이다. 제 2 단계는 카르복실 말단에서 His-tag를 갖는 MECA32 mAb의 카파 경쇄에 대한 전장 cDNA를 제조하고, pET26b 플라스미드 벡터에 삽입하는 것이다. 제 3 단계는 3' 말단에서 MECA32 mAb 중쇄의 VH1 및 CH1 도메인 (Fd) 플러스 힌지 영역과 링커 서열의 cDNA, 및 5' 말단에서 hTF 및 링커 서열에 대한 cDNA를 제조하는 것이다. 이어서, 오버랩핑 PCR을 사용하여 두개의 cDNA를 함께 스티치 (stitch)시켰다. MECA32-Fd-힌지-링커-TF의 이러한 cDNA를 pET26b 플라스미드 벡터내로 삽입하였다. 제 4 단계는 제 2 단계 및 제 3 단계로부터 제조된 플라스미드로부터 바이시스트로닉(bicistronic) 플라스미드 벡터를 작제하는 것이다. 이러한 4 단계는 하기 더욱 상세히 기술되어 있으며, 도 3a 및 3b에 요약되어 있다.
제 1 단계: 핵산 서열분석을 위한 MECA32 mAb 중쇄의 VH 도메인 및 MECA32 mAb 카파 경쇄의 VL 도메인의 cDNA 클로닝
MECA32 mAb 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 가변 도메인을 코딩하는 cDNA를 제조업자의 지시에 따라 FirstChoice RLM-RACE 키트 (Ambion, Inc., Austin, TX)를 사용하여 제조하였다. 간단하게는, MECA32 하이브리도마로부터 분리된 전체 RNA를 주형으로 사용하여, 각각 VH 도메인 옆의 중쇄의 CH1 도메인 (5'TGAGAGTGTAGAGTCCAGACTGCAGG3') (SEQ ID NO: 28) 및 VL 도메인 옆의 카파 경쇄의 불변 도메인 (5'TGTCCTGATCAGTAACACTGTCC3') (SEQ ID NO: 27)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 프라이머를 사용한 역전사 PCR에 의해 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 가변 도메인을 증폭시켰다.
PCR 생성물을 분석하고, Qiaquick 겔 추출 키트 (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada)를 사용하여 1.5% 아가로스 겔로부터 분리하였다. 정제된 PCR 단편을 플라스미드 벡터인 pGEM-T-easy (Promega, Madison, WI, USA)로 삽입하고, 에스체리치아 콜라이 균주 YE707-J (Yeastern Biotech, Taipei, Taiwan)로 형질전환시켰다. VL 및 VH 도메인의 삽입물을 함유하는 플라스미드를 형질전환된 E. 콜라이로부터 제조하고, VL 및 VH 도메인의 DNA 서열 결정에 사용하였다. 이어서, 서열을 사용하여 제 2 단계 및 제 3 단계에 사용된 프라이머를 설계하였다.
제 2 단계: MECA32 mAb 카파 경쇄 및 His-tag로 구성된 cDNA의 제조 및 이의 pET-26b 플라스미드 벡터로의 삽입
제 1 단계로부터의 VL 사슬의 서열을 사용하여 MECA32 항체의 카파 경쇄 cDNA 전장 서열을 수득하는데 적합한 프라이머를 설계하였다. 먼저, MECA32 mAb의 카파쇄 전장 cDNA를, 하기 기재된 프라이머를 사용하여 MECA32 하이브리도마 세포의 전체 RNA로부터 RT-PCR에 의해 생성하였다:
정방향 프라이머: 5'GATCCTGACATCCAGATGACCCAGACTCC3'(SEQ ID NO: 29) 및
역방향 프라이머: 5'CACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG3'(SEQ ID NO: 30).
BamHI 및 Sal I 제한 부위를 갖는 정제된 PCR 단편을 CK 도메인의 카르복실 말단에서 (His)6-tag를 갖는 플라스미드 벡터 pET26b에 삽입하고, 이러한 플라스미드를 pET26b-M32K로서 지정하였다 (도 3a).
제 3 단계: MECA32-Fd-힌지-링커-TF cDNA의 제조 및 pET26b 플라스미드 벡터로의 삽입
본 발명자들은 먼저 MECA32 하이브리도마 세포로부터의 cDNA 주형 및 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해, MECA32 mAb Fd, 힌지 영역 플러스 및 링커 서열로 구성된 cDNA를 제조하였다:
정방향 프라이머: 5'GACATCCAGATGACCCAGACTCC3'(SEQ ID NO: 31) 및
힌지 링커 역방향 프라이머: 5'AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGTACATCCACAAGGATTGCATTCC3'(SEQ ID NO: 32).
이어서, 본 발명자들은 클로닝된 hTF cDNA 주형 및 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 인간 조직 인자 (AA. 33-251) (hTF)의 세포외 도메인 및 (Gly4Ser)3 링커 서열로 구성된 cDNA를 제조하였다:
hTF 링커 정방향 프라이머 : 5'GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACT GTGG3'(SEQ ID NO: 33) 및
TF 역방향 프라이머: 5'CAGTGTGAGGTGCAACTGGTGGAG3'(SEQ ID NO: 34).
두 PCR 생성물을 오버랩핑 연장에 의해 스티치하였다. 최종 융합된 PCR 생성물을 pET-26b 벡터에 삽입하였다. 이러한 벡터를 pET26b-M32-Fd-TF 로서 지정하였다(도 3a).
제 4 단계: MECA32 Fd-힌지-(Gly 4 Ser) 3 링커-TF 및 Hig-tag를 갖는 MECA32 카파 경쇄 둘 모두를 함유하는 비스시스트로닉 플라스미드 벡터의 작제
본 발명자들은 주형으로서의 pET26b-M32-Fd-TF 및 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 DNA 단편을 생성시켰다:
26b-RBS-F: 5'　ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA　3' (SEQ ID NO: 35) 및
26b-말단화-R: 5'　CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG　3' (SEQ ID NO: 36).
이러한 DNA 단편은 리보좀 결합 서열 (rbs), MECA32 mAb 중쇄의 VH1과 CH1, 힌지 영역, 링커 서열, hTF 및 정지 코돈을 포함하였다. 이어서 이러한 단편을 pET26b-M32K의 Xba I 제한 부위로 삽입하였다. 전체 삽입물의 서열을 염료 탈산소 방법 (dye-deoxy method)을 이용하여 DNA 서열분석에 의해 입증하였다. 이러한 플라스미드 작제물을 pET26b MECA32-Fab-TF (도 3b)로서 지정하고, 단백질 발현을 위한 E. 콜라이 SHuffle T7 발현 균주 (New England Biolabs Corp.)로 형질전환시켰다. MECA32-Fab-TF의 생성을 위한 이러한 바이시스트로닉 플라스미드 발현 벡터의 작제 단계를 요약한 도해가 도 3a 및 3b에 도시되어 있다.
인간 조직 인자를 공동발현하는 MECA32 항-마우스 PLVAP 모노클로날 항체의 Fab의 생성 (MECA32-Fab-TF)
MECA32-Fab-TF를 생성하기 위해, 신선한 E. 콜라이 배양물의 집락 (1-2mm)을, 30㎍/ml 카나마이신을 함유하는 4 ml의 2xYT 배지에 30℃, 230 rpm에서 밤새 접종하였다. 다음날 아침, 하룻밤 지난 배양물을 30㎍/ml 카나마이신을 함유하는 400 ml의 2xYT에 접종시키고, 30℃, 250 rpm에서 계속 성장시켰다. 600nm에서의 흡광도가 ~0.6-0.8에 도달하면, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 재조합 단백질 생성의 유도를 위해 0.4 mM의 최종 농도가 되도록 첨가하였다. 30℃에서 약 20 h 동안 계속 진탕하였다.
