JP6513189B2 - 間接ＥＬＩＳＡを利用するヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット及びこれを利用したＦｃ包含タンパク質の力価測定方法 - Google Patents

Description

本発明はヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット及びこれを利用したＦｃ包含タンパク質の力価測定方法に関し、より詳細には間接ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｉｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）を介した分析に利用されて、検体希釈液、接合体希釈液及び洗浄液で構成されるヒトＦｃ包含タンパク質のヒト血しょうまたは血清内での力価測定キット及びこれを利用したヒトＦｃ包含タンパク質のヒト血しょうまたは血清内力価測定方法に関する。

抗−Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（Ａｎｔｉ−ＨＢＳＡｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）感染やＢ型肝炎ウイルスワクチン（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ）接種後に生成されて、抗−ＨＢｓ（ａｎｔｉ−ＨＢｓ）抗体力価検査を介して生成された抗−ＨＢｓ（ａｎｔｉ−ＨＢｓ）抗体濃度を測定してＢ型肝炎ワクチンの結果をモニタリング（ａｎｔｉ−ＨＢｓ濃度が１０ｍＩＵ／ｍＬ以下なら非免疫性の抗−ＨＢｓ（ａｎｔｉ−ＨＢｓ）濃度と判断）するのに利用される。それだけでなくＢ型肝炎ウイルスによるＢ型肝炎を基底疾患にする肝移植を行う場合、Ｂ型肝炎ウイルスの再感染を予防するために、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＨＢＩＧ）を投与する時、抗−ＨＢ（ａｎｔｉ−ＨＢｓ）抗体力価をモニタリングするのに利用される。

抗−ＨＢｓ（ａｎｔｉ−ＨＢｓ）抗体力価分析方法としては、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄ、以下ＥＩＡ）、ＣＭＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、以下ＲＩＡ）等が使用されている（Ｅｌ−Ｍａｄｈｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１６：１５６−１６０，１９９８；Ｌ．Ｈａａｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ，１２１９：２８３−２８９，２００１；Ｏｄｄ Ｏｄｉｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４（１０）：１６２３−１６２８，２００７；Ｐ．Ｋｒｙｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：４０５−４０９，１９８１）。

抗−ＨＢｓ抗体力価分析法の原理は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢＳＡｇ）をマイクロウェルプレート（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）またはマイクロ粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ）にコーティングした後、測定しようとする検体を反応させた後、酵素あるいは放射性同位元素を接合させたＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢＳＡｇ）を利用して発色、発光、または同位元素の量を測定して抗体を力価を測定するものである。

代表的な抗体であるＩｇＧの場合、Ｙ字型の形態を有していて、図１の（Ａ）のようにＹの両末端には抗原がつく抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）が存在して、各部分に抗原がつくことができるようになる。図１の（Ａ）のように抗−ＨＢｓ抗体の片方抗原結合部位が底にコーティングされたＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（以下コーティングＨＢＳＡｇという）と他方の枝が酵素あるいは放射性同位元素が標識されたＢ型肝炎ウイルスの表面抗原（以下、標識ＨＢＳＡｇという）にそれぞれ片枝ずつ結合してこそ正常な力価測定が可能である。

しかし、韓国緑十字で開発した抗−ＨＢｓ単クローン抗体の力価をヒトの血しょうまたは血清がない状態で図１の（Ａ）のような方法で測定した時、図１の（Ｄ）のような方法で測定した結果より２０〜１００倍程度低く測定された。図１の（Ａ）方法に従う方法を使用する場合、抗−ＨＢｓ単クローン抗体の抗−ＨＢｓ力価が低く出てくる理由は、実際には図１の（Ｂ）あるいは（Ｃ）のような形態の結合による誤りの可能性があるためと判断される。すなわち、測定抗体の二つの結合部位がコーティングＨＢＳＡｇあるいは標識ＨＢＳＡｇに共に結合する場合（図１の（Ｂ））、または、抗体の結合部位中１ヶ所が抗原に結合すると、抗体の残りの結合部位が他の抗原に結合できない場合（図１の（Ｃ））が発生する可能性があり、これにより、抗体の量を正確に測定できない問題点がある。

しかし、このような問題点を克服するために、図１の（Ｄ）のような方法で力価を測定する場合にも、韓国緑十字で開発した抗−ＨＢｓ単クローン抗体のような完全ヒト抗体を使用する場合には図２のようにヒトの血しょうまたは血清に本来存在する他のヒト抗体との非特異的結合が発生して、ヒトＦｃ包含タンパク質を認識する２次抗体がこのような非特異的な結合と抗−ＨＢｓ単クローン抗体の特異的結合を区分できなくて高いバックグラウンド信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｎｏｉｓｅ）が発生することによって、正常な力価測定が難しくなる問題点が依然として残る。

前記短所を克服しようと、本発明者等は間接ＥＬＩＳＡに基づいた力価測定方法を介して図１の（Ｄ）のような特異的反応だけ正確に測定することによって、測定誤りを減らすことができることを発見したが、依然として試験者間抗体力価測定の精度が低い短所は存在した。

そこで、本発明者等は前記のような従来の力価測定法の誤り発生の可能性を排除して、ヒトの血しょうまたは血清内でのヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定精度を高めるために鋭意努力した結果、特定組成を有する検体希釈液、接合体希釈液及び洗浄液で構成される測定キットを利用する場合、ヒトの血しょうまたは血清内でヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定誤りが顕著に減って、試験者間抗体力価測定の精度が高くなることを確認して本発明を完成するようになった。

本発明の目的は、ヒトの血しょうまたは血清でヒト抗体、ヒト化抗体またはヒトＦｃ融合タンパク質力価測定の精度を高めることができるヒトＦｃ包含タンパク質力価測定キット及びこれを利用したヒトの血しょうまたは血清でヒトＦｃ包含タンパク質、特に抗体の力価測定方法を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、
（ａ）ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、脱脂牛乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）及び非イオン性界面活性剤を含む検体希釈液；
（ｂ）動物由来血清を含む接合体希釈液；及び
（ｃ）酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）及び非イオン性界面活性剤を含む洗浄液；
を含むヒトＦｃ包含タンパク質力価測定キットを提供する。

本発明はまた、
（ａ）ヒトＦｃ包含タンパク質を含む検体を検体希釈液を利用して希釈する工程；
（ｂ）様々な濃度で希釈された標準液と前記検体希釈液を目標抗原が吸着したプレートウェル（ｗｅｌｌ）に入れて反応させる工程；
（ｃ）各ウェル（ｗｅｌｌ）の内容物を吸引して出して、洗浄液で洗浄する工程；
（ｄ）各ウェル（ｗｅｌｌ）の残余洗浄液を完全に除去した後、接合体希釈液を各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れて、反応させる工程；
（ｅ）各ウェル（ｗｅｌｌ）の内容物を吸引して出して洗浄液で洗浄する工程；
（ｆ）各ウェル（ｗｅｌｌ）の残余洗浄液を完全に除去した後、基質液を各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れて反応させる工程；
（ｇ）反応停止液を各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れて反応を停止させる工程；及び
（ｈ）標準液及び検体の吸光度を測定する工程；
を含む、ヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定方法を提供する。

