JP6408910B2 - 細胞培養システム及び細胞培養方法 - Google Patents
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Description
(細胞培養システム)
培養装置としては、8連動動物培養装置Bio Jr.8(BJR−25NA1S−8C、エイブル株式会社)を使用した。本装置は、1台のコントローラーで8台の100mL容量の細胞培養槽を制御可能で、測定・制御項目は攪拌速度、温度、pH、及び溶存酸素濃度(DO)で各培養槽は独立に制御できる。
培養細胞としてはマウスES細胞(EMG7株)を選択した。
(培養0日目から培養3日目)
細胞培養槽としてガラス製の専用槽(エイブル株式会社)使用し、培養液を100mLとした。
マウスES細胞を密度1x10^5 cells/mLとし、培養を開始した。この時点を培養0日目とした。
培養液としては、Glasgow最少必須培地(GMEM、インビトロジェン社)に以下の成分を添加して使用した。
すなわち、10%ウシ胎児血清(FBS、株式会社ニチレイ)、0.1mM非必須アミノ酸(NEAA、インビトロジェン社)、1mMピルビン酸ナトリウム(Na−pyruvate、シグマ社)、0.1mM 2−メルカプトエタノール(2−ME、インビトロジェン社)となるように培養液を調製した。
3日目までこのまま培養し、ES細胞の会合体である胚様体(EB:Embryoid body)を形成させた。
細胞培養槽には攪拌回転翼を設置し、回転数は85rpmとした。
細胞培養槽には、温度、pH、溶存酸素濃度をそれぞれ計測可能なセンサーを設置した。
また、溶存酸素濃度は40%に制御される設定とし、そのために酸素、窒素、空気の混合ガスが細胞培養槽内の培養液に対して上面通気となるようにガス導入ラインを設置した。さらにガスを槽から排出する導出ラインを設置した。
培養3日目に得られた全細胞数を算出し、以下のように実施例1と比較例の培養方法に分割し培養を再開した。一つの培養槽あたりの細胞密度は1.8x10^5 cells/mLとした。
さらに、細胞培養槽内には細胞隗が培養液とともに培養槽の外側に出てしまうことを防止するための手段としてポリエチレンの焼結体からなる直径15mm、平均孔径30μmの平板型膜を設置した。
成分調整液槽は容量1Lのガラス製滅菌ビンを使用した。
槽の蓋の部分に通気ライン、培養液の入口、出口ラインを設置した。
培養液成分調整手段は、旭ポリスルホンダイアライザーAPS(旭化成クラレメディカル株式会社)の中空糸を400本束ねて有効長20cmとなるように中空糸両端部の管腔構造が解放されるようにウレタン接着剤にて固定したものを使用した。
培養液成分調整手段は、成分調整液貯留手段の内部に設置し、中空糸束の両端部と培養液の入口、出口ラインを回路にて接続した。
成分調整液としては、細胞培養液にFBSを添加していない培養液を1L使用した。
送液回路としては、シリコン製チューブ(内径1mmφ、外径4mmφ)を用いた。
培養液の送液手段としては、ペリスタポンプ IPC−N4(ISMATEC社)を2台使用した。2台のポンプはそれぞれ細胞培養槽と成分調整液貯留槽を接続する送液回路に接し送液可能な状態に設置した。
以上説明した方法により、図2に示したような細胞培養システムを作製した。
ポンプの作動速度は、3日目から4日目は100mL/日、4日目から5日目までは400mL/日、5日目から10日目までは1,000mL/日とした。
細胞培養槽の液容量が実質的に同じレベルを維持できるようにしながら2台のポンプ流速を微調整し、10日目まで連続的に培養液を灌流しながら培養を実施した。
10日目に細胞培養を終了し、細胞数の測定をおこなった。
(細胞数の測定)
培養10日目に胚様体を細胞培養槽から回収し、0.25%トリプシン/EDTA(インビトロジェン社)にて処理し単細胞の状態とした後、トリパンブルー色素にて死細胞を染色し、生細胞のみを計算盤を用いてカウントした。
