BR102014029197A2 - biológico terapêutico para tratamento de carcinoma hepatocelular - Google Patents

biológico terapêutico para tratamento de carcinoma hepatocelular Download PDF

Info

Publication number
BR102014029197A2
BR102014029197A2 BR102014029197A BR102014029197A BR102014029197A2 BR 102014029197 A2 BR102014029197 A2 BR 102014029197A2 BR 102014029197 A BR102014029197 A BR 102014029197A BR 102014029197 A BR102014029197 A BR 102014029197A BR 102014029197 A2 BR102014029197 A2 BR 102014029197A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
conjugate
tumor
seq
variable region
fab
Prior art date
Application number
BR102014029197A
Other languages
English (en)
Other versions
BR102014029197B1 (pt
BR102014029197A8 (pt
Inventor
Kuo-Jang Kao
Yun-Hsin Wang
Original Assignee
China Synthetic Rubber Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Synthetic Rubber Corp filed Critical China Synthetic Rubber Corp
Publication of BR102014029197A2 publication Critical patent/BR102014029197A2/pt
Publication of BR102014029197A8 publication Critical patent/BR102014029197A8/pt
Publication of BR102014029197B1 publication Critical patent/BR102014029197B1/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

biológico terapêutico para tratament de carcinoma hepatocelular. a presente invenção refere-se a, inter ali, conjugados compreendendo um agente de coagulação conjugado a um anticorpo, onde anticorpo se liga especificamente a um epítopo de domínio extracelu ar de uma proteína plvap de mamífero. estes gentes alvejam es ecificamente tumores hcc e tratam o hcc. a invenção também provê processos de uso destes conjugados, tais como os processos de tratamento de hcc através de administração de conjugados providos pela invenção ou composição providas pela invenção, tais como composições farmacêuticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção dara "BIOLÓ- GICO TERAPÊUTICO PARA TRATAMENTO DE CARCINOMA HE- PATOCELULAR".
Pedido de Patente Relacionado [001] Este pedido de patente reivindica o benefício de pedido de patente provisório U.S. N° 61/904 951, depositado em 15 de novem- bro de 2013. Os inteiros ensinamentos do pedido de patente acima são aqui incorporados por referência.
Incorporação por referência de material em arquivo de texto ASCII [002] Este pedido de patente incorpora por referência a Listagem de Sequências contida no seguinte arquivo de texto ASC II sendo sub- metido simultaneamente com o mesmo: a) nome de arquivo: Listagem de sequências.txt; criado em 28 de ou- tubro de 2014, de 38 KB de tamanho.
Antecedentes da Invenção [003] Câncer de fígado primário é o quinto câncer mais comum em homens e o sétimo em mulheres em todo o mundo. Globalmente, ele é a segunda causa líder de morte de câncer em homens e a sexta causa líder de morte de câncer entre mulheres. Carcinoma hepatoce- lular (HCC) totaliza 85% de câncer de fígado primário. HCC é endêmi- co no sudeste da Ásia e África Sub-Saariana. A incidência em países ocidentais aumentou em anos recentes e é esperado ccntinuar a au- mentar. HCC é a quinta e nona causa líder de mortes de: câncer para homens e mulheres nos U.S. A sobrevivência total de 5 anos para HCC é de somente 15%. [004] Em vista da significante incidência desta doença, e suas imensas barreiras sobre pacientes, seus sistemas de suporte e socie- dade no todo, ainda aperfeiçoamento em tratamento de paciente de HCC com doença em estágio intermediário e avançado é urgentemen- te necessário — mais especificamente, existe uma necessidade de agentes que possa especificamente alvejar tumores HCC e, por exemp o, reduzir o volume dos tumores para tratar o HCC e/ou elimi- nar os tumores assim como processos de fabricação e uso dos mes- mos.
Sumário da Invenção [005] A invenção provê, inter alia, agentes que alvejam especifi- camente células endoteliais de tumores HCC e tratam 3 HCC, junto com processos associados de uso destes agentes. Em um primeiro aspecto, a invenção provê conjugados compreendendo um agente co- agulante conjugado a um anticorpo, onde o anticorpo se liga especifi- camente a um epítopo de domínio extraceiular de uma proteína PLVAP de mamífero. [006] Em algumas modalidades, o agente coagulanle é uma pro- teína çoagulante. Em modalidades mais particulares, a proteína coa- gulante é um fator de tecido. Ainda em modalidades mais particulares, o fator de tecido compreende uma sequencia de aminoácidos pelo menos cerca de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 1; por exemplo, pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ D NO: 1; por exemp o, pelo menos 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idênt ca a SEQ ID NO: 1. [007] Em um aspecto relacionado, a invenção provê conjugados compreendendo um fator de tecido com uma sequência de aminoáci- dos peo menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 1 conjugada, através de uma ligação peptídica, a um anticorpo, onde o anticorpo se lic a especifica- mente a um epítopo em um domínio extraceiular de uma proteína PLVAP humana. [008] Em qualquer um dos precedentes aspectos e nodalidades, a proteína PLVAP de mamífero pode compreender uma sequência de aminoíicidos pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 2; mais preferiv elmente pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica £ SEQ ID NO: 2; ainda mais preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 2. [009] Para qualquer um dos aspectos e modalidade s, o anticorpo pode ligar especificamente um epítopo selecionado de 3PAGIPVAP- SSG (SEQ ID NO: 25) ou LAIRNSALDTCIKTKSQPMMPVSRPM (SEQ ID NO: 26). Em modalidades mais particulares, o anticorpo liga especi- ficame ite o epítopo PPAGIPVAPSSG (SEQ ID NO: 25). [0010] Para os conjugados de qualquer dos aspectos e modalida- des anteriores, em algumas modalidades, a proteína coagulante e an- ticorpo são quimicamente reticulados. Em outras modalidades, a prote- ína coé gulante e anticorpo são ligados por uma ligação peptídica. [0011] Nos conjugados de qualquer um dos aspectos e modalida- des anteriores, o anticorpo pode ser uma imunoglobulira compreen- dendo uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada. Em modalidades mais particulares, a proteína coagu- lante e anticorpo estão ligados por uma ligação peptídica entre o ter- minus carboxi de uma proteína compreendendo a regiãa variável de cadeia pesada e o terminus amino da proteína coagulanle. Em outras modalidades, a proteína coagulante e anticorpo são ligados por uma ligação peptídica entre o terminus carboxi de uma proteína compreen- dendo a região variável de cadeia leve e o terminus amina da proteína coaguliante. [0012] Em algumas modalidades, no conjugado de qualquer um dos asaectos ou modalidades anteriores, a proteína coagulante e anti- corpo são ligados por uma ligação peptídica através de um peptídeo ligante. Em modalidades mais particulares, o peptídeo ligante compre- ende (Gly4-Ser)n, onde n é 1, 2, 3, 4, 5, ou 6; mais preferivelmente on- de n é 3. [0013] Em certas modalidades, o conjugado de qua quer um dos aspectos ou modalidades anteriores, o anticorpo é uma imunoglobuli- na compreendendo: [0014] i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo as CDRs da região variável compreendendo a sequência de amínoáci- dos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreen- dendo as CDRs da região variável compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, opcionalmente onde a Ccdeia leve va- riável e cadeia pesada variável têm até 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácidos conservativas em cada CDR; ou [0015] ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo as CDRs da região variável compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve compreen- dendo as CDRs da região variável compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, opcionalmente onde a cadeia leve va- riável e a cadeia pesada variável têm até 1, 2, 3, ou 4 substituições de aminoácidos conservativas em cada CDR. [0016] Em modalidades mais particulares, a região variável de ca- deia leve e/ou região variável de cadeia pesada são humanizadas.
Ainda èm modalidades mais particulares, a região variável de cadeia leve e região variável de cadeia pesada são dadas por: i) uma região variável de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, ou 11, mais particularmente onde a região variável de cadeia pesada é SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve seleci- onada de SEQ ID NO: 12, 13, ou 14, mais particularmente onde a re- gião variável de cadeia leve é SEQ ID NO: 13 ou ii) uma região variável de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, ou 19, mais particularmente onde a região variável de cadeiaipesada é SEQ ID NO: 19;um e a região variável de cadeia leve selecionada de SEQ ID NO: 20, 21, ou 22, mais preferíve l mente onde a região variável de cadeia leve é SEQ ID NO: 22. [0017] Em certas modalidades de qualquer dos aspectos e moda- lidades anteriores, o conjugado compreende uma sequência de ami- noácidos pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. [0018] Em um aspecto relacionado, a invenção pre vê um ácido nucléico codificando o conjugado de qualquer um dos aspectos e mo- dalidades anteriores. Em uma modalidade particular, os ácidos nucléi- cos providos pela invenção estão contidos em um vetor. Em uma mo- dalidade relacionada, o vetor pode estar em uma célula lospedeira, e em certas modalidades, a célula hospedeira é uma bactéria (tal como, por exemplo, Escherichia coli). Em outras modalidades, a célula hos- pedeira é uma célula eucariótica (por exemplo, um furgo, tal como uma levedura, incluindo levedura reproduzindo; uma cé ula de inser- ção, tal como SfO, Sf21, ou células cinco alto; ou células mamíferas, tais como células CHO, VERO, ou COS). [0019] Em outro aspecto relacionado, a invenção provê composi- ções farmacêuticas compreendendo o conjugado de qualquer um dos aspectos e modalidades anteriores, onde a composição ainda com- preende um apropriado carreador, excipiente, ou meio de contraste.
Em modalidades mais particulares, a composição está en uma forma de dospgem apropriada para administração a um sujeito. [0020] Em outro aspecto, a invenção provê processos de fabrica- ção de conjugado de qualquer um dos aspectos e modalidades anteri- ores através de cultura de célula hospedeira de qualquer um dos as- pectos e modalidades anteriores sob condições que suportam a ex- pressão do com jugado através de hospedeiro e isolamento de conju- gado expresso. [0021] Ainda em outra modalidade, a invenção pro/ê processos de: tra amento de um tumor com vasculatura positiva - PLVAP, trata- mento de carcinoma hepatocelular (HCC), redução de volume de tum tumor :om vasculatura positiva - PLVAP, ou indução de trombose e necrose de tumor de um tumor com vasculatura positiva - PLVAP, em um sueito mamífero em sua necessidade. Nestes processos, uma quantic ade terapeuticamente efetiva do conjugado de qusiquer um dos aspectos e modalidades anteriores ou uma composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos e modalidades anteriores é provida (por exemp o, administrada, através de quaisquer meios apropriados) ao sujeito (por exemplo, um humano). [0022] Em algumas modalidades, o volume de tumor HCC é redu- zido seguindo trombose e necrose de tumor induzida pelo conjugado. [0023] Em certas modalidades, o conjugado é administrado intra- vascularmente para o tumor, por exemplo, HCC, do sujeilo. Em moda- lidades mais particulares, o conjugado é diretamente nfundido em uma oi mais artérias de alimentação de tumor. [0024] Em algumas modalidades, o sujeito está sofrsndo concor- rente cu sequencial tratamento com um ou mais agentes quimiotera- pêuticcs, rádio - terapia, injeção de álcool intratumoral, cirurgia, criote- rapia, ablação com frequência de rádio, ou uma combinação de um ou mais dos anteriores. Em modalidades mais particulares, o com jugado é administrado ao sujeito junto com um ou mais agentes quimiotera- pêuticos. Ainda em modalidades mais particulares, o um ou mais agentes quimioterapêuticos compreendem uma quantidade terapeuti- camenie efetiva de sorafenibe (ver, por exemplo, PubChem 216239), bevacizumAb, ou outras drogas terapêuticas antiangiogênicas. Em certas modalidades, o conjugado é administrado ao sujeito em uma composição farmacêutica ainda compreendendo o um ou mais agen- tes quimioterapêuticos. [0025] Em algumas modalidades, o conjugado é administrado em uma dose de cerca de 5 a cerca de 200 pg/cm3 de tumor, mais particu- larmente cerca de 10 a cerca de 150 pg/cm3 de tumor, e mais particu- larmente cerca de 15 a cerca de 100 pg/cm3 de tumor. [0026] Em certas modalidades, o conjugado é administrado em uma dòse simples. Em outras modalidades, o conjugado é administra- do em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 doses ou mais. Em modalidades mais particulares, as doses são administradas sobre um período de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 dias; ou 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 semanas; ou 1,2, 3, 4, 5, ou 6 meses, ou mais.
Breve Descrição dos Desenhos [0027] Esta patente ou arquivo de pedido de patente contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta patente ou publi- cação de pedido de patente com desenho(s) a cores serão providas pelo Escritório com requisição e pagamento da taxa necessária. [0028] O anterior será aparente a partir da seguinte descrição mais detalhada de modalidades exemplares da invenção, como ilustrado nos desenhos acompanhantes. [0029] A FIG. 1 é um quadro de um gel eletroforético, que mostra análise SDS-PAGE de proteína de fator de tecido humano rotulada- GST purificada. Foi usado gel de poliacrilamida dez porcento. Três mi- crogramas de fator de tecido humano recombinante rotulado com GST (GST-hTF) foram carregados sobre o gel. [0030] A FIG. 2 é um gráfico de OD405nm como una função de concentração de proteína, ilustrando a ligação de MECA32 quimica- mente conjugado com fator de tecido humano (MECA32~hTF) para PLVAR hu mana através de ensaio imuno ligado a enzima. Cada cavi- dade da placa de ensaio foi revestida com um domínio extracelular so- lúvel em água de proteína PLVAP de camundongo. Após bloqueio, as cavidades revestidas foram incubadas com crescentes concentrações de MECA32-hTF. Uma cavidade foi incubada com fator de tecido hu- mano (hTF). Ligação de MECA32-hTF a PLVAP foi detectada anticor- po anti-hTF biotinilado de R&D Systems, Inc. (Rockford, IL). O resulta- do mostrou que MECA32-hTF ligou-se a PLVAP de camundongo e carreop hTF detectável com anticorpo anti-hTF. hTF soiúvel controle sem ahticorpo (círculo sólido) não pode se ligar a PLVAP e ser detec- tado. [0031] As FIGS. 3A e 3B são diagramas mostrando construção de vetores; de expressão MECA32-Fab-TF. [0032] A FIG. 4 é um diagrama da construção de expressão para CSR02-Fab-TF. [0033] A FIG. 5 é um quadro de uma SDS-PAGE ce PLVAP hu mana recombinante e PLVAP de camundongo. PLVAP humana re- combinante (5 pg) e PLVAP de camundongo (2,5 pg) foram analisadas com gel de poliacrilamida 12%. [0034] As FIGS. 6A e 6B são micrografias ilustrando manchamen- to imuno histoquímico (IHC) de expressão de PLVAP e, células endo- teliais vasculares de xenoenxerto de tumor Hep3B em camundongos SCID. Anticorpo monoclonal PLVAP anticamundongo A/IECA32 (10 pg/mL) foi usado para manchamento IHC (painel B). O painel esquer- do foi a seção do mesmo bloco manchado com IgG de rato normal na mesma concentração como controle negativo (painel A) O resultado mostra que células endoteliais vasculares em HCC humano semelhan- te a xenoenxerto de tumor Hep3B mancharam positivamente para ex- pressão de PLVAP (precipitados marrom escuro apontados por setas em painel B). A PLVAP expressa por células endoteliais vasculares de tumor por isso pode ser alvejada para avaliar efeitos terapêuticos de MECAÍ2-TF e MECA32-Fab-TF. Os mesmos vasos não podem ser manchados com IgG controle de rato (setas em painel A). [0035] A FIG. 7 mostra quadros de fluxo de sangue em tumores através de sonografia, ilustrando o efeito de anticorpc monoclonal (mAb) antiPLVAP MECA32 conjugado com fator de tecido humano re- combirante (MECA32-hTF) sobre fluxo de sangue de tunor. Fluxo de sangue de tumor foi avaliado com sonografia 3D Power Doppler. Po- wer Doppler foi realizada 48 horas e 48 horas após o fatamento. O resultado mostra que fluxo de sangue foi sígnificantemente diminuído no grupo tratado com 20 pg de MECA32-TF (setas brancas) mas não no grupo controle tratado com 24 pg de MECA32mAb. S naís de fluxo de sangue vermelho estavam presentes dentro de tumcres antes de tratamento. [0036] A FIG. 8 é um gráfico de linha de volume de tumor sobre tempo, ilustrando o efeito de infusão de MECA32-TF sobre crescimen- to de tumor. O resultado mostrado nesta figura é o do mesmo experi- mento descrito em FIG. 7. Camundongos SCID transportando xenoen- xertos de tumor Hep3 foram tratados através de infusão com 20 pg de MECA32-TF em uma artéria de alimentação de tumor. O grupo contro- le foi tratado com 24 pg de MECA32mAb. Volumes de ti mores foram monito ados usando sonografia 3D antes e após tratamento no dia 0.
Um dos camundongos no grupo controle morreu no dia 20 após o tra- tamento inicial devido a rápido crescimento progressivo de tumor (+).