Ｂ型肝炎ウイルス表面抗体（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）に対する抗体力価測定過程に対する概略図である。 従来の抗−ＨＢｓ力価測定過程のヒト血しょうまたは血清での問題点に対する概略図である。 本発明の抗−ＨＢｓ抗体力価測定過程の概略図である。 ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡとＲＩＡ（ＡＭＣ）を利用した抗体力価測定実験の最終分析結果の線形回帰分析結果を示したグラフである。 ＲＩＡ（ＡＭＣ）分析結果とヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ分析結果のブランドアルトマンプロット（Ｂｌａｎｄ ＆ Ａｌｔｍａｎ ｐｌｏｔ）を示したグラフである。 従来の１％ＢＳＡ／ＰＢＳを検体希釈液として使用するＥＬＩＳＡ力価測定方法とＲＩＡ（ＡＳＭ）分析結果を比較して示したグラフである。 ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡとＲＩＡ（ＡＳＭ）分析結果を比較して示したグラフである。 ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡとジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬を利用した分析結果を比較して示したグラフである。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明では、ヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定方法において、ヒトの血しょうまたは血清に本来存在するヒト抗体との非特異的な結合により発生する誤りが顕著に減り、特定抗原に親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）が高い抗体に対して従来測定方法よりも正確な値を示す新しい測定方法及びこれのためにキットを提供する。

本発明でのヒトＦｃ包含タンパク質とは、ヒトＦｃ領域を含む全てのタンパク質を意味し、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）のように水溶性受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、サイトカイン、ホルモンなどとＦｃが融合した融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）や、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体で構成される群から選択される一つ以上であってもよいが、これに限定されず、ヒト抗体及びヒト化抗体が特に好ましい。

本明細書での「ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ（Ｈｅｐａｂｉｇ−Ｇｅｎｅ ＥＬＩＳＡ）」または「Ｈ−Ｅ」とは、本発明のヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キットを意味する。

本発明の一実施例では、本発明のヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キットを利用した分析結果と従来の抗−ＨＢｓ抗体力価測定法（以下、ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法）分析結果を比較して本発明のヒトＦｃ包含タンパク質力価測定キットの測定精度及び正確度を確認した。

以下、本発明に係るヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット及びその測定方法を抗−ＨＢｓ抗体力価キットを使用したものを挙げて具体的に説明する。

従来の抗−ＨＢｓ抗体の力価測定方法は、図１の（Ａ）のように、抗−ＨＢｓ抗体の片方抗原結合部位が底にコーティングされたＢ型肝炎ウイルスの表面抗原と他方の一方抗原結合部位が酵素あるいは放射性同位元素が標識されたＢ型肝炎ウイルスの表面抗原にそれぞれ結合してこそ正常な力価測定が可能である。

しかし、韓国緑十字で開発した抗−ＨＢｓ単クローン抗体等を利用して、図１の（Ａ）のような方法で力価を測定した時、図１の（Ｄ）のような方法で測定した結果よりも２０〜１００倍程度低く測定された（ｄａｔａ ｎｏｔ ｓｈｏｗｎ）。図１の（Ａ）方法に従う方法を介して測定した抗体の抗−ＨＢｓ力価が低く出てくる理由は、図１の（Ｂ）あるいは（Ｃ）のような誤りの可能性があるためと判断された。そこで、本発明者等は、従来の力価測定法の誤り発生の可能性（図１の（Ｂ）と（Ｃ））を排除するための方法として、図１の（Ｄ）のような方法で抗体力価測定実験を進行し、従来の方法よりも正確に抗体力価測定が可能であることを確認した。

現在Ｂ型肝炎の理由で肝移植を受けた患者の場合、Ｂ型肝炎の再発防止のために、Ｂ型肝炎ヒト免疫グロブリンと血しょう分画製剤の投与を周期的に受けている。従来ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法で測定した５００ｍＩＵ／ｍＬを基準に周期的な血清内モニタリングを介して再投与時期を決めている。しかし、抗−ＨＢｓ力価測定法も、図１の（Ａ）のような方法であるため、ヒト単クローン抗体であるＧＣ１１０２（大韓民国登録特許第４６７７０６号参照）等の正確な力価を測定するのは不可能であった。

また、Ｂ型肝炎のため肝移植を受けた患者の場合、Ｂ型肝炎のヒト免疫グロブリン血しょう分画製剤の投与を周期的に受けるようになると、数千ｍＩＵ／ｍＬまで血しょうまたは血清内力価が上がるが、従来抗−ＨＢｓ力価測定法は、１０ｍＩＵ／ｍＬから最大１，０００ｍＩＵ／ｍＬまでの測定範囲を有するため、正確な力価を確認するためには、血しょうまたは血清を追加的に希釈しなければならず、検体希釈液に応じて希釈による正確性及び精度が変わり得るため、検体希釈に対する別途の検証が必要とされた。

従って、本発明ではＢ型肝炎ヒト免疫グロブリンと国家標準品を利用してＲＩＡ（ＡＭＣ）分析法の分析結果と本発明に係る分析法、すなわち抗体力価測定方法の分析結果間の相関を明らかにして、Ｂ型肝炎ヒト免疫グロブリンと血しょう分画製剤の再投与基準になる患者血清内抗−ＨＢｓ抗体力価５００ｍＩＵ／ｍＬ（ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法）が、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡにも同様に適用できるか否かと本発明に係る検体希釈液を適用した時、広い範囲でも正確性と精度を確保することができるか確認しようとした。

本発明の一実施例では、本発明の間接ＥＬＩＳＡを利用する抗体力価測定キットを介して国家標準品を抗体力価測定時実際の値より約９３．３％の回収率を示し、３，５００ｍＩＵ／ｍＬまで正確な力価を測定することができた。従来方式であるＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法は、Ｂ型肝炎ヒト免疫グロブリンと国家標準品を測定した時、その力価値が１．４倍が測定された。これにより、本発明の抗体力価測定キットを利用した間接ＥＬＩＳＡが従来のＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法よりさらに広い範囲でより正確な値で測定が可能であることが確認された。