培養液中の乳酸濃度の変化は、細胞培養槽から少量の培養液を採取したのち、多機能バイオセンサBF−7(王子計測機器株式会社)を用いて測定した。
(EBの円相当径測定)
EBの円相当直径は、光学顕微鏡ECLIPSE Ti−U(株式会社ニコン)を用いてEBの画像を撮影したのち、画像解析ソフト(Nikon ElementsD、株式会社ニコン)を用いてEBの外周長を測定し、その値から真円の場合の円相当直径算出した。各サンプルから100個のEBの円相当直径を測定し、円相当直径の頻度分布を作成した。
(EB内部細胞のTUNEL染色)
EB内部の細胞がどの程度アポトーシスを生じているかについて判定するためにTUNEL染色を行った。
各サンプルから、EBの凍結切片を作製し、アポトーシス検出キット(タカラバイオ株式会社)をもちいて死細胞を染色した。
培養3日目までの装置を用いて、10日目まで培養を継続した。
4及び5日目に1回、6から9日目に2回の培養液の交換を実施した。
培養液の交換は、細胞培養槽の撹拌を止めて胚様体を沈降させた後、装置から細胞培養槽を切り離し、クリーンベンチ内で培養液上清を抜きとったのち、新鮮な培養液を添加する方法とした。
培養液交換は合計10回実施し、合計1Lの培養液を使用した。
実施例1で用いた装置から、成分調整液貯留槽から細胞培養槽に向かってつながる送液回路に設置されたポンプを取り外した装置を用いて培養を継続した。培養継続とともに細胞培養槽内の培養液量が減少し始め、培養継続が困難となり培養を中止した。
培養10日目の実施例1及び比較例1の培養により得られた総細胞数を以下に示す。
実施例1の総細胞数 4.6x10^8個
比較例1の総細胞数 3.4x10^8個
培養10日間の実施例1及び比較例1の細胞培養槽内細胞培養液の乳酸濃度変化を図7に示した。
培養10日目の実施例1及び比較例1の培養結果、得られたEBのそれぞれの円相当直径を図8に示した。
培養10日目の実施例1及び比較例1の培養の結果、得られたEBの凍結切片の染色結果を図9に示した。アポトーシス細胞が茶色に染色された。
培養細胞としては実施例1と同様にマウスES細胞(EMG7株)を選択した。
(胚様体培養)
(培養0日目から培養3日目)
実施例1の培養0日目から培養3日目と同様の方法で細胞培養槽4個を使用しES細胞を培養した。
実施例2においては、図5に示したような細胞培養システムを作製した。すなわち、培養3日目に上記4個の細胞培養槽から得られた全細胞数を算出し、ひとつのガラス製の大型培養槽(エイブル株式会社)に細胞密度1.7x10^5cells/mLとし集めた。培養液容量を1Lとした。上記培養槽を動物細胞培養装置 BCP(BCP−03NP3S、エイブル株式会社)に設置して培養を開始した。
培養液としては、実施例1と同じものを用いた。
細胞培養槽には攪拌回転翼を設置し、回転数は60rpmとした。
細胞培養槽には、温度、pH、溶存酸素濃度をそれぞれ計測可能なセンサーを設置した。
また、溶存酸素濃度は40%に制御される設定とし、そのために酸素、窒素、空気の混合ガスが細胞培養槽内の培養液に対して上面通気となるようにガス導入ラインを設置した。さらにガスを槽から排出する導出ラインを設置した。
さらに、細胞培養槽内には細胞隗が培養液とともに培養槽の外側に出てしまうことを防止するための手段としてポリエチレンの焼結体からなる直径47mm、平均孔径30μmの平板型膜を液上面に設置した。
成分調整液槽には容量10Lのポリプロピレン製タンクを使用した。
槽の蓋の部分に通気ライン、培養液の入口、出口ラインを設置した。
培養液成分調整手段は、持続緩徐式血液濾過器エクセルフローAEF-03(旭化成クラレメディカル株式会社)を使用した。
培養液成分調整手段は、細胞培養槽、成分調整液貯留槽の外部に独立して設置した。
細胞培養槽から上記平板型膜を通過して取り出された培養液が中空糸内側を流れるように培養液の入口ラインを回路にて接続した。次に中空糸内側を通過してきた培養液が培養槽に戻るように出口ラインを回路にて接続した。