As taxas de crescimento do grupo de tratamento e o g upo controle foram comparadas usando modelo de efeitos mistos lineares e foram sígnificantemente diferentes (p = 0,0002). Os resultados deste estudo (FIGS. 7 e 8) demonstraram que anticorpo antiPLVAP conjugado com fator der tecido foi capaz de bloquear fluxo de sangue de tumor e inibir efetivamente crescimento de tumor. Círculo sólido (·): sontrole ME- CA32rrAb (n=3); cruzado (x): grupo de tratamento MECA32-TF (n=3) [0037] A FIG. 9 é um quadro provendo diagramas d£ estrutura de conjugados de PLVAP MECA32-Fab-TF anticamundongo recombinan- te e PLVAP CSR02-Fab-TF anti-humana. A principal di erença enter dois artiPLVAP Fab-TFs é que há uma etiqueta histidina etiqueta-His) no terminus-C de cadeia leve kapa de MECA 32-Fab-TF. A etiqueta histidina foi introduzida para propósitos de purificação. C£>R02-Fab-TF não requer etiqueta histidina para purificação. [0038] A FIG. 10 é um gráfico de linha de OD405nm versus con- centração de anticorpo competindo, ilustrando ligação de MECA32- Fab-TF a PLVAP de camundongo através de ensaio imune ligado a enzima competitivo. Cavidades de placas ELISA foram revestidas com PLVAP de camundongo solúvel em água recombinante (2,5 μ/mL) por toda noite. Após o bloqueio de cavidades com tampão contendo albu- mina de soro bovino, crescentes concentrações de IgG de rato (0,5 pg/mL a 50 pg/mL), MECA32-Fab-TF (0,5 pg/mL a 50 pg/mL) ou ME- CA32mAb (0,05 pg/mL a 5 pg/mL) foram incubadas con 0,25 pg/mL de MECA32mAb biotinilada. Ligação de MECA32mAb biotinilada a PLVAP foi medida com conjugado streptavidina — fosfatcise alcalina e substrato cromogênico. Os resultados mostram que ambos ME- CA32mAb e MECA32-Fab-TF podem competir com MECA32 mAb bio- tinilado para ligação a PLVAP de camundongo, mas não controle IgG de rato. Como esperado MECA32mAb foi aproximadamente um log mais potente que MECA32-Fab-TF para sua ligação a FLVAP de ca- mundongo, porque a afinidade de ligação de MECA32-Fab-TF é um log menor que MECA32 mAb. [0039] A FIG. 11 é um conjunto de micrografias ilustrando indução de necrose de tumor de xenoenxerto de tumor Hep3B por MECA32- Fab-TF (3, 6 e 12 pg) e anticorpo monoclonal MECA32 controle (12 pg). Após infusão de MECA32-Fab-TF ou MECA32 mAb em artéria alimentando tumor, xenoenxertos foram colhidos 72 horas após trata- mento e submetidos a secções histológicas. As micrografias mostra- ram massiva necrose de tumor (áreas destacadas em rosa) para todas as três diferentes doses de MECA32-Fab-TF. As áreas restantes de tecido viável de tumor são destacadas em azul. Todos os três tumores j do grupo controle foram 100% viáveis como mostrado na coluna à di- reita. Áreas de necrose dos tumores tratados foram calcu adas através de pesagens de cortes de imagens de tumor inteiro e áreias de necro- se, e foram expressas em porcentagem. Limites de tumoi são esboça- dos com linhas vermelha e azul. Existiram três camundorgos em cada grupo tratado. [0040] A FIG. 12 é um conjunto de micrografias ilustrando indução de necrose de tumor de xenoenxerto de tumor Hep3B por MECA32- Fab-TF (2,5, 5, e 10 pg) e anticorpo monoclonal MECA32 controle (10 pg). Este estudo foi similar àquele mostrado na FIG. 11. A principal diferença foram doses usadas para tratar xenoenxertos de tumor Hep3B. Novamente, tumores foram colhidos 72 horas após infusão em artérias de alimentação de tumor e submetidos a secçõe;s de histolo- gia. Existiram dois camundongos em cada grupo. Novamente, os re- sultados mostraram significante necrose de tumor em todas as três doses ãpós tratamento. Área necrótica em cada tumor t atado desta- cada eim roda foi determinada em porcentagem de seçãc de tumor in- teira como descrito na FIG. 11. Limite de tumor é esboçado com linhas vermelha e azul. Áreas de quadrado foram aumentadas 40x e 100 x) e mostradas à direita para demonstrar células de tumor viáveis residu- ais (setas). Porcentagem mostrada em cada tumor é a área necrótica relativa para seção transversa de tumor total. [0041] As FIGS. 13A e 13B são conjuntos de micrografias ilustran- do mudanças de histologia de tumor em 2, 24, 48 e 72 horas após in- fusão de 10 pg de MECA32-Fab-TF. As seções foram manchadas com hematoxilina e eosina. Na FIG. 13A, aparecimento de trombos de fibri- na (sejas) em vasos sanguíneos foi notada em 2 horas após infusão. O número de vasos sanguíneos contendo trombos de fibrina tornou-se mais proeminente a seguir (setas). Nenhum trombo de ibrina foi ob- servado em vasos sanguíneos de tumor antes de tratamento (0 hora).
Tecido de tumor tornou-se completamente necrótico em 4 3 e 72 horas.
Fotomicrografias foram tomadas em aumentos de 100::. Na Figura 13B, células de tumor mostram leve separação com aumentado espa- ço limpD entre elas em 4 horas após tratamento. Esta mudança se tor- na mais proeminente em 24 horas. Franca necrose com perda de manchamento nuclear azul torna-se aparente 48 horas após tratamen- to, e se torna mais pronunciado em 72 horas. As fotomicrografias fo- ram tonadas em aumento de 200x. [0042] A FIG. 14 é um conjunto de fotografias de fluxo de sangue em turror através de sonografia ilustrando mudanças de luxo de san- gue de tumor em diferentes pontos de tempo após infusão de 10 mi- crogranas de MECA32-Fab-TF. Fluxo de tumor de sangue foi avaliado por 3D power Doppler antes e após tratamento. Existiram dois camun- dongos em cada ponto de tempo. Camundongos sofreram eutanásia imediatamente após tratamento de estudo 3D power Dc ppler. Sono- grafias com sinal power Doppler (vermelho) de um dos dois camun- dongos em cada ponto de tempo antes e após tratamento foram aqui mostradas. Sonografias de tumores coletadas 48 horas antes de tra- tamento são mostradas na esquerda. Após tratamento são mostradas na direjta, nas quais sinais de fluxo de sangue em tumor desaparece- ram em 2 horas e persistiram até 72 horas após tratamento. [0043] A FIG. 15 é um gráfico de linhas de volume d€ tumor sobre o tempo, ilustrando o efeito de infusão intra-arterial de MECA32-Fab- TF sobre crescimento de xenoenxertos de tumor Hep3B Camundon- gos SGID transportando xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano Flep3B foram tratados com infusão simples de 10 microgra- mas de anticorpo monoclonal MECA32 controle (mAb) e 5 ou 10 mi- crogramas de MECA32-Fab-TF no dia 0. Volumes de ti mores foram medidc s usando sonografia 3D — 2, 9, e 24 dias a partir c e tratamento no dia 0. Os volumes de tumores iniciais médios medidos no dia - 2 para grupo controle MECA32mAb e dois grupos de tratamento com MECA32-Fab-TF (10 e 5 microgramas) foram 26,8, 29,0 e 23,1 mm3, respectivamente. O volume de tumor de cada grupo é expresso como média +/- DP em mm3. As diferentes taxas de crescimenlo dos grupos de tratamento e o grupo controle foram comparadas usando modelo de efeitos mistos lineares. Valores de P foram 0,0003 e 0,0001 para comparações entre o grupo de tratamento de 5 microgramas e o grupo controle, e o grupo de tratamento de 10 microgramas e o grupo contro- le, respectivamente.
[0044] A FIG. 16A mostra fotografias e pesos dos tumores Flep3B excisados 25 dias após tratamento inicial com MECA32mAb ou ME- CA32-Fab-TF (painel A). Os pesos médios de tumor de cada grupo de tratamento e os grupos controles (média +/- SEM) são mostrados em FIG. 16B como gráficos de barras. Pesos de tumores de cada grupo de tratamento com MECA32-Fab-TF foram comparados com aqueles do grupo controle através de teste-t. Valores de P foram 0,01 e 0,03 para 10 microgramas e 5 microgramas de grupos de tratamento com MECA32-Fab-TF, respectivamente. [0045] A FIG. 17 é um gráfico de linha de volume de tumor sobre tempo, ilustrando o efeito de administração sistêmica de MECA32- Fab-TF sobre crescimento de xenoenxertos de tumor He33B. Camun- dongos foram tratados com administração sistêmica de MECA32-Fab- TF para tratamento ou solução salina tamponada com fosfato para controle através de veia de cauda. Crescimento de tumor foi monitora- do através de medição de três dimensões perpendiculares com um calibre antes e após tratamento no dia 0. Os volumes finais de tumor de todos os três grupos foram comparados por ANOVA O resultado não mostrou diferença significante entre todos os três grupos com va- lor p de 0,96. O volumes médios de tumores (média +/- SEM) destes três grupos foram 1844+/-840 mm3 (controle), 1867+/-602 mm3 (20 mi- ί Ο crograrjnas de MECA32-Fab-TF) e 1617+/-559 mm (10 microgramas de MECA32-Fab-TF). [0046] A FIG. 18 é um conjunto de micrografias, ilustrando man- chamento imuno histoquímico de seções de três diferentes casos de carcinomas hepatocelulares humanos (HCC) e adjacentes tecidos de fígado sem tumores com CSR02-Fab-TF biotinilado. Todos os vasos sanguíneos em três seções de HCC mostradas na coluna da esquerda foram manchados positivamente (setas) para PLVAP com precipitado de cor marrom em células endoteliais vasculares. Em contraste, célu- las endoteliais forrando sinusóide de fígado, veia portal e veias hepáti- cas (d amantes) mostraram manchamento negativo sem detectável expressão de PLVAP. [0047] A FIG. 19 é uma sequência anotada de SEQ iD NO: 2, on- de a rejgião extracelular de completa NP_11600.1 (hPLVAP) está sub- linhada. [0048] A FIG. 20 é uma sequência anotada de SEQ ID NO:3 > KFCCGY4_VH_domínio_4, onde as CDRs são sublinhadas. [0049] A FIG. 21 é uma sequência anotada de SE Q ID NO: 4 >KFCCGY4_VL_domínio_9, onde as CDRs são sublinhadas. [0050] A FIG. 22 é uma sequência anotada de SEQ ID NO: 5, >KFCCGY5_VH__14, onde as CDRs são sublinhadas. [0051] A FIG. 23 é uma sequência anotada de SEQ ID NO: 6 > KFCCGY5_VL_19, onde as CDRs são sublinhadas. [0052] A FIG. 24 é uma sequência anotada de SEQ ID NO: 23, a inserção CSR02-Fd-TF recombinante, onde o domínio VH de Fd (1- 114) está sublinhado, o domínio CH1 de Fd (115-216) está em negrito, a articúlação (217-225) está sublinhada - dupla, o ligador (226-239) é representado por letras de menor caixa, e o domínio extracelular de fator dé tecido humano (240-458) está em itálico.
Descrição Detalhada da Invenção [0053] A descrição de modalidades exemplares da invenção se segue. Definições de certos termos serão adicionadas po- todo o pedi- do de patente.
Conjugados e composições providas pela invenção [0054] A invenção provê conjugados compreendendo um agente coagulante conjugado a um anticorpo, onde o anticorpo liga especifi- camen e um epítopo de domínio extracelular de uma prcteína PLVAP de mamífero. Tais conjugados são referidos como “conjugado(s) pro- vido pela invenção”, “conjugado(s) da invenção”, e semolhantes, en- quanto composições contendo os mesmos, tais como composições farmacêuticas, são conhecidas como “composição(s) provida pela in- vençãc” e semelhantes. O pedido de patente também poce referir-se a “conjuc ado(s) e composição(s) provida pela invenção” pera descrever “conjuç ado(s) provido pela invenção” e “composição(s) provida pela invenção”. [0055] Um “agente coagulante” promove a formação c e um trombo in vivo no sistema circulatório de um mamífero, isto é, na presença de uma cascata de coagulação funcional e caminho de ativação de pla- queta. Um “agente coagulante” peptídeo é uma “proteína coagulante”.
Elementos exemplares da cascata de coagulação incluem, por exem- plo, fator de tecido, fator Hageman (human GenelD No. 2161), trom- boplaslina de plasma (human GenelD No. 2160), trombina (human GenelD No. 2147), fator Christmas (human GenelD No 2158), fator estável VII (human GenelD No. 2155), e fator estabilizante de fibrina (human GenelD Nos. 2162, 2165); ver também human 3enelD Nos. 2156, 2157, e 2159. Elementos exemplares do caminho d 3 ativação de plaquel a incluem, por exemplo, ADP, serotonina, fator de ativação de plaque a (PAF; human GenelD No. 7941), fator Von Willebrand (vWF; human GenelD No. 7450), fator de plaqueta 4 (human GenelD No. 5196), e tromboxano A2 (TXA2)). O agente coagulante oode ser um componente ou produto da cascata de coagulação (isto é, um compo- nente do caminho intrínseco, extrínseco, ou comum) ou caminho de ativação de piaqueta, assim como proteínas heterólogas, incluindo ve- nenos de coagulação, como convulxina (ver, por exempÍD, uniprot Ids 093426 e 093427 para sequências de proteínas referências para as subunidades alfa e beta, respectivamente) e Russellysina (ver, por exemplo, unirpot Q7LZ61), contanto que o agente promova trombogê- nese, por exemplo, na presença de uma cascata de coac ulação funci- onal e caminho de ativação de piaqueta. [0056] Em modalidades particulares, o agente coagulante é uma proteína coagulante. A proteína coagulante pode estar no conjugado como um monômero, ou um oligômero, tal como um dímero, ou tríme- ro; ou um polímero de maior ordem de estrutura. Em modalidades mais particulares, a proteína coagulante é um fator de tecido. Um “fa- tor de tecido”, também conhecido como fator III, tromboplastina, e CD142, é um receptor para fator VI! que promove trombogênese. Um fator de tecido é exemplificado por human GenelD No. 2152, e nume- rosos homólogos são conhecidos (ver HomoloGene ID 1511), incluin- do proteínas de humano:NP_001984.1, camundongo: NP_034301.3, chimpanzé: XP_001156450.1, e cão NP_001019811.1. A proteína hu- mana inclui motivos tais como um par de domínios tipo 3 de fibronecti- na (c100065) conservados entre homólogos, assim corro um par de motivos WKS (Uniprot P13726.1), e uma região de ligação de interfe- ron (domínio conservado CDD:204189). Em modalidades particulares, o fator de tecido é uma porção extraceíular, solúvel de fator de tecido, exemplificada por SEQ ID NO: 1, que é aminoácido 33-251 de NP_001984.1, e sequências correspondentes como identificáveis atra- vés de alinhamentos com sequências homólogas de outros organis- mos, assim como suas variantes funcionais, incluindo substituições e truncações (por exemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 resíduos ou i mais). jEm algumas modalidades o fator de tecido compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 1; mais preferivelmente pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% ou mais idêntica a SEQ ID NO: 1; ainda mais preferivelmente peo menos 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 1. Fatores de tecido variantes, com alterados níveis de atividade, também podem ser usa- dos na invenção, tanto como monômeros, ou, em algumas modalida- des, multímeros, tais como dímeros. Estes incluem o fator de tecido “deficiente de coagulação”, como descrito na patente U.S. 6 156 321, incorporada por referência em sua totalidade, que são 1 D0 vezes, ou mais, menos ativos que fator de tecido nativo, por exemplo, com rela- ção a Fator VII de ativação. [0057] “Anticorpo” abrange ambos tablados, imunogbbulinas (as- sim como seus fragmentos de ligação de antígeno) e não imuinoglobu- linas que podem ser adaptados e usados similares a munoglobuli- nas—assim chamados miméticos de anticorpo. Miméticos de anticorpo | exemplares incluem aqueles baseados em domínios 3 de fibronectina (domínjos Fn3; também conhecidos como monocorpDs; ver, por exemplo, Koide and Koide, Methods Mol. Biol. 352:95-109) (2007)), domínid Z de proteína A (também conhecidos como afico pos; ver, por exemplo, Nygren FEBS J. 275(11):2668-76 (2008), crista ina gama -B ou ubicjpíina (aflinas; ver, por exemplo, Ebersbach, et al., J. Mol. Biol. 372(1):172-85 (2007)), lipocalinas (anticalinas; ver, por exemplo, Sker- ra, FEBS J., 275(11):2677-83 (2008)); domínios A de r-ceptores de | membrana (avimeros; ver, por exemplo, Silverman, et al., Nat. Bio- techno . 23(12):1556-61 (2005)); repetições ancrina (darpínas; ver, por exempo, Stumpp et al., Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701 (2008)); domínio SH3 de Fyn (finômeros); ver, por exemplo, Grabu- lovski ot al., J Biol Chem 282 (5): 3196-3204 (2007)), e domínios tipo Kunitz (peptídeos de domino Kunitz; ver, por exemplo, N xon and Wo- od CR, CurrOpin Drug Discov Devel9 (2): 261-8 (2006)). [0058] Anticorpos para uso nos conjugados providos pela invenção ligam e specificamente um epítopo de domínio extracelula * de uma pro- teína FLVAP de mamífero. Epítopos de domínio extracelular exempla- res de uma PLVAP de mamífero incluem regiões correspondendo a (por exemplo, como avaliado por alinhamentos de secuências, tais como BLASTp, ClustalW, COBALT, etc., usando parâmstros default) para o domínio extracelular de uma PLVAP (de cerca de aminoãcido 49 em diante em SEQ ID NO: 2), ou, mais particularmente, no termi- nus-C de PLVAP, tal como: de cerca de aminoãcido 238 em diante em SEQ ID NO: 24 (NP_115774.2, a sequência referência cie PLVAP de camundongo, por exemplo, tal como um peptídeo consi stindo na se- quência de aminoácidos de aminoácidos 238-413 de SEQ ID NO: 24), ou sequências contidas em cerca de aminoácidos 370 a cerca de 442 de SEQ ID NO: 2 (a sequência referência de PLV^P humana, NP_11 2600.1), tais como aminoácidos 378 a 404 de SEQ ID NO: 2 ou aminoscidos 431 a 442 de SEQ ID NO: 2. Em modalidades particula- res, os anticorpos para uso nos conjugados providos pele invenção se ligam especificamente a um epítopo em aminoácidos 378 a 404 de SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 431 a 442 de SEQ ID NO: 2; e/ou um correspondente homólogo de primata de qualquer um destes, tais co- mo correspondentes sequências de Macaca fascicularis (XP^OC 5588437.1) e Macaca mulata (AFH29537.1). [0059] Em modalidades particulares, o anticorpo é uma imunoglo- bulina. “Imunoglobulina” refere-se a ambas, imunoglobulinas de inteiro comprimento, assim como fragmentos de ligação a antígeno de imu- noglobuíinas, tais como Fab, F(ab’)2, Fv, scFv, Fd, dAb, e outros frag- mentos de imunoglobulina que retêm função de ligação de antígeno.
Imunoclobulinas terão pelo menos 3 CDRs (regiões determinantes de complementaridade) em seu domínio de ligação de antígeno, e, em modalidades mais particulares, 4, 5, ou 6 CDRs, e ainda mais particu- larmente, 6 CDRs em um domínio de ligação de antígeno. Imunoglo- bulinas para uso na invenção incluem, por exemplo, anticorpos huma- nos, orangotango, camundongo, rato, cabra, carneiro, coelho e gali- nha. Imunoglobulinas podem ser policlonais, monoclonsis, mono es- pecíficas, poli específicas, não específicas, humanizadas, cameliza- das, de cadeia simples, quiméricas, sintéticas, recombi nantes, híbri- das, mutantes, ou enxertadas-CDR. Particulares imunoglobulinas para uso na invenção incluem aquelas com as CDRs dos anticorpos produ- zidos por hibridoma murinho KFCC-GY4 (designação de: depósito de patente ATCC PTA-9963) ou hibridoma murinho KFCC-G Y5 (designa- ção de depósito de patente ATCC PTA-9964), ou suas substituições conservativas, por exemplo, em modalidades particulares, com até cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 substituições conservativas de aminoácidos (mais particularmente 1, 2, 3, 4, 5, ou mais substituições) no domínio de ligação de antígeno, por exemplo, até cerca de 1, 2, 3, ou 4 substituições conservativas em ca- da CDR; mais particularmente até 1 ou 2 substituições conservativas em cada CDR. Em certas modalidades, a imunoglobulina compreende domínios variáveis leves e pesados humanizados. Os anticorpos KFCC-GY4 e KFCC-GY, incluindo sequências de aminoácidos de seus domínios variáveis e CDRs são descritos na publicação ie pedido de patente Ü.S. Nos. US 2011/0085973 (primeiro descrevendo os anti- corpos monoclonais, que foram gerados em camundongos) e US 2011/0262349 (descrevendo particulares variantes quiméricas e hu- manizadas), ambas as quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades. Ver também SEQ ID Nos: 3-22, provendo sequências de domínio variável, e CDRs identificadas para estes anticorpos. [0060] “PLVAP”, também conhecida como proteína associada a vesícula plasmalema, PV1, FELS, e gp68, é uma proteína expressa em vasulatura de tumor, tal como vasculatura de tumor FCC, e é des- crita em human GenelD No. 83483. PLVAP foi identificada em vários organismos (ver HomoloGene ID 10578), tais como: humano ((NP__112600.1, ver também SEQ ID NO: 2), chimpanzé (XP_512490.3), camundongo (NP_115774.2), e cão (XP_541943.3) e compreende um domínio PV-1 (pfam06637). Anticorpos que ligam es- pecificamente uma PLVAP, tal como uma PLVAP de mamífero, em algumas modalidades, ligam um domínio extracelular de PLVAP, que corresponde a aproximadamente aminoácidos 49-442 c u 51-442 de SEQ ID NO: 2. Em modalidades particulares, a PLVAP de mamífero compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 2 (ou um seu domínio extracelular), mais preferivelmente pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica s SEQ ID NO: 2 (ou um seu domínio extracelular); ainda mais preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 2 (ou um seu dèmínio extracelular). Em algumas modalidades a proteína PLVAP inclui substituições (por exemplo, de 1,2, 3, 4, l resíduos ou mais) e/ou truncações (por exemplo, de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 resí- duos ou mais), em relação a SEQ ID NO: 2, ou um seu domínio extra- celuiar. [0061] Um peptídeo ligador para uso consonante com a invenção pode aboplar o anticorpo e agente coagulante, por exemplo, proteína coagulante, através de uma ligação peptídica - por exemplo, o anti- corpo (por exemplo, um dos domínios variáveis de uma munoglobuli- na) e proteína coagulante podem ser expressos como urna cadeia de polipeptídeo simples. O peptídeo ligador pode variar em comprimento de, por exemplo, cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 2 5, 30, 35, 40, 45, ou 50 aminoácidos, ou mais, por exemplo, cerca de 75, 100, 150, 200, 21)0, ou 300 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligador compreende uma região de articulação, análoga aos domínios ricos em prolina e ricos em cisteína encontrados em imunoglobulinas ocor- rendo naturalmente, e opcionalmente ainda incluindo um peptídeo li- gador, tal como (Gly4-Ser)3, para espaçar o anticorpo <por exemplo imunoglobulina) e agente coagulante (por exemplo, proteína coagulan- te). [0062] Conjugados providos pela invenção opcionalnente podem compreender um rótulo, tal como um rótulo detectável, tal como um rótulo f uorescente, enzimático, ou de rádio. Em certas modalidades, o conjugado provido pela invenção é biotinilado. [0063] Em um aspecto relacionado à invenção provê ácidos nu- cléicos codificando os conjugados providos pela invenção, vetores contendo os ácidos nucléicos, e células hospedeiras contendo os áci- dos nucléicos e vetores. Ácidos nucléicos exemplares incuem aqueles codificando proteínas pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais icênticas a um conjugado provido pela invenção, incluindo, em modalidades particulares, o conjugado tendo a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO:23. Em outras modalidades, o ácidc nucléico po- de hibridizar sob condições de hibridização altamente rigorosas para um ácido nucléico codificando um conjugado provido pela invenção.