本発明の他の実施例では、本発明のＦｃ包含タンパク質力価測定キットを使用してラット血清内の抗−ＨＢｓ抗体に対する力価測定が可能であることも確認することができた。これは、本発明と類似の特定動物種から由来した抗体またはＦｃ包含タンパク質の同じ種の血しょうまたは血清での力価測定でも高い精度で力価を測定することができることを意味する。

一観点において、本発明は、
（ａ）ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、脱脂牛乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）及び非イオン性界面活性剤を含む検体希釈液；
（ｂ）動物由来血清を含む接合体希釈液；及び
（ｃ）酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）及び非イオン性界面活性剤を含む洗浄液；
を含むヒトＦｃ包含タンパク質力価測定キットに関する。

本発明において、前記検体希釈液のウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）の濃度は、５〜１００（ｗ／ｖ）％であり得る。また、前記検体希釈液の脱脂牛乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）の濃度は、０．０５〜０．２（ｗ／ｖ）％であり得る。前記脱脂牛乳の濃度が前記範囲より高くなると、１次希釈液（Ｐｒｉｍａｒｙ ｄｉｌｕｔｅ）がべたつき過ぎて測定誤りが大きくなり、ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）と脱脂牛乳の濃度が前記範囲より低くなると、ヒトＦｃ包含タンパク質が不要なタンパク質あるいは抗原でない望まない所に検出しようとする抗体がつく非特異的結合が発生する可能性が大きくなる。好ましくは、前記ウシ血清と脱脂牛乳の濃度はそれぞれ１０（ｗ／ｖ）％と０．１（ｗ／ｖ）％であり得る。

前記検体希釈液の非イオン性界面活性剤は、本発明の目的に合致する限り、いずれも制限なしに使用可能で、好ましくは、ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０，ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０）、ツイン８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０，ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（４） ｌａｕｒｙｌ ｅｔｈｅｒ）及びＢｒｉｊ（登録商標）３５（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２３） ｌａｕｒｙｌ ｅｔｈｅｒ）等で構成された群から選択された一つ以上が使用され得る。最も好ましくはツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）が使用されてもよい。前記非イオン性界面活性剤の濃度は、０．０２５〜０．１（ｗ／ｖ）％であってもよく、好ましくは０．０５（ｗ／ｖ）％であってもよい。

前記検体希釈液には追加的に防腐剤が含まれてもよく、好ましい防腐剤の例としては、プロクリン３００（Ｐｒｏｃｌｉｎ３００）が使用されるが、これに限定されない。防腐剤が添加される場合、０．０２５〜０．１（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．０５（ｗ／ｖ）％の濃度で含まれてもよい。

本発明において、前記接合体希釈液の動物由来血清は、好ましくはヤギ血清であってもよいが、これに限定されず、本発明の目的に合致するものなら全ての動物由来血清が使用されてもよい。

前記ヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）を含み、前記ヤギ抗ヒトＩｇＧは、Ｆｃ特異的なであり得、全ＩｇＧ（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）またはＦａｂなどの抗体断片であり得る。好ましくは、前記接合体希釈液のヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）は、Ｆｃ特異的なものであってもよい。
前記接合体希釈液には動物由来血清が５〜２０（ｗ／ｖ）％の濃度で含まれてもよい。

本発明において、前記洗浄液の酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）の濃度は１０〜４０ｍＭ、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の濃度は７５〜３００ｍＭ、非イオン性界面活性剤の濃度は０．０２５〜０．１（ｗ／ｖ）％であってもよく、前記洗浄液のｐＨは３〜５であってもよい。好ましくは、酢酸ナトリウムの濃度は２０ｍＭ、塩化ナトリウムの濃度は１５０ｍＭ、非イオン性界面活性剤の濃度は０．０５（ｗ／ｖ）％、ｐＨは４である洗浄液を使用いてもよい。

前記洗浄液の非イオン性界面活性剤は、本発明の目的に合致する限り、いずれも制限なしに使用可能で、好ましくは、ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０，ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０）、ツイン８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０，ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（４） ｌａｕｒｙｌ ｅｔｈｅｒ）及びＢｒｉｊ（登録商標）３５（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２３） ｌａｕｒｙｌ ｅｔｈｅｒ）等で構成された群から選択された一つ以上が使用され得る。最も好ましくはツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）が使用されてもよい。

他の観点において、本発明は、
（ａ）ヒトＦｃ包含タンパク質を含む検体を検体希釈液を利用して希釈する工程；
（ｂ）様々な濃度で希釈された標準液と前記検体希釈液を目標抗原が吸着したプレートウェル（ｗｅｌｌ）に入れて反応させる工程；
（ｃ）各ウェル（ｗｅｌｌ）の内容物を吸引して出して、洗浄液で洗浄する工程；
（ｄ）各ウェル（ｗｅｌｌ）の残余洗浄液を完全に除去した後、接合体希釈液を各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れて、反応させる工程；
（ｅ）各ウェル（ｗｅｌｌ）の内容物を吸引して出して洗浄液で洗浄する工程；
（ｆ）各ウェル（ｗｅｌｌ）の残余洗浄液を完全に除去した後、基質液を各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れて反応させる工程；
（ｇ）反応停止液を各ウェル（ｗｅｌｌ）に入れて反応を停止させる工程；及び
（ｈ）標準液及び検体の吸光度を測定する工程；
を含む、前記キットを利用したヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定方法に関する。

本発明において、前記検体希釈液は、ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、脱脂牛乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）及び非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とし、前記検体希釈液のウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）は５〜１００（ｗ／ｖ）％の濃度、脱脂牛乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）は０．０５〜０．２（ｗ／ｖ）％の濃度、前記非イオン性界面活性剤は、０．０２５〜０．１（ｗ／ｖ）％の濃度で含まれてもよい。

前記検体希釈液には防腐剤、好ましくはプロクリン３００である防腐剤が追加的に含まれてもよく、防腐剤は０．０２５〜０．１（ｗ／ｖ）％の濃度で含まれてもよい。

前記（ａ）工程での検体希釈液を利用した希釈は、検体対比約２〜２０倍、好ましくは５〜１５倍、最も好ましくは１０倍体積の検体希釈液を利用して行われてもよい。また、前記ヒトＦｃ包含タンパク質を含む検体は、ヒト血清、ヒト血しょう及びヒト血液で構成された群から選択された一つ以上であることが好ましいが、これに限定されない。

本発明において、前記接合体希釈液は、動物由来血清を含み、好ましくはヤギ血清であってもよいが、これに限定されず、本発明の目的に合致するものなら全ての動物由来血清が使用されてもよい。

前記ヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）を含み、前記ヤギ抗ヒトＩｇＧは、ＦａｂまたはＦｃ特異的なであり得る。好ましくは、前記接合体希釈液のヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）は、Ｆｃ特異的なものであってもよい。