실온에서 20 분 동안 10000 x g에서의 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 봉입체를 분리하는데 사용하였다. 세포 페이스트를, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.17 mg/ml PMSF 및 2 mg/ml 난백 라이소자임 (Sigma)을 함유하는 4 ml의 10 mM Tris/HCl, pH 7.5에 현탁시켰다. Benzonase (250 유닛; EM Science)를 첨가하고, 현탁액을 1.5 시간 동안 실온에서 완만하게 혼합한 후, 12000 x g에서 15 분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 1 mM EDTA 및 3 % Nonidet P40 (2 ml)를 함유하는 10 mM Tris/HCl, pH 7.5중에 재현탁시키고, 1 분 동안 50% 전력으로 초음파처리하고, 12000 g에서 20분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 물중에 재현탁시키고, 50% 전력으로 20-30 초 동안 초음파처리하고, 12000 x g에서 20분 동안 원심분리하였다. 물로의 세척을 반복하고, 봉입체가 매우 풍부한 최종 펠렛을 6 M 구아니디늄 클로라이드, 0.5 M NaCl, 20 mM 포스페이트 및 10 mM 2-메르캅토에탄올을 함유하는 완충제 (pH 8)중에 실온에서 밤새 완만하게 혼합함으로써 현탁시켰다. 용액을 실온에서 밤새 유지시킨 후 6 M 우레아/50 mM Tris/HC1, pH 8중에 약 1 mg/ml의 단백질 농도로 희석하고, 10-20 용적의 동일한 완충제로 4℃에서 밤새 투석하였다. 그 후, 2 M 우레아, 50 mM Tris/HCl, 300 mM NaCl, 2.5 mM GSH, 0.5 mM GSSG, pH 8 (폴딩 완충제 (foling buffer))를 함유하는 완충제로 교환하여 투석하였다. 2일 동안 투석 후, 완충제를 새로운 폴딩 완충제로 대체하고, 투석을 2일 더 계속하였다. 그 다음에, 투석 완충제를 1M 우레아, 50mM Tris-HCl, 300mM NaCl pH8의 완충제로 교체하고, 투석을 1일 더 계속하였다. 그 후, 6 시간 동안 0.8M 우레아, 밤새 0.56M 우레아 및 6시간 동안 0.28M 우레아로 우레아의 농도를 연속적으로 감소시키면서 동일한 완충제에서 투석을 수행하였다. 최종적으로, 투석을 우레아의 부재하에 폴딩 완충제에서 수행하고 밤새 계속하였다. 리폴딩된 상청액을 니켈 니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA; GE Healthcare) 컬럼 상에 로딩하고, pH 7.0의 0.3M NaCl 및 50mM 소듐 포스페이트중의 500mM 이미다졸로 용리시켰다. 재조합 MECA32-Fab-TF를 HiLoad 16/60 Superdex 75 사전 준비 등급 (GE Healthcare) 겔 여과 컬럼 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 표적 MECA32-Fab-TF를 함유하는 용리물을 SDS-PAGE로 분석하고 풀링하였다. MECA32-Fab-TF을 ELISA에 의해 특성 결정하여 마우스 PLVAP으로의 결합을 확인하였다. MECA32-Fab-TF의 조직 인자 특이적 활성을 비색 TF 검정법을 이용하여 측정하였다.
수용성 인간 조직 인자를 공동-발현하는 CSRO2 항-인간 PLVAP 모노클로날 항체의 재조합 Fab 단편을 발현시키기 위한 플라스미드 작제물 (CSRO2-Fab-TF)의 개발
본 발명자들은 또한, MECA32-Fab-TF와 유사한 재조합 항-인간 PLVAP CSRO2-Fab-TF 단백질을 생성시켰다. 이러한 단백질은 항-인간 PLVAP mAb CSRO2을 기반으로 하여 개발하였다. 이러한 재조합 단백질의 구조는 상이한 Ab 도메인 및 카파 경쇄의 카르복실 말단의 His-tag의 부재를 제외하고는, 상기 기술된 MECA32-Fab-TF와 실질적으로 유사하였다. His-tag는 his-tag가 CSRO2-Fab-TF의 정제에 필요하지 않기 때문에 제거되었다. CSRO2-Fab-TF를 항-인간 카파 경쇄 KappaSelect 친화성 칼럼 크로마토그래피 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)를 사용하여 정제하였다. CSRO2 mAb은 인간 PLVAP에 대한 인간화된 모노클로날 항체이다.
CSRO2-Fab-TF의 생성을 위한 플라스미드 작제물을 제조하는데 이용되는 절차는 약간 변형된, MECA32-Fab-TF에 대한 플라스미드 작제물을 제조하는 절차와 유사하였다. 항체 중쇄 및 경쇄의 5'-말단의 DNA 서열을 수득하기 위해 cDNA를 클로닝하기 위한 상기 기술된 제 1 단계는 생략되는데, 그 이유는 CSRO2 mAb 중쇄 및 경쇄에 대한 cDNA 서열은 이미 공지되어 있기 때문이다. 따라서, CSRO2-Fab-TF 발현 작제물을 제조하는데는 단지 3 단계만 요구되었다. 이러한 3 단계는 하기 기술되어 있다.
제 1 단계: CSRO2 mAb 경쇄 cDNA의 pET26b 플라스미드 벡터로의 삽입
CSR02 mAb를 생성하는 NS0 세포주로부터의 전체 RNA를 프라이머로서 올리고-dT를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. CSR02의 카파 경쇄 cDNA를, 주형으로서의 올리고-dT 프라이밍된 cDNA 및 하기 기재된 프라이머 쌍을 사용한 PCR에 의해 생성시켰다.
CSR02-VK3F-26b F Nde I 정방향 프라이머: 5'　TATGGATGTTGTGATGACCCAATCTCCA　3' (SEQ ID NO: 37)
카파 -R-26b-Not I 역방향 프라이머: 5'　GGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTG　3' (SEQ ID NO: 38).
그 후, CSRO2mAb 경쇄에 대한 정제된 PCR DNA 단편을 플라스미드 벡터 pET26b의 Nde I 및 Not I 부위에 삽입하여 pET26b-cVK3를 생성하였다.
제 2 단계: CSRO2 mAb의 힌지 영역, VH1 및 CH1 플러스 (Gly 4 Ser) 3 링커 서열 및 인간 조직 인자 (AA. 33-251) (hTF)의 세포외 도메인으로 구성된 융합 폴리펩티드의 발현을 위한 cDNA가 삽입된 pET26b 플라스미드 벡터의 작제
본 플라스미드는 주형으로서의 클로닝된 인간 조직 인자 cDNA 및 NS0 세포주로부터 제조된 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 작제하였다. 하기 프라이머 쌍을 PCR에 사용하였다:
I) CSRO2 mAb 중쇄의 VH1-CH1-힌지 영역 및 링커 서열에 대한 프라이머 쌍:
VH5-pro26b-NdeI-F 정방향 프라이머: 5'　TATGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGG　3' (SEQ ID NO: 39) 및
힌지 링커 R: 5'　AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGGGCATGATGGGCATGGGGGACC　3' (SEQ ID NO: 40).
II) 링커 서열-hTF-플러스 삽입용 제한 부위에 대한 프라이머 쌍:
hTF 링커 F: 5'　GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACAAATACTGTGG　3' (SEQ ID NO: 41)
hTF R- Not I: 5'　GGCCGCTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG　3' (SEQ ID NO: 42).
상기 기술된 2개의 PCR 반응으로부터 생성된 PCR 단편을 추가로 융합하고 오버랩핑 연장에 의해 증폭하였다. 융합된 cDNA를 pET26b 플라스미드 벡터로 삽입하고, 이를 pET26b-VH5-Fd-TF로 지정하였다.
제 3 단계: CSRO2 mAb Fd-힌지-(Gly4Ser)3링커-TF 및 CSRO2 mAb 카파 경쇄 둘 모두에 대한 cDNA를 함유하는 비스시스트로닉 플라스미드 벡터의 작제
본 발명자들은 주형으로서의 pET-26b-VH5-Fd-TF 및 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 DNA 단편을 생성시켰다.
26b-RBS-F: 5'　ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA　3' (SEQ ID NO: 43) 및
26b-말단화-R: 5'　CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG　3' (SEQ ID NO: 44).
증폭된 DNA 단편은 리보좀 결합 부위 (rbs); CSRO2 중쇄의 힌지 서열, VH1 및 CH1; 링커 서열; 용해성 인간 조직 인자; 및 정지 코돈을 포함하였다. 이러한 DNA 단편을 pET26b-cVK3 벡터의 Xba I 부위에 삽입하여, pET26b CSR02-Fab-TF로서 지정한 신규한 바이시스트로닉 플라스미드 벡터를 유도하였다 (도 4). 이러한 플라스미드를 단일 프로모터의 조정하에 카파 경쇄 및 융합 중쇄 둘 모두를 발현시키는데 사용하였다. 전체 삽입물의 서열은 염료-탈산소 방법을 사용하여 DNA 서열분석에 의해 입증하였다.
수용성 인간 조직 인자를 공동발현하는 CSRO2 항-인간 PLVAP 모노클로날 항체의 재조합 Fab 단편 ( CSRO2 - Fab - TF )의 생성
재조합 CSR02-Fab-TF 단백질의 발현. 컴피턴트 세포를 pET-26b CSR02-Fab-TF 플라스미드 DNA와 얼음 상에서 5분 동안 인큐베이션하고, 42℃ 수조에서 정확히 30초 동안 가열하고, 이어서 2분 동안 얼음 상에 놓음으로써 에스체리치아 콜라이 Shuffle T7 Express (New England Biolabs)의 형질전환을 수행하였다. 선택 배지상에 플레이팅 하기 전에, 형질전환체를 60분 동안 SOC 배지 (0.5% 효모 추출물; 2% 트립톤; 10 mM NaCl; 2.5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM 글루코스)와 250rpm에서 진탕시키면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 0.05 mM의 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드로 30℃ 또는 37℃에서 16시간 동안 CSR02-Fab-TF의 발현을 유도하였다. 유도 후, 박테리아 세포를 실온하에 2시간 동안 라이소자임 및 Benzonase Nuclease의 존재하에 0.2% Tween 80을 갖는 1x PBS에서 용해시켰다. 세포 용해물을 4℃에서 30분 동안 10000rpm으로 원심분리하여 수집하였다. 상청액을 모으고, 여과하여 용해성 분획을 분리시켰다.