Condiçees de “hibridização altamente rigorosas” são: pelo menos cer- ca de 6X SSC e 1% SDS a 650+c· com uma primeira lavagem por 10 minutos a cerca de 42°+C com cerca de 20% (v/v) formanida em 0,1X SSC, com uma subsequente lavagem com 0,2XSSC e 0,1% SDS a 65°C. Em modalidades particulares, um ácido nucléico provido pela invenção pode ser modificado em códon, por exemplo, piara a particu- lar célijila hospedeira usada para a produção do conjugado. Vetores codificando um ácido nucléico provido pela invenção podem conter adicionais sequências requeridas para, por exemplo, expressão de um conjugado provido pela invenção (tais como sequências reguladoras, promotores e aperfeiçoadores) assim como certas sequências ancila- res, tais como uma ou mais origens de replicação, um oi mais marca- dores selecionáveis, e sequências de integração (por exemplo, para integração em um genoma hospedeiro, tanto através de integração randômica, elementos transponíveis, ou integração específica de sítio, por exemplo, através de recombinação homóloga, tal como através de nucleases alvejadas). [0064] I Em aspectos relacionados, a invenção provê processos de fabricação de conjugados providos pela invenção, por exemplo, atra- vés de cultura de uma célula hospedeira contendo um ácido nucléico provido pela invenção sob condições que suportam a expressão do conjugado pelo hospedeiro (por exemplo, se um promotc r é induzível, através de adição de agente de indução, etc.), e então isolando o con- jugado expresso. Apropriados hospedeiros incluem bactérias (por exemplo, Escherichi coli) assim como células eucarióticas, como um fungo, tal como levedura, incluindo levedura em reprodução; uma célu- la de inseto, tais como células SfO, Sf21 ou cinco alta; ou células de mamíferos, tais como células CHO, VERO, ou COS, ou células tronco mesenquimais (MSCs). [0065] Os conjugados providos pela invenção podem ser utilmente formulados em composições, tais como composições farmacêuticas - por exemplo, onde um conjugado provido pela invenção está compos- to com um apropriado carreador ou excipiente. Qualquer carreador farmacêutico apropriado pode ser usado na invenção. Eim modalida- des particulares, o carreador promoverá a estabilidade co conjugado, por exemplo, quando liofilizado para estocagem ou transporte, e su- porta a estabilidade dos conjugados providos pela invenção quando em uma solução, tal como uma solução aquosa após reconstituição, consistente com melhores práticas farmacêuticas. Composições far- macêutiicas podem incluir um ou mais de: um tampão (tal como um tampão histidina, fosfato, ou succínato), um agente de volume ou for- mação de torta (tal como glicina ou sorbitol, ou um açúcar, tal como sucrose, dextrose, lactose ou frutose), um modificador de tonicidade (tal como um sal inorgânico, como cloreto de sódio, fosfato de potás- sio, ou fosfato de sódio), um preservativo, agentes umectantes, emul- sificantes, etc. [0066] Em modalidades particulares, os conjugados providos pela invenção são formulados em uma composição farmacêuica apropria- da parja administração direta para vasculatura de tumcr HCC, por exemplo, através de administração transvascular, tal como administra- ção transarterial. Em modalidades particulares, os conji gados provi- dos pea invenção podem ser formulados em um óleo lipidol. Em ou- tras modalidades, os conjugados providos pela invenção podem ser formuládos com micro partículas com um diâmetro médio de entre cer- ca de 45 micrometros e cerca de 90 micrometros, tais como partículas embólieas IVALON. Injeção com presença de tais exci cientes pode aumentar a disponibilidade dos conjugados providos pela invenção, quandcj» administrados para os tumores tratados, por exemplo, através de indução de estase de sangue dentro de vasos sanguíneos de tumor após injeção. [0067] Em algumas modalidades, as composições providas pela invenção podem incluir um meio de contraste solúvel em agua, compa- tível (pjara aplicações radiográficas, MRI, ou de ultrasscm) para, por exemplo, permitir avaliação da distribuição do conjugado provido pela invenção nos tumores tratados através de fluoroscopia e/ou para ava- liar a iritegralidade de um tumor exposto aos conjugados Drovidos pela invenção. [0068] As composições farmacêuticas providas pela invenção po- dem sèr preparadas em forma(s) de dosagem para distr buição e ad- ministração a um sujeito em sua necessidade (conson ante com os processos providos pela invenção), incluindo kits de múltiplas formas de dosagem, que podem conter um ou mais recipientes enchidos com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da in- venção. Opcionalmente associada com tal recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamenta regulando a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou bológicos, es- te aviso refletindo aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para administração humana. A embalagem ou kit pode ser rotulada com in ormação relacionando-se ao modo de administrarão, sequên- cia de administração de droga (por exemplo, separadame nte, sequen- cialmerite ou concorrentemente no caso de kits de múltiplos agentes), ou serr elhantes. A embalagem ou kit também pode inclu r meios para lembra o paciente de tomar a terapia. A embalagem ou kit pode ser uma dosagem unitária simples da terapia de combinação ou pode ser uma pluralidade de dosagens unitárias. Em particular, o composto(s) pode estar separado, misturado em qualquer combinação, presente em uma forma simples, por exemplo, frasco ou comprimido. Para o propôs to desta invenção, dosagem unitária é pretend da significar uma dosagem que é dependente das fármaco-dinâmicc s individuais de cada composto, e administrada em dosagens aprovadas por FDA em cursos de tempos padrões. [0069] Os conjugados providos pela invenção, as composições farmacêuticas providas pela invenção, e kits providos pela invenção contendo os mesmos são por isso úteis em processos ce tratamento de um sujeito com um tumor com vasculatura positiva-PLVAP, tal co- mo HCC, assim como processo de visualização de um tumor com vas- culatura positiva-PLVAP.
Processos de Tratamento [0070] Os conjugados e composições providos pela invenção po- dem ser usados em processos de, por exemplo: tratamento de um tu- mor cohn vasculatura positiva-PLVAP (tal como HCC ou c lioblastoma), trataménto de carcinoma hepatocelular (HCC), redução de volume de tumor de um tumor com vasculatura positiva-PLVAP, em um sujeito mamífero em sua necessidade. Estes processos compreendem admi- nistração de uma quantidade terapeuticamente efetiva dos conjugados providos pela invenção ou composições providas pela invenção ao su- jeito. [0071] Um “sujeito” refere-se a um mamífero, mais particularmen- te, um paciente humano (macho ou fêmea), e em modalidades mais particulares, um paciente humano com HCC, glioblastoma, ou qual- quer tumor com vasculatura positiva-PLVAP. Embora suj sitos possam ser de qualquer estágio de vida e qualquer idade, por exemplo, neona- to, bebe, adolescente, criança, adulto jovem, adulto ou icoso, em mo- dalidades particulares o sujeito é um adulto, por exemplo, um adulto humano, isto é, de cerca de 18 anos de idade, ou mais velho, por exemplo, cerca de: 18-70, 20-60, 25-55, 25-50, 30-50, 25-65 anos de idade, assim como maior que cerca de: 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 anos de idade. Em modalidades mais particulares, o sujeito é de 60 anos de idade, ou mais velho. Ainda em modalidades mais particula- res, o sujeito está entre cerca de 70 e cerca de 79 anos de idade. [0072] Como aqui usado, os termos “tratar”, “tratando”, ou “trata- mento” significam oposição a uma condição médica (por exemplo, HCC oü um tumor com vasculatura positiva-PLVAP) de modo que a condição médica seja aperfeiçoada de acordo com um padrão clinica- mente aceitável. Por exemplo, um aperfeiçoamento em HCC inclui re- duzido Ivolume de tumor, reduzido fluxo de sangue de tumor, necrose de tumor e/ou apoptose, função hepática normalizada, etc. [0073] Uma “quantidade terapeuticamente efetiva” é uma quanti- dade suficiente para obter o desejado efeito terapêutico ou profilático sob as condições de administração, tal como uma quantic ade suficien- te para tratar HCC. A eficácia de terapia pode ser determinada por aqueles versados na técnica usando medidas padrões e processos rotineiros. Em modalidades particulares, o conjugado é administrado em uma dose de cerca de 5 a cerca de 200 microgramas/cm3 de tu- mor, mais particularmente cerca de 10 a cerca de 150 microgra- mas/cm3 de tumor, e mais particularmente cerca de 15 a cerca de 100 microg(amas/cm3 de tumor. Dosagens verificadas sererr efetivas em um organismo, tais como os exemplos de camundongos aqui providos, podem ser convertidas para uso em outro organismo, como humanos, usando metodologias conhecidas. Ver, por exemplo, Reagan-Shaw et ai, FASEB J. 22:659-61 (2008); Schein et ai, Clin. Pharmacol. Ther. 11:3-40 (1970); e Freireich et ai, Câncer Chemother. Reports 50(4):219-244 (1966). Por exemplo, dosagem equivale:nte humana (HED) em mg/kg baseada em dosagem animal pode ser dada através da seguinte equação: HED (mg/kg) = dose animal (mg/kg) X (Kman'~ mal/Krnhumano), onde Km = peso / área de superfície (kg/nY). Fatores de conversão exemplares baseados na equação acima são mostrados na Tabela A.
Tabela A
De: Camun- Rato macaco Cão Humano Para: dongo (150g) (3,5 kg) (8 kg) (60 kg) (20g) 'Cãmundongo Ί Õ~5 025 ÕJ7 0,08 HRatõ 2 ” T~ Õ5 “lT25 ÕJÃ Macaco 4 2 1 0,6 0,33 Cão "ΊΓ 4 ~Tj “Ί " 05 Humano 12 7 3 2 1 [0074j Os conjugados providos pela invenção e composições pro- vidas pela invenção podem ser providos (por exemplo, administrados) ao sujeito através de quaisquer meios apropriados, incluindo, em mo- dalidades particulares, intravascularmente para o tumor do sujeito, por exemplo, o conjugado é infundido diretamente em um ou mais vasos de alimentação de tumor do HCC. [0075] Sujeitos tratados pelos processos providos pela invenção podem estar sofrendo tratamento concorrente ou sequencial com: um ou mais agentes quimioterapêuticos, rádio - terapia, injeção de álcool intratunoral, cirurgia, crioterapia, ablação com frequência de rádio, ou uma cc mbinação de um ou mais dos anteriores. Em certas modalida- des, o jm ou mais agentes quimioterapêuticos incluem uma quantida- de teré peuticamente efetiva de sorafenibe (ver, por exemplo, Pub- Chem 216239), bevacizumAb, ou outras drogas terapêuticas antian- giogênicas. Para processos de combinação, o conjugado provido pela invenção (ou composição provida pela invenção) pode seir administra- do concorrentemente (tanto em uma composição simplss como em composições separadas) ou sequencialmente (tanto antes como de- pois de outro tratamento). [0076] Onde o processo emprega uma composição provida pela invenção que inclui um agente de contraste, os processos providos pela in/enção podem, emalgumas modalidades, incluir a etapa de vi- sualizarão de tumor (por exemplo, HCC ou glioblastorr a) usando o agente de contraste, por exemplo, através de raio-x (incluindo explora- ção CAT),MRI, ou ultrassom. [0077] Sujeitos podem ser administrados com os conjugados ou compo sições providas pela invenção em uma dose simples ou, em ou- tras modalidades, em doses múltiplas, por exemplo, em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 doses, ou mais. Quando administradas múltipl as doses, as doses podem ser administradas sobre um período de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 dias; ou 1,2, 3, 4, 5, ou 6 semanas; ou 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 meses [0078] Grupos de alto risco para desenvolvimento de HCC podem incluir sujeitos que: são positivos HBV; são positivos HCV; têm função de fígado prejudicada; têm cirrose de fígado; têm mutações em um ou mais de TP53 (OM1M 191170), MET (OMIM 164860), CTNNB1 (OMIM 116806), CASP8 (OMIM 601763), PIK3CA (OMIM 171834), AXIN1 (OMIM 603816), PDGFRL (OMIM 604584), e APC (OMIM 611731); deficiência de alfa-1-antitripsina (OMIM 613490); hemocromatose (OMIM 235200); tirosinemia (OMIM 276700); e combinações dos ante- riores. Da mesma maneira, em certas modalidades, os processos pro- vidos pela invenção vinculam a etapa de provimento de um sujeito com (ou suspeito de ter) HCC, que tem uma ou mais destas mutações, por exèmplo, o sujeito é identificado como tendo uma cas mutações (ou quàlquer mutação que é associada com aumentada aatogenicida- de de HCC) antes de administração do conjugado provido pela inven- ção. [0079] Os conjugados providos pela invenção e composições pro- vidas pela invenção podemser administrados ao sujeito [tal como um humano) através de qualquer rota apropriada e através de quaisquer meios apropriados. Por exemplo, o conjugado ou compos ção pode ser administrado intravascularmente para o HCC do sujeito, por exemplo, através de infusão diretamente em um ou mais vasos de alimentação de tumor, tal como uma artéria hepática ou uma artéria femoral ou através de veia portal hepática. O conjugado provido pela invenção e composições providas pela invenção podem ser adminisrados ao su- jeito sozinhos ou juntos (tanto na mesma composição, como concor- rentemente ou administração sequencial) com um ou mais agentes quimioterapêuticos, tal como um ou mais de sorafen be (ver, por exemplo, PubChem 216239), bevacizumAb, ou outras drogas terapêu- ticas antiangiogênicas. [0080] ; Em qualquer um dos processos providos pela invenção o | conjugado é administrado em uma dose de cerca de 5 microgra- mas/cm3 de tumor a cerca de 200 microgramas/cm3 de tumor, mais particularmente cerca de 10 a cerca de 150 microgramés/cm3 de tu- mor, e mais particularmente cerca de 15 a cerca de 130 microgra- mas/cm3 de tumor. Os conjugados providos pela invenção ou compo- sições providas pela invenção podem ser administradas em uma dose simples, ou em doses múltiplas, tais como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 do- ses, ou mais. Doses múltiplas podem ser sobre qualquer período útil, tal como 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 dias; ou 1,2, 3, 4, 5, ou 6 sema- nas; ou 1,2, 3, 4, 5, ou 6 meses.
Exemp ificação [0081] Expressão de gene PLVAP é restrita a células endoteliais vasculares de HCC e não em tecido de fígado não canceroso. Proteí- na PLVAP é uma proteína estrutural de fenestrae e caveclae de endo- télio vascular. Ela não é conhecida estar envolvida em sinalização.
Tratamento com anticorpo antiPLVAP foi recentemente reportado afe- tar trânsito de leucócitos cruzando células endoteliais vasculares em camundongos. [0082] Neste pedido de patente, nós descrevemos o desenvolvi- mento de uma nova biologia terapêutica para tratamento de HCC atra- vés de exploração de expressão diferencial de PLVAP em células en- doteliais vasculares de HCC não em tecido de fígado não canceroso.
Para nossa abordagem, nós desenvolvemos esta biologia terapêutica através de coexpressão de proteína de fator de tecido humano sobre anticorpo antiPLVAP ou seu fragmento Fab. Fator de tecido humano é um potente gatilho de coagulação de sangue. Infusão de um tal agente terapêutico desenvolvido por nós em vasos sanguíneos de HCC pode conduzir a sua ligação a células endoteliais vasculares de tumor e dis- parar formação de coágulo de sangue em todos os vaso 5 sanguíneos de HCC. A trombose de vasos sanguíneos de tumor HCC conduz a retirada de suprimento de sangue de tumor e necrose isquêmica.
Usandc um modelo de xenoenxerto HCC em camundongos SCID, nós mostramos que infusão em artéria de alimentação de tumor do anti- corpo monoclonal antiPLVAP desenvolvido, ou seu fragmento Fab, com fa or de tecido humano induziu com sucesso massiva necrose isquem ca dos xenoenxertos de tumor e suprimiu crescimento de tu- mor. Administração sistêmica de um tal agente terapêutico através de uma veia periférica foi ineficaz Assim, infusão deste nova agente em artérias de alimentação de tumor é preferida para obtenção de efeito terapêitico.
Materiais e Métodos Anticor oo monoclonal (mAb) PLVAPMECA32 anticamundongo rato [0083] Banco de hibridoma na Universidade de lows foi obtido a partir d b Developmental Studies Hybridoma Bank at University of lowa (lowa City, IA). As células de hibridoma foram cultivacas em meio RPMI contendo soro bovino fetal baixa IgG 10%, GLUTA-VIax 1% (Life Technc iogies) e HEPES 1% (Life Technologies). PLVAPMECA32mAb anticamundongo rato foi purificado de sobrenadante de cjitura espes- so de células de hibridoma MECA32 usando coluna HiTrap Protein G de GE Healthcare Life Sciences de acordo com as instruções do fabri- cante. D anticorpo purificado foi dialisado em solução sal na tampona- da com fosfato (PBS), pH 7,4. A concentração de anticorpo foi deter- minade por absorbância em comprimento de onda de 28 3 nm usando coeficiente de extinção de 1,37 para 1 mg/mL.
Produção de domínio extracelular solúvel em água de proieína de fator de tecido humano [0084] j Para produzir porção extracelular solúvel em água recom- binante de proteína de fator de tecido humano (hTF), um fragmento de PCR para o domínio extracelular de cDNA de fator de tecido humano (aminoácidos 33 a 251) foi preparado de um clone cDNA de inteiro comprimento de fator de tecido humano (NM001993.2) (OriGene Corp., Rockville, MD). Iniciadores usados para PCR contiveram se- quências de restrição para BamH1 e Sall na extremidade 5’ de ambos iniciadores para frente e para trás, respectivamente. O fragmento de cDNA amplificado foi inserido em plasmídeo pGEX-6P-1 (GE Heal- thcare Life Sciences) e marcado com glutationa transferase (GST). A construção de expressão descrita acima foi verificada por sequencia- mento de DNA e transformada em Escherichi coii linhagem SHuffle T7 Express (New England Biolabs. Inc. Ipswich, MA) para produção de hTF. Os transformantes E. coli foram revestidos sobre neio seletivo.
Mais tarde, uma colônia de 1-2 mm foi randomicamente s elecionada e inoculada em 4 mL de meio 2xYT contendo 100 microg'amas/mL de ampicilina a 30°C e incubada em uma incubadora agitadora em 230 rpm por toda noite. No dia seguinte, a cultura de noite inteira foi inocu- lada em 400 mL de meio 2xYT contendo 100 microgramas/mL de am- picilinal e continuada a crescer a 30°C em uma incubadora agitadora em 230 rpm por toda noite. Quando a absorbância em 600 nm atingiu cerca de 0,6-0,8, Isopropil beta-D-1-tiogalacto piranosídso (ÍPTG) foi adicionado para uma concentração final de 0,4 mM para induzir produ- ção de proteína. Agitação foi continuada a 30°C por cerca de 20 horas.