前記様々な濃度で希釈された標準液の力価値は、１，０００、５００、１５０、１００、５０、１０、０ｍＩＵ／ｍＬであってもよい。

前記接合体希釈液は、ヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）であってもよく、ヤギ血清の濃度は５〜２０（ｗ／ｖ）％であってもよい。

前記洗浄液は、酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）及び非イオン性界面活性剤を含んでもよい。

前記洗浄液の酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）の濃度は１０〜４０ｍＭ、前記洗浄液の塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）の濃度は７５〜３００ｍＭ、前記洗浄液の非イオン性界面活性剤の濃度は０．０２５〜０．１（ｗ／ｖ）％であってもよく、前記洗浄液のｐＨは４であってもよい。

前記（ｂ）工程は、室温で行われていり、１０〜１２０分、好ましくは３０〜９０分間、最も好ましくは分間反応させることができ、前記（ｄ）工程と（ｆ）工程は、室温で行われていり、１０〜６０分、好ましくは２０〜４０分間、最も好ましくは３０分間反応させることがでる。
前記（ｈ）工程で、吸光度は反応停止液を入れた後、３０分以内に測定波長４５０ｎｍと参照波長６２０ｎｍで測定することが好ましいが、これに限定されない。

前記（ｆ）工程での基質液はＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）、好ましくはＴＭＢ ＡとＴＭＢ Ｂで選択された一つ以上、特にＴＭＢ ＡとＴＭＢ Ｂの混合物が最も好ましいが、これに限定されず、通常の全ての基質液が使用できることは通常の技術者には自明である。

前記（ｇ）工程での反応停止液は、基質の発色を停止させる機能をするものであれば、いずれも制限せず使用可能で、硫酸溶液が好ましいが、これに限定されない。

以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡのヒト血清内力価測定試験
本実施例の目的は、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用してヒト血清で抗−ＨＢｓ抗体の力価を測定してＢＳＡ／ＰＢＳを利用する一般的なＥＬＩＳＡの結果と比較してバックグラウンド信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｎｏｉｓｅ）が減少することを確認して、ヒト血清で正常に抗−ＨＢｓ抗体の力価測定が可能であるか否かを確認することである。

本実施例で使用された試薬は下記のとおりである。
（１）抗−ＨＢｓ抗体
−ＧＣ１１０２力価標準品（ＧＣＣ、Ｌｏｔ．Ｎ７８７Ｒ８００３、１０，５００ｍＩＵ／ｍＬ、大韓民国登録特許第４６７７０６号参照）
−ＨＢ４８−３３（大韓民国登録特許第１０７２８９５号参照）
−ＨＢ４８−３５（大韓民国登録特許第１０７２８９５号参照）
−ＨＢ４８−５９（大韓民国登録特許第１０７２８９５号参照）
（２）ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ、１６１７０−０７８）
（３）ヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ、Ｇｉｂｃｏ、１６１７０−０７２）
（４）脱脂牛乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ、Ｄｉｆｃｏ、２３２１００）
（５）Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原コーティングされたジェネディアキットプレート（ＨｂｓＡｇ−ｃｏａｔｅｄ ＧＥＮＥＤＩＡ ｋｉｔ ｐｌａｔｅ，ＧＥＮＥＤＩＡ Ａｎｔｉ−ＨＢｓ ＥＬＩＳＡ ３．０，ＧＣＭＳ，Ｆ１１０３）
（６）ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０、Ｓｉｇｍａ、Ｐ１３７９）
（７）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、Ｓｉｇｍａ、Ａ０１７０）
（８）ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、５０−７６−０３）
（９）硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４、Ｒｉｅｄｅｌ、３０７４３）
（１０）塩化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ３０１４）
（１１）酢酸（Ｒｉｅｄｅｌ、２７２２５）
（１２）酢酸ナトリウム３水化物（Ｒｉｅｄｅｌ、２５０２２）
（１３）ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（Ｌｏｎｚａ、１７−５１６Ｑ）
（１４）ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）（Ｂｏｖｏｇｅｎ、ＢＳＡ１００）
（１５）ジェネディア抗−ＨＢＳ ＥＬＩＳＡ３．０（韓国緑十字ＭＳ、Ｆ１１０３）

分析に使用された試薬は次のような過程を経て製造された。
（１）濃度１０％（ｗ／ｖ）のツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）：
蒸溜水９０ｍＬにツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）原液１０ｇを入れてよく混ぜた。
（２）非活性ウシ血清とヤギ血清加熱（Ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ ＆ ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）：
常温または２〜８℃で溶解したウシ血清とヤギ血清を５６℃で３０分間加熱させて作った。
（３）希釈緩衝液（０．１％脱脂牛乳／０．０５％ツイン２０／１０％ウシ血清／９０％ＰＢＳ）：
加熱した非活性ウシ血清１００ｍＬ、１ｇの脱脂牛乳及び５ｍＬの１０％ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０）を入れて混ぜた後、ＰＢＳを利用して１Ｌにした。浮遊物がないようによく混ぜた後、０．４５フィルターを利用してろ過した後使用した。
（４）２次抗体複合コンジュゲート溶液（１：２０，０００）：
加熱した非活性ヤギ血清５ｍＬにヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的である）、ペルオキシダーゼコンジュゲーディド５を入れてよく混ぜて製造した溶液１ｍＬを加熱した非活性ヤギ血清１９ｍＬとよく混ぜた。
（５）基質液：
ＴＭＢペルオキシダーゼ基質Ａ（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）とＴＭＢペルオキシダーゼ基質Ｂ（ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｂ）を１：１でよく混ぜた。
（６）反応停止液：
硫酸２８ｍＬを蒸溜水９７２ｍＬにゆっくり混ぜた。
（７）洗浄液：
蒸溜水９００ｍＬに酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ ｔｒｉｈｙｒａｔｅ）２．７２２ｇ、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）８．７６６ｇ、１０％ツイン２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０）５ｇを入れて酢酸原液でｐＨを４．０に合わせた後、蒸溜水で最終的に１Ｌに合わせてよく混ぜた。
（８）１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳ：
ＰＢＳ１ＬにＢＳＡ１０ｇを入れて溶解した後使用した。
（９）ＰＢＳＴ
ＰＢＳ１Ｌにツイン２０ ５ｇを入れて泡が生じないようにゆっくり振って完全に溶解した後使用した。
１％ＢＳＡ／ＰＢＳをサンプル希釈液として使用するＥＬＩＳＡとヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡのサンプル希釈液、２次抗体、２次抗体希釈液及び洗浄液は下記の表１のとおりである。