KappaSelect 및 Capto Adhere Mmultimodal 컬럼 크로마토그래피에 의한 CSR02-Fab-TF의 정제. KappaSelect 컬럼 (1ml)을 인산염 완충된 염수 (PBS), pH 7.4 (0.01M 포스페이트 완충제, 0.0027M KCl, 0.14M NaCl)와 평행을 이루게 하였다. CSR02-Fab-TF을 함유하는 E. 콜라이 세포 용해물을 1ml/min의 유속으로 로딩하였다. 샘플 적용 후, OD280가 기준치로 떨어질 때까지 칼럼을 평형화 완충제로 세척하였다. 나머지 결합된 단백질을 0.25 M 수크로스를 함유하는 0.1M 글리신 완충제, pH 2.7로 용리시켰다. 1ml 용리물 당 50㎕의 1M Tris-염기 완충제 (pH 9.0)를 첨가함으로써 용리물을 생리학적 pH로 즉시 조절하였다.
KappaSelect 컬럼으로부터의 용리된 CSRO2-Fab-TF를, 20mM Tris 완충제, pH 7.5로 사전-평형화된 Capto Adhere 컬럼 (5 ml)으로 추가로 정제하였다. KappaSelect 컬럼으로부터 용리된 CSR02-Fab-TF 샘플을 20mM Tris 완충제, pH 7.5로 50배 희석한 후, 이를 1 ml/min의 유속으로 Capto Adhere 컬럼 상에 로딩하였다. 샘플 적용 후, OD280가 기준치로 떨어질 때까지 칼럼을 평형화 완충제로 세척하였다. 이어서, 결합된 CSRO2-Fab-TF 단백질을 200 mM NaCl을 함유하는 20mM Tris 완충제 pH 7.5로 용리시켰다.
가용성 재조합 인간 및 마우스 PLVAP 단백질 ( hPLVAP 및 mPLVAP )의 생성
( hPLVAP )의 생성. 트렁케이션된 PLVAP (마우스 PLVAP의 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 잔기 51 내지 442)를 나타내는 PCR 단편을 pGEM®-T Easy 벡터(Promega)에 삽입시킴에 의해 플라스미드 pGEM®-T Easy-hPLVAP51 -442를 생성하였다. 이러한 PCR 단편을 하기 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해 인간 PLVAP (NM_031310) (OriGene, Rockville, MD)의 cDNA 클론으로부터 생성하였다:
Figure 112014110000898-pat00002
재조합 PLVAP 단백질을 생성하는 플라스미드 pET-15b-hPLVAP51 -442의 작제를 위해, 말단에 NdeI/Bam HI 인지 서열 (박스에 표시된 서열)을 지니는 PLVAP의 아미노산 잔기 51 내지 442를 엔코딩하는 cDNA 단편을 pGEM®-T Easy-hPLVAP51 -442로부터 절제하고 pET-15b (Novagen)에 삽입하였다. 상기 기재된 발현 작제물을 DNA 서열분석에 의해 입증하고 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)(Rosetta-gami2(DE3)pLysS)(EMD Millipore Corp.)로 형질전환시켰다.
His-태깅된(tagged) hPLVAP 융합 단백질을 생성하고 하기 기재된 대로 정제시켰다. 신선한 배양액으로부터의 형질전환된 이.콜라이(E. coli)의 집락 (1-2mm)을 100 μg/ml 암피실린, 34 μg/ml 클로르암페니칼, 12.5μg/ml 테트라사이클린을 함유하는 4 ml의 TB 배지로 37℃, 230 rpm에서 밤새 접종시켰다. 밤새도록 배양액을 100 μg/ml 암피실린, 34 μg/ml 클로르암페니칼, 12.5μg/ml 테트라사이클린을 함유하는 400 ml의 TB 배지에 접종시키고 37℃, 250 rpm에서 계속 성장시켰다. 600 nm에서의 흡광도가 약 0.6~0.8에 도달하면, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 1.66 mM의 최종 농도로 첨가시켜 단백질 생성을 유도하였다. 30℃에서 약 20 h 동안 진탕을 유지시켰다. 세포를 10000 g으로 30분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 수거하였다. 세포 펠렛을 8 M 우레아가 보충된 12 ml의 평형-세척 완충제(50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, pH 7, 10 mM 이미다졸)에 재현탁시키고 -20℃에서 적어도 2시간 동안 저장하였다. 각 버스트(burst) 사이에 30초씩 중단시키면서 해동된 샘플을 10초 동안 초음파처리함으로써 이것이 반투명해질 때까지 점도를 감소시켰다. 세포 현탁액을 10,000-12,000 x g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리시켜 임의의 불용성 물질을 펠렛으로 만들었다. 이전 단계로부터의 상청액을 8 M 우레아가 보충된 10 컬럼 부피의 평형-세척 완충제로 평형화된 TALON Resin 컬럼 (Clontech)에 적용시켰다. 10-20 컬럼 부피의 1X 평형-세척 완충제로 컬럼을 세척한 후에, 재조합 폴리히스티딘-태깅된 인간 PLVAP 단백질을 6 M 우레아를 함유하는 5 컬럼 부피의 용리 완충제 (50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, pH 7, 500 mM 이미다졸)로 용리시켰다. 용리액 중 정제된 재조합 단백질을 3M 우레아를 함유하는 1X 평형/세척 완충제에 대해 4℃에서 적어도 4시간 동안 투석시킨 후, 완충제를 1M 우레아를 함유하는 1X 평형-세척 완충제로 교환하고, 4℃에서 적어도 4시간 동안 투석시켰다. Bradford 염료 결합 검정(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 단백질 농도를 결정하였다. 그 후 단백질을 각 mg의 재조합 PLVAP 단백질에 대해 1 유닛의 바이오티닐화된 트롬빈 (Novagen)으로 23℃에서 16시간 동안 분해시켜 폴리히스티딘-태그를 제거하였다. 고체상 스트렙타비딘-아가로스에 의해 인큐베이션으로부터 바이오티닐화된 트롬빈을 제거하였다. 생성된 재조합 수용성 인간 PLVAP (hPLVAP)를 우레아가 없는 1X 평형-세척 완충제 (50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, pH 7)에 대해 투석시켰다. 단백질 농도를 결정하고, 단백질을 순도에 대해 SDS-PAGE에 의해 분석하였다 (도 5).
mPLVAP (마우스 PLVAP )의 생성. 트렁케이션된 PLVAP (마우스 PLVAP의 세포외 도메인을 포함하는 아미노산 잔기 48 내지 438)를 나타내는 PCR 단편을 pGEM®-T Easy 벡터(Promega Corp.)에 삽입시킴에 의해 플라스미드 pGEM®-T Easy-hPLVAP48 - 438를 생성하였다. 이러한 PCR 단편을 하기 프라이머 쌍을 이용한 PCR에 의해 마우스 PLVAP (Invitrogen, Life Technologies Corp.)의 cDNA 클론으로부터 제조하였다:
Figure 112014110000898-pat00003
이어서, 각 말단에 NdeI 및 XhoI 인지 서열을 함유하는 PLVAP의 아미노산 잔기 48 내지 437을 엔코딩하는 cDNA 단편을 pGEM®-T Easy-mPLVAP48 -438로부터 절제하고 단백질 발현을 위해 pET-15b (Novagen-EMD Millipore, Darmstadt, Germany)에 삽입하였다. DNA 서열분석에 의한 입증 후에, 이러한 발현 작제물을 에스체리치아 콜라이(Rosetta-gami2(DE3)pLysS)로 형질전환시켰다. 에스체리치아 콜라이 Rosetta-gami2(DE3)pLysS에서 His-태깅된 융합 mPLVAP 단백질의 발현을 1 mM 이소프로필-ß-D-티오갈락토피라노시드로 16시간 동안 30℃에서 유도하였다. 유도 후에, 박테리아 세포를 8 M 우레아가 보충된 평형 완충제(50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, pH 7)에서의 초음파처리에 의해 용해시키고, 15,652 x g에서 30분 동안 4℃에서의 원심분리에 의해 가용성 및 불용성 분획으로 분리시켰다. His-PLVAP48-438 단백질을 정제시키기 위해, 가용성 분획을 TALON® 금속 친화성 수지 (Clontech, Palo Alto, CA) 상에 로딩시키고 용리 완충제 (50 mM 소듐 포스페이트, 300 mM NaCl, pH 7, 500 mM 이미다졸)로 용리시켰다. 용리액 중 생성된 마우스 PLVAP48-438 단백질을 PBS에 대해 투석시켰다. 정제된 His-mPLVAP의 SDS-PAGE 분석을 도 5에 도시한다.