続いて、成分調整液が成分調整液貯留槽から取り出されて培養液成分調整手段の中空糸外側を通過して、成分調整液貯留槽に戻るように入口ライン、出口ラインを接続した。
成分調整液としては、血清を加えていない細胞培養液を10L使用した。
送液回路としては、フロンチューブ(内径2mmφ、外径4mmφ)を用いた。
培養液の送液手段としては、ペリスタポンプ IPC−N4(ISMATEC社)を3台使用した。3台のポンプはそれぞれ細胞培養槽と培養液成分調整手段、培養液成分調整手段と成分調整液貯留槽を接続する送液回路に接し送液可能な状態に設置した。
さらに、細胞培養槽には液面検知手段としてレーザー式検知器(株式会社キーエンス)を取り付け、液面の上昇が起こったときには、ペリスタポンプの流速を止めるようにプログラムした調整器を出口ライン1の送液ポンプとの間に設置した。
以上説明した方法により、図5に示したような細胞培養システムを作製した。
培養10日目の実施例及び比較例の培養により得られた総細胞数を以下に示す。
実施例2の総細胞数 5.7x10^9個
以上の結果から実施例に係る細胞培養システムによればスケールアップが容易であることが確認できた。
培養細胞としては市販の浮遊細胞であるCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣由来、ライフテクノロジーズ社)を選択した。
実施例3においては、図3に示したような細胞培養システムを作製した。すなわち、細胞培養槽としてカルスターフラスコ(ダブルアーム型、撹拌セット付、柴田科学)を使用し、培養液を300mLとした。
CHO細胞を播種密度2x10^5 cells/mLとし、培養を開始した。この時点を培養0日目とした。
培養液としては、CD−CHO培地(ライフテクノロジーズ社)を使用した。
細胞培養槽には攪拌回転翼を設置し、回転数は80rpmとした。
細胞培養槽は上記の培養槽の蓋部分に培養液の取り出しと返却が可能な口を設置した。
成分調整液槽は容量500mLのガラス製滅菌ビンを使用した。
細胞培養槽の蓋の部分に通気ライン、成分調整液の入口、出口ラインを設置した。
培養液成分調整手段は、旭ポリスルホンダイアライザーAPS(旭化成クラレメディカル株式会社)の中空糸を100本束ねて有効長25cmとなるように中空糸両端部の管腔構造が解放されるようにウレタン接着剤にて固定したものを使用した。
培養液成分調整手段は、細胞培養槽の内部に設置し、中空糸束の両端部と成分調整液の入口、出口ラインを回路にて接続した。
成分調整液としては、CD−CHO培地を300mL使用した。
送液回路としては、シリコン製チューブ(内径1mmφ、外径4mmφ)を用いた。
上記の2槽を37℃、5%CO2雰囲気下のインキュベータ(IP400、ヤマト科学)内に設置した。
成分調整液の送液手段としては、ペリスタポンプ (SJ−121H、ATTO社)を2台使用した。2台のポンプはそれぞれ細胞培養槽と成分調整液貯留槽を接続する送液回路に接し送液可能な状態に設置した。
以上説明した方法により、図3に示したような細胞培養システムを作製した。
ポンプの初期作動速度は、0日目から4日目は0.22mL/分、4日目から7日目までは0.62mL/分とした。
細胞培養槽の液容量が実質的に同じレベルを維持できるようにしながら2台のポンプ流速を微調整し、7日目まで連続的に培養液を灌流しながら培養を実施した。
(比較例3)
実施例の細胞培養槽のみとした装置(培養液成分調整手段もなし)を用いて、実施例と同様に7日目まで培養を継続した。
(結果)
培養7日目の実施例3及び比較例3の培養により得られた生細胞の密度を以下に示す。
実施例3の細胞密度 66.8x10^5cells/mL
比較例3の細胞密度 28.9x10^5cells/mL
以上のとおり単一細胞の形態で増殖する浮遊細胞においても実施例に係る細胞培養システムが有効であることが確認できた。
2 成分調整液貯留槽
3 培養液成分調整手段
4 送液回路
5 送液回路
6 送液手段
7 送液手段
8 フィルター
9 細胞培養液
10 成分調整液
11 通気フィルター
12 撹拌翼
13 撹拌回転子
14 通気フィルター
15 送液手段
16 送液回路
17 送液回路
18 液面検知手段
19 情報伝達回路
20 送液手段調整器
Claims (15)
- 細胞を培養するための細胞培養槽と、
成分調整液貯留槽と、
細胞培養液及び/又は成分調整液の入口と出口とを有し、半透膜を備える培養液成分調整手段と、
前記細胞培養槽及び/又は前記成分調整液貯留槽から前記培養液成分調整手段の入口に接続された入口接続送液回路と、
前記細胞培養槽及び/又は前記成分調整液貯留槽から前記培養液成分調整手段の出口に接続された出口接続送液回路と、
前記入口接続送液回路から前記培養液成分調整手段を経て前記出口接続送液回路に前記細胞培養液及び/又は前記成分調整液を灌流する手段と、
を備える細胞培養システムであって、
前記灌流する手段が、前記入口接続送液回路に設けられた送液手段と、前記出口接続送液回路に設けられた送液手段と、を備え、
前記入口接続送液回路に設けられた送液手段と、前記出口接続送液回路に設けられた送液手段と、を制御することにより、前記培養液成分調整手段を介して前記細胞培養槽内の前記細胞培養液の成分と前記成分調整液貯留槽内の前記成分調整液の成分とを連続的に調整可能であると同時に、前記細胞培養槽内の前記細胞培養液の量を実質的に一定に調整可能である、
細胞培養システム。 - 培養液成分調整手段が、中空糸状である
請求項1に記載の細胞培養システム。 - 前記培養液成分調整手段が前記成分調整液貯留槽内に配置されており、
前記培養液成分調整手段が前記細胞培養液の入口と出口とを有し、
前記入口接続送液回路が前記細胞培養槽から前記培養液成分調整手段の入口に接続されており、
前記出口接続送液回路が前記細胞培養槽から前記培養液成分調整手段の出口に接続されており、
前記灌流する手段が、前記入口接続送液回路から前記培養液成分調整手段を経て前記出口接続送液回路に前記細胞培養液を灌流する、
請求項1又は2に記載の細胞培養システム。 - 前記培養液成分調整手段が前記細胞培養槽内に配置されており、
前記培養液成分調整手段が前記成分調整液の入口と出口とを有し、
前記入口接続送液回路が前記成分調整液貯留槽から前記培養液成分調整手段の入口に接続されており、
前記出口接続送液回路が前記成分調整液貯留槽から前記培養液成分調整手段の出口に接続されており、
前記灌流する手段が前記入口接続送液回路から前記培養液成分調整手段を経て前記出口接続送液回路に前記成分調整液を灌流する、
請求項1又は2に記載の細胞培養システム。 - 前記培養液成分調整手段が前記成分調整液貯留槽及び前記細胞培養槽の外部に設置されており、
前記入口接続送液回路が、前記細胞培養槽から前記培養液成分調整手段の第1の入口に接続された第1の入口接続送液回路と、前記成分調整液貯留槽から前記培養液成分調整手段の第2の入口に接続された第2の入口接続送液回路と、を含み、
前記出口接続送液回路が、前記細胞培養槽から前記培養液成分調整手段の第1の出口に接続された第1の出口接続送液回路と、前記成分調整液貯留槽から前記培養液成分調整手段の第2の出口に接続された第2の出口接続送液回路と、を含み、
前記第1の入口と前記第1の出口を結ぶ空間と、前記第2の入口と前記第2の出口を結ぶ空間とを、前記半透膜が構成し、
前記灌流する手段が、前記第1の入口接続送液回路から前記培養液成分調整手段を経て前記第1の出口接続送液回路に前記細胞培養液を灌流し、かつ、前記第2の入口接続送液回路から前記培養液成分調整手段を経て前記第2の出口接続送液回路に前記成分調整液を灌流する、