抗−ＨＢｓ抗体力価測定診断試薬であるジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０を利用した抗体力価分析過程は下記のとおりである。診断試薬内マイクロウェルプレートに陰性標準液、標準液及び陰性標準液で１０〜２５倍希釈された検体を入れて、濃縮接合体液を接合体希釈液を利用して２６倍希釈して標準液、陰性標準液及び検体が入っているマイクローウェルに添加した後、軽く振ってよく混合して３７ １で６０分間反応させる。反応が終わった後、診断試薬内濃縮洗浄液を蒸溜水を利用して１０倍希釈して洗浄する。診断試薬内基質液を基質用緩衝液を利用して１０１倍希釈して洗浄されたプレートに入れて室温で３０分間反応させる。診断試薬内反応停止液を入れて反応を停止させる。

１％ＢＳＡ／ＰＢＳをサンプル希釈液として使用するＥＬＩＳＡ抗体力価の分析過程は下記のとおりである。ホルマリンが処理されなかった組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原をマイクロウェルプレートにコーティングした後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを利用してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）して標準溶液及びヒト血清試料を検体希釈液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で２５倍希釈してプレートに入れた後反応させた。反応が完了した後、ＰＢＳＴを利用して洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーディド抗−ヒトＩｇＧ抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｆａｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）と２次反応させて再びＰＢＳＴを利用して洗浄を実施した。２次反応後ＴＭＢ基質液を添加して発色させた後、硫酸溶液を添加して反応を停止させた。

ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用した抗体力価の分析過程は下記のとおりである。ホルマリンが処理されなかった組換えＢ型肝炎ウイルス表面抗原をマイクロウェルプレートにコーティングした後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを利用してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）して標準溶液及び検体希釈液（脱脂牛乳０．１（ｗ／ｖ）％、ツイン２０ ０．０５（ｗ／ｖ）％及びプロクリン３００ ０．０５（ｗ／ｖ）％が含まれた１０（ｗ／ｖ）％ウシ血清）で１０倍希釈されたヒト血清試料をマイクロウェルプレートに入れた後反応させた。反応が完了した後、洗浄液を利用して洗浄後ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｆｃ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーディド（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）と２次反応させて、ＴＭＢ基質を添加して発色させた。

１次分析では通常抗−ＨＢｓ抗体がないと知られるＢ型肝炎患者（ＨＢＳＡｇ（＋））１９人の血清を利用してヒト血清でヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡのバックグラウンド信号（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｎｏｉｓｅ）を確認した。まずジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬を利用してＢ型肝炎患者の血清に抗−ＨＢｓ抗体がないことを確認した（表２）。１％ＢＳＡ／ＰＢＳを利用して検体を希釈した時１９個の検体全てにおいて９００ｍＩＵ／ｍＬを超える高いバックグラウンド信号が現れたが、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡでは全ての検体で１００ｍＩＵ／ｍＬ未満とバックグラウンド信号がないことを確認した。

２次分析ではＢ型肝炎患者でないヒトの血清２１個を利用してヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡがヒトの血清でもバックグラウンド信号なしに正常な力価測定が可能であるか否かを確認した。バックグラウンド信号が現れるか否かを確認するために、ジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬を対照法で使用した。ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡは、検体２１個全てにおいて１次分析の時１％ＢＳＡ／ＰＢＳを検体希釈液として使用した時と同じような高いバックグラウンド信号を示さなく、ジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬と比較した時にもバックグラウンド信号の差を発見することができなかった（表３）。２次分析ではすでに高いバックグラウンド信号が現れると確認された１％ＢＳＡ／ＰＢＳを検体希釈液として使用するＥＬＩＳＡ力価測定法は使用しなかった。

１次及び２次分析結果で従来１％ＢＳＡ／ＰＢＳを検体希釈液として使用するＥＬＩＳＡ法は、抗−ＨＢｓ抗体力価がないにも関わらず９００ｍＩＵ／ｍＬを超える非常に高いバックグラウンド信号が現れたが、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡでは商用に販売中のジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬と同等な水準のバックグラウンド信号が現れることを確認した。これは、従来抗−ヒトＩｇＧ抗体を２次抗体として使用した時現れる高いバックグラウンド信号をヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡは効果的に制御する可能性があることを示す。

実施例２：ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡとＡＭＣを利用した力価測定比較試験
本実施例の目的は、韓国食品医薬品安全処（ＭＦＤＳ）のＢ型肝炎ヒト免疫グロブリンと国家標準品（ＫＦＤＡ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ０８／０２６）を利用して本発明に係るヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用した力価測定方法と血清内抗−ＨＢｓ抗体力価測定法（ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法）の相関を求めることである。本実施例で、Ｂ型肝炎ヒト免疫グロブリンは、国家標準品（９５．４５ ＩＵ／ｖｉａｌ，ＭＦＤＳ）を使用した。

本実施例で使用された試薬及び試薬の製造過程は、ジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬を除いた実施例１の試薬及び製造過程と同様である。
ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用した抗体力価の分析過程は実施例１と同様である。

ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法は、図１の（Ａ）のように従来の抗−ＨＢｓ抗体力価測定法のように、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原をコーティングした後、測定しようとする検体を反応させた後、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原にペルオキシダーゼ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）またはアルカリ性リン酸加水分解酵素（ａｌｋａｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）のような酵素を接合させた（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ；ＥＩＡ）法を使用するかＢ型肝炎ウイルスの表面抗原に１２５Ｉのような放射性同位元素を標識した放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏ−Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ；ＲＩＡ）を使用して力価を測定した。

ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法を利用した分析過程は下記のとおりである。陰性対照、陽性対照及び検体を試験管に分注した後、各試験管にＨＢｓ抗原がコーティングされたビーズ（ｂｅａｄ）を入れて室温振動反応または４５℃で９０分間反応させた。反応が完了した後、蒸溜水でビーズ（ｂｅａｄ）を３〜５回洗浄して１２５Ｉ−ＨＢｓを分注して室温振動反応または４５℃で９０分間反応させた。この反応後、蒸溜水でビーズ（ｂｅａｄ）を３〜５回洗浄した後２４時間内ガンマ線計測器で各試験管の放射能を１分間測定した。

分析試料の製造過程は下記のとおりである。
陰性対照、陽性対照及び検体を試験管に分注した後、各試験管にＨＢｓ抗原がコーティングされたビーズを入れて室温振動反応または４５℃で９０分間反応させた。反応が完了すると、蒸溜水でビーズを３〜５回洗浄して、１２５Ｉ−ＨＢｓを分注して室温振動反応または４５℃で９０分間反応させた。反応が完了すると、蒸溜水でビーズを３〜５回洗浄した後、２４時間内ガンマ線計測器で各試験管の放射能を１分間測定した。