ELISA 에 의한 개개의 인간 및 마우스 PLVAP 에 대한 CSRO2 - Fab - TF 및 MECA32 -Fab-TF 결합의 연구
재조합 항-PLVAP-Fab-TF 단백질이 인간 또는 마우스 PLVAP 단백질에 결합할 수 있는지를 확인하기 위해, ELISA 검정을 개발하고 이용하였다. 먼저, ELISA 플레이트의 각 웰을 PBS-아지드 (0.02%) 중 50 μl의 2.5μg/ml 인간 또는 마우스 재조합 PLVAP 단백질로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이후에, 검정을 실온에서 수행하였다. 각 웰을 150μl의 세척 완충제 (0.2% Tween-20을 함유하는 PBS)로 3회 세척한 후, 각 웰을 150 μl의 차단 완충제(2% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS)로 30분 동안 차단시켰다. 3회 세척 후, 50 μl의 항-인간 PLVAP CSRO2-Fab-TF 또는 항-마우스 PLVAP MECA32-Fab-TF를 각 웰에 상이한 농도로 이중으로(in duplicates) 첨가시켰다. 모든 웰을 45분 동안 인큐베이션하고 3회 세척하였다. 그 후 세척 웰을 1:500 희석률의 50μl의 바이오티닐화된 항-인간 TF 항체 (R&D Systems Corp.)와 함께 차단 완충제에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 3회 세척 후에, 각 웰을 5000x 희석된 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 컨쥬게이트와 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 각 웰을 100μl 알칼리 포스파타제 기질과 60분 동안 인큐베이션시키고 각 웰의 흡광도를 405nm에서 마이크로플레이트 리더에서 측정하였다.
검정은 또한 경쟁적 결합 검정으로 변형되었다. 경쟁적 결합 검정을 위해, 증가하는 농도의 항-PLVAP 항체 또는 Fab-TF를 최적량의 바이오티닐화된 항-PLVAP 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션시켜 PLVAP와의 결합에 대해 경쟁시켰다. 인큐베이션 및 세척 후에, PLVAP에 결합된 바이오티닐화된 항체를 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제 컨쥬게이트 및 발색 기질로 정량하였다.
인간 조직 인자 활성에 대한 발색 검정
재조합 CSRO2-Fab-TF, MECA32-Fab-TF 및 인간 TF에 가교된 MECA32 mAb의 TF 활성을 발색 검정을 이용하여 측정하였다. 이러한 검정은 인자 VIIa로의 TF의 결합 및 인자 X (FX)를 활성화시키는 TF/FVIIa 복합체의 능력에 기반한다. TF 활성을 생성된 FXa의 양에 의해 간접적으로 정량하였다. 생성된 FXa는 FXa 특이적 색소 펩티드 기질로부터 파라-니트로아밀린(pNA)의 방출에 따라 405 nm에서의 흡광도의 증가로서 동역학적으로 측정되었다. TF 활성은 상업용 수용성 재조합 TF 표준(R&D systems Corp.)에 대해 결정되었다. 발색 TF 활성 검정은 문헌[Philipp et al.. Philipp J, Dienst A, Unruh Maike, et al. "Soluble tissue factor induces coagulation on tumor endothelial cells in vivo if coadministered with low-dose lipopolysaccharides" Arterioscler Thromb Vasc Biol .; 23:905-910 (2003) 참조]에 보고된 절차에 기반한였다.
SCID 마우스에서 Hep3B HCC 이종이식편 모델
Hep3B는 인간 HCC 세포주이다. 항-PLVAP Fab-TF의 치료적 유효성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 BALB/c C.B-17 SCID 마우스에서 HEP3B 이종이식편 모델을 구축하였다. 이소플루란의 흡입에 의한 전신 마취하에 5주령 수컷 C.B-17 SCID 마우스의 우측 상부 안쪽 허벅지에 4백만 개의 Hep3B 세포를 피하 주입함에 의해 Hep3B HCC 이종이식편을 수립하였다. 세포를 혈청 없이 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) (Life Technologies Corp.)에 용해된 60μl의 빙냉 75% BD Mtrigel™ (BD Bioscience Corp.)에 현탁시켰다. 29 게이지 인슐린 주사기를 이용하여 주입시켰다.
주입에 이용된 Hep3 B 세포를 10% 우태아 혈청, 1% GLUTA-MAX, 1% 항생제-항진균제, 및 1% HEPES를 함유하는 DMEM에서 배양시켰다. 모든 시약은 Life Technologies에서 구입하였다. 주입용 세포를 이들이 80% 컨플루언시(confluency)에 도달했을 때 수거하였다. 세포를 Life Technologies로부터의 트립신-EDTA 용액을 이용하여 제조자의 지시에 따라 배양 플라스크로부터 리프팅하고, 종양 세포를 DMEM로 1회 세척한 후 주입을 위해 빙냉 75% BD Mtrigel™에 현탁시켰다. 주입 후에, 마우스는 종양 이종이식편의 성장에 대해 정기적으로 관찰되었다. 보통은, 종양이 연구 준비가 되기까지 5 내지 6주 걸렸다.
종양 영양 동맥으로의 항- PLVAP Fab - TF 의 주입
항-PLVAP MECA32-Fab-TF를 지닌 Hep3B 종양 이종이식편의 처리를 위해, Hep3B 종양 이종이식편을 지닌 마우스를 MATRX™ 마취 기계를 이용한 이소플루란의 흡입에 의해 마취시켰다. 마우스를 해부 현미경 아래에 앙아위로 눕혔다. 우측 서혜부 영역 위의 머리를 주입 하루 전에 Nair hair remover (Church & Dwight Co.)로 제거하였다. 피부를 75% 알코올로 세정한 후, 종양 위 우측 서혜부 영역에서 0.5 cm 절개를 수행하였다. 상처를 깊게 하여 우측 대퇴 동맥 및 정맥을 노출시켰다. 그 후 우측 대퇴 동맥을 6-0 나일론 실을 이용하여 고리로 만들었다. 동맥을 기부에서 부드럽게 수축시켰다. 수축 원위부에서 미세-가위를 이용하여 동맥절개술을 수행하고, 파인 33 게이지 바늘을 원위부에 삽입하였다. MECA32-Fab-TF 또는 대조군 항체를 분당 약 40 μl의 속도로 천천히 주입하였다. 면밀한 관찰하에 주입을 수행하여 누수가 없음을 확인하였다. 주입 후, 바늘을 거두어 들였다. 동맥절개술 부위를 Histoacryl (TissueSeal, AnnArbor, MI)로 봉합하였다. 수축을 위해 나일론을 제거하였다. 적당한 지혈의 확인 후에, 절개 상처를 연속 봉합으로 막았다.
종양 부피 및 혈류 측정을 위한 3D 초음파촬영술 및 파워 도플러
Vevo 2100 고해상도 이미징 시스템(Visual Sonics, Inc., Toronto, Canada)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 3D 종양 이미지를 획득하였다. 하기 측정치를 취하여 종양의 3개의 수직 치수를 결정하였다. 종양 X축과 Y축을 따른 가장 큰 단면적 상의 2개의 수직 치수를 먼저 측정하였다. 그 후 X 및 Y 치수에 수직인 Z 축을 따라 가장 긴 치수를 판매사가 제공한 소프트웨어를 이용하여 결정하였다. 종양 부피를 타원형 대상에 대해 하기 포뮬러를 이용하여 결정하였다: 부피=π/6 x 길이 x 너비 x 높이. 종양 혈류 이미지를 Vevo 2100 고해상도 이미징 시스템에 대한 매뉴얼에 따라 3D 파워 도플러를 이용하여 캡쳐하였다.
MECA32 - Fab - TF 및 CSRO2 - Fab - TF 의 결합 친화성의 측정
항-PLVAP-Fab-TF 및 표적 PLVAP간의 결합 친화성을 결정하기 위해 이용된 검정은 앞부분에서 기재된 바와 같이 발색 TF 활성에 기반하였다. 간단히 말해, ELISA 플레이트의 각 웰을 2.5μg/ml 수용성 재조합 인간 또는 마우스 PLVAP로 밤새 코팅하였다. PLVAP에 결합하는 CSRO2-Fab-TF 및 MECA32-Fab-TF를 연구하기 위한 ELISA에 대해 기재된 대로 세척 및 차단시킨 후, 인간 또는 마우스 PLVAP 단백질로 코팅된 웰을 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 및 10 μg/ml의 증가하는 농도의 50 μl의 CSRO2-Fab-TF 또는 MECA32-Fab-TF와 함께 이중으로 인큐베이션시켰다. 실온에서 3시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 웰을 세척하고 발색 TF 활성 검정에 대해 앞부분에서 기재된 바와 같이 TF 표준 곡선을 이용하여 웰에서 결합된 TF 활성의 양에 대해 검정하였다. 각 웰에 첨가된 전체 CSRO2-Fab-TF 또는 MECA32-Fab-TF의 농도는 알려져 있고 각 웰에서 결합된 CSRO2-Fab-TF 또는 MECA32-Fab-TF의 농도는 검정 결과로부터 계산될 수 있었다. 그 후 이러한 숫자를 Scatchard 플롯 분석을 이용하여 분석하여 CSRO2-Fab-TF 또는 MECA32-Fab-TF의 결합 친화성을 결정하였다. 예컨대, 문헌[Scatchard G. "The attractions of proteins for small molecules and ions" Ann NY Acad Sci. 51:660-672(1949)] 참조.