Seguindo a indução com IPTG, as células foram colhidas por centrifu- gação (10 000 x g; 20 minutos) e submetidas a lise em 1x PBS com 0,2% Tween 80 contendo lisozima e Benzonase Nuclease (Novagen) em temperatura ambiente por 2 horas. Lisado de células foi centrifu- gado em 10 000 rpm por 30 minutos a 4°C. Sobrenadants foi coletado e filtrado como fração solúvel.
[0085] | O fator de tecido humano recombinante marcado com GST (GST-hTF) foi purificado a partir de coluna GSTrap FF (G E Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabri- cante. ÍAs frações eluídas contendo GST-hTF foram identificdas com eletrofofese de gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), reunidas e diali- sadas ém PBS. A concentração da proteína purificada foi determinada usando ensaio de proteína Bradford (Bio-Rad laboratórios, Hercules, CA) e ãlbumina de soro bovino como padrão. A GST-h““F purificada mostrou uma banda de proteína com peso molecular esperado de 50 kDa em gel SDS-PAGE (10% poíiacrilamida) (FIG. 1). A atividade de fator de? tecido da proteína purificada foi ensaiada contra um fator de tecido humano comerciai usando um ensaio cromogênico. A GST-hTF purificada foi ensaiada contra um padrão hTF comercial e teve ativida- de hTF de 3 microgramas por micrograma de proteína. O procedimen- to deste ensaio de atividade de hTF é detalhado em uma seção poste- rior.
Conjugação de GST-hTF recombínante a anticorpo monoclonal PLVAPMECA32 anticamundongo rato [0086] Primeiro, o MECA32mAb purificado foi diaíisadD em tampão MES 0,1 M contendo NaCI 0,5 M em pH 6,0. MES é ácido 2-(N- morfolino) etano sulfônico. O anticorpo foi ajustado para 1 mg/mL usando o mesmo tampão MES. A 1 mL de MECA32mAD, 1,2 mg de EDC coridrato de (1-etil-3-{3-dimetil amino propil] carbo diimida e 3,3 mg de sulfo-NHS(N-hidroxi sulfo succinimida) foram adicionados em temperatura ambiente por um hora. Coluna de dessaliriização Zeba pré-equilibrada com tampão de acoplamento PBS foi usada para recu- perar MECA32mAb ativado. Tampão de acoplamento PBS consistiu em NalSI 140 mM, fosfato de sódio 10 mM e KCI 3 mM em pH 7,4-7,5. A seguir, o igual número de GST-hTF (0,33 mg em 0,66 ril_) foi adicio- nado ao MECA32mAb ativado. A mistura foi incubada sobre um mistu- rador rotatório por 3 horas em temperatura ambiente. A reação foi en- tão rapidamente resfriada pela adição de hidroxil amina para uma con- centração final de 10 mM. O anticorpo conjugado com proteína de fa- tor de tecido humano foi dialisado extensivamente contra 1x solução salina tamponada com fosfato para remoção de todos os compostos químicos orgânicos pequenos. A concentração de anticorpo foi deter- minada por absorbância em 280 nm. O coeficiente de exti ição de 1,37 para 1 mg/mL foi usado para determinação de concentração de anti- corpo. 3 anticorpo conjugado com fator de tecido humaro foi medido para a atividade de fator de tecido usando um ensaio cromogênico. O fator da tecido humano recombinante adquirido de R5*D Systems (Minneapolis, MN) foi usado como um padrão para o ensaio. O conju- gado TF purificado de MECA32 anticorpo monoclonal (VIECA32-TF) foi ensaiado para ligação a PLVAP de camundongo e a presença de fator de tecido humano sobre o anticorpo ligado a PLVAD de camun- dongo ' FIG. 2).
Desenvolvimento de uma construção de plasmídeo para expressar fragmeito Fab de anticorpo monoclonal PLVAP anticami ndongo coe- xpressando hTF(MECA32-Fab-TF) [0087] | Preparação de uma construção de plasmídec para produ- ção de MECA32-Fab-TF foi realizada em quatro etapas. A primeira etapa foi preparar cDNAs de domínio variável de cadeia leve de ME- CA32rr Ab (VL) e domínio variável de cadeia pesada de MECA32mAb (VH), e determinar suas sequências de DNA para preparação de inici- adores para serem usados na segundo etapa. A segunda etapa foi preparar cDNA de inteiro comprimento para cadeia leve kapa de ME- CA32rrAb com etiqueta-His no terminus carboxila, e inseido em vetor plasmídeo pET26b. A terceira etapa foi para preparar um cDNA de domínios VH1 e CFI1 (Fd) plus região de articulação de cadeia pesada de MECA32mAb com uma sequência ligadora na extremidade 3’, e cDNA oara hTF e uma sequência ligadora na extremidade 5’. A PCR de sobreposição foi então usada para costurar dois cDNAs juntos. Es- te cDFA de MECA32-Fd-articulação-ligador-TF foi inserido em vetor plasmídeo pET26b. A quarta etapa foi construir um vetor plasmídeo bicistrônico a partir dos plasmídeos preparados a partir da segunda e a terceira etapas. Estas quatro etapas são descritas em mais detalhes abaixo e resumidas em FIGS. 3A e 3B.
Primeira Etapa: Clonagem de cDNAs de domínio VL de cadeia leve kapa de MECA32mAb e domínio VH de cadeia pesada de ME- CA32mAb para sequenciamento de ácido nucléico [0088] Os domínios variáveis codificando cDNAs de cadeia leve de MECA32mAb (VL) e cadeia pesada (VH) foram preparados usando FirstChoice RLM-RACE kit (Ambion, Inc., Austin, TX) de: acordo com instruções do fabricante. Resumidamente, RNA total iso ado de hibri- doma MECA32 foi usado como um molde para amplificar domínio va- riável de cadeias leve (VL) e pesada (VH) através de PCR de transcri- ção reversa usando iniciadores complementares para as sequências de nucíeotídeos do domínio constante da cadeia leve kapa seguinte a domínio VL (5’ TGTCCTGATCAGTAACACTGTCC3’) (SEQ ID NO: 27) e domínio CH1 da cadeia pesada seguinte para domínio VH (5ΎGAGAGTGTAGAGTCCAGACTGCAGG3’) (SEQ ID NO: 28), sepa- radamente. [0089] Produtos de PCR foram analisados e isoladcs a partir de gel de agarose 1,5% usando o kit de extração de gel Ciaquick (Qia- gen, Mlssissauga, Ontario, canada). Os fragmentos de PCR purifica- dos foram inseridos no vetor plasmídeo, pGEM-T-easy (Promega, Ma- dison, Wl, USAO e transformados em Escherichia coli linhagem YE707-J (Yeastern Biotech, Taipei, Taiwan). Plasmídeos contendo in- serções dos domínios VL e VH foram preparados a paitir de E. coli transformada e usados para determinação de sequência de DNA dos domínios VL e VH. As sequências então foram usadas para desenhos de iniciadores para serem usados nas segunda e terceira etapas.
Segunda Etapa: Preparação de cDNA consistindo em cadsia leve kapa de MECA32mAb e etiqueta-His, e inserção do mesmo em vetor pias- mídeo pET-26b [0090] A sequência da cadeia VL da primeira etapa foi usada para desenho de apropriado iniciador para obtenção de sequência de cDNA de cadeia leve kapa de inteiro comprimento de anticorpo MECA32.
Primeiro, cDNA de cadeia kapa de inteiro comprimeinto de ME- CA32mAb foi gerado por RT-PCR a partir de RNA total de células de hibridoma MECA32 usando iniciadores listados abaixo: Iniciador para frente: 5 ’ G AT C CT G AC AT C C AG AT G AC C C AG ACT C C 3 ’ (SEQ ID NO: 29) e Iniciador Reverso : 5 ’ C AC ACT C ATT CCT GTT G AAG CT C TT G 3 ’ (SEQ ID NO: 30). [0091] O fragmento de PCR purificado com sítios de restrição BamHI e Sal I foi inserido no vetor plasmídeo pET26b com uma etique- ta-(His)6 no terminus carboxi do domínio CK e este plasmídeo foi de- signado como pET26b-M32K (FIG. 3A).
Terceira Etapa: Preparação de cDNA de MECA32-Fd-articulação- ligador-TF e inserção dele em vetor plasmídeo pET26b [0092] | Nós primeiro preparamos um cDNA consisti ido em ME- CA32mAbFd, região de articulação e sequência ligadora através de PCR ulsando molde cDNA de células de hibridoma MEOA32 e o se- guinte par de iniciadores: Iniciador para frente: 5’GACATCCAGATGACCCAGACTCC3’ (SEQ ID NO: 31) e Iniciador reverso articulação ligador: 5’agaGogaootoogoctgaaccgoctocacotgtacatoqagaa GGATTGCATTCC3’ (SEQ ID NO: 32). [0093] A seguir, nós preparamos um cDNA consis indo em se- quência ligadora (Gly4Ser)3 e domínio extracelular de fator de tecido humanp (AA.33-251) (hTF) através de PCR usando mole e cDNA hTF | clonadò e o seguinte par de iniciadores: Iniciador para frente ligador hTF : 5’GGC 3GAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACA AATACT GTGG3’ (SEQ ID NO: 33) e Iniciador reverso TF: 5’CAGTGTGAGGTGCAACTGGTGGAG3’ (SEQ ID NO: 34). [0094] Dois produtos de PCR foram costurados através de exten- são de sobreposição. O produto de PCR fundido final fo inserido em vetor p ET~26b. Este vetor foi designado como pET26D-M32-Fd-TF (FIG. 3A).
Quarta Etapa: Construção de um vetor plasmídeo biscistrônico con- tendo ambos, MECA32Fd-articulação-(Gly4Ser)3 ligador-TF e cadeia leve kaca de MECA32 com uma etiqueta His [0095] Nós geramos um fragmento de DNA por PCR usando pET26b-M32-Fd-TF como um molde e o seguinte par de iniciadores: 26b-REJS-F: 5' ACA VTTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGG AGA 3’ (SEQ ID NO: 35) e 26b-Terminação-R: 5' CAA\ATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGG 3' (SEQ ID NO: 36). [0096] Este fragmento de DNA incluiu uma sequênc a de ligação de ribossoma (rbs), VH1 e CH1 de cadeia pesada de MECA32 mAb, região de articulação, sequência ligadora, hTF, e um códon de inter- rupção Este fragmento foi então inserido em sitio de restr ção Xba I de pET26b-M32K. A sequência da inteira inserção foi verificada através de sequenciamento de DNA usando o processo corante - desoxi. Esta construção de plasmídeo foi designada como pET26b MECA32-Fab- TF (FIG. 3B) e transformada em E. colí linhagem SHuffle T7 Express (New England Biolabs Corp.) para expressão de proteína. Os diagra- mas resumindo as etapas de construção deste vetor ce expressão píasmídeo bicistrônico para produção de MECA32-Fab-'“F são mos- trados ém FIGS. 3A e 3B.
Produção de anticorpo monoclonal PLVAP anticamundongo MECA32 coexpressando fator de tecido hu mano (MECA32-Fab~TF> [0097] Para produzir MECA32-Fab-TF, uma colônia (1-2 mm) de cultura recente de E.coli foi inoculada em 4 mL de meio 2xYT conten- do 30 rtiicrogramas/mL de canamicina a 30°C, 230 rpm por toda noite.
Na manhã seguinte, a cultura por toda noite foi inoculada em 400 mL de meio 2xYT contendo 30 microgramas/mL de canamici iá e continu- ada a crescer a 30°C, 250 rpm. Quando a absorbância em 600 nm atingiu I-0,6-0,8, isopropil beta-D-1-tiogalacto piranosídeo (IPTG) foi adicionado para uma concentração final de 0,4 mM para indução de produção de proteína recombinante. Agitação foi continuada a 30°c por cerca de 20 horas. [0098] I As células foram colhidas por centrifugação em 10000xg por 20 minutos em temperatura ambiente e usadas para isolar corpos de inclusão. A pasta de células foi suspensa em 4 mL de Tris/FICI 10 mM, pH 7,5, contendo NaCI 150 mM, MgCI2 1 mM, PMSF 0,17 mg/mL e lisozima de clara de ovo de galinha 2 mg/mL (Sigma). Benzonase (250 unidades; EM Science) foi adicionada e a suspensão foi suave- mente misturada em temperatura ambiente por 1,5 horas então centri- fugada em 12000xg por 15 minutos. A pelota foi ressuspensa em Tris/HCI 10 mM, pH 7,5, contendo EDTA 1 mM e Nonidet P40 3% (2 mL), sonificada por 1 minuto em energia de 50% e centrifugada em 12000 g por 20 minutos. A pelota foi ressuspensa em água, sonificada por 20-30 segundos a em 50% de energia e centrifugada em 12000 x g por 20 minutos. A lavagem com água foi repetida, e a pelota final, altamente enriquecida com os corpos de inclusão, foi suspensa em tampão contendo cloreto de guanidinium 6 M, NaCI 0,5 M, fosfato 20 mM e 2-mercapto etanol 10 mM, pH 8 através de agitação suave em temperatura ambiente por toda noite. A solução foi mantica em tempe- ratura ambiente por toda noite então diluída para uma concentração de proteína de cerca de 1 mg/mL em uréia 6 M/ Tris/HCI 50 mM, pH 8, e dializada a 4°C por toda noite contra 10-20 volumes do mesmo tam- pão. Então, a diálise foi alterada para um tampão contendo uréia 2 M, Tris/HCI 50 mM, NaCí 300 mM, GSH 2,5 mM, GSSG 0 5 mM, pH 8 (tampão folding). Após diálise por 2 dias, o tampão foi substituído com tampão folding recente e a diálise foi continuada por m ais 2 dias. A seguir, tampão de diálise foi trocado para um tampão de uréia 1 M, Tris-HCI 50 mM, NaCI 300 mM, pH 8 e a diálise foi continuada por mais um dia. A diálise então foi realizada no mesmo tampão com con- centrações sequencialmente reduzidas de uréia a partir de uréia 0,8 M por 6 h|oras, uréia 0,56 M por toda a noite, e uréia 0,28 M por 6 horas.
Finalmente, a diálise foi realizada em tampão folding serr uréia e con- tinuada por toda noite. O sobrenadante redobrado foi carregado sobre uma coluna de níquel ácido nitrilo tri-acético (Ni-NTA; GE: Healthcare) e eluídò com imidazol 500 mM em fosfato de sódio 50 mM e NaCI 0,3 ! M em jpH 7,0. MECA32-Fab-TF recombi nante foi ainda purificado através de cromatografia de coluna de filtração em gel HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade (GE Healthcare). Eluatos contendo MECA32- Fab-TF alvo foram analisados por SDS-PAGE e MECA32-Fab-TF reu- nido foi caracterizado por ELISA para confirmar ligação a PLVAP de camundongo. Atividade específica de fator de tecido de MECA32- mAb-TF foi medida usando um ensaio TF cromogênico.
Desenvolvimento de construção de plasmídeo para expressar frag- mento Fab recombinante de anticorpo monoclonal 3LVAP anti- humano CSR02 coexpressando fator de tecido humano solúvel em água (CSR02-Fab-TF) [0099] Nós também produzimos proteína PLVAP CSR02-Fab-TF anti-humana recombinante similar a MECA32-Fab-TF. EEsta proteína foi desenvolvida baseada em PLVAPmAbCESR02 anti-hu mana. A estrutuia desta proteína recombinante foi substancialmeite similar a MECA^ 2-Fab-TF descrita acima, exceto para os diferen es domínios Ab e ausência de etiqueta His no terminus carboxila da cadeia leve kapa. E;tiqueta-His foi eliminada porque etiqueta-His não foi requerida para purificação de CSR02-Fab-TF. CSR02-Fab-TF f:>i purificado usandc cromatografia de coluna de afinidade KappaSelect de cadeia leve kaoa anti-humana (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).
CSR02mAb é um anticorpo monoclonal humanizado contra PLVAP humana. [00100' O procedimento usado para preparar a ccnstrução de plasmídeo para produção de CSR02-Fab-TF foi similar à obtenção da construção de plasmídeo para MECA32-Fab-TF com algumas modifi- cações;. A primeira etapa descrita inicialmente para clonagem de cDNAs) para obtenção de sequências de DNA de extrerriidades-5’ de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo foi pulada, porque sequên- cias de cDNA para cadeia pesada e cadeia leve de CSRG2mAb já são conhecidas. Por isso, somente três etapas são requeridas para prepa- ração de construção de expressão de CSR02-Fa-TF. Estas três eta- pas são descritas abaixo.
Primeina Etapa; Inserção de cDNA de cadeia leve de CSR02mAb em vetor p asmídeo pET26b [00101| RNA total de linha de células BS0 produzindo CSR02mAb foi transcrito reverso para cDNA usando oligo-dT como inisiador. cDNA
de caoeía leve kapa de CSR02 foi gerado por PCR use ndo o cDNA iniciado oligo-dT como molde e o par de iniciadores mostr ado abaixo;
Iniciador para frente CSR02-VK3F-26b F Nde I: 5' TAT 3GATGTTGTGATGACCCAATCTCCA 3' (SEQ ID IslO; 37) [00102j Iniciador reverso Kappa-R-26b-Not I: 5’ GGCCCGCTAA- CACTCTCCCCTGTTG 3’ (SEQ ID NO: 38). [00103] O fragmento de DNA purificado por PCR pars cadeia leve de CSR02mAb foi então inserido nos sítios Nde I e Not I de vetor plasmídeo pET26b para gerar pET26b-cVK3.
Segunda Etapa:Construção de um vetor plasmídeo pET26b inserido com cDNA para expressão de um polipeptídeo de fusão compreendido por VH1, CH1 e região de articulação de CSR02mAb plis (Gly4Ser)3, sequência ligadora e domínio extracelular de fator de teoido humano (AA.33-251) (hTF) [00104] Este plasmídeo foi construído através de PCR usando cDNA preparado a partir de linha de células NS0 e cDNA de fator de tecido humano clonado como moldes. Os seguintes pares de iniciado- res foram usados para PCR: [00105] I) Para iniciador para região VH1-CH1-articulação de cadeia pesada de CSR02 mAb e sequência ligadora: [00106] Iniciador para frente VH5-prD26b-Ndel-F: 5' TATGCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGG 3' (SEQ ID NO: 39) e [00107] Articulação ligador R: 5' AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGGGC ATGATGG GCATGGGGGACC 3' (SEQ ID NO: 40) [00108] II) Par iniciador para sequência ligadora-hTF-plus sítio de restrição para inserção: hTF ligador F: 5' GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCAGGCACTACA AATACTGTGG 3’ (SEQ ID NO: 41) hTF R-Not I: 5' GGCCGCTATTCTCTGAATTCCCCTTTCTCCTGG 3’ (SEQ ID NO: 42). [00109] Os fragmentos de PCR gerados a partir de duas reações de PCR descritas acima foram ainda fundidos e amplificados através de extensão de sobreposição. O cDNA fundido foi inserido no vetor plas- mídeo pET26b que foi designado como pET26b-VH5-Fd-'“F.
J
Terceira Etapa: Construção de um vetor plasmídeo bicistrônico con- tendo cDNAs para ambos CSR02mAb-articulação-(Gly4í>er)3~ligador- TF e cadeia leve kapa de CSR02mAb [00110] Nós geramos um fragmento de DNA através de PCR usan- do pET-26b-VH5-Fd-TF como molde e o seguinte par de iriiciadores: 26b-RB'S-F: 5' ACAATTCCCCTCTAGATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGA 3' (SEQ ID NO: 43) e 26b-Terminação-R: 5' CAAAATTATTTCTAGATTTCGGGCTTTGTTAGCAGCC GG 3' (SEQ ID NO: 44). [00111] O fragmento de DNA amplificado incluiu um sítio de ligação de ribossoma (rbs); VFÍ1, CH1 e sequência de articulação de cadeia pesada de CSR02; sequência ligadora; fator de tecido humano solúvel; e um códon de interrupção. Este fragmento de DNA foi irserido no sí- tio Xba de vetor pET26b-cVK3 para derivar um novo vetor plasmídeo bicistrômco designado como pET26b CSR02-Fab-TF (FIG. 4). Este plasmídeo foi usado para expressar cadeia leve kapa e cadeia pesada de fusão sob o controle de um único promotor. A sequêrcia da inser- ção inteira foi verificada por sequenciamento de DNA usando o pro- | cesso de corante - desoxi.
Produção de fragmento Fab recombinante de anticorpc monoclonal PLVAP anti-humano CSR02 coexpressando fator de tecido solúvel em água (ÇSR02-Fab-TF) j [00112j Expressão de proteína CSR02-Fab-TF recombinante. i Transformação de Escherichi coli Shuffie T7 Express (New England Biolabs) foi realizada através de incubação de células competentes com DNA plasmídeo pET-26b CSR02-Fab-TF sobre gele - por 5 minu- tos, aquecendo exatamente 30 segundos em um banhD de água a 42°C e seguido por colocação sobre gelo por 2 minutos. Antes de re- | vestimento sobre meio seletivo, os transformantes forarr incubados a 30°C enquanto agitando em 250 rpm com meio SOC (extrato de leve- dura 0,5%; Triptona 2%; NaCI 10 mM; KCI 2,5 mM; IVgCl2 10 mM;
MgSO, 10 mM; glicose 20 mM) por 60 minutos. Expressão de CSR02- Fab-ΤΓ foi induzida com 0,05 mM de isopropil-beta-D-tiogalacto pira- nosídeD por 16 horas a 3o0C ou 37°C. Seguindo a indução, as células bacterianas foram submetidas a lise em 1xPBS com Tvreen 80 0,2% na presença de lisozima e Benzonase Nuclease em temperatura am- biente por 2 horas, Lisado de células foi colhido por cen rifugação em 10000 rpm por 30 minutos a 4°C. Sobrenadante foi cole: ado e filtrado para isolar a fração solúvel. [00112] Purificação de CSR02-Fab-Tf através de KappaSelect e croma ografia de coluna Capto AdhereMmultimodal. Colma KappaSe- lect (1 ml_) foi equilibrada com solução salina tamponad a com fosfato (PBS), pH 7,4 (tampão fosfato 0,01 M, KCI 0,0027 M, Islacl 0,14 M).