１次分析では、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡで３０個の盲検検体を分析して、分析結果中ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの検出制限（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ，＜１０ｍＩＵ／ｍＬ）以下である二つの結果は最終結果に含ませなかった。ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法で３０個の盲検検体を分析して、分析結果中ＡＭＣ測定法の検出制限（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ，＜１０ｍＩＵ／ｍＬ）以下である二つの結果は含ませなかった。各測定法の平均％回収率を見ると、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡは、平均９５６．０％、ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法は、平均１４７１２．９％と確認され、分析結果は下記の表４のとおりであった。

２次分析では、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡで２８個の盲検検体を分析して、分析結果中ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの検出制限（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ，＜１０ｍＩＵ／ｍＬ）以下である四つの結果は最終結果に含ませなかった。ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法で２８個の盲検検体を分析して、分析結果中ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法の検出制限（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ，＜１０ｍＩＵ／ｍＬ）以下である四つの結果は含ませなかった。各測定法の平均回収率（％）を見ると、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡは、平均９６７．１％、ＡＭＣ測定法は、平均１４０１６．４％と確認されて、分析結果は下記の表５のとおりである。

各測定法の回収率（％）を利用して１次及び２次分析結果（調製機関の差）に対する２標本ｔ検証（２−Ｓａｍｐｌｅ ｔ−ｔｅｓｔ）を行った（９５％信頼水準）。ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの１次分析結果と２次分析結果に対する有意確率（Ｐ−ｖａｌｕｅ）は０．５６５であって、ＡＭＣ測定法の１次分析結果と２次分析結果に対する有意確率（Ｐ−ｖａｌｕｅ）は０．１１２と確認された。１次分析結果と２次分析結果に対する二つの有意確率（Ｐ−ｖａｌｕｅ）評価が０．０５以上であるため、１次分析結果と２次分析結果の差はないと見て、以後結果分析は、１次と２次結果を合わせた最終分析結果を利用した（表６）。

最終分析結果で各測定法の平均回収率（％）を見ると、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡは平均９６６．５％、ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法は平均１４４１４．８％と確認された。エクセルを利用した線形回帰分析結果、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡは国家標準品の理論力価対比９３．３％の％回収率を示し、ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法は国家標準品の理論力価対比１４１．５％の％回収率を示した（表６）。また、Ｒ２値も０．９９以上で線形回帰分析モデルの説明力が非常に高いと言える（図４）。

ブランドアルトマンプロット（Ｂｌａｎｄ ＆ Ａｌｔｍａｎ ｐｌｏｔ）を介して二つの測定法の同等性を評価した。プロットは９５％信頼区間（１．９６ＳＤ）内に分布しているが、プロットの平均ｙ値が３９．９％であり（図５）、下記の式のような関係が成り立つことを確認した。
ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法結果−ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ結果＝０．３９９測定法結果間の平均
すなわち、二つの測定法結果の差が二つの測定法結果平均の３９．９％だけあって、この結果を介して二つの測定法及び分析結果は同等でないことが確認された。

相関係数はピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）相関係数で評価して（９５％信頼水準、ＪＭＰ ｖ８．０）、ピアソン相関係数が０．９９６（有意確率（Ｐ−ｖａｌｕｅ）＝０．０００）と二つの試験法の分析結果は強い正の相関関係があることが分かった。

ｘ軸をヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの力価分析値にしてｙ軸をソウル牙山（アサン）病院核医学科のＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法力価分析分にして回帰分析を行った。回帰分析結果の下記の線形回帰式を得て、係数に対する有意確率（Ｐ−ｖａｌｕｅ）は０．０００で有意水準０．０５で高度に有意であった。
ＲＩＡ（ＡＭＣ）＝１．５１ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ［線形回帰式］

この結果を介して従来の検体希釈液を使用して国家標準品を希釈した時、ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法の分析結果、５００ｍＩＵ／ｍＬはヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの分析結果平均３３１ｍＩＵ／ｍＬと同等であると言える。

すなわち、本実施例の実験結果を介してヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの分析結果は、国家標準品を正しく評価するが（線形回帰分析結果９３．３％回収率）、ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定法は国家標準品を１．４倍高く評価することが確認された（線形回帰分析結果１４１．５％回収率）。二つの測定法の分析結果は、強い正の相関関係を有していて（ピアソン相関係数で評価）、ＲＩＡ（ＡＭＣ）測定結果は、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ測定結果よりも１．５１倍高く測定することを確認して、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ測定法を介した抗体力価測定が従来の測定方法に比べて同等な測定精度を有していて、より正確な抗体量を測定する可能性があることを確認した。

実施例３：ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡとＡＭＣを利用した力価測定比較試験
本実施例の目的は、本発明に係るヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡと１％ＢＳＡ／ＰＢＳを検体希釈液で使用するＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ（ＡＭＣ）及びジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬等、計４種類の抗−ＨＢｓ力価測定方法の間の抗−ＨＢｓ力価測定値をＢ型肝炎が原因で肝移植実施後、Ｂ型肝炎の再発を予防するためにＢ型肝炎ヒト免疫グロブリン（ＨＢＩＧ；Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の投与を受けている患者の血清１５６個を利用して比較分析することである。

ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを検体希釈液で使用するＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ（ＡＭＣ）及びジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬等に使用された試薬及び試薬製造方法は、前記実施例１及び２と同様である。また、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを検体希釈液で使用するＥＬＩＳＡ及びジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬等の分析方法は、前記実施例１と同様であり、ＲＩＡ（ＡＭＣ）の分析方法は前記実施例２と同様である。

従来の１％ＢＳＡ／ＰＢＳを検体希釈液で使用するＥＬＩＳＡ力価測定方法とＲＩＡ（ＡＭＣ）とそれぞれ比較した時、図６のようにＲＩＡ（ＡＭＣ）で０に近い低い力価を示す検体が１％ＢＳＡ／ＰＢＳ方法を使用した時には最大２，０００ｍＩＵ／ｍＬまでバックグラウンド信号が高く現れた。これは、前記実施例１と似た結果である。また、二つの方法間の相関もＲ２＝０．４５８２と低く示されて、傾向線回帰式の傾きも０．４８５７とＲＩＡ（ＡＭＣ）が同じ検体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ方法に比べて高く測定することが分かった。

一方、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡとＲＩＡ（ＡＭＣ）を比較した時、図７で見るようにヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを使用しながらバックグラウンド信号が効果的に除去されることを確認して、Ｒ２＝０．７１８１と１％ＢＳＡ／ＰＢＳ方法に比べてＲＩＡ（ＡＭＣ）との相関が改善されたことを確認した。しかし、二つの方法間傾向線回帰式の傾きは０．５０１５であり、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ方法と比較した時と同様にＲＩＡ（ＡＭＣ）方法がヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ方法に比べて高く測定されることを確認した。これは実施例２の結果とも非常に類似することが分かる。

ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡとジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬を比較した時、図８のように二つの方法間Ｒ２＝０．８６２７と高い相関を示し、傾向線回帰式の傾きも１．００６８と二つの方法間測定値が略同一であることを確認した。