MECA32 항- PLVAP 모노클로날 항체를 이용하여 HEP3B 종양 이종이식편에서 PLVAP의 면역조직화학적( IHC ) 염색
마우스 Hep3B 이종이식편에서 PLVAP의 발현을 연구하기 위해, 포르말린 고정된 파라핀 조직 블록의 섹션을 항-PLVAP 모노클로날 항체에 의한 면역조직화학적 염색을 위해 프로세싱하였다. 통상의 절차에 따른 조직 섹션의 탈파라핀화 및 재수화 이후에, 담체 중 조직 섹션을 지닌 슬라이드를 비이커에 넣고 Target Retrieval 용액 (Dako, Inc. Carpinteria, CA)에 담갔다. 비이커를 오토클레이브에 넣고 121℃에서 10분 동안 가열시켰다. 냉각 후에, 슬라이드를 증류수로 옮겼다. 그 후 각 슬라이드의 섹션을 Ventana iView DAB Detection 키트 (Ventana Medical Systems, Inc.)에서 200-400μl의 과산화수소로 처리하여 내인성 퍼옥시다제를 켄칭시켰다. 슬라이드를 Tris-완충된 염수(TBS)(Dako)로 세정한 후에, 섹션을 0.1% 우혈청 알부민(TBS-BSA)을 함유하는 TBS에 희석된 5 μg의 MECA32 항-PLVAP 모노클로날 항체와 함께 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 TBS 완충제에 5분 동안 3회 침수시킴에 의해 세척한 후, 섹션을 판매사가 권고하는 희석률의 바이오티닐화된 이차 항체 (예컨대, MECA32 mAb에 대한 바이오티닐화된 양 항-래트 IgG)와 함께 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드 상의 섹션을 상기 기재된 바와 유사하게 세척하였다. 슬라이드 상의 섹션을 신선하게 제조된 DAB 기질과 함께 키트에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 증류수로 수 회 세정하였다. Gill's 헤마톡실린 용액으로의 15분 동안의 대비 염색 후에, 슬라이드를 TBS로 세정한 다음 증류수로 세정하였다. 공기-건조 구간 후에, 섹션을 Permount 배지 및 커버 슬립으로 덮었다.
결과
HCC 및 HEP3B 이종이식편에서 PLVAP 발현
본 발명자들의 초기 연구는 PLVAP가 HCC의 혈관 내피 세포에 대해 차별적으로 발현되고 비-종양성 간 조직의 혈관 내피 세포에서는 발현되지 않음을 나타내었다. PLVAP의 차별적인 발현은 치료 목적을 위해 HCC를 표적화할 기회를 제공하였다. 본 발명자들은 항-PLVAP 모노클로날 항체 또는 이의 Fab 단편을 이용한 신규한 접근법을 고안하였고 이는 HCC의 치료를 위해 공동-발현된 혈액 응고 촉발성 조직 인자 단백질에 대한 담체로서 기능한다. 이러한 치료적 작용제의 종양 영양 동맥으로의 주입은 이러한 치료적 항체 또는 이의 Fab 단편의 HCC의 혈관 내피 세포로의 결합을 초래하여, 종양 혈관에서 혈괴 형성을 유도하고 종양의 허혈성 괴사를 초래하는 것으로 여겨졌다.
이러한 접근법의 실행가능성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 HEP3B HCC 세포주를 이용하여 SCID 마우스에서 인간 HCC 이종이식편 모델을 수립하였다. 이어서 본 발명자들은 MECA32 항-마우스 PLVAP mAb를 이용한 면역조직화학적(IHC) 염색에 의해 HEP3B 종양 이종이식편으로 성장한 혈관 내피 세포가 마우스 PLVAP를 발현시켰는지를 확인하였다. 도 6B에 도시된 대로, SCID 마우스에서 HEP3B 종양 이종이식편의 혈관 내피 세포는 실제로 인간 HCC와 같이 PLVAP를 발현시켰다. 따라서, HEP3B 이종이식편은 인간 조직 인자로 컨쥬게이션된 항-PLVAP mAb 또는 이의 Fab 단편의 항-종양 효과를 입증하기 위한 연구에 이용될 수 있었다.
HEP3 B 이종이식편에 대한 가용성 인간 TF 로 컨쥬게이션된 MECA32 mAb 의 효과
먼저, 본 발명자들은 HEP3B 이종이식편 종양을 지닌 SCID 마우스를 재조합 수용성 인간 조직 인자와 화학적으로 컨쥬게이션된 MECA32 mAb(MECA32-TF)로 처리하였다. 인간 TF가 인간 및 마우스 둘 모두에서 혈액 응고를 촉발하기에 효과적이고 인간 TF의 cDNA가 시판되었기 때문에 인간 TF를 이용하였다. 100 μl의 인산염 완충된 염수(PBS) 중 24 μg의 MECA32-TF (치료군) 또는 20 μg MECA32 mAb (대조군)을 해부 현미경하에 종양 영양 우측 대퇴 동맥으로 주입시킴에 의해 각 종양-포함 마우스를 처리하였다. 약간 적은 양의 MECA32 mAb (20μg)를 이용하여 더 높은 분자량의 MECA32-TF에 대해 조정하였다. 3D 파워 도플러를 이용하여 치료하기 48시간 전 그리고 치료 후의 종양 혈류를 평가하였다. 결과는 치료군에서 MECA32-TF로의 처리 후 종양내 혈류 신호의 현저한 감소를 나타내었고 대조군에서는 그렇지 않았다 (도 7). 종양 성장의 추적 조사는 MECA32-TF 치료군에서 종양 성장의 현저한 억제를 나타내었고 대조군에서는 그렇지 않았다 (도 8). 이러한 연구 결과는 인간 TF와 컨쥬게이션된 항-PLVAP 모노클로날 항체가 HCC 이종이식편의 치료에 효과적이었음을 뒷받침한다.
MECA32 - Fab - TF 의 개발 및 특성규명
TF의 MECA32 mAb로의 화학적 컨쥬게이션의 경우, MECA32 mAb에 가교되는 TF 단백질 분자의 수 및 부위를 지속적으로 그리고 재현가능하게 조절하기가 어려웠다. 화학적 가교에 의해 제조된 MECA32-TF는 균질한 생성물을 산출하지 못했다. 고분자량의 MECA32-TF 컨쥬게이트 (대략 170 kDa)는 또한 불리한 부작용을 야기할 기회가 증가된 긴 순환 반감기를 초래한다.
표적을 벗어난(off-target) 부작용을 제한하기 위해 더 짧은 반감기를 갖는 구조적으로 잘 정의된 균질한 치료적 생물학제를 얻기 위해, 본 발명자들은 항-PLVAP mAb의 Fab 부분 및 중쇄 불변 도메인 1의 카르복실 말단에 연결된 인간 조직 인자의 세포외 도메인으로 구성된 신규한 재조합 단백질을 개발하였다. 그 후 본 발명자들은 항-뮤린 PLVAP MECA32-Fab-TF 재조합 단백질 (MECA32-Fab-TF)을 생성하였다. 이러한 재조합 단백질의 구조를 묘사하는 다이아그램을 도 9에 도시한다.
정제된 MECA32-Fab-TF를 이용하여 마우스 PLVAP와의 결합에 대해 바이오티닐화된 MECA32 mAb와 경쟁시켰다. 이러한 결과는 MECA32-Fab-TF가 PLVAP와 결합하는 이의 능력을 실제로 보유함을 나타내었다 (도 10). MECA-32-Fab-TF의 6개의 상이한 배치의 Scatchard 분석은 또한 마우스 PLVAP에 대한 5.7±1.4 x 10-8M의 Kd의 높은 결합 친화성을 나타내었다. MECA32 Fd의 카르복실 말단에 연결된 TF도 기능적이었고 인자 VIIa와 상호작용하여 인자 X를 활성화시킬 수 있었다. 측정된 조직 인자 특이적 활성은 MECA32-Fab-TF의 각 밀리그램에서 90±22 μg (n=6)이었다.