Lisados de E. coli contendo CSR02-Fab-TF foi carregado em uma taxa de flu>o de 1 mL / minuto. Após aplicação de amostras, a coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio até OD280 ter caído aara linha ba- se. O 'esto de proteínas ligadas foi eluído com tampão glicina 0,1 M, pH 2,7 contendo sucrose 0,25 Μ. O eluado foi imediatamente ajustado para pH fisiológico através de adição de 50 microlitros de tampão Tris- base 1 M, pH 9,0 por 1 mL de eluado. [0011 ^ ] CSR02-Fab-TF eluído de coluna KappaSelec : foi ainda pu- rificado com uma coluna Capto Adhere (5 mL) pré-equilibrada com tampãD Tris 20 mM, pH 7,5. A amostra de CSR02-Fab-TF eluída de colune KappaSelect foi diluída 50 vezes com tampão Tris 20 mM, pH 7,5 e seguidopor carga d mesma sobre uma coluna Capto Adhere em uma taxa de fluxo de 1 mL/Minuto. Após aplicação da amostra, a colu- na foi avada com tampão de equilíbrio até OD280 ter caído para iinha base. A proteína CSR02-Fab-TF ligada foi então eluída com tampão Tris 20 mM, pH 7,5 contendo NaCI 200 mM.
Produção de proteínas PLVAP de camundongo e humana recombi- nante (hPLVAP e mPLVAP) [00115] Produção de (hPLVAP). Plasmídeo pGEM-T Easy- hPLV4P5i-442 foi gerado através de inserção de um fragmento de PCR
I representando a PLVAP truncada (resíduos de aminoác dos 51 a 442 compreendendo o domínio extracelular de PLVAP de carnundongo) no pGEMj-T Easy Vector (Promega). Este fragmento de PCR foi gerado a partir de um cione de cDNA de PLVAP humana (NM_031310) (OriGe- ne, Rcjckville, MD) através de PCR usando o seguinte par de iniciado- res: [00110] 5’-lCATATG|AACGTGCACGTGAGCACAGAGTCC-3’ (SEQ ID NO: 45) e S^SGGATCClTGAGCATATCCCTGCATCCTCC-S’ (SEQ ID NO: 46) Para construção de plasmídeo pET-15b-hPLVAP51_442 para produção de proteína PLVAP recombinante, um fragmento de cDNA codificando os resíduos de aminoácidos 51 a 442 de PLVAP com sequências de reconhecimento Ndel/Bam Hl (sequências em caixas) nas extremida- des foi excisado de pGEM-T Easy-hPLVAP51^42 e inserido em pET- 15b (Novagen). A construção de expressão descrita acina foi verifica- da pop sequenciamento de DNA e transformada para Escherichia coli (Rosetta-gami2(DE3)pLysS) (EMD Millipore Corp.). [00117] Uma proteína de fusão hPLVAP marcada - His foi produzi- da e purificada como descrito abaixo. Uma clAonia (1-2 mm) de E. coli transformada a partir de uma cultura recente foi inoculada em 4 mL de meio TB contendo 100 microgramas/mL de ampicilina, 34 microgra- mas / mL cloranfenicol, 12,5 microgramas/mL de tetraciclina a 37°C, 230 rpm por toda noite. A cultura de noite inteira foi inoculada em 400 mL de meio TB contendo 100 microgramas/mL de ampiicilina, 34 mi- crogramas/mL de cloranfenical, 12,5 microgramas/mL de; tetraciclina e continuada a crescer a 37°C, 250 rpm. Quando a absorbância a 600 nm atingiu cerca de 0,6-0,8, isopropil beta-D-1-tiogalacto piranosídeo (IPTG) foi adicionado para uma concentração finai de 1,66 mM para induzir produção de proteína. Agitação foi continuada a 30°C por cerca de 20 horas. Células foram colhidas por centrifugação a 10000 g por 30 minutos a 4°C. A pelota de células foi ressuspensa em 12 mL de tampão de equilíbrio - lavagem (fosfato de sódio 50 mM, NaCL 300 mM, pH 7, ímidazol 10 mM) suplementado com uréia 8 M e estocada a -20°C por pelo menos 2 horas. A amostra descongelada foi sonificada por 10 segundos, com uma pausa de 30 segundos entre cada explo- são para reduzir a viscosidade até tornar-se translúcida. A suspensão de céliilas foi centrifugada em 10 000 - 12 OOOxg por 20 minutos a 4°C i para pelotizar qualquer material insolúvel. O sobrenadante da etapa prévia aplicado a coluna de resina TALON (Clontech) que: foi equilibra- da corp 10 volumes de coluna de tampão de equilíbrio - lavagem su- plementado com uréia 8 M. Após lavagem de coluna com 10-20 vo- lumes de coluna de tampão de equilíbrio — lavagem 1X, proteína PLVAFf humana marcada com poli histidina, recombinante foi eluida com 5 volumes de coluna de tampão de eluição (fosfate» de sódio 50 mM, NaCI 300 mM, pH 7, imidazol 500 mM) contendo uréia 6 M. Prote- ína reÇombinante purificada no eluato foi dialisada contra tampão de equilíbrio / lavagem 1X contendo uréia 3 M a 4°C por pelo menos 4 horas, então tampão foi trocado para tampão de equilíbrio - lavagem 1X contendo uréia 1 M, e diálise a 4°C por pelo menos 4 horas. Con- centração de proteína foi determinada com ensaio de ligação de co- rante Bradford (Bto-Rad, Hercules, CA). A proteína foi então digerida com 11 unidade de trombina biotinilada (Novagen) para cada mg da proteína PLVAP recombinante a 23°C por 16 horas para remoção de marcador poli histidina. Trombina biotinilada foi removida da incubação atravéè de streptavidina — agarose de fase sólida. A resultante PLVAP(hPLVAP) humana solúvel em água, recombiname, foi dialisada contra tampão de equilíbrio - lavagem 1X (fosfato de sódio 50 mM, NaCI 300 mM, pH 7) sem uréia. A concentração de proteína foi deter- minada e a proteína foi analisada por SDS-PAGE para pureza (FIG. 5). [00118] Produção de ,PLVAP (PLVAP de camundongo). Plasmídeo pGEM-T Easy-mPLVAP48_438 foi gerado através de inserção de um fra- gmerto de PCR representando a PLVAP truncada (resíduos de ami- noácidos 48 a 438 compreendendo o domínio extracelular de PLVAP de cs mundongo) no pGEM-T Easy Vector (Promega Corp.). Este fra- gmerto de PCR foi preparado de um clone de cDNA de PLVAP de camundongo (Invitrogen, Life Technologies Corp.) através de PCR usando o seguinte par de iniciadores: mPLVAP CDS Ndel F: 5’CATATGTATGGCAATGTGCACGCCACC3’ (SEQ ID NO: 47) e mPLVAP Interrupção Xho I R: 5’CT(ÍGAGATCCACAGGTGGGCGATTCTGGC3’ (SEQ ID NO: 48). [00119] A seguir, um fragmento de cDNA codificando os resíduos de aninoácidos 48 a 437 de PLVAP contendo as sequências de reco- nhecimento Ndel e Xhol em cada extremidade foi excisado de pGEM- T-Easy-mPLVP48_438 e inserido em pET-15b (Novagen-EMD Millipore, Darmstadt, Germany) para expressão de proteína. Após verificação através de sequenciamento de DNA, esta construção do expressão foi transformada em Escherichia coli (Rosetta-gami2(DE3)pLysS). Ex- pressão de proteína mPLVAP de fusão marcada com his em Escheri- chia coli Rosetta-gami2(DE3)pLysS foi induzida com isapropil-beta-D- tiogalacto piranosídeo 1 mM por 16 horas a 30°C. Seguindo a indução, as células bacterianas foram submetidas a lise por sonificação em tampão de equilíbrio (fosfato de sódio 50 mM, NaCI 300 mM, pH 7) suplementado com uréia 8 M e separadas em frações solúvel e insolú- vel at-avés de centrifugação em 15 652 x g por 30 minutos a 4°C. Para purificar] a proteína His-PLVAP^-^e, a fração solúvel foi carregada so- bre umà resina TALON Metal Affinity (Clontech, Paio Alio, CA) e foi eluída c{om tampão de eluição (fosfato de sódio 50 mM, NaCI 300 mM, pH 7, irfiidazol 500 mM). A resultante proteína PLVAP48_4a8 de camun- dongo r)o eluato foi dialisada contra PBS. Análise SDS-PAGE da His- í mPLVAl3 purificada é mostrada na FIG. 5.
Estudos de ligação de CSR02-Fab-TF e MECA32-Fab~TF a respecti- vas PLVAP humana e de camundongo através de ELISA [00120] De modo a se ter certeza de que proteínas antiPLVAP-Fab- TF recqmbinantes podem se ligar a proteína PLVAP humana ou de camundongo, um ensaio ELISA foi desenvolvido e usado. Primeiro, cada cavidade de uma placa ELISA foi revestida com 50 nicrolitros de proteína PLVAP recombinante humana ou de camundongo 2,5 micro- gramas/mL em PBS-azida (0,02%) por toda noite a 4°C. A seguir, os ensaios; foram realizados em temperatura ambiente. Após três lava- gens dè cada cavidade com 150 microlitros de tampão de lavagem (PBS contendo 0,2% Tween-20). Cada cavidade foi bloqueada com 150 miçrolitros de tampão de bloqueio (PBS contendo 2% BSA e 0,05% Tween-20) por 30 minutos. Após três lavagens, 50 microlitros de PLVAP CSR02-Fab-Tf anti-humana ou PLVAP MEC A32-Fab-TF anticamjundongo são adicionados a cada cavidade em diferentes con- centrações em duplicatas. Todas as cavidades foram incubadas por 45 minutos e lavadas três vezes. Cavidade lavada foi então incubada com 50 micrplitros de anticorpo TF anti-humano biotinilado (R&D Systems Corp.) em diluições de 1:500 no tampão de bloqueio por 45 minutos.
Após três lavagens, cada cavidade foi incubada com conjugado de streptaVidina - fosfatase alcalina diluído 5000x por 30 m nutos. Cada cavidade foi então incubada com 100 microlitros de substr ato fosfatase alcalina por 60 minutos e absorbância de cada cavidade foi medida em 405 nm em um leitor de microplaca. [00121] O ensaio também foi modificado em um ensaio de iigação competitiva. Para o ensaio de ligação competitiva, crescer tes concen- trações de anticorpos antiPLVAP ou Fab-TF foram incubados com uma quantidade ótima de anticorpo monoclonal antiPLVA3 biotinilado para competir por ligação para PLVAP. Após incubação e lavagem, anticorpo biotinilado ligado a PLVAP foi quantificado com conjugado de streptavidina - fosfatase alcalina e substrato cromogênico.
Ensaio cromogênico para atividade de fatore de tecido humano [00122] As atividades TF de CSR02-Fab-TF, MECAí 2-Fab-TF e ! MECA32mAb reticulado com TF humano foram medidas usando um | ensaio cromogênico. Este ensaio é baseado em ligação de TF a fator Vila e a habilidade de complexo TF/FVIIa para ativar fator X (FX). A atividade TF foi quantificada indiretamente através de quantidade de FXa produzida. FXa produzido foi medido cineticamentei de acordo com a liberação de para-nitro amilina (pNA) a partir de substrato peptí- deo cromogênico específico FXa como um aumento de absorbância em 405 nm. A atividade de TF foi determinada contra um padrão TF recombinante solúvel em água comercial (R&D Systems Corp.). O en- saio de atividade de TF cromogênico foi baseado no procedimento re- portado por Phillipp et al. Ver, Philipp J, Dienst A, Unruh Maike, et ai “Solublé tissue fator induces coagulation on tumor endo elial cells in vivo if çoadministered with low-doselipopolysaccharides” Arterioscler.
Thromb Vasc Bio.: 23:905-910 (2003).
Modelo de xenoenxerto HCC Hep3B em camundongos SCID [00123] Hep3B é uma linha de células HCC humanas De modo a demonstrar a eficácia terapêutica de antiPLVAPFab-TF, rós estabele- cemos um modelo de xenoenxerto HEP3B em camundongos BALB/cC.B-17SCID. Xenoenxerto HCC Hep3B foi estabslecido atra- vés de injeção subcutânea de 4 milhões de células Hep3B na coxa in- terna superior direita de um C.B-17 SCID macho, de 5 semanas de idade sob anestesia geral com inalação de isoflurano. As células foram suspensas em 60 microlitros de BD Mtrigel 75% (BD Bioscience Corp.) dissolvico em meio eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies Corp.) sem soro. Injeção foi realizada usando uma se- ringa de insulina de medida 29. [00124] Células Hep3 usadas para injeção foram cu tivadas em DMEM contendo soro bovino fetal 10%, GLUTA-MAX 1%, antibióticos - antimiaóticos 1%, e HEPES 1%. Todos os reagentes foram adquiri- dos de Jfe Technologies. As células para injeção foram colhidas que elas atir giram 80% de confluência. As células foram retiradas do fras- co de cultura usando solução de tripsina - EDTA de Life Technologies de acorio com as instruções do fabricante, e células de [umor foram lavadas uma vez com DMEM antes de suspensão em BD Mtrigel 75% para injeção. Após injeção, camundongos foram seguidos regularmen- te para crescimento de xenoenxerto de tumor. Normalmente, demora cinco a seis semanas para tumores tornarem-se prontos para o estu- do.
Infusão de antiPLVAP Fab-TF em artéria de alimentação ds tumor [00125] Para tratamento de xenoenxerto de tumor de Flep3B com antiPLN/AP MECA32-Fab-TF, um camundongo transportando xenoen- xerto de tumor Hep3B foi anestesiado com inalação ce isoflurano usando uma máquina de anestesia MATRIX. O camundongo foi colo- cado e n posição supino sob um microscópio de dissecação. O pelo sobre a área inguinal direita foi removido com um removec or de cabelo Nair (Cnurch & Dwight Co.) um dia antes de infusão. Após limpeza de pele ccm álcool 75%, foi feita uma incisão de 0,5 cm na área inguinal direita acima de tumor. O ferimento foi aprofundado para expor artéria e veia emoral direita. Artéria femoral direita foi então laçada com um fio de náilon 6-0. A artéria foi suavemente retraída proximalmente.
Uma aleriotomia foi feita com uma micro-tesoura distai para a retra- ção e uma agulha de medida 33 fina foi inserida no ladc distai. ME- CA32-Fab-TF ou anticorpo controle foi infundido lentamente em uma taxa de cerca de 40 microlitros por minuto. Injeção foi realizada sob observação próxima para assegurar que não houve vazamento. Após infusão, a agulha foi retirada. O sítio de arteriotomia foi selado com Histoacryl (TissueSeal, AnnHarbor, Ml). O náilon para retração foi reti- rado. Após confirmação de adequada hemóstase, o ferimento de inci- são foi fechado com sutura contínua.
Sonografía 3D e power Doppler para medição de volume de tumor e fluxo de sangue [00126] ; Vevo 2100 High-Resolution ímaging System (Vsual Sonics, Inc., To:ronto, Canada) foi usado para aquisição de imagem 3D de tu- mor de [acordo com as instruções do fabricante. Três dimensões per- pendiculares do tumor foram determinadas através de tomada de se- guintes; medidas. Duas dimensões perpendiculares s obre a área de maior sêção transversa ao longo de tumor eixos X e Y foram primeiro medidaç. A maior dimensão ao longo de eixo Z perpendicular a dimen- sões X|e Y foi então determinada usando o suporte lógico provido pelo vendedor. Volume de tumor foi determinado usando a seg jinte fórmula para objeto elíptico: Volume = tt/6 x comprimento x íarçura x altura.
Imagens de fluxo de sangue de tumor foram capturadas usando 3D power [Doppler de acordo com o manual para um Vevo 2100 High- Resolution Imaging System.
Medição de afinidades de ligação de MECA32-Fab-TF e CSR02-Fab- yp [00127] O ensaio usado para determinar afinidade de ligação entre antiPLyAP-Fab-TF e PLVAP alvo foi baseado em um ensaio de ativi- dade dje TF cromogênica como descrito na seção anterior. Em resumo, cada cavidade de uma placa ELISA foi revestida com 2,5 microgra- mas/mL de PLVAP de camundongo ou humana recombinante solúvel j em água por toda noite. Após lavagens e bloqueio como descrito para o ELISA para estudar ligação de CSR02-Fab-TF e MECA32-Fab-TF a PLVAP cavidades revestidas com proteína PLVAP humaia ou de ca- mundongo foram incubadas com 50 microlitros de concentrações crescentes de CSR02-Fab-TF ou MECA32-Fab-TF em 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, e 10 microlitros/mL em duplicatas. Após incubação por 3 ho- ras em temperatura ambiente, cavidades foram lavadas e ensaiadas para quantidades de atividade TF ligada em cavidades usando uma curva padrão TF como descrito na seção anterior para o ensaio de ati- vidade TF cromogênica. A concentração de CSR02-Fab-TF ou ME- CA32-Fab-TF adicionada em cada cavidade foi conhecida e a concen- tração de CSR02-Fab-TF ou MECA32-Fab-TF em cada cavidade pode ser caipulada a partir dos resultados de ensaio. Estes números foram então analisados usando análise de gráfico Scatchard pa a determinar a afinidade de ligação de CSR02-Fab-TF ou MECA32-Fab-TF. Ver, por exemplo, Scatchard G. “The Attractions of proteins fcr small mole- cules and ions” Ann NY Acad Sei. 51:660-672 (1949).
Manchamento imuno-histoquímico (IHC) de PLVAP em xenoenxerto de tumor HEP3B usando anticorpos monoclonais antiPLV^P MECA32 [00128] Para estudar expressão de PLVAP em xenoenxerto Flep3B de camundongos, seções de blocos de tecidos em pa afina fixados com formalina foram processados para manchamento i muno - histo- químico através de anticorpos monoclonais antiPLVAP. Após despara- finização e reidratação de seções de tecido seguindo procedimentos de rotina, lâminas com seções de tecido em um carreador foram colo- cadas em um bécher e imersas em Target Retrieval Solution (Dako, Inc. Garpinteria, CA). O bécher foi colocado em ume autoclave e aquecido a 121°C por 10 minutos. Após resfriamento, as lâminas fo- ram transferidas em água destilada. A seção sobre cada lâmina foi en- tão trátada com 200-400 microlitros de peróxido de t idrogênio em Ventana iView DAB Detection kit (Ventana Medicai Systems, Inc.) para resfriar rapidamente peroxidase endógena. Após rinsagem de lâminas com sclução salina tamponada com Tris (TBS) (Dako), Seções foram incubadas com 5 microgramas de anticorpos monoclonas antiPLVAP MECA32 diluídos em TBS contendo albumina de soro bovino 0,1% (TBS-ESA) com a 37°C por 60 minutos. Após lavagen através de subme são de lâminas em tampões TBS por 5 minutos três vezes, as seções foram incubadas com um anticorpo secundário biotínilado (por exemp o, IgG antirrato cabra biotinilado para MECA32rrAb) em uma diluição recomendada pelo vendedor em temperatura armiente por 15 minutos. As seções sobre lâminas foram lavadas simila mente como descrito acima. As seções sobre lâminas foram incubadas com subs- tratos DAB recentemente preparados no kit por 30 minutos. As lâminas foram l insadas com água destilada umas poucas vezes. Após contra manch amento com solução de hematoxilina de Gill por 15 segundos, as lâminas foram rinsadas com TBS seguido com ágja destilada.
Após secagem a ar das seções, as mesmas foram cober as com meio Permount e tampas de correr.
Resultados Expressão de PLVAP em xenoenxerto de HEP3B e HCC [00129 Nosso estudo iniciai mostrou que PLVAP é dife renciaimente expressa sobre células endoteliais de HCC e não em céUlas endoteli- ais vasculares de tecido de fígado não tumor. A express ão diferencial de PLVAP ofereceu uma oportunidade para alvejar HCC Dara propósi- to terapêutico. Nós concebemos uma nova abordagem de uso de anti- corpo ínonoclonai antiPLVAP ou seu fragmento Fab para servir como um carreador para uma proteína de fator de tecido disparando coagu- lação de sangue coexpresso para o tratamento de HCC. Infusão de um tal agente terapêutico em uma artéria de alimentação de tumor foi acreditada resultar em ligação deste anticorpo terapêutico ou seu fra- gmentcb Fab a células endoteliais vasculares de HCC, disparar forma- ção de coágulo de sangue em vasos de sangue de tumor e conduzir a necrose isquêmica de tumor. [00130] Para demonstrar e exequibilidade desta abordagem, nós estabe ecemos um modelo de xenoenxerto HCC em camundongos SCID usando linha de células HEP3B HCC. Nós então determinamos se células endoteliais vasculares cresceram em PLVAP ce camundon- go expressa por xenoenxerto de tumor HEP3B através de mancha- mento j imuno-histoquímico (IHC) usando MECA32 anticamundongo PLVAPmAb. Como mostrado na FIG. 6B, células endoteliais vascula- res de (xenoenxerto de tumor HEP3B em camundongos SCID realmen- te expressaram PLVAP como HCC humano. Por isso, xenoenxerto de HEP3B pode ser usado para o estudo para demonstrar efeito antitu- mor de antiPLVAP mAb ou seu fragmento Fab conjugadc com fator de tecido humano.
Efeito de MECA32mAb conjugada com TF solúvel humano sobre xe- noenxerto de HEP3B [00131ÍJ Primeiro, nós tratamos camundongos SCID carreando tu- mores de xenoenxerto HEP3B com MECA32mAb quimicamente con- jugada! com fator de tecido humano solúvel em água ‘ecombinante (MECÁ32-TF). TF humano foi usado, por que TF humane é efetivo pa- ra disparar coagulação de sangue em ambos humano e camundongo e cDNA de TF humano foi comercialmente disponível. Cada camun- dongo (transportando tumor foi tratado por infusão de 24 microgramas de MECA32-TF (grupo de tratamento) ou 20 microgramas de ME- CA32mAb (grupo controle) em 100 microlitros de solução salina tam- ponada com fosfato (PBS) em uma artéria femoral direfe alimentando tumor sob microscópio de dissecção. A quantidade leve mente menor de MEbA32mAb (20 microgramas) foi usada para ajustar para maior peso molecular de MECA32-TF. 3D power Doppler foi usado para ava- liar fluxp de sangue em tumor 48 horas antes e após tratamento. Os I 1 resultados mostraram significante redução de sinais de fuxo de san- gue intratumor após tratamento com MECA32-TF no grupo de trata- mento e não no grupo controle (FIG. 7). Acompanhamento de cresci- mento de tumor mostrou significante supressão de cresci mento de tu- mor no grupo de tratamento com MECA32-TF e não no grupo controle (FIG. 8). Os resultados deste estudo suportam que anticorpo monocio- nal antiPLVAP conjugado com TF humano foi efetivo para tratamento de xenoenxertos de HCC.