以上の図６〜図８の結果から見るように、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡはヒトの血清で従来の１％ＢＳＡ／ＰＢＳ方法が有する高いバックグラウンド信号を効果的に下げて商業的に販売されているＲＩＡ及びジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬と高い相関を示して、特にジェネディアアンチエイチビーエスＥＬＩＳＡ３．０診断試薬とは測定結果でも略同一であることを確認した。

実施例４：ＧＣ１１０２を利用したラット血清内抗−ＨＢｓ抗体力価測定
本実施例は、ヒト血清内抗Ｂ型肝炎ウイルス表面（ａｎｔｉ−ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ、抗−ＨＢｓ）抗体の力価測定のための本発明に係るヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用した力価測定法がラット（Ｒａｔ）血清内抗−ＨＢｓ抗体（ＧＣ１１０２、ＩＶ−Ｈｅｐａｂｉｇ株及びＩＶ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓ株に混合されたＧＣ１１０２の抗−ＨＢｓ抗体力価）の定量も可能であることを確認するために進行された。

本実施例に使用された標準品（Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）及び試料（Ｓａｍｐｌｅｓ）は、下記のとおりである。
（１）標準品：ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの標準品、抗−ＨＢｓ力価１０，５００ＩＵ／ｍＬ。
（２）ＧＣ１１０２：抗−ＨＢｓ単クローン抗体、抗−ＨＢｓ力価１０，５００ＩＵ／ｍＬ。
（３）ＩＶ−ヘパビッグ株（ＩＶ−Ｈｅｐａｂｉｇ株）：定注用ヘパビッグ株１０ｍＬ、抗−ＨＢｓ力価２７０．５ＩＵ／ｍＬ。
（４）ＩＶ−グロブリンエス株（ＩＶ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓ株）：アイブイ−グロブリンエス株１０ｍＬ、抗−ＨＢｓ力価２．２Ｕ／ｍＬ。

本実施例で使用された試薬は、前記実施例に使用されたのと同一で、検体希釈液、接合体希釈液及び洗浄液等を含む試薬の調製も前記実施例と同様の方法で製造されたのを使用して、標準液はＧＣ１１０２力価標準品を希釈緩衝液で希釈して、０、１０、５０、１００、１５０、５００、１０００ＩＵ／ｍＬの濃度に調製して標準曲線を求めた。

ＧＣ１１０２（１０，５００ＩＵ／ｍＬ）及び定注用ヘパビッグ株（ＩＶ−Ｈｅｐａｂｉｇ株、２７０．５ＩＵ／ｍＬ、韓国緑十字）のＱＣ試料はＧＣ１１０２をラット血清で希釈してそれぞれ２００、１０００、４０００、８０００ｍＩＵ／ｍＬの濃度に調製して使用した。

ＧＣ１１０２＋ＩＶ−グロブリンＳ株（ＩＶ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓ株、韓国緑十字）のＱＣ試料はＩＶ−グロブリンＳ株（ＩＶ−Ｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓ株）のタンパク濃度（ｍｇ／ｍＬ）を定注用ヘパビッグ株とタンパク濃度と同様に緩衝液を利用して調整して、定注用ヘパビッグ株と同じ抗−ＨＢｓ抗体力価を示すように混ぜて混合液を作った。作られた混合液をラット血清で希釈してそれぞれ２００、１０００、４０００、８０００ｍＩＵ／ｍＬの濃度に調製して使用した。

ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用した定注用ヘパビッグ株の抗−ＨＢｓ抗体力価分析は、定注用ヘパビッグ株のＬｏｔ．１５０Ｈ８０２８に対する代表成績書に明示されているａｎｔｉ−ＨＢｓ抗体力価２７０．５ＩＵ／ｍＬがヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用して分析した時、約２７０．５ＩＵ／ｍＬが出てくるか確認した。検体はヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの検体希釈液で８００倍、１，６００倍、３，２００倍、６，４００倍希釈した定注用ヘパビッグ株を利用した。

正確性評価は一濃度当たり６回の繰り返し試験を行って、分析範囲内の四つの濃度をスパイキン（ｓｐｉｋｉｎｇ）してテストした。％回収率（％ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，％ＲＥ）で評価して８０〜１２０％範囲内で測定されるか確認した。

精度評価は一濃度当たり６回の繰り返し試験を行って、分析範囲内の四つの濃度をｓｐｉｋｉｎｇしてテストした。精度は％変動係数（％ Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，％ＲＳＤ）で評価して１５％以内で測定されるか確認して、一つの基準に２回繰り返し試験を行って得た結果値の間の％ＲＳＤが１５％以内に入るか確認して評価する実験内精度（Ｉｎｔｒａ−Ａｓｓａｙ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）と１日３回繰り返し試験を行って得た結果値の間の％変動係数が１５％以内に入るか確認して評価する実験間精度（Ｉｎｔｅｒ−Ａｓｓａｙ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を進行した。

選択性評価は、８匹のラットの血清を利用して生物学的媒質の干渉効果（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）がないことを示した。８匹のＲａｔ血清にＧＣ１１０２ ５０ｍＩＵ／ｍＬをスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）して回収率を確認して干渉効果がないことを確認した。

その他本実施例に使用された試験方法は、前記実施例１のヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ方法と同じ方法を使用した。
１）ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用したＩＶ−ヘパビッグ株の抗−ＨＢｓ抗体力価分析
ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用してヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡの検体希釈液で８００倍、１，６００倍、３，２００倍、６，４００倍希釈されたＩＶ−ヘパビッグ株の抗−ＨＢｓ抗体力価を測定した。分析結果、２７６．０ＩＵ／ｍＬ（％ＲＳＤ４．７％）で定注用ヘパビッグ株の代表成績書結果である２７０．５ＩＵ／ｍＬと標準偏差以内で同等に測定されて定注用ヘパビッグ株のような血しょう由来ＨＢＩＧ製剤の抗−ＨＢｓ抗体の出荷試験のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ力価測定のために、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを使用する可能性があることを確認した（表７）。

２）ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用してラット血清内ＧＣ１１０２抗体力価測定
ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用してラット血清内ＧＣ１１０２抗体力価測定するためにラット血清にＧＣ１１０２が８，０００、４，０００、１，０００、２００ｍＩＵ／ｍＬスパイキング（ｓｐｉｋｉｎｇ）されたＱＣ試料をヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡ１．１で分析して正確性、実験内精度、実験間精度を確認した。ラット血清に２００ｍＩＵ／ｍＬ、１，０００ｍＩＵ／ｍＬ、４，０００ｍＩＵ／ｍＬ、８，０００ｍＩＵ／ｍＬのＧＣ１１０２をスパイキングして計６回繰り返しテストした。％回収率は８８．８〜１０７．５％、実験内精度は％ＲＳＤ１３．７％以内、実験間精度は、％変動係数１１．０％以内で測定されてヒトの血清だけでなくラット血清でもヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用してＧＣ１１０２の抗−ＨＢｓ力価測定が可能であることを確認した（表８）。