SCID 마우스에서 HEP3B 종양 이종이식편에 대한 MECA32 - Fab - TF 의 효과
재조합 MECA32-Fab-TF의 치료적 효능을 입증하기 위해, 본 발명자들은 먼저 2 용량 반응 연구를 수행하였다. 두 연구 모두에서, MECA32-Fab-TF는 종양 영양 대퇴 동맥으로 주입되었다. 치료한 지 72시간 후에, 치료 마우스를 희생시키고, 조직학적 검사를 위해 종양을 회수하였다. 첫 번째 연구를 위해, 상이한 세 용량의 MECA32-Fab-TF (3μg, 6μg 및 12 μg)를 이용하여 종양-포함 마우스를 치료하고 대조군을 조직 인자 없이 12μg의 MECA32 모노클로날 항체로 치료하였다. 각 용량에 대해 3마리의 마우스가 존재하였다. 두 번째 연구를 위해, 이용된 MECA32-Fab-TF의 용량은 2.5μg, 5μg 및 10μg이었다. 각 용량에 대해 2마리의 마우스가 존재하였다. 이러한 두 연구의 결과가 도 11 및 12에 요약되고 도시되어 있다. 이러한 연구의 결과는 MECA32-Fab-TF로 치료된 마우스로부터의 종양이 모든 용량에서 대량의 허혈성 괴사를 발생시켰음을 나타내었다. 그러나, 10μg 또는 그 초과의 용량이 더욱 일관된 결과를 나타내었다. 대조군에서는 종양 괴사가 없거나 최소로 나타났다. 이러한 연구의 결과는 항-PLVAP-Fab-TF가 상당히 효능 있었고 마우스당 2.5μg만큼 낮은 용량에서도 72시간 내에 현저한 허혈성 종양 괴사를 유도할 수 있었음을 나타내었다.
주입 후 상이한 시점에 HEP3B 종양 이종이식편의 조직학에 대한 항- mPLVAP MECA32-Fab-TF의 효과
상기 기재된 연구는 치료한 지 72시간 후에 종양이 프랭크 허혈성 뇌사를 일으켰음을 묘사하였다. TF를 공발현시키는 항-mPLVAP Fab로 치료된 후 괴사가 어떻게 유도되는지를 알기 위해, 본 발명자들은 MECA32-Fab-TF를 종양 영양 동맥에 주입시키고 10μg의 MECA32-Fab-TF를 주입한 지 2시간, 4시간, 24시간, 48시간 및 72시간 후에 HEP3B 종양을 회수하였다. 각 시점에 2마리의 종양-포함 마우스가 존재하였다. 치료받지 않은 2마리의 마우스를 또한 0시간 기준선 대조군으로서 이러한 실험과 동일한 날에 희생시켰다.
도 13a에 도시된 대로, 본 발명자들의 결과는 종양 혈관에서 섬유소혈전이 치료한 지 2시간 후에 발견될 수 있었음을 나타내었다. 섬유소혈전을 함유하는 혈관의 수는 치료한 지 4시간 후 및 24시간 후에 더욱 명백해졌다. 종양 세포는 4시간 째에 증가된 빈 공간(clear space)을 지닌 서로에게서 분리되기 시작했고 이러한 변화는 24시간 째에 더욱 분명해졌다 (도 13b). 핵 염색의 손실을 이용한 프랭크 허혈성 뇌사가 치료한 지 48시간 후에 인지되었고 72시간 째에 더욱 뚜렷해졌다 (도 13a 및 13b). 치료 전에 (0시간) 종양 혈관에서 섬유소혈전은 인지되지 않았다 (도 13a). 파워 도플러 연구는 또한 주입한 지 2시간 후에 주요 종양 혈관에서 혈류의 중단을 나타내었고 이는 72시간까지 지속되었다 (도 14). 이러한 발견은 항-PLVAP-Fab-TF가 종양 혈관 내피 세포의 PLVAP에 실제로 결합하여, 종양 혈관에서 혈괴 형성을 유도하고, 혈류의 폐색을 일으키고, 종양 괴사를 야기시킬 수 있었음을 뒷받침한다.
HEP3B 종양 이종이식편의 성장에 대한 항- PLVAP MECA32 - Fab - TF 의 효과
다음으로, 본 발명자들은 종양 성장에 대한 항-PLVAP Fab-TF 치료의 치료적 효과를 연구하였다. 두 상이한 연구를 수행하였다. 첫 번째 연구에서 치료한 후 25일 동안의 종양 성장을 관찰하였다. 연구는 치료한 지 25일 후에 종료되었는데, 그 이유는 대조군에서 종양의 큰 크기가 연구 중단을 필요로 했기 때문이다. 종양 크기는 3D-초음파촬영술을 이용하여 관찰되었다. 도 15, 16a 및 16b에 요약된 결과는 5μg 또는 10μg의 MECA32-Fab-TF의 단일 주입이 종양 성장을 효과적으로 억제하였으나 TF가 없는 10μg의 대조군 MECA32 항체에 의해서는 억제되지 않았음을 나타내었다.
두 번째 연구를 위해, HEP3B 종양 이종이식편을 지니는 SCID 마우스를 10μg의 MECA32-Fab-TF (n=4) 또는 10μg의 MECA32 모노클로날 항체 (n=2)의 동맥내 주입으로 치료하였다. 종양 성장을 3D 초음파촬영술을 이용하여 관찰하였다. HEP3B 종양이 대략 2000 입방 밀리미터로 성장했을 때, 종양-포함 마우스를 안락사시켰다. 이러한 연구는 본 발명자들로 하여금 치료군에서 종양 성장의 지연을 평가할 수 있게 하였다. 도 17에 요약된 결과는 10 μg의 MECA32-Fab-TF를 종양-영양 동맥에 단일 주입한 후 종양 성장의 현저한 지연이 존재하였음을 나타내었다. 대조군 마우스에 비해 치료군에서의 종양이 1600mm3로 성장하는데에는 42일이 넘게 걸렸다. 대조군 및 치료군 간에 종양이 1600mm3로 성장하기 위한 평균 일수는 각각 9.8±3.0일 및 51.8±3.2일이었다 (도 17).
요약컨대, 이러한 두 상이한 연구의 결과는 항-PLVAP-Fab-TF의 종양 영양 동맥으로의 주입이 종양 괴사를 유도하고 종양 성장을 조절하는데 효과적이었음을 추가로 뒷받침하였다.
종양 성장에 대한 항- PLVAP - Fab - TF 의 전신 투여의 효과
말초 정맥을 통한 MECA32-Fab-TF의 전신 투여가 또한 동일한 치료적 효과를 달성할 수 있을지 또는 없을지를 알기 위해, 본 발명자들은 10 μg 또는 20μg의 MECA32-Fab-TF를 HEP3B 종양 이종이식편을 지니는 SCID 마우스의 꼬리 정맥에 주입시키고 주입 후 종양 성장을 모니터하였다. 대조군 마우스에게 인산염 완충된 염수를 주입하였다. 각 치료군에는 3마리의 마우스가 존재하였다. 도 17에 요약된 결과는 MECA32-Fab-TF가 꼬리 정맥을 통해 투여되었을 때 종양 부피에 대해 통계적으로 유의한 효과가 없었음을 나타내었다. 따라서, 종양 영양 동맥으로의 항-PLVAP MECA32-Fab-TF의 주입은 종양 괴사를 유도하고 치료적 효과를 달성하기 위해 필수적이었다. MECA32-Fab-TF의 전신 투여는 주입된 MECA32-Fab-TF의 희석 및 종양 혈관에 도달하기 전에 다른 기관 (예컨대, 폐, 신장 및 위장관)의 혈관 내피 세포 상의 PLVAP로의 MECA32-Fab-TF의 결합을 초래할 수 있다.
항-인간 PLVAP Fab - TF 의 개발 및 특성규명
유사한 치료적 작용제가 인간 PLVAP에 대해 개발될 수 있었는지를 알기 위해, 인간 PLVAP의 카르복실 말단에서 PPAGIPVAPSS의 아미노산 서열로 존재하는 항원성 에피토프에 대한 인간화 항-인간 PLVAP 모노클로날 항체를 이용하였다. 이러한 인간화 항-인간 PLVAP 모노클로날 항체는 종래에 개발되었고 미국특허출원공개 US20110262349 A1호에 기재되어 있다. 이러한 항-인간 PLVAP-Fab-TF 컨쥬게이트를 CSRO2-Fab-TF로서 명명하였다 (도 9). 그 후 본 발명자들은 조직 인자 특이적 활성 및 표적 PLVAP에 대한 결합 친화성에 관해 CSRO2-Fab-TF를 MECA32-Fab-TF와 비교하기 위해 일련의 연구를 수행하였다. 본 연구의 결과는 항-인간 PLVAP CSRO2-Fab-TF가 각 밀리그램의 항-PLVAP Fab-TF에서 항-마우스 PLVAP MECA32-Fab-TF에 비해 더 높은 TF 활성을 나타내었고 CSRO2-Fab-TF 및 MECA32-Fab-TF 둘 모두는 유사한 결합 친화성을 지님을 나타내었다 (표 1). 이러한 발견은 CSRO2-Fab-TF가 MECA32-Fab-TF와 같이 충분한 친화성으로 이들의 PLVAP 표적에 결합할 수 있고 충분한 TF 활성을 지녀서 치료적 효과를 달성하기 위한 혈액 응고를 개시함을 나타내었다.
표 1. 각 밀리그램의 항-PLVAP Fab-TF에 대한 조직 인자(TF) 특이적 활성 및 항-인간 PLVAP CSRO2-Fab-TF 및 항-마우스 PLVAP MECA32-Fab-TF 간에 PLVAP에 대한 결합 친화성의 비교.
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표 1에 요약된 대로, 상이한 3개 배치의 CSRO2-Fab-TF 및 상이한 6개 배치의 MECA32-Fab-TF를 연구하였다. 결과는 둘 모두의 Fab-TF가 유사한 결합 친화성을 지녔음을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, CSRO2-Fab-TF는 MECA32-Fab-TF보다 높은 특이적 TF 활성을 지녔다. 결과는 CSRO2-Fab-TF가 간세포 암종의 치료를 위해 MECA32-Fab-TF와 같은 치료적 효과를 달성하기에 충분한 결합 친화성 및 조직 인자 특이적 활성을 지님을 나타낸다.
치료 당시에 평균 종양 부피 및 본 발명자들의 Hep3B 이종이식편 모델에서 종양 괴사를 효과적으로 유도하는데 필요한 MECA32-Fab-TF의 용량에 기반하여, 본 발명자들은 종양 영양 동맥으로의 주입에 의해 HCC를 치료함에 있어서 항-PLVAP-Fab-TF에 대한 효과적인 치료 용량을 종양의 각 밀리리터 (입방 센티미터)에 대해 15μg 내지 100μg으로 산정하였다.
발생한 CSRO2-Fab-TF가 인간 HCC의 혈관 내피 세포에 결합할 수 있는 지를 추가로 입증하기 위해, 본 발명자들은 CSRO2-Fab-TF를 바이오티닐화시키고 이러한 Fab-TF를 인간 HCC의 혈관 내피 세포와의 이의 결합을 연구하는데 이용하였다. 본 연구의 결과는 바이오티닐화된 CSRO2-Fab-TF가 실제로 HCC의 혈관 내피 세포에는 결합하였으나 비-종양성 간 조직의 혈관 내피 세포에는 결합하지 않음을 나타내었다 (도 18). 본 연구의 결과는 CSRO2-Fab-TF가 MECA32-Fab-TF와 같이 종양 영양 동맥(들)으로의 주입을 통해 환자에서 HCC를 치료하는데 이용될 수 있었음을 뒷받침하였다.
PLVAP가 HCC의 혈관에서 차별적으로 발현되고 비-종양성 간 조직의 혈관에서는 그렇지 않다는 지식에 기반하여, 본 발명자들은 항-PLVAP 모노클로날 항체 또는 이의 Fab 단편 상에서 인간 조직 인자 단백질을 공동-발현시킴에 의해 HCC를 치료하는 신규한 치료적 작용제를 개발하였다. 본 발명자들은 인간 조직 인자의 가용성 세포외 도메인을 지니는 전체 항체 및 이의 Fab 단편 둘 모두가 실제로 종양 영양 동맥으로의 단일 주입 후에 종양 괴사를 유도하고 종양 성장을 억제시킬 수 있었음을 나타내었다.
항-PLVAP 항체로의 가용성 조직 인자의 화학적 컨쥬게이션이 동일한 부위에서 각 항체에 가교되는 조직 인자의 동일한 수를 재현가능하게 제어할 수 없었기 때문에, 이에 따라 본 발명자들은 인간 조직 인자의 세포외 도메인을 공동-발현시키는 Fd 사슬의 카르복실 말단을 지니는 항-PLVAP 모노클로날 항체의 재조합 Fab 단편을 생성하였고 이러한 재조합 단백질을 HCC를 치료하기 위한 치료적 작용제로서 이용하였다. 이러한 치료적 작용제가 HCC를 치료하는데 실제로 이용될 수 있는지를 입증하기 위해, HEP3B 인간 간세포 암종 세포주로부터 유래된 종양을 지니는 SCID 마우스를 먼저 구축하고 이를 개념증명 연구에 이용하였다. 이어서 본 발명자들은 MECA32 항-마우스 PLVAP 하이브리도마를 이용하여 항-PLVAP-Fab-TF의 마우스 형태를 개발하였다. 항-PLVAP-Fab-TF의 마우스 형태를 개발하는 것이 필요하였는데, 그 이유는 인간 HCC 이종이식편으로 성장하는 혈관이 마우스로부터 유래되고 마우스 PLVAP를 발현하기 때문이다. 본 발명자들은 항-PLVAP Fab-TF의 인간 및 마우스 형태 둘 모두에서 인간 조직 인자를 발현시켰는데, 그 이유는 인간 조직 인자가 마우스 응고 인자 VII를 활성화시키고 마우스에서 혈액 응고를 유도할 수 있기 때문이다. 본 발명자들의 CSRO2-Fab-TF 및 MECA32-Fab-TF간의 비교 연구는 이들 둘 모두가 충분한 친화성으로 이들의 PLVAP 표적에 결합할 수 있고 충분한 조직 인자 활성을 지녀서 혈액 응고를 촉발시키고 치료적 효과를 달성할 수 있음을 확인시켜 주었다.
본 발명자들의 연구 결과는 이들에 의해 개발된 재조합 항-PLVAP-Fab-TF가 이러한 신규한 치료적 작용제를 종양 영양 동맥에 직접 주입한 후에 종양 혈관에서의 혈괴 촉발, 종양 흐름의 차단 및 종양 괴사의 유도를 통해 HCC의 치료에 치료적 효과를 지녔으나, 말초 정맥을 통한 정맥내 전신 투여에 의해서는 그렇지 않았음을 나타내었다. 본 출원에 기재된 연구는 또한 조직 인자 단백질을 공동-발현시키는 항-인간 PLVAP 모노클로날 항체 또는 이의 Fab 단편이 아교모세포종과 같이 종양 혈관에 제한적인 PLVAP의 발현을 나타내는 종양을 치료하는데 이용될 수 있었음을 뒷받침한다.
본 출원에서 일부 변수를 기재하는 모든 수치 범위, 예컨대 "약", "적어도", "미만" 및 "초과"의 경우, 이러한 기재는 또한 열거된 값에 속하는 임의의 범위를 반드시 포함하는 것임이 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5의 기재는 또한, 그 중에서도, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-3, 2-4, 2-5, 3-4, 3-5, 및 4-5의 범위 등을 묘사한다.
본원에 인용된 모든 특허, 출원, 또는 다른 참고문헌, 예컨대 비-특허 문헌 및 참조 서열 정보의 경우, 이것은 그 전문이 모든 목적을 위해 그리고 인용된 제안을 위해 참조로서 포함됨이 이해되어야 한다. 참조로서 포함된 문서와 본 출원간에 어떠한 불일치가 존재하는 경우, 본 출원이 우선할 것이다. 본 출원에 기재된 참조 유전자 서열과 관련된 모든 정보, 예컨대 예를 들어, 유전체 위치, 유전체 서열, 기능적 주석, 대립유전자 변이체, 및 참조 mRNA (예컨대, 엑손 경계 또는 반응 엘리먼트 포함)를 포함하는 GeneID 또는 수탁 번호(전형적으로 NCBI 수탁 번호를 언급함) 및 단백질 서열 (예컨대 보존된 도메인 구조, 호몰로겐(Homologene) 항목 등등) 뿐만 아니라 화학적 참조물질(예컨대, Pub Chem 화합물, Pub Chem 물질, 또는 Pub Chem 생물검정 항목, 예를 들어 그 안의 주석, 예컨대 구조 및 검정 등등)은 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다.
본 출원에 사용된 제목은 편의를 위한 것일 뿐 본 출원의 해석에 영향을 미치지 않는다.