請求項1又は2に記載の細胞培養システム。 - 前記入口接続送液回路に設けられた送液手段の1時間あたりの送液量V1と、前記出口接続送液回路に設けられた送液手段の1時間あたりの返液量V2とが、0.9 x V1≦ V2 ≦1.1 x V1であり、前記細胞を含んだ前記細胞培養液の総量の変動が10%以内である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の細胞培養システム。
- 前記入口接続送液回路に設置された、前記細胞培養槽内側端部に細胞又は細胞凝集塊を通過させず、前記細胞培養液を実質的に通過させるフィルターを更に備える、請求項3に記載の細胞培養システム。
- 前記第1の入口接続送液回路に設置された、前記細胞培養槽内側端部に細胞又は細胞凝集塊を通過させず、前記細胞培養液を実質的に通過させるフィルターを更に備える、請求項5に記載の細胞培養システム。
- a)請求項1〜8のいずれか1項に記載の細胞培養システムを設置することと、
b)前記細胞培養槽に、細胞及び前記細胞培養液を供給し、前記成分調整液貯留槽に前記成分調整液を供給することと、
c)前記細胞培養液及び/又は前記成分調整液を連続的に灌流するにことと、
を含み、
前記入口接続送液回路に設けられた送液手段の1時間あたりの送液量V1と、前記出口接続送液回路に設けられた送液手段の1時間あたりの返液量V2とを、0.9 x V1≦ V2 ≦1.1 x V1となるように制御し、かつ前記細胞を含んだ前記細胞培養液の総量の変動が10%以内になるように制御する、細胞培養方法。 - 少なくとも、細胞及び細胞培養液が入れられ、前記細胞を培養する細胞培養槽と、
有用物質を含有する成分調整液が入れられる成分調整液貯留槽と、
前記細胞培養液と前記成分調整液を接触させ物質交換を行う培養液成分調整手段と、
前記細胞培養槽の前記細胞培養液及び/又は前記成分調整液貯留槽の前記成分調整液を前記培養液成分調整手段に送液する送液手段と、
接触させた前記細胞培養液及び/又は前記成分調整液を前記培養液成分調整手段から返液する返液手段と、
を備え、
前記送液手段と、前記返液手段と、を制御することにより、前記送液手段の1時間あたりの送液量V1と、前記返液手段の1時間あたりの返液量V2とを、0.9 x V1≦ V2 ≦1.1 x V1にし、細胞培養液の前記細胞を含んだ前記細胞培養液の総量の変動を10%以内にする、
細胞培養システム。 - 少なくとも、細胞及び細胞培養液を細胞培養槽に入れて、前記細胞を培養する工程と、
前記細胞培養槽の前記細胞培養液及び/又は成分調整液貯留槽の成分調整液を送液手段により膜に送液する工程と、
前記細胞培養液と前記成分調整液を、前記膜を介して接触させる工程と、
前記膜を介して前記成分調整液に接触した細胞培養液及び/又は成分調整液を返液手段により前記細胞培養槽に返液する工程と、
前記送液手段と、前記返液手段と、を制御する工程と、
を含み、
前記制御する工程により、前記送液する工程での1時間あたりの送液量V1と、前記返液する工程の1時間あたりの返液量V2とを、0.9 x V1≦ V2 ≦1.1 x V1にし、細胞培養液の細胞を含んだ細胞培養液の総量の変動を、10%以内にする、細胞培養方法。 - 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜8、及び10のいずれか1項に記載の細胞培養システム。
- 前記哺乳動物細胞が、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、間葉系幹細胞、造血幹細胞、及び/又はこれらから分化誘導された細胞である、請求項12に記載の細胞培養システム。
- 前記細胞が浮遊培養可能な細胞、接着細胞、細胞凝集体を形成する細胞、及び/又は粒子状担体に接着可能な細胞である、請求項1〜8、及び10のいずれか1項に記載の細胞培養システム。
- 前記粒子状担体に接着可能な細胞は、細胞培養槽に細胞及び粒子状担体を入れて培養される、請求項14に記載の細胞培養システム。
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