３）ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用したラット血清内ＩＶ−ヘパビッグ株抗体力価測定
ラット血清にＩＶ−ヘパビッグ株が８，０００、４，０００、１，０００、２００ｍＩＵ／ｍＬスパイキングされたＣ試料をヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡで分析して正確性、実験内精度、実験間精度を確認した。ラット血清に２００ｍＩＵ／ｍＬ、１，０００ｍＩＵ／ｍＬ、４，０００ｍＩＵ／ｍＬ、８，０００ｍＩＵ／ｍＬのＩＶ−ヘパビッグ株をスパイキングして計６回繰り返しテストした。％回収率は、９２．２〜１１１．８％、実験内精度は、％変動係数１１．４％以内、実験間精度は、％変動係数６．８％以内で測定されてラット血清でもヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用して血しょう由来ＨＢＩＧのような製剤の抗−ＨＢｓ力価測定が可能であることを確認した（表９）。

４）ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用したラット血清内ＧＣ１１０２＋ＩＶ−グロブリンＳ株抗体力価測定
ラット血清にＧＣ１１０２＋ＩＶ−グロブリンＳ株が１：２４で混合された混合液が、８，０００、４，０００、１，０００、２００ｍＩＵ／ｍＬスパイキングされたＱＣ試料をヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡで分析して、正確性、実験内精度、実験間精度を確認した。ラット血清に２００ｍＩＵ／ｍＬ、１，０００ｍＩＵ／ｍＬ、４，０００ｍＩＵ／ｍＬ、８，０００ｍＩＵ／ｍＬのＩＶ−ヘパビッグ株をスパイキングして計６回繰り返しテストした。％回収率は、８３．８〜１０２．８％、実験内精度は、％変動係数７．５％以内、実験間精度は、％変動係数７．８％以内で測定されて、ＧＣ１１０２とＩＶ−グロブリンのようなグロブリン製剤の混合物もヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用して抗−ＨＢｓ力価測定が可能であることを確認した（表１０）。

５）選択性評価
選択性を確認するために、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡを利用して８匹のラット血清及びラット血清に５００ｍＩＵ／ｍＬがスパイキングされた検液を分析した。８匹のラット血清を利用してヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡで分析した時、全てのラット血清で抗−ＨＢｓ抗体力価陰性と測定されて、ＧＣ１１０２ ５００ｍＩＵ／ｍＬを各ラット血清にスパイキングして分析した時、回収率は、９６．０〜１０６．２％と測定されて、ラット血清内の他のコンポーネントに対する干渉効果がないことを確認した（表１１）。

ＧＣ１１０２以外の他の抗−ＨＢｓ抗体であるＨＢ４８−３３、ＨＢ４８−３５及びＨＢ４８−５９（大韓民国登録特許第１０７２８９５号参照）を利用した場合にも、ヘパビッグ−ジーンＥＬＩＳＡは、全ての抗体に対して全部ＧＣ１１０２と類似して従来の方法に比べて正確な力価を測定する可能性があることを確認することができた。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

本発明に係るＦｃ包含タンパク質の力価測定キットは、特異的抗原または官能基をコーティングして使用する従来の酵素免疫測定法を利用する力価測定キットでのヒトの血しょうまたは血清に存在する多くの非特異的なヒト抗体によって特異的なヒト抗体、ヒト化抗体またはヒトＦｃ融合タンパク質等のＦｃ包含タンパク質の力価を正確に測定できなかった限界を克服することができ、実験者間高い精度を維持しながらヒトの血しょうまたは血清でヒトＦｃ包含タンパク質の力価を測定することができる。

特に、従来のヒトＦｃ包含タンパク質、特にヒト抗体またはヒト化抗体の力価測定法は、最大１０〜１，０００ｍＩＵ／ｍＬの測定範囲を有するが、本発明に係るＦｃ包含タンパク質力価測定キットを利用した力価測定法は、はるかに広い範囲である１００〜１０，０００ｍＩＵ／ｍＬの測定範囲を有する。

また、本発明と類似する特定動物種から由来した抗体またはＦｃ包含タンパク質の同じ種の血しょうまたは血清での力価測定でも高い精度で力価を測定することができる。

Claims (8)

1. 下記を含むヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット：
   （ａ）ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、０．０５〜０．２％（ｗ／ｖ）の脱脂牛乳（ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）、０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤、及び０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）の防腐剤を含む検体希釈液；
   （ｂ）１０％（ｗ／ｖ）のヤギ血清を含む接合体希釈液；並びに
   （ｃ）１０〜４０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、７５〜３００ｍＭの塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）及び０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）の非イオン性界面活性剤を含む洗浄液。
2. 前記防腐剤は、プロクリン３００（Ｐｒｏｃｌｉｎ ３００）であることを特徴とする請求項１に記載のヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット。
3. 前記ヤギ血清（ｇｏａｔ ｓｅｒｕｍ）は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ）を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット。
4. 前記ヤギ抗ヒトＩｇＧは、ヒトＦｃ特異的であることを特徴とする請求項３に記載のヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット。
5. 前記ヒトＦｃ包含タンパク質とは、ヒト抗体、ヒト化抗体および融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）で構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット。
6. 前記洗浄液のｐＨは、３〜５であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定キット。
7. （ａ）ヒトＦｃ包含タンパク質を含む検体を検体希釈液を利用して希釈する工程；
   （ｂ）様々な濃度で希釈された標準液と前記検体希釈液を目標抗原が吸着したプレートウェルに入れて反応させる工程；
   （ｃ）各ウェルの内容物を吸引して出して、洗浄液で洗浄する工程；
   （ｄ）各ウェルの残余洗浄液を完全に除去した後、接合体希釈液を各ウェルに入れて、反応させる工程；
   （ｅ）各ウェルの内容物を吸引して出して洗浄液で洗浄する工程；
   （ｆ）各ウェルの残余洗浄液を完全に除去した後、基質液を各ウェルに入れて反応させる工程；
   （ｇ）反応停止液を各ウェルに入れて反応を停止させる工程；及び
   （ｈ）標準液及び検体の吸光度を測定する工程；
   を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のキットを利用したヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定方法。
8. 前記ヒトＦｃ包含タンパク質を含む検体は、ヒト血清、ヒト血しょう及びヒト血液で構成された群から選択された一つ以上であることを特徴とする請求項７に記載のヒトＦｃ包含タンパク質の力価測定方法。