본 발명에 의해 제공된 양태들의 각각의 바람직한 특징은 필요한 부분의 수정을 거쳐 본 발명의 다른 모든 양태에 적용될 수 있고, 이는 비제한적으로 종속항에 의해 예시되며, 또한 실시예를 포함하는 본 발명의 특정의 구체예 및 양태의 개개 특징(예컨대, 수치 범위를 포함하는 엘리먼트 및 예시적인 구체예)의 조합 및 치환을 포함한다. 예를 들어, 실시예에 예시된 특정 실험 변수는 본 발명을 벗어나지 않으며 조금씩 청구된 발명에서의 사용을 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 기재된 물질의 경우, 이러한 화합물의 각각의 다양한 개별적이고 총괄적인 조합 및 치환의 특수한 언급이 명백하게 개시되지 않을 수 있지만, 각각은 명백히 고려되며 본원에 기재된 것이다. 따라서, 엘리먼트 A, B, 및 C의 부류가 기재되었을 뿐만 아니라 엘리먼트 D, E, 및 F의 부류 및 엘리먼트 A-D의 조합의 예가 기재된 경우, 비록 각각이 개별적으로 열거되지 않았을지라도, 각각은 개별적으로 그리고 총괄적으로 고려된다. 따라서, 이러한 예에서, 조합 A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, C-D, C-E, 및 C-F 각각은 분명히 고려되며 A, B, 및 C; D, E, 및 F; 및 조합 A-D의 예의 기재로부터 기재된 것으로 고려되어야 한다. 유사하게, 이들의 임의의 서브셋 또는 조합이 또한 특히 고려되며 기재된 것이다. 따라서, 예를 들어, A-E, B-F, 및 C-E의 서브그룹이 특히 고려되며 A, B, 및 C; D, E, 및 F; 및 조합 A-D의 예의 기재로부터 기재된 것으로 고려되어야 한다. 이러한 개념은 물질의 조성물의 엘리먼트 및 조성물을 제조하거나 이용하는 방법의 단계를 포함하는 본 출원의 모든 양태에 적용된다.
본 명세서의 교시에 따라 당업자가 인지하는 바와 같은 본 발명의 상기 양태는 신규하고 종래 분야에 비해 명백하지 않은 한도 - 이에 따라 엘리먼트가 당업자에게 공지된 하나 이상의 참조로서 기재된 한도의 임의의 조합 또는 치환으로 청구될 수 있고, 이들은, 특히, 특징 또는 특징들의 조합의 네거티브 단서 또는 고지에 의해 청구된 발명으로부터 배제될 수 있다.
본 발명은 이의 예시적인 구체예에 관해 구체적으로 제시되고 기재되었으나, 형태 및 상세에서의 다양한 변화가 첨부된 청구범위에 의해 포함된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으며 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
ATCC PTA9963 20090408 ATCC PTA9964 20090408
SEQUENCE LISTING <110> Kao, Kuo-Jang Wang, Yun-Hsin <120> THERAPEUTIC BIOLOGIC FOR TREATMENT OF HEPATOCELLULAR CARCINOMA <130> 4261.1003-001 <150> US 61/904,951 <151> 2013-11-15 <160> 48 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser 1 5 10 15 Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln 20 25 30 Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys 35 40 45 Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val 50 55 60 Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 80 Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 85 90 95 Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr 100 105 110 Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu 115 120 125 Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr 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<211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 30 cacactcatt cctgttgaag ctcttg 26 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 31 gacatccaga tgacccagac tcc 23 <210> 32 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 32 agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgtacatcca caaggattgc attcc 55 <210> 33 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 33 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg tcaggcacta caaatactgt gg 52 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 34 cagtgtgagg tgcaactggt ggag 24 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 35 acaattcccc tctagatttt gtttaacttt aagaaggaga 40 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 36 caaaattatt tctagatttc gggctttgtt agcagccgg 39 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 37 tatggatgtt gtgatgaccc aatctcca 28 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 38 ggccgctaac actctcccct gttg 24 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 39 tatgcaggtc caactggtgc agtctgg 27 <210> 40 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 40 agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc tgggcatgat gggcatgggg gacc 54 <210> 41 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 41 ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg tcaggcacta caaatactgt gg 52 <210> 42 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 42 ggccgctatt ctctgaattc ccctttctcc tgg 33 <210> 43 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 43 acaattcccc tctagatttt gtttaacttt aagaaggaga 40 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 44 caaaattatt tctagatttc gggctttgtt agcagccgg 39 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 45 catatgaacg tgcacgtgag cacagagtcc 30 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 46 ggatcctgag catatccctg catcctcc 28 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 47 catatgtatg gcaatgtgca cgccacc 27 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 48 ctcgagatcc acaggtgggc gattctggc 29

Claims (42)

  1. 항체에 컨쥬게이션된 응고 작용제를 포함하는 컨쥬게이트로서, 항체가 포유동물 PLVAP의 세포외 도메인 에피토프에 특이적으로 결합하며, 여기서 응고 작용제가 SEQ ID NO: 1과 적어도 95, 96, 97, 98, 99%, 또는 그 초과만큼 동일한 아미노산 서열을 포함하는 조직 인자이며, 여기서 항체는
    i) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    ii) SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 컨쥬게이트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, PLVAP이 SEQ ID NO: 2와 적어도 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, 또는 그 초과만큼 동일한 아미노산 서열을 포함하는 컨쥬게이트.
  7. 제 1항에 있어서, 항체가 PPAGIPVAPSSG 또는 LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM으로부터 선택된 에피토프에 특이적으로 결합하는 컨쥬게이트.
  8. 제 7항에 있어서, 항체가 에피토프 PPAGIPVAPSSG에 특이적으로 결합하는 컨쥬게이트.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서, 응고 작용제 및 항체가 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 카르복시 말단과 응고 작용제의 아미노 말단 사이에서 펩티드 결합에 의해 연결되는 컨쥬게이트.
  13. 제 1항에 있어서, 응고 작용제 및 항체가 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 카르복시 말단과 응고 작용제의 아미노 말단 사이에서 펩티드 결합에 의해 연결되는 컨쥬게이트.
  14. 제 1항에 있어서, 응고 작용제 및 항체가 링커 펩티드에 의한 펩티드 결합에 의해 연결되는 컨쥬게이트.
  15. 제 14항에 있어서, 링커 펩티드가 (Gly4-Ser)n을 포함하고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인 컨쥬게이트.
  16. 삭제
  17. 제 1항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이 인간화된 것인 컨쥬게이트.
  18. 제 17항에 있어서, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이,
    i) SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 또는 11로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 12, 13, 또는 14로부터 선택된 경쇄 가변 영역; 또는
    ii) SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 또는 19로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO: 20, 21, 또는 22로부터 선택된 경쇄 가변 영역에 의해 제공되는 컨쥬게이트.
  19. 제 14항에 있어서, 컨쥬게이트가 SEQ ID NO: 23과 적어도 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, 또는 그 초과만큼 동일한 아미노산 서열을 포함하는 컨쥬게이트.
  20. 제 1항 및 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 포함하는 간세포암종(HCC)을 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 조성물이 적합한 담체, 부형제, 및 조영제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  21. 제 20항에 있어서, 대상체에게 투여하기 적합한 투여 형태로 존재하는 약학적 조성물.
  22. 제 1항 및 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 엔코딩하는 핵산.
  23. 제 22항의 핵산을 포함하는 벡터.
  24. 제 22항의 핵산 또는 제 22항의 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  25. 제 24항에 있어서, 숙주 세포가 박테리아 세포인 숙주 세포.
  26. 제 24항에 있어서, 세포가 진균류, 효모, 발아 효모, 곤충 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, 하이 파이브 세포 (high five cell), 포유동물 세포, CHO 세포, VERO 세포, 또는 COS 세포로부터 선택되는 진핵 세포인 숙주 세포.
  27. 제 1항 및 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포 또는 제 1항 및 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 숙주에 의한 컨쥬게이트의 발현을 지지하는 조건하에 배양시키고, 발현된 컨쥬게이트를 단리시키는 것을 포함하는, 제 1항 및 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트를 제조하는 방법.
  28. 삭제
  29. 제 20항에 있어서, HCC 종양 부피가 컨쥬게이트의 투여 후에 혈전증 및 종양 괴사에 의해 감소되는 약학적 조성물.
  30. 제 21항에 있어서, 대상체가 인간인 약학적 조성물.
  31. 제 20항에 있어서, 컨쥬게이트가 대상체의 종양에 혈관내 투여되는 약학적 조성물.
  32. 제 20항에 있어서, 컨쥬게이트가 하나 이상의 종양-영양 동맥에 직접 주입되는 약학적 조성물.
  33. 제 20항에 있어서, HCC를 치료하는 것을 필요로 하는 인간 대상체에서 HCC를 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 컨쥬게이트가 하나 이상의 종양-영양 동맥에 직접 주입되는 약학적 조성물.
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 제 20항에 있어서, 컨쥬게이트가 5 내지 200 ㎍/종양 cm3의 용량으로 투여되는 약학적 조성물.
  40. 제 20항에 있어서, 컨쥬게이트가 단일 용량으로 투여되는 약학적 조성물.
  41. 제 20항에 있어서, 컨쥬게이트가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회, 또는 그 초과의 용량으로 투여되는 약학적 조성물.
  42. 제 41항에 있어서, 용량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6주; 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월, 또는 그 초과의 기간에 걸쳐 투여되는 약학적 조성물.
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