Desenvolvimento de caracterização de MECA32-Fab-TF [00132] Para conjugação química de TF a MECA32m^b, foi difícil controlar consistentemente e reproduzivelmente os números e sítios de moléculas de proteína TF retículadas para MECA32mAb. MECA32- TF preparada por reticulação química não rende produto homogêneo. O alto peso molecular de conjugado MECA32-TF (aproximadamente 170 kDá) também conduz a longa meia-vida de circulação com au- mentadja chance de causar efeitos colaterais adversos. [00133] ) De modo a se ter um composto biológico terapêutico ho- mogêneo estruturalmente bem definido com menor meia-vida para li- mitar efeitos colaterais fora de alvo, nós desenvolvemos uma nova proteínà recombinante que consistiu em uma porção Fab de anti- PLVAPmAb e domínio extracelular de fator de tecido hurrano ligado à extremidade carboxila do domínio constante de cadeia pecada 1. Nós então produzimos proteína recombinante antimurina PLVAPMECA32- Fab-TFí (MECA32-Fab-TF). Um diagrama mostrando a estrutura desta proteína recombinante é mostrado em FIG. 9. [00134] MECA32-Fab-TF purificada foi usada para CDmpetir com MECA3>2mAb biotinilada para ligação a PLVAP de camundongo. Estes resultados indicaram que MECA32-Fab-TF realmente reteve sua habi- lidade para ligar a PLVAP (FIG. 10). Análise Scatchard de: seis bateia- das diferentes de MECA32-Fab-TF também mostraram alta afinidade de ligação para PLVAP de camundongo com Kd de 5,7+/-1,4x10~8M. O TF ligado no terminus carboxi de MECA32Fd também fcii funcional e pode irteragir com fator Vila para ativar fator X. A atividade específica de fato· de tecido medida foi 90+/-22 microgramas (n = 6) em cada mi- ligrama de MECA32-Fab-TF.
Efeito ie MECA32-Fab-TF sobre xenoenxerto de tumor HEP3B em camundongo SCID [00135 Para demonstrar a eficácia terapêutica de MECA32-Fab- TF, nós primeiro conduzimos dois estudos de resposta de dose. Para ambos estudos, MECA32-Fab-TF foi infundida em uma a téria femoral de aiirrentação de tumor. Setenta e duas horas após tr atamento, os camundongos tratados foram sacrificados e tumores foam colhidos para exame histológico. Para o primeiro estudo, três diferentes doses de ME 3A32-Fab-TF (3 microgramas, 6 microgramas e 12 microgra- mas) foram usadas para tratar camundongos transportando tumores e o grupo controle foi tratado com 12 microgramas de ant corpo mono- clonal MECA32 sem fator de tecido. Existiram três camur dongos para cada cose. Para o segundo estudo, as doses de MEOA32-Fab-TF usadas foram 2,5 microgramas, 5 microgramas e 10 microgramas.
Existiram dois camundongos em cada dose. Os resultados destes dois estudos foram resumidos e mostrados em FIGS. 11 e 12. Os resulta- dos destes estudos revelaram que tumores dos camundongos tratados com M ECA32-Fab-TF desenvolveram massiva necrose isquêmica em todas éiS doses. Entretanto, a dose de 10 microgramas ou maior ren- deu resultados mais consistentes. Nenhuma ou mínima necrose de tumor 1oi notada nos grupos controles. Os resultados destes estudos demon straram que antiPLVAP-Fab-TF foi bem potente e pode induzir significante necrose isquêmica de tumor tão baixa como 2,5 microgra- mas per camundongo dentro de 72 horas.
Efeito de anti-mPLVAPMECA32-Fab-TF sobre histoiogia de xertoen- xertos de tumor HEP3B em diferentes pontos de tempo após infusão [00136] Os estudos descritos acima indicaram que turror desenvol- veu franca necrose isquêmica 72 horas após tratamento De modo a aprender como necrose foi induzida após tratamento com anti- mPLVAPFab coexpressando TF, nós infundimos MECA32-Fab~TF em artéria plimentando tumor e colhemos tumores HEP3B em 2 horas, 4 horas, 2.A horas, 48 horas e 72 horas após infusão de 10 microgramas de ME0A32-Fab-TF. Existiram dois camundongos transportando tu- mor em cada ponto de tempo. Dois camundongos sem tratamento também foram sacrificados no mesmo dia deste experimento como controlés de linha base de 0 hora. [00137] Como mostrado na FIG. 13A, nossos resultados revelaram que trombos de fibrina em vasos sanguíneos de tumor podemser en- contrados em 2 horas após tratamento. O número de vascs de sangue contendo trombos de fibrina tornou-se mais evidente em 4 horas e 24 horas após tratamento. Células de tumor começaram a se separar umas das outras com espaço limpo aumentado em 4 horas e esta mu- dança tornou-se mais aparente em 24 horas (FIG. 13B). Franca necro- se isquêmica com perda de manchamento nuclear foi notada em 48 horas Ppós tratamento e tornou-se mais pronunciada em 72 horas (FIGS. |13A e 13B). Nenhum trombo de fibrina foi notado em vasos sanguíneos de tumor antes de tratamento (0 hora) (FIG. ' 3A). Estudo de powbr Doppler também revelou término de fluxo de sangue em principais vasos sanguíneos de tumor em 2 horas após infusão e du- rou para 72 horas (FIG. 14). Estas verificações suportam que anti- PLVAPnFab-TF realmente pode se ligar a PLVAP de células endoteli- ais vasculares de tumor, induziu formação de coágulo de sangue em vasos spnguíneos de tumor, criou bloqueio de fluxo de sangue e cau- sou necrose de tumor.
Efeito de antiPLVAP MECA32-Fab-TF sobre crescimento de xenoen- xertos cte tumor HEP3B [00138] A seguir, nós estudamos o efeito terapêutico de tratamento com antiPLVAP Fab-TF sobre crescimento de tumor. Dos estudos di- í ferented foram conduzidos. O pri meiro estudo foi para seguir cresci- mento |de tumor por 25 dias após tratamento. O estudo foi terminado I 25 dias após tratamento, porque os grandes tamanhos de tumores no grupo Controle necessitaram a interrupção do estudo. Tamanhos de tumore|s foram seguidos usando sonografia de 3D. Os resultados re- sumidos em FIGS. 15, 16A e 16B mostraram que infusão simples de 5 microgramas ou 10 microgramas de MECA32-Fab-TF efetivamente suprimju o crescimento de tumor mas não por 10 microgramas de anti- corpos! MECA32 controle sem TF. [00139] Para o segundo estudo, camundongos SCID transportando xenoenxertos de tumor HEP3B foram tratados com infusão intra- arterial de 10 microgramas de MECA32-Fab-TF (n = 4) ou 10 micro- gramas de anticorpo monoclonal MECA32 (n = 2). Crescimento de tu- mor foi seguido com sonografia 3D. Quando tumores ΗΙΞΡ3Β cresce- ram para aproximadamente 2000 milímetros cúbico, camundongos transpcprtando tumores sofreram eutanásia. Este estudo nos permitiu avaliar!o retardo de crescimento de tumor no grupo de tratamento. Os resultados resumidos na FIG. 17 mostraram que houve un significante retardo de crescimento de tumor após infusão simples de 10 micro- gramas de MECA32-Fab-TF na artéria de alimentação cie tumor. De- morou (mais 42dias para o tumor no grupo de tratamento crescer para 1600 rpm3 comparando aos camundongos controles. Os dias médios para crescimento de tumores para 1600 mm3 entre os grupos controle e tratamento foram 9,8 +/- 3,0 dias e 51,8 +/- 3,2 dias, respectiva mente (FIG. 17). [00140j] Em suma, os resultados destes dois estudos diferentes ain- da suportaram que infusão de antiPLVAP-Fab-TF em aléria de ali- mentação de tumor foi efetiva para induzir necrose de tumor e contro- lar cresoimento de tumor.
Efeito ce administração sistêmica de antiPLVAP-Fab-Tf sobre cresci- mento ( e tumor [00141] De modo a saber se administração sistêmica 1e MECA32- Fab-TF através de uma veia periférica também pode ob:er o mesmo efeito terapêutico ou não, nós injetamos 10 microgramas ou 20 micro- gramas de MECA32-Fab-TF em uma veia de cauda de camundongos SCID Iransportando xenoenxerto de tumor HEP3B e monitoramos crescimento de tumor após injeção. Camundongos controles foram injetados com solução salina tamponada com fosfato. Eixistiram três camundongos em cada grupo de tratamento. Os resultados resumidos na FIG. 17 mostraram que não há efeito estatisticamente significante sobre volume de tumor quando MECA32-Fab-TF foi administrada atra- vés de uma veia de cauda. Por isso, infusão de antiPLVA3 MECAA32- Fab-TF em uma artéria alimentando tumor foi necessária para induzir necrose de tumor e obter efeito terapêutico. É possível que adminis- tração sistêmica de MECA32-Fab-TF resultou em diluição da ME- CA32- :ab-TF injetada e ligação de MECA32-Fab-TF a 3I_VAP sobre céluls sndoteliais vasculares de outros órgãos (por exemplo, pulmões, rins e érgãos gastrointestinais) antes de atingir vasos sanguíneos de tumor.
Desen /olvimento e caracterização de PLVAPFab-TF anti· humana [00142] De modo a saber se um agente terapêutico similar pode ser desenvolvido contra PLVAP humana, um anticorpo monoclonal PLVAP anti-hi mano humanizado contra um epítopo antigênico residindo na sequê ícia de aminoácidos PPAGGIPVAPSS no terminus carboxiia de PLVAP humana foi usado. Este anticorpo monoclonal PLVAP anti- humario humanizado foi previamente desenvolvido e é cjescrito na pu- blicação; de pedido de patente N° US20110262349 A1. Este conjuga- do PLVAP-Fab-TF anti-humano foi designado como CSR02-Fab-TF (FIG. 9)l Nós então conduzimos uma série de estudos para comparar CSR02^Fab-TF com MECA32-Fab-TF em termos de atividade especí- fica de fator de tecido e afinidade de ligação para PLVAP alvo. Os re- sultado^ de nossos estudos mostraram que PLVAP CSR02-Fab~TF anti-humana pareceu ter maior atividade TF em cada miligrama de an- tiPLVAP Fab-TF comparando a anticamundongo PLVA^ MECA32- Fab-Tf e ambas CSR02-Fab-TF e MECA32-Fab-TF tiveram afinidades de ligação similares (Tabela 1). As verificações indicaram que CSR02- Fab-TF como MECA32-Fab-TF podem se ligar a seus alvos PLVAP com suficiente afinidade e transportaram suficiente atividade TF para iniciar coagulação de sangue para obter um efeito terapêutico.
Tabela jl. Comparação de atividade específica de fator de tecido (TF) sobre cada miligrama de antiPLVAP Fab-TF e afinidade de ligação pa- ra PLVAP entre PLVAP CSR02-Fab-TF anti-humana e PLVAP ME- CA32-Fab-TF anticamundongo N° de Atividade es- Kd (M) bateladas pecífica de Média+/-DP fator de tecido (ug/mg) Média +/-DP 15SR02-Fab^TF 3 156+/-16 3,07+/-1,25)(10^ lvi^CÃ32-Fab~fF 6 9ÕÍÃ22 5/72^7^0x10^“ ” [00143] Como resumido na Tabela 1, três diferentes bateladas de CSR02-Fab-TF e seis bateladas diferentes de MECA32-Fab-TF foram estudadas. Resultados indicaram que ambas Fab-TF tiveram similares afinidades de ligação. Não obstante, CSR02-Fab-TF teve maior ativi- dade TF específica que MECA32-Fab-TF. Os resultados indicam que CSR02-Fab-TF tem suficiente afinidade de ligação e atividade especí- fica de fjator de tecido para obter efeito terapêutico semelhante a Mfc- | CA32-Fab-TF para tratamento de carcinoma hepatocelular. [00144] Baseado no volume de tumor médio no momento de trata- mento e as doses de MECA32-Fab-TF requeridas para induzir efeti- vamente necrose de tumor em nosso modelo de xenoenxerto de Hep3B, nós estimamos que uma dose terapêutica efetiva para anti- PLVAP-Fab-TF para tratar HCC através de infusão em aderia de ali- mentação dè tumor está entre 15 microgramas a 100 microgramas pa- ra cada (mililitro (centímetro cúbico) de tumor. [00145] Para ainda demonstrar que CSR02-Fab-TF desenvolvida pode se ligar a células endoteliais vasculares de HCC fumano, nós biotinilamos CSR02-Fab-TF e usamos esta Fab-TF para estudar sua ligação (a células endoteliais vasculares de HCC humano. Os resulta- dos de (nossos estudos mostraram que CSR02-Fab-TF biotinilada re- almente ligou-se a células endoteliais vasculares de HCC e não a célu- las endoteliais vasculares de tecido de fígado sem tumor (FIG. 18). Os resultados deste estudo suportaram que CSR02-Fab-Tlr como ME- CA32-Fab-TF pode ser usada para tratamento de HCC em pacientes através( de infusão em artéria(s) de alimentação de tumor. [00146] Baseado nos conhecimentos de que PLVAP é expressa diferençiaimente em vasos sanguíneos de HCC e não naqueles de te- cidos dç fígado sem tumor, nós desenvolvemos um novo agente tera- pêutico para tratamento de HCC através de coexpressão de proteína fator de tecido humano sobre anticorpo monoclonal antiP _VAP ou seu framento Fab. Nós mostramos que ambos, anticorpo inteiro e seu fra- gmento Fab carreando domínio extracelular solúvel de feitor de tecido humanb realmente pode induzir necrose e suprimiu crescimento de tumor ápós infusão simples em uma artéria de alimentação de tumor. [00147] Devido conjugação química de fator de tecido solúvel a an- ticorpo) antiPLVAP não poder controlar reproduzivelmerjite o mesmo número de fator de tecido reticulado a cada anticorpo nos mesmos sí- tios, nós por isso criamos um fragmento Fab recombinante de anticor- po monocíonal antiPLVAP com terminus carboxila de cadeia Fd coex- pressanio domínio extracelular de fator de tecido humana e usamos esta prcteína recombinante como agente terapêutico pam tratamento de HCC. Para demonstrar que um ta! agente terapêutica realmente pode se r usado para tratamento de HCC, camundongos SCID trans- portand a tumor derivado de linha de células de carcinoma hepatocelu- lar humano HEP3B foram primeiro estabelecidos e usados para o es- tudo de prova de conceito. Nós então desenvolvemos uma versão ca- mundor go de antiPLVAP-Fab-TF usando hibridoma PLVAP antica- mundongo MECA32. Foi necessário desenvolver uma ve-são camun- dongo cie antiPLVAP-Fab-TF, porque vasos sanguíneos crescendo em xenoen<erto HCC humano são derivados de camundongo e expres- sam PL VAP de camundongo. Nós expressamos fator de tacido human o sobre ambas versões, humana e camundongo de antiPLVAP Fab- TF, porque fator de tecido humano pode ativar fator VII do coagulação de camundongo e induzir coagulação de sangue em camundongos.
Nosso estudo comparativo entre CSR02-Fab-TF e MECA32-Fab-TF confirmou que ambas podem ligar a seus alvos PLVAP com suficiente afinidade e transportar suficiente atividade de fator de tec ido para dis- parar coagulação de sangue e obter efeito terapêutico. [00148| Os resultados de nossos estudos demonstraram que a an- tiPLVAP-Fab-TF recombinante desenvolvida por nós teve efeito tera- pêutico para tratamento de HCC através de disparo de formação de coágulo de sangue em vasos sanguíneos de tumor, blocueando fluxo de turr or e induzindo necrose de tumor seguindo infusão deste novo agente terapêutico diretamente em uma artéria de alimentação de tu- mor, mas não através de administração intravenosa sistêmica através de uma veia periférica. Os estudos descritos neste pedido de patente tambémj suportam que anticorpo monoclonal PLVAP anti-humano ou seu fragmento Fab coexpressando proteína de fator de tec do pode ser usado para tratar tumores mostrando expressão de PLVAP restrita a vasos dé sangue de tumor, tal como um glioblastoma. [00149] ! Deve ser entendido que para todas as ligações numéricas descrevendo algum parâmetro neste pedido de patente, tal como “cer- ca”, “pelo menos”, “menos que”, e “mais que”, a descrição necessari- amente! também abrange qualquer faixa ligada pelos valores recitados.
Da me$ma maneira, por exemplo, a descrição de pelo menos 1, 2, 3, 4, ou 5 {também descreve, inter alia, as faixas 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-3, 2- 4, 2-5, 3-4, 3-5, e 4-5, etc. [00150] Para todas as patentes, pedidos de patente, ou outra refe- rência aqui citada, tal como literatura não patente e informação de se- quência de referência, deve ser entendido que são aqui incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos assim como para a proposição que é recitada. Onde existe qualquer conflito entre um documento incorporado por referência e o presente pedido de patente, este pedido de patente controlará. Toda informação asso- ciada com sequências de genes de referências mostradas neste pedi- do de patente, tais como GenelDs ou números de acesso (tipicamente referindo-se a números de acesso NCBI), incluindo, por exemplo, loci genômicos, sequências genômicas, anotações funcionais, variantes alélicaè, e mRNA referência (incluindo, por exemplo, lim tes de exons ou elementos de resposta) e sequências de proteínas (tais como estru- turas de domínio conservadas), entradas de homologênic, etc.) assim como referências químicas (por exemplo, composto PubChem, subs- tância (PubChem, ou entradas de bioensaio PubChem, incluindo ano- tações ali, tais como estruturas e ensaios, etc.) são aqui incorporados por referência em suas totalidades. [0015]] Títulos usados neste pedido de patente são por conveniên- cia somente e não afetam a interpretação deste pedido de patente. [00152] Características preferidas de cada um dos aspectos provi- dos pela invenção são aplicáveis a todos os outros aspectos da inven- ção mutatis mutandis e, sem limitação, são exemplificadas pelas rei- vindicações dependentes e também abrangem combinações e permu- tações de características individuais (por exemplo, elementos, incluin- do faixas numéricas e modalidades exemplares) de moda idades parti- culares [e aspectos da invenção incluindo os exemplos de trabalho. Por exemplo, particulares parâmetros experimentais exemp ificados nos exemplòs de trabalho podem ser adaptados para uso na nvenção rei- í vindicada separadamente sem fugir da invenção. Por exemplo, para materiais que são mostrados, embora específica referência de cada um de yárias combinações coletivas e individuais e permutações des- tes compostos podem não ser explicitamente mostradas, cada uma é aqui especificamente contemplada e descrita. Assim, se uma classe de elementos A, B, e C é mostrada assim como uma casse de ele- mentoé D, E, e F e uma exemplo de uma combinação de elementos, A-D é mostrada, então mesmo se cada uma não é individualmente re- citada, [cada uma é individualmente e coletivamente contemplada. As- sim, néste exemplo, cada uma das combinações A-E, A-F, B-D, B-E, B-F, CfD, C-E, e C-F é especificamente contemplada e deve ser con- siderada mostrada a partir de exposição de A,B, eC; D, E, e F; e a combinação exemplo A-D. Da mesma maneira, qualquer subconjunto ou combinação destas é também especificamente contemplada e mos- trada. Assim, por exemplo, o subgrupo de A-E, B-F, e C-E é especifi- camente contemplado e deve ser considerado mostrado a partir da exposição de A, B, e C; D, E, e F; e a combinação exemplo A-D. Este conceijo se aplica a todos os aspectos de processo de fabricação ou uso de composições. [0015$] Os aspectos anteriores da invenção, como reconhecido por aqueles versados na técnica seguindo os ensinamentos do relatório descritivo, podem ser reivindicados em qualquer combinação ou per- mutação para a extensão em que eles são novos e não óbvios sobre a técnica anterior - assim para a extensão em que um elemento é des- crito em uma ou mais referências conhecidas por aqueles versados na técnica eles podem ser excluídos da invenção reivindicada através de, inter alia, uma provisão negativa ou renúncia da característica ou combinação de características. [00154' Embora a invenção tenha sido partícularmente mostrada e descrita com referências à suas modalidades exemplares, será enten- dido per aqueles versados na técnica que várias mudanças em forma e detahes podem ser ali feitas sem fugir do escopo da invenção abrang do pelas reivindicações apostas.

Claims (42)

1. Conjugado, caracterizado por compreendejr um agente de coagulação conjugado a um anticorpo, onde o anticorpo se liga es- pecificamente a um epítopo de domínio extracelular de uma PLVAP de mamífero.
2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo; fato de o agente de coagulação ser uma proteína de coagula- ção.
3. Conjugado de acordo com a reivindicação 2, caracteriza- do pelo fato de a proteína de coagulação ser um fator de tecido.
4. Conjugado de acordo com a reivindicação 3, caracteriza- do peld fato de o fator de tecido compreender uma sequência de ami- noácidós pelo menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98,; 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 1; mais preferivelmente pelo mènos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% ou mais idênt ca a SEQ ID NO: 1; ainda mais preferivelmente pelo menos 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 1.
5. Conjugado, caracterizado por compreender um fator de tecido com uma sequência de aminoácidos pelo menos 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% ou mais idêntica a SEQ ID NO: 1 conjugado através de uma ligação peptídica a um anticorpo, onde olanticorpo se liga especificamente a um epítopo em um domínio extracelular de uma proteína PLVAP humana.
6. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de a proteína PL.VAP de ma- mífero compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 2; mais preferivelmente pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 2.
7. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado por anticorpo que liga especificamente um epítopo selecionado de PPAGIPVAPSSG ou LAIRN 3ALDTCIKT- KSQPMMPVSRPM.
8. Conjugado de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do por anticorpo que liga especificamente o epítopo PPAG IPVAPSSG.
9. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de a proteína de coagulação e anticorpo serem quimicamente reticulados.
10. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindica- ções arjiteriores, caracterizado pelo fato de a proteína de coagulação e anticorpo serem ligados por uma ligação peptídica.
11. Conjugado de acordo com qualquer uma d as reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de o anticorpo ser uma imuno- globulipa compreendendo uma região variável de cadeici leve e uma região variável de cadeia pesada e onde o agente de coagulação é uma proteína de coagulação.
12. Conjugado de acordo com a reivindicação 11, caracteri- zado pelo fato de que a proteína de coagulação e anticc rpo são liga- dos por uma ligação peptídica entre o terminus carboxi de uma proteí- na compreendendo a região variável de cadeia pesada e o terminus amino da proteína de coagulação.
13. Conjugado de acordo com a reivindicação 11, caracteri- zado pfelo fato de a proteína de coagulação e anticorpo serem ligados por urria ligação peptídica entre o terminus carboxi de uma proteína compreendendo a região variável de cadeia leve e o terminus amino da proteína de coagulação.
14. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de o agente de coagulação ser uma proteína de coagulação e a proteína de coagulaçãc e anticorpo são ligados por uma ligação peptídica através de um peptídeo ligador. 1
15. Conjugado de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de o peptídeo ligador compreender (Gly4-Ser)n, onde n é 1, 2, 3, 4, 5, ou 6; mais preferivelmente onde n é 3.
16. Conjugado de acordo com qualquer uma d as reivindica- ções anteriores, caracterizado pelo fato de o anticorpo sei uma imuno- globulir a compreendendo: i) uma região variável de cadeia pesada compreendendo as CDRs da região variável compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve compreen- dendo as CDRs da região variável compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, opcionalmente onde a cadeia leve va- riável e a cadeia pesada variável têm até 1, 2, 3, ou 4 substituições conser cativas de aminoácidos em cada CDR; ou ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo as CDEs da região variável compreendendo a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 5 e uma região variável de cadeia leve compreen- dendo as CDRs da região variável compreendendo a s equência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, opcionalmente onde a cadeia leve va- riável e a cadeia pesada variável têm até 1,2, 3, ou 4 substituições de aminoácidos conservativas em cada CDR.
17. Conjugado de acordo com a reivindicação 16, caracteri- zado pslo fato de a região variável de cadeia leve e/ou região variável de cadeia pesada serem humanizadas.
18. Conjugado de acordo com a reivindicação 17, caracteri- zado pslo fato de a região variável de cadeia leve e regiêo variável de cadeia pesada serem dadas por: i) uma região variável de cadeia pesada selecionada de SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, ou 11, mais particularmente onde a região va- riável cie cadeia pesada é SEQ ID NO: 11; e uma região variável de cadeia leve selecionada de SEQ ID NO: 12, 13, ou 14, mais particu- larmente onde a região variável de cadeia leve é SEQ ID NO: 13; ou ii) uma região variável de cadeia pesada selecionada de SEQ I0 NO: 15, 16, 17, 18, ou 19, mais particularmente onde a região variável de cadeia pesada é SEQ ID NO: 19; e uma região variável de cadeia leve selecionada de SEQ ID NO: 20, 21, ou 22, mais particu- larmente onde a região variável de cadeia leve é SEQ ID NO: 22.
19. Conjugado de acordo com a reivindicação 14, caracteri- zado pelo fato de o conjugado compreender uma sequência de amino- ácidos pelo menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, ou 99%, ou mais idêntica a SEQ ID NO: 23.
20. Composição farmacêutica, caracterizada por compre- ender o conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde a composição ainda compreende um apropriado car- reador, excipiente, e/ou meio de contraste.
21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 20; ou o conjugado como definido em qualquer uma das reivindi- cações! 1 a 19, caracterizado por estar em uma forma dcsagem apro- priada para administração a um sujeito.
22. Ácido nucléico, caracterizado por codificar o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 10 a 19.
23. Vetor, caracterizado por compreender o ácido nucléico como definido na reivindicação 22.
24. Célula hospedeira, caracterizada por compreender o ve- tor como definido na reivindicação 23, ou o ácido nucléico como defi- nido ná reivindicação 22.
25. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de a célula hospedeira ser uma célula bacteri- ana, màis particularmente onde a célula bacteriana é Esct>erichia coli.
26. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de a célula ser uma célula eucariotica seiecio- nada aj partir de um fungo, tal como levedura, incluindo levedura em desenvolvimento; uma célula de inseto, tal como SfO, SÍ21, ou células i five altas; ou células de mamíferos, tais como células CHO, VERO, ou COS.
27. Processo de obtenção de conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8ou 10a 19, caracterizado por compreender uma cultura de célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 24 a 26 sob condições que suportam a expressão do conjugado pelo hospedeiro e isolamento de conjugado expresso.
28. Processo, caracterizado por: tratar um tunor com vas- culaturà positiva-PLVAP, reduzir volume de um tumor corrí vasculatura positiva PLVAP, ou induzir trombose e necrose de tumor de um tumor com vãsculatura positiva PLVAP, em um sujeito mamífero em sua ne- cessidade, compreendendo administração de uma quantidade tera- peuticãmente efetiva do conjugado como definido em cualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou a composição farmacêutica como defini- da na reivindicação 20 ou 21, ao sujeito.
29. Processo de acordo com a reivindicação 28, caracteri- zado pjor tumor ser um HCC e volume de tumor HCC é reduzido por trombose e necrose de tumor após administração do conjugado.
30. Processo de acordo com a reivindicação 28 ou 29, ca- racterizado pelo fato de o sujeito ser um humano.
31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 30, caracterizado pelo fato de o conjugado ser administrado intravaècularmente para o tumor de sujeito.
32. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 26 a 31, caracterizado pelo fato de o conjugado ser infundido di- retam^nte em uma ou mais artérias de alimentação de tumor.
33. Processo de tratamento de HCC em um sujeito humano em suá necessidade, caracterizado por compreender administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva do conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, ou a composição farma- cêutica como definida na reivindicação 20 ou 21, ao sljeito, onde o conjugado ou composição é infundido diretamente em uma ou mais artérias de alimentação de tumor.
34. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 23 a 33, caracterizado pelo fato de o sujeito estar sofrendo trata- mento concorrente ou sequencial com um ou mais agentes quimiote- rapêutbos, radioterapia, injeção de álcool intratumor, cirurgia, criotera- pia, ablação de frequência de rádio, ou uma combinação de um ou mais dos anteriores.
35. Processo de acordo com a reivindicação 34, caracteri- zado paio fato de o conjugado ser administrado ao suje to junto com um ou riais agentes quimioterapêuticos.
36. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracteri- zado p alo fato de um ou mais agentes quimioterapêuticos compreen- derem uma quantidade terapeuticamente efetiva de sorafenibe, be- vacizuriabe, ou outras drogas terapêuticas antiangiogênicas.
37. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracteri- zado pelo fato de o conjugado ser administrado ao sujeito em uma composição farmacêutica ainda compreendendo o um ou mais agen- tes quimioterapêuticos.
38. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 37, caracterizado por tumor com vasculatura positiva PLVAP ser um glioblastoma.
39. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 38, caracterizado pelo fato de o conjugado ser administrado em uma dose de cerca de 5 a cerca de 200 pg/cm3 de tumor, mais particularmente cerca de 10 a cerca de 150 pg/cm3 de tumor, e mais particularmente cerca de 15 a cerca de 100 pg/cm3 de turjior.
40. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 39, caracterizado pelo fato de o conjugado ser administrado em uma dose única.
41. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 28 a 39, caracterizado pelo fato de o conjugado ser administrado em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 doses, ou mais.
42. Processo de acordo com a reivindicação 40, caracteri- zado pelo fato de as doses serem administradas sobre um período de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 dias; ou 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 sqmanas; ou 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 meses ou mais.
BR102014029197-0A 2013-11-15 2014-11-14 Conjugado, seu processo de obtenção, seu uso, composição farmacêutica, vetor e célula hospedeira BR102014029197B1 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361904951P 2013-11-15 2013-11-15
US61/904.951 2013-11-15

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BR102014029197A2 true BR102014029197A2 (pt) 2016-01-05
BR102014029197A8 BR102014029197A8 (pt) 2018-01-09
BR102014029197B1 BR102014029197B1 (pt) 2022-05-31

Family

ID=51951740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR102014029197-0A BR102014029197B1 (pt) 2013-11-15 2014-11-14 Conjugado, seu processo de obtenção, seu uso, composição farmacêutica, vetor e célula hospedeira

Country Status (13)

Country Link
US (5) US9493552B2 (pt)
EP (1) EP2915545A1 (pt)
JP (1) JP6538331B2 (pt)
KR (1) KR102240342B1 (pt)
CN (1) CN104892767B (pt)
AU (1) AU2014262247C1 (pt)
BR (1) BR102014029197B1 (pt)
CA (1) CA2871114C (pt)
HK (1) HK1210788A1 (pt)
IL (1) IL235693B (pt)
RU (2) RU2020129180A (pt)
SG (1) SG10201407557VA (pt)
TW (1) TWI655212B (pt)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2718869C (en) 2008-03-19 2018-10-30 China Synthetic Rubber Corporation Methods and agents for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma
US9493552B2 (en) 2013-11-15 2016-11-15 China Synthetic Rubber Corporation Therapeutic biologic for treatment of hepatocellular carcinoma
US11382953B2 (en) * 2016-08-26 2022-07-12 Tetsuji Okuno Microvascular blood flow decreasing agent and use thereof
CN108997497B (zh) * 2018-03-30 2022-02-25 华兰基因工程有限公司 特异结合人质膜膜泡关联蛋白pv-1的单克隆抗体及其制备方法与应用
CN112368299A (zh) * 2018-04-02 2021-02-12 阿拉玛布治疗学股份有限公司 连接蛋白43抗体及其用途
CN108913709A (zh) * 2018-06-26 2018-11-30 山东兴瑞生物科技有限公司 用于治疗hcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的car-t细胞及细胞的制备方法
US11912764B2 (en) 2020-07-31 2024-02-27 Alamab Therapeutics, Inc. Anti-connexin antibody formulations
CN116514979B (zh) * 2022-05-09 2024-05-07 华兰基因工程(河南)有限公司 特异性结合pv-1蛋白的抗体或其抗原结合片段hlpv-p09及其应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6749853B1 (en) * 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
BR9508402A (pt) 1994-07-11 1997-10-21 Univ Texas Ligante de união construção de fator de tecido composição farmacêutica kit e uso de um ligante de união
JP2002514201A (ja) 1997-01-22 2002-05-14 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 凝固および腫瘍の処置のための組織因子の方法および組成物
US20040067490A1 (en) 2001-09-07 2004-04-08 Mei Zhong Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
AU1181802A (en) 2000-09-27 2002-04-08 Curagen Corp Novel proteins and nucleic acids encoding same
DE10136273A1 (de) 2001-07-25 2003-02-13 Sabine Debuschewitz Molekulare Marker beim hepatozellulären Karzinom
NZ573742A (en) 2001-09-18 2010-07-30 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor, particularly breast tumor - TAT212
ES2381201T3 (es) 2005-03-31 2012-05-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos
WO2006110593A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Macrogenics, Inc. Biological targets for the diagnosis, treatment and prevention of cancer
WO2008091781A1 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Mayo Foundation For Medical Education And Research Reducing tumor growth
CA2718869C (en) * 2008-03-19 2018-10-30 China Synthetic Rubber Corporation Methods and agents for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma
EP2268838A1 (en) 2008-04-11 2011-01-05 China Synthetic Rubber Corporation Methods, agents and kits for the detection of cancer
DK3199553T3 (da) * 2008-10-29 2019-07-22 Circular Commitment Company Fremgangsmåder og midler til diagnosticering og behandling af hepatocellulært carcinom
CN102574908B (zh) * 2009-08-27 2018-08-03 诺沃—诺迪斯克有限公司 组织因子向活化的血小板的靶向
US9493552B2 (en) 2013-11-15 2016-11-15 China Synthetic Rubber Corporation Therapeutic biologic for treatment of hepatocellular carcinoma

Also Published As

Publication number Publication date
NZ701995A (en) 2020-05-29
US20170000898A1 (en) 2017-01-05
US11485771B2 (en) 2022-11-01
US20220372109A1 (en) 2022-11-24
US10906959B2 (en) 2021-02-02
CA2871114C (en) 2023-05-23
AU2014262247C1 (en) 2020-07-02
SG10201407557VA (en) 2015-06-29
US20190338016A1 (en) 2019-11-07
IL235693A0 (en) 2015-02-26
US20150140021A1 (en) 2015-05-21
US9493552B2 (en) 2016-11-15
BR102014029197B1 (pt) 2022-05-31
AU2014262247A1 (en) 2015-06-04
IL235693B (en) 2021-09-30
CN104892767A (zh) 2015-09-09
BR102014029197A8 (pt) 2018-01-09
US10400026B2 (en) 2019-09-03
HK1210788A1 (en) 2016-05-06
US20180362614A1 (en) 2018-12-20
CA2871114A1 (en) 2015-05-15
RU2020129180A (ru) 2020-10-16
JP2015096065A (ja) 2015-05-21
JP6538331B2 (ja) 2019-07-03
TW201609817A (zh) 2016-03-16
RU2739218C2 (ru) 2020-12-22
CN104892767B (zh) 2020-08-21
KR20150056489A (ko) 2015-05-26
EP2915545A1 (en) 2015-09-09
RU2014145841A3 (pt) 2018-06-25
KR102240342B1 (ko) 2021-04-14
RU2014145841A (ru) 2016-06-10
AU2014262247B2 (en) 2019-12-12
TWI655212B (zh) 2019-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR102014029197A2 (pt) biológico terapêutico para tratamento de carcinoma hepatocelular
US20230377764A1 (en) Methods and compositions for treating cancer with ecm-affinity peptides linked to immunotherapeutic antibodies
JP7020656B2 (ja) 組織因子を標的とする抗体、その調製方法及びその使用
US10501549B2 (en) Methods of inhibiting pathological angiogenesis with doppel-targeting molecules
US20240123042A1 (en) Methods and compositions related to a tissue factor-targeting igg3 immunoconjugates
AU2019231696A1 (en) Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
US20140341971A1 (en) Composition for targeting dendritic cells
CA2321974A1 (en) Tumor associated antigen 791tgp72
NZ701995B (en) Therapeutic biologic for treatment of hepatocellular carcinoma
KR102207221B1 (ko) 도펠-타겟팅 분자를 이용한 병리학적 신생혈관 생성을 억제하는 방법
JP5822407B2 (ja) 軟骨・骨破壊抑制剤

Legal Events

Date Code Title Description
B03A Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette]
B03H Publication of an application: rectification [chapter 3.8 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: INTERNATIONAL CSRC INVESTMENT HOLDINGS CO., LTD. (CN)

B25A Requested transfer of rights approved

Owner name: CIRCULAR COMMITMENT COMPANY (TW)

B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 14/11/2014, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS