WO2021199529A1 - 細胞培養装置及び培養方法 - Google Patents

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WO2021199529A1
WO2021199529A1 PCT/JP2020/047727 JP2020047727W WO2021199529A1 WO 2021199529 A1 WO2021199529 A1 WO 2021199529A1 JP 2020047727 W JP2020047727 W JP 2020047727W WO 2021199529 A1 WO2021199529 A1 WO 2021199529A1
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culture
culture tank
cell
cells
separation tube
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PCT/JP2020/047727
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French (fr)
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優史 丸山
優至 佐藤
靖彦 多田
悠午 鈴木
雅弘 岡野定
尚武 陳
亮介 高橋
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昭和電工マテリアルズ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0006—Modification of the membrane of cells, e.g. cell decoration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present disclosure relates to a cell culture device and a culture method.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-209761 describes in a perfusion culture (perfusion culture) that a culture medium in which cell metabolites are accumulated is used in the culture tank while continuously supplying a fresh culture solution into the culture tank.
  • a culture device that discharges and collects the cells to the outside is disclosed.
  • this culture device rapidly attenuates the disturbance of the culture solution due to stirring in the sedimentation separation tube. It is equipped with a sedimentation separation tube that can form a clear settling zone.
  • the cell support to which the cells are attached may be drawn into the separation tube.
  • the cell support When the cell support is drawn into the separation tube, it easily invades the upper part of the separation tube as the culture solution is discharged. In order to recover the cells, it is sometimes necessary to stop the perfusion and collect the cell support that has entered the inside of the separation tube. It is conceivable to slow down the perfusion rate so that it is not drawn into the separation tube, but it takes time to replace the medium and is inefficient.
  • An object of the present disclosure is to provide a cell culture apparatus capable of efficiently culturing cells. Another object of the present disclosure is to provide a culturing method capable of culturing cells efficiently.
  • This disclosure relates to the following embodiments.
  • a culture tank having a capacity of 0.5 L to 50 L, a separation tube extending from the inside to the outside of the culture tank and having an inner diameter of 0.5 cm to 5 cm, and a separation tube connected to the separation tube.
  • a pump, an intake port and an exhaust port provided in the culture tank, a medium supply port provided in the culture tank, and at least a part of the separation tube are provided, and the separation tube is adjusted to 30 ° C. to 45 ° C.
  • a cell culture device comprising a adjusting tool and a device for culturing.
  • a method of culturing including doing.
  • (6) The culture method according to (5), wherein the capacity of the culture tank is 0.5 L to 50 L.
  • the present disclosure it is possible to provide a cell culture device capable of efficiently culturing cells. Further, according to the present disclosure, it is possible to provide a culture method for efficiently culturing cells.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of a cell culture apparatus.
  • FIG. 2 is a schematic view showing another example of the cell culture apparatus.
  • FIG. 3 is a schematic view showing another example of the cell culture apparatus.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an example of a cell culture apparatus according to the present embodiment.
  • the cell culture apparatus 20 according to the present embodiment includes a culture tank 1 for culturing target cells, a separation tube 3, a pump 4, and a regulator (temperature regulator) 8.
  • a regulator temperature regulator 8.
  • FIG. 1 the routes connecting the intake port 5, the exhaust port 6, the medium supply port 7, and the recovery tank 9, which will be described later, are shown by lines for simplification.
  • the cell culture device 20 is for culturing cells, and here the cells may be those attached to a cell support. Although the cells are shown in circles in FIG. 1 for convenience, there are no particular restrictions on the shape of the cells attached to the cell support. The cells and cell supports will be described later.
  • the culture tank 1 contains a liquid medium 2c in an amount corresponding to the size of the culture tank 1.
  • the medium will be described later.
  • the size of the culture tank 1 is not particularly limited, and can be, for example, 0.5 L or more, 1 L or more, 2 L or more, 5 L or more, 10 L or more, 20 L or more, or 50 L or more, and in other embodiments, 80 L or more. As described above, a culture tank having a larger size may be used.
  • the cell culture apparatus 20 may be provided with a heater for keeping the temperature of the medium 2c contained in the culture tank 1 at a constant temperature, for example, around 37 ° C.
  • a stirrer 10 for stirring the medium when the internal medium is contained is provided inside the culture tank 1, a stirrer 10 for stirring the medium when the internal medium is contained.
  • the stirring speed of the stirrer 10 can be appropriately selected depending on the shape of the stirrer, the size of the culture tank 1, and the like.
  • an intake port 5 for supplying a mixed gas containing oxygen, carbon dioxide, etc. into the culture tank 1 an exhaust port 6 for discharging the mixed gas from the culture tank 1, and a liquid medium 2c are cultured.
  • a medium supply port 7 for supplying into the tank 1 is provided.
  • the intake port 5 is provided with a removable filter 11.
  • the filter 11 may be provided in only one of the intake port 5 and the exhaust port 6, or may be provided in both the intake port 5 and the exhaust port 6. If there is another structure that does not allow foreign matter to enter the intake port 5 and / or the exhaust port 6, the intake port 5 and / or the exhaust port 6 may not be provided with the filter 11.
  • the shape of the pores of the filter 11 may be any shape as long as it can prevent foreign substances such as microorganisms and impurities from entering the culture tank 1, and examples thereof include a circular shape, an elliptical shape, a rectangular shape, and a polygonal shape.
  • the hole diameter of the filter 11 means the diameter when the shape of the hole of the filter 11 is circular, and when the shape of the hole of the filter is other than circular, it is arbitrary to pass through the center point of the hole in the cross section of the hole. Means the length of the longest straight line of.
  • the pore size of the filter 11 can be, for example, in the range of 0.01 ⁇ m to 30.0 ⁇ m, and can be 0.2 ⁇ m or less.
  • the filter 11 can be, for example, a sterile filter.
  • the separation tube 3 extends from the inside of the culture tank 1 to the outside.
  • the inner diameter of the separation tube 3 is not particularly limited as long as the temperature of the culture supernatant passing through the inside can be adjusted by the adjusting tool 8 described later, and can be appropriately selected depending on the material of the separation tube 3 and the like.
  • the separation tube 3 according to one embodiment has an inner diameter of 0.5 cm to 5 cm or 1 cm to 4 cm.
  • the material of the separation tube 3 is not particularly limited, and examples thereof include glass, SUS, and resin.
  • the culture supernatant refers to a medium obtained after culturing cells for a certain period of time and accumulating metabolites of the cells.
  • the opening surface of the separation tube 3 at the outer end of the culture tank 1 is connected to the pump 4 in order to discharge the culture supernatant to the outside of the culture tank 1.
  • the culture supernatant is stored in the recovery tank 9 by the pump 4.
  • the pump 4 is not particularly limited as long as the culture supernatant can be discharged to the recovery tank 9, and for example, a positive displacement pump such as a peristaltic pump can be used. Further, the culture supernatant contained in the recovery tank 9 may be used for analysis of the internal state of the culture tank 1, and the culture supernatant recovered in the recovery tank 9 may be used for other purposes.
  • the opening surface of the separation tube 3 at the inner side end of the culture tank 1 is located in the medium 2c.
  • the distance D between the opening surface at the inner side end of the culture tank 1 of the separation tube 3 and the inner bottom surface of the culture tank 1 can be a distance that allows the culture supernatant to be discharged and does not cause precipitation, clogging, or the like.
  • the size of the culture tank 1, the cell density, the discharge rate and the like can be selected.
  • the distance D can be, for example, 0.1 cm or more, 0.5 cm or more, or 1.0 cm or more.
  • the upper limit of the distance D may be a position where the inner side end of the culture tank 1 of the separation tube 3 does not rise above the liquid level of the medium 2c housed in the culture tank 1 by the drive of the pump 4. It can be appropriately selected depending on the amount of liquid contained therein.
  • the inner side end of the culture tank 1 of the separation tube 3 is 80%, 85%, 90%, or 95% of the distance from the inner bottom surface of the culture tank 1 to the liquid level of the liquid contained in the culture tank 1. Can be the position.
  • the separation tube 3 is provided with an adjusting tool 8 in a portion extending to the outside of the culture tank 1.
  • the adjusting tool 8 can adjust the separation tube 3 to a constant temperature, for example, 30 ° C. to 45 ° C., 33 ° C. to 42 ° C., or 35 ° C. to 40 ° C.
  • a liquid flow is generated in the downward direction (direction from the outside of the culture tank to the inside of the culture tank) near the inner wall of the separation tube 3, and an upward direction (in the vicinity of the center).
  • the speed of the liquid flow (in the direction from the inside of the culture tank to the outside of the culture tank) may increase, and heat convection may occur.
  • the separation tube 3 is provided with the adjuster 8 to adjust the temperature difference between the vicinity of the inner wall of the separation tube 3 and the vicinity of the center to prevent the occurrence of heat convection. can.
  • the temperature of the separation tube 3 adjusted by the adjusting tool 8 is not limited to the above-mentioned temperature range as long as the temperature difference between the vicinity of the inner wall of the separation tube 3 and the vicinity of the center of the liquid arranged inside can be reduced. It can be appropriately selected depending on the temperature of the liquid contained inside the culture tank 1, the temperature of the space inside the culture tank 1, the temperature outside the culture tank 1, the temperature of the place where the cell culture device 20 is installed, and the like.
  • the regulator 8 may be provided in at least a part of the separation tube 3.
  • the regulator 8 is one of the separation tubes 3 located outside the culture tank 1. It may be provided in the whole area (the entire area of the separation tube 3 between the culture tank 1 and the pump 4) unlike the drawing, and may not come into contact with the liquid in the culture tank 1.
  • the separation pipe 3 located in the region may be provided in the entire area or a part thereof, or may be provided in two or more regions as a combination of one or more of these regions.
  • One or more adjusters 8 may be provided in each region.
  • the adjusting tool 8 may be any as long as it keeps or heats the separation tube 3, and examples thereof include a heat insulating material and a heater.
  • the generation of heat convection can be suppressed in the separation tube 3. Therefore, even if cells, for example, cells attached to a cell support are cultured in the culture tank 1, the cells are not easily drawn into the separation tube 3, and the cells and the culture supernatant can be efficiently separated. Further, in the case of culturing cells by pulling out only the culture supernatant through the separation tube 3 while adding the medium, that is, in the case of perfusion culture, the speed is faster than that of the culturing device without the adjusting tool 8. The culture supernatant can be withdrawn at, and fresh medium can be added at a faster rate.
  • ⁇ Culture method> The culture method according to this embodiment will be described.
  • the culturing method will be described with reference to the cell culturing device 20 shown in FIG. 1, but the culturing method according to the present embodiment is not limited to the method using the cell culturing device 20 shown in FIG. No.
  • the cells adhering to the cell support are suspended and cultured in the culture tank 1 provided with the separation tube 3 extending from the inside to the outside, and the culture supernatant in the culture tank 1 is cultivated. It includes discharging the culture supernatant to the outside of the culture tank 1 through the separation tube 3 and adjusting the temperature of the culture supernatant to 30 to 45 ° C. when passing through the separation tube 3.
  • the cells that can be cultured using the cell culture apparatus according to the embodiment according to the present disclosure are not particularly limited as long as they are cells capable of suspension culture, and may be floating cells or adhesive cells. good.
  • the cells may be those in which a plurality of cells come into contact with each other to form an aggregate during suspension culture, or they may adhere to a culture carrier to form a complex of cells and a culture carrier, and the cells may be simply formed during culture. It may float in the suspension as a single cell.
  • the adhesive cell may be any adhesive cell that can adhere to the cell support, and examples thereof include somatic cells and stem cells.
  • somatic cells for example, endothelial cells, epidermal cells, epithelial cells, myocardial cells, myoblasts, nerve cells, bone cells, osteoblasts, fibroblasts, fat cells, hepatocytes, renal cells, pancreatic cells, adrenal cells , Dental cells, gingival cells, bone membrane cells, skin cells, dendritic cells, macrophages and the like.
  • Adhesive cells are preferably animal-derived cells, and more preferably mammalian-derived cells. Mammals include, for example, humans, monkeys, chimpanzees, cows, pigs, horses, sheep, goats, rabbits, rats, mice, guinea pigs, dogs, cats and the like. Adhesive cells may be, for example, cells derived from tissues such as skin, liver, kidney, muscle, bone, blood vessel, blood, nervous tissue and the like.
  • Adhesive cells can be used alone or in combination of two or more.
  • the adherent cell may be a stem cell.
  • stem cells include somatic stem cells such as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, bone marrow stem cells, and germline stem cells, and can be mesenchymal stem cells or bone marrow mesenchymal stem cells. ..
  • Mesenchymal stem cells broadly mean somatic stem cells that are present in various tissues of an individual and can be differentiated into all or some of mesenchymal cells such as osteoblasts, chondrocytes and adipocytes. do.
  • the stem cells may further include induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells).
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • the floating cell may be any cell. Examples thereof include, but are not limited to, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), Vero cells, Jurkat, HL60, FM3A and the like.
  • the culture When cells are suspended and cultured, the culture is carried out as a cell suspension having a cell concentration of 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 8 cells / mL, although it depends on the type of cells, the presence or absence of a cell support, and the like. You can start.
  • the medium used for culturing cells preferably contains inorganic salts, amino acids, sugars, and water.
  • the medium may further contain any component such as serum, vitamins, hormones, antibiotics, growth factors, adhesion factors and the like.
  • a medium known as a basal medium for cell culture can be used as the medium.
  • any medium known to be used for culturing selected cells can be used without particular limitation.
  • DMEM Denbecco modified Eagle's medium
  • MEM Eagle's minimum essential medium
  • ⁇ MEM medium Eagle's minimum essential medium ⁇ modified type
  • the medium used for culturing can be free of heterologous components.
  • the medium containing no heterologous component include a serum-free medium, a limited culture medium (Chemically defined medium), and the like.
  • the medium containing no heterologous component is a substitute additive for serum (for example, Knockout Serum Replacement (KSR) (manufactured by Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (manufactured by Gibco), Glutamax (manufactured by Gibco), instead of the serum derived from animals. Company), etc.) can be included.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the cell support that can be used for cell culture is also called a microcarrier, and takes the form of beads having a diameter of several hundred ⁇ m, for example.
  • the cells can be obtained in a high culture area and high density by adhering the cells on beads floating in the medium and proliferating the cells.
  • the material of the cell support may be an organic substance, an inorganic substance, or a composite material thereof, and may be either soluble or insoluble.
  • organic substances include polystyrene, polyester, polyurethane, polyethylene, polypropylene, polyvinyl alcohol, (meth) acrylic polymers, (meth) acrylamide polymers, silicone polymers, epoxy resins, synthetic polymers such as urethane resins, cellulose, and the like. Natural polymers such as dextran, collagen, polygalacturonic acid, polyargicic acid, and gelatin can be mentioned, but are not limited thereto.
  • the inorganic substance include, but are not limited to, glass, ceramics, metals, alloys, metal oxides and the like.
  • the carrier one containing at least polystyrene is used.
  • Cell detachment from the cell support can be performed by enzymatically degrading the bond between the carrier and the cell. If the cell support is, for example, alginic acid, the enzyme used for degradation is trypsin.
  • a cell adhesion peptide such as collagen, laminin, fibronectin, or vitronectin or a partial peptide thereof may be bound to the cell support in order to improve the adhesion between the cell and the carrier.
  • cells are cultured by accommodating a predetermined amount of medium, cell support, and cells in the culture tank 1.
  • the cells adhere to the cell support in the medium, and by driving the stirrer 10 in the culture tank 1, the cells grow and proliferate while floating in the medium together with the cell support.
  • the discharge rate of the culture supernatant by the pump 4 may be equal to or lower than the sedimentation rate of the cells 2b (and the cell support 2a) that enter when the culture supernatant is passed through the separation tube 3, for example.
  • the linear velocity is 2.5 cm / min or less.
  • the temperature is adjusted to 30 ° C. to 45 ° C. when the culture supernatant is passed through the separation tube 3 discharged to the outside of the culture tank 1.
  • the culture supernatant can be adjusted to the temperature range by using the adjusting tool 8 for at least a part of the separation tube 3 outside the culture tank 1.
  • the regulator 8 can reduce the temperature difference between the temperature of the culture supernatant near the inner wall of the separation tube 3 and the temperature of the culture supernatant near the center of the separation tube 3, thereby suppressing heat convection. Can be done. As a result, even if cells, for example, cells attached to a cell support are cultured in the culture tank 1, the cells are less likely to be drawn into the separation tube 3, and the cells and the culture supernatant can be efficiently separated. Further, when culturing cells by pulling out only the culture supernatant through the separation tube 3 while adding the medium, the culture supernatant is pulled out at a faster speed as compared with the culture apparatus not provided with the adjusting tool 8. It is possible to add fresh medium at a faster rate. In this way, by discharging the culture supernatant and supplying the fresh medium faster, the cell density in the medium can be increased, and the cell culture can be performed efficiently.
  • the cell culture device 20 shown in FIG. 1 has been used for explanation, but the generation of heat convection inside the separation tube 3 is suppressed to reduce the contribution of the downward liquid flow, and the cells adhere to the cell support.
  • the configuration of the cell culture device 20 is not limited as long as the drawing of the cells into the separation tube 3 can be suppressed.
  • an embodiment including a separation tube in which the diameter of the separation tube 3 is smaller than the position outside the culture tank 1, a separation tube in which the direction of the separation tube 3 is changed horizontally from the position outside the culture tank 1 An embodiment to be provided, or an embodiment in which these are combined may be used.
  • a culture tank having a capacity of 0.5 L to 50 L, a separation tube extending from the inside to the outside of the culture tank and having an inner diameter of 0.5 cm to 5 cm, and a separation tube.
  • a pump connected to the culture tank, an intake port and an exhaust port provided in the culture tank, a medium supply port provided in the culture tank, and at least a part of the separation tube, and the separation tube is set to 30 ° C. to 45 ° C.
  • the intake port may include a filter.
  • FIG. 2 shows a schematic view showing an example of the cell culture apparatus according to this embodiment. Note that, in FIG. 2, the same reference reference numerals may be given to the configuration requirements common to those in FIG. 1, and the description may be omitted.
  • the cell culture device 22 shown in FIG. 2 includes a culture tank 1, a separation tube 3, a pump 4, an intake port 5, an exhaust port 6, a medium supply port 7, a regulator 8, and a medium component concentration measuring device. A 16 and an observation device 18 are provided.
  • the culture tank 1 the separation tube 3, the pump 4, the intake port 5, the exhaust port 6, the medium supply port 7, and the adjusting tool 8, the ones described in FIG. 1 above may be used.
  • the concentration measuring device 16 measures the concentration of at least one or more medium components in the medium in the culture tank.
  • the concentration measuring device 16 is not particularly limited, and for example, a measuring device based on near-infrared spectroscopy (NIR), Raman spectroscopy, enzyme electrode method, or the like can be used. Thereby, the change in the concentration of the medium component can be monitored by measuring the medium component.
  • the concentration of the medium component may be quantified using a calibration model.
  • the calibration model means a model in which the medium component concentration is calculated based on the measured values acquired by the concentration measuring device such as the spectral intensity, the current value, and the voltage value.
  • the method described in Anal. Chem. 2020, 92, 2946-2952 can be used, but the method is not limited thereto.
  • the observation device 18 observes the state of cells in the culture tank.
  • the observing device 18 is not particularly limited as long as it is a device capable of observing the state of cells, and may be an imaging device such as a camera, or an electrical measuring device including an electrical measuring unit. It may be both, or it may be another device.
  • the electric measurement unit can be connected to, for example, two or more conductive parts provided in the culture tank, and a direct current or an alternating current can be applied between the two or more electrodes, and the electric capacity or conductivity can be set to voltage. By changing the current, frequency, etc., it is possible to observe the inside of the incubator.
  • the cell culture device 30 shown in FIG. 3 includes a culture tank 1, a medium supply path 32, a discharge flow path 34, a NIR measuring unit 36 which is a concentration measuring device, and a capacitance sensor probe 38 of an electric measuring device. ..
  • a culture tank 1 includes a culture tank 1, a medium supply path 32, a discharge flow path 34, a NIR measuring unit 36 which is a concentration measuring device, and a capacitance sensor probe 38 of an electric measuring device. ..
  • the members not particularly described those described in FIGS. 1 and 2 may be used, and the members described in FIGS. 1 and 2 may be applied to the cell culture apparatus 30 shown in FIG.
  • the medium supply path 32 conducts from the storage unit 32a containing the fresh medium to the culture tank 1, and the fresh medium is supplied from the storage unit 32a to the culture tank 1 by driving the pump 32b.
  • the opening of the medium supply path 32 on the culture tank 1 side functions as a medium supply port.
  • the discharge flow path 34 conducts from the culture tank 1 to the accommodating portion 34a accommodating the excretion medium, and discharges the medium discharged by the drive of the pump 34b from the culture tank 1 to the accommodating portion 34a.
  • the portion of the discharge channel 34 extending from the inside to the outside of the culture tank 1 also functions as a separation tube.
  • the culture medium 39c and the cells 39d adhered to the support are housed in the culture tank 1.
  • the culture tank 1 may further include a stirrer 40 such as a stirrer blade, whereby the medium can be agitated during cell culture.
  • FIG. 3 shows a cell culture device 30 capable of monitoring by NIR.
  • the cell culture apparatus 30 is provided with a medium supply path 32 for supplying a fresh medium to the culture tank 1 and a discharge flow path 34 for discharging the used medium (culture supernatant) from the culture tank 1.
  • the culture tank 1 side of the discharge flow path 34 also serves as a separation pipe 3 (see FIG. 1).
  • a measuring unit 36 by NIR is provided on the discharge flow path 34, and the concentration of the component in the medium discharged from the culture tank 1, for example, the concentration of glutamine in the medium component is measured.
  • the drive of the pump provided in the cell culture device 30 is controlled based on the measurement result.
  • the pump whose drive is controlled may be a pump 32b for the culture medium supply path 32, a pump 34b for the discharge flow path 34, or a combination thereof.
  • the amount of fresh medium supplied to the culture tank 1 is adjusted according to the monitored concentration change of the medium component, and the amount of the medium component in the culture tank 1 is optimized.
  • the concentration of the medium component to be measured can be adjusted within a predetermined range. This makes it possible to efficiently carry out suspension culture of cells while monitoring changes in the concentration of medium components.
  • the pump 32b of the culture medium supply path 32 can be controlled based on the information obtained by the measuring unit 36.
  • the cell culture device 30 is provided with a capacitance sensor probe 38 as an electrical measurement device, and the number of cells (cell concentration) in the culture tank 1 is electrically measured.
  • the driving of the stirrer 10 in the culture tank 1 is controlled based on the measurement result, and the number of cells in the culture tank 1 is optimized. As a result, suspension culture of cells can be efficiently performed while monitoring the number of cells in the culture tank 1.
  • the cell number may be monitored in real time by a monitor for the result of electrical measurement.
  • the measuring unit 36 concentrate measuring apparatus
  • the sensor probe 38 observing apparatus control the driving of the pump and the stirring blade, respectively, and adjust the concentration of the medium component in the culture tank 1 and adjust the concentration.
  • the cell state in the culture tank 1 is not limited to this as long as it can be controlled.
  • the cell culture device 30 includes both a concentration measuring device and an observing device, but either one may be used.
  • the measuring unit 36 may measure the concentration of the medium component in the medium supplied to the culture tank 1. As a result, it is possible to more accurately monitor the change in the concentration of the medium component in the culture tank 1 from the concentration of the medium component in the medium supplied to the culture tank 1 and the concentration of the medium component discharged from the culture tank 1. Therefore, the concentration of the medium component in the culture tank 1 can be adjusted more precisely.
  • the cell culture device 30 includes one concentration measuring device 16 and one cell observing device 18, but one or more of them may be independently provided. Further, although the cell culture device 30 includes both the concentration measuring device 16 and the cell observing device 18, only the concentration measuring device 16 or the cell observing device 18 may be used. Further, the cell culture device 30 may be provided with an adjusting tool for preventing the entrainment of cells at the time of discharging the medium, and may not be provided with the adjusting tool as long as it has another entrainment prevention device. .. Examples of other entrainment prevention devices include a filter provided near the opening of the discharge channel on the culture tank side, a baffle for controlling convection in the culture tank, and the like.
  • another embodiment of the present disclosure includes a culture tank having a capacity of 0.5 L to 50 L, a separation tube extending from the inside to the outside of the culture tank and having an inner diameter of 0.5 cm to 5 cm. It is provided with a pump connected to a separation tube, an intake port and an exhaust port provided in the culture tank, a medium supply port provided in the culture tank, and at least one of a medium component concentration measuring device and a cell observation device.
  • Cell culture apparatus can be provided.
  • Yet another embodiment of the present disclosure is to suspend and culture cells adhering to a cell support in a culture tank provided with a separation tube having an inner diameter of 0.5 cm to 5 cm extending from the inside to the outside. It is possible to provide a culture method including discharging the culture supernatant in the culture tank to the outside of the culture tank through a separation tube, and monitoring at least one of the cell number and the medium component.
  • the culture supernatant may be adjusted to a temperature of 30 ° C. to 45 ° C. as it passes through at least a part of the separation tube discharged to the outside of the culture tank.
  • the capacity of this culture tank may be 0.5 L to 50 L.
  • the culturing method according to this embodiment can be carried out using the cell culturing apparatus shown in FIGS. 2 and 3, and the detailed method can be carried out according to the above method, but the method is not limited thereto.
  • a method for monitoring at least one of the cell number and the medium component for example, the above-mentioned medium component concentration measuring device, cell observing device, or a combination thereof can be used.
  • Any of the above-mentioned cell culture devices can perform perfusion culture. Any of the above-mentioned culture methods can be applied to the method of performing perfusion culture.
  • the numerical range indicated by using "-" indicates a range including the numerical values before and after "-" as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the upper limit value or the lower limit value of the numerical range of one step can be arbitrarily combined with the upper limit value or the lower limit value of the numerical range of another step.
  • the materials exemplified in the present specification may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of each component in the composition is the total amount of the plurality of substances present in the composition unless otherwise specified, when a plurality of substances corresponding to each component are present in the composition. Means.
  • the term "process” is included in this term not only in an independent process but also in the case where the desired action of the process is achieved even if it cannot be clearly distinguished from other processes.
  • Example 1 Cells were cultured using the cell culture device described above. Specifically, human mesenchymal stem cells were cultured in a culture tank having a capacity of 2 L. The medium was 1.0 L ⁇ MEM supplemented with 10% FBS. Soluble microcarriers (Corning), which is a cell support, were added to the medium together with the cells, and the temperature was maintained at 37 ° C. The stirring blade provided in the culture tank was rotated at 140 rpm.
  • the distance D between the opening surface at the inner end of the culture tank and the inner bottom surface of the culture tank is about 9 cm, and the separation tube outside the culture tank is provided with a heat insulating material as an adjusting tool.
  • the opening surface of the separation tube at the inner end of the culture tank was about 1 cm from the liquid level of the medium 2c.
  • Example 2 The cells were cultured in the same manner as in Example 1 except that the distance D was changed to about 5 cm.
  • the opening surface of the separation tube at the inner end of the culture tank was about 5 cm from the liquid level of the medium 2c.
  • Example 1 The cells were cultured in the same manner as in Example 1 except that the heat insulating material as an adjusting tool was not provided.
  • Example 1 The culture efficiencies in Example 1, Example 2 and Comparative Example 1 were evaluated based on the amount of cell supports drawn into the recovery tank by driving the pump. The cells were attached to the cell support recovered in the recovery tank. In the cell culture apparatus of Example 1, Example 2 and Comparative Example 1, the drain rate was changed as shown in Table 1, and the cell support reached the recovery tank when the culture supernatant was discharged at each drain rate. Concentration (g / L) was measured. The results are shown in Table 1. Note that "-" in Table 1 means that the measurement has not been performed.
  • Example 1 From Table 1, in Examples 1 and 2 in which the heat insulating material was provided in the separation tube, the cell supports collected in the recovery tank at the same drain rate as compared with Comparative Example 1 in which the heat insulating material was not provided in the separation tube. It can be seen that the amount of is low. Further, for example, as a result of comparison at a drain rate at which 0.253 g / L of cell support was recovered, Comparative Example 1 was 1.5 mL / min, but Example 1 was more than doubled to 3.7 mL / min. Therefore, it was found that in Example 2, the culture supernatant could be discharged while being well separated from the cell support even at a faster rate than in Example 1.
  • Example 1 and Example 2 were separated more efficiently in Example 1 and Example 2 than in Comparative Example 1. It was also found that the closer the opening of the separation tube is to the inner bottom surface of the culture tank, the more efficiently the cells and the culture supernatant can be separated. Therefore, cells can be efficiently cultured by using this cell culture device. Further, in the above-described embodiment, cell culture can also be performed even when a device for measuring the concentration of the medium by near-infrared spectroscopy is provided in the separation tube.
  • the code of the drawing is as follows. 1 culture tank; 2a cell support; 2b cells; 2c medium; 3 separation tube; 4 pump; 5 intake port; 6 exhaust port; 7 medium supply port; 8 regulator; 9 recovery tank; 10 stirrer (stirring blade); 11 Filter; 16 Concentration measuring device; 18 Observation device; 20 Cell culture device; 22 Cell culture device; 30 Cell culture device; 32 Medium supply path; 34 Discharge channel; 36 Measuring unit; 38 Sensor probe.

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Abstract

容量が０．５Ｌ～５０Ｌの培養槽と、前記培養槽の内部から外部に延在して配置され、０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管と、前記分離管に接続されたポンプと、前記培養槽に設けられた吸気口及び排気口と、前記培養槽に設けられた培地供給口と、前記分離管の少なくとも一部に設けられ、分離管を３０℃～４５℃に調整する調整具と、を備える、細胞培養装置が提供される。

Description

細胞培養装置及び培養方法
　本開示は、細胞培養装置及び培養方法に関する。
　近年、再生医療等の分野で用いる目的で、細胞を高密度で培養することが行われている。例えば、特開平６－２０９７６１号公報には、灌流培養（パフュージョン培養）において、培養槽内に連続的に新鮮な培養液を供給しながら、細胞の代謝物が蓄積された培養液を培養槽外に排出して回収する培養装置が開示されている。この培養装置は、細胞支持体（マイクロキャリア）及び細胞支持体に付着した細胞を培養液上清と連続的に沈降分離する際に、攪拌による培養液の乱れを沈降分離管内で急速に減衰せしめて、清澄なセトリングゾーンを形成し得る沈降分離管を備えている。
　しかしながら、分離管等を用いて培養槽外に培養液を排出する際に、細胞が付着した細胞支持体が、分離管に引き込まれることがある。細胞支持体が分離管に引き込まれると、培養液の排出と共に分離管内の上部まで侵入しやすい。細胞を回収するには、場合によって灌流を停止して、分離管内部に入り込んだ細胞支持体を回収する必要がある。分離管に引き込まれないように灌流速度を遅くすることも考えられるが、培地の交換に時間がかかり、効率が悪い。
　本開示は、効率よく細胞を培養することができる細胞培養装置を提供することを課題とする。また、本開示は、効率よく細胞を培養することができる培養方法を提供することを課題とする。
　本開示は、以下の実施形態に関する。
　（１）容量が０．５Ｌ～５０Ｌの培養槽と、前記培養槽の内部から外部に延在して配置され、０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管と、前記分離管に接続されたポンプと、前記培養槽に設けられた吸気口及び排気口と、前記培養槽に設けられた培地供給口と、前記分離管の少なくとも一部に設けられ、分離管を３０℃～４５℃に調整する調整具と、を備える、細胞培養装置。
　（２）前記吸気口は、フィルタを備える、（１）に記載の細胞培養装置。
　（３）前記調整具は、前記培養槽外に位置する前記分離管の一部を３０℃～４５℃に調整する、（１）又は（２）に記載の細胞培養装置。
　（４）前記分離管の培養槽内部側端部における開口面と前記培養槽の内底面との距離は０．１ｃｍ以上である、（１）～（３）のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
　（５）０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管を内部から外部に延在させて備える培養槽内で、細胞支持体に接着した細胞を浮遊させて培養すること、前記培養槽内の培養上清を、前記分離管を通して培養槽外に排出すること、及び、培養上清を、培養槽外へ排出する分離管の少なくとも一部を通過させる際に、３０℃～４５℃の温度に調整すること、を含む、培養方法。
　（６）前記培養槽の容量は０．５Ｌ～５０Ｌである、（５）に記載の培養方法。
　（７）更に、培地成分の濃度測定装置及び細胞の観察装置の少なくとも一方を備える、（１）～（４）のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
　（８）更に、細胞数及び培地成分の少なくとも一方のモニタリングを行うこと、を含む（５）又は（６）に記載の培養方法。
　本開示によれば、効率よく細胞を培養することができる細胞培養装置を提供することできる。また、本開示によれば、効率よく細胞を培養する培養方法を提供することができる。
図１は、細胞培養装置の一例を示す概略図である。 図２は、細胞培養装置の他の例を示す概略図である。 図３は、細胞培養装置の他の例を示す概略図である。
　以下、本開示に係る実施形態について説明するが、本開示に係る実施形態は以下のものに限定されることはない。なお、図面において共通した構成要件には同一の参照番号を付して、説明を省略することがある。また、ある図面に表現された構成要素が、説明の便宜上、別の図面においては省略されていることがある点に留意されたい。更にまた、添付した図面が必ずしも正確な縮尺で記載されている訳ではない。
　＜細胞培養装置＞
　図面を用いて、本実施形態に係る細胞培養装置の構成を説明する。図１は、本実施形態に係る細胞培養装置の一例を示す概略図である。本実施形態に係る細胞培養装置２０は、対象となる細胞を培養するための培養槽１と、分離管３と、ポンプ４と、調整具（温度調整具）８と、を備えている。図１において、後述する吸気口５、排気口６、培地供給口７、及び回収タンク９と接続する経路は、簡略化のため、線で図示する。
　細胞培養装置２０は、細胞を培養するためのものであり、ここで細胞は、細胞支持体に付着したものであってもよい。図１において細胞は、便宜上、円で示されているが、細胞支持体に付着した細胞の形状について特に制限はない。細胞及び細胞支持体については後述する。
　培養槽１には、培養槽１のサイズに応じた量の液状の培地２ｃが収容される。培地については後述する。培養槽１のサイズは、特に制限はなく、例えば、０．５Ｌ以上、１Ｌ以上、２Ｌ以上、５Ｌ以上、１０Ｌ以上、２０Ｌ以上、又は５０Ｌ以上とすることができ、他の実施形態では、８０Ｌ以上、更に大きいサイズの培養槽としてもよい。細胞培養装置２０には、培養槽１に収容された培地２ｃの温度を一定温度、例えば３７℃付近に保持するためのヒーターが備えられていてもよい。
　培養槽１の内部には、内部の培地が収容された際に培地を攪拌するための攪拌機１０が設けられている。攪拌機１０は、攪拌することにより、培地の均質化を図ると共に、培地中での細胞の沈殿、過度の凝集等を防ぎ、細胞の浮遊状態を保持する。攪拌機１０の攪拌速度は、攪拌機の形状、培養槽１の大きさ等によって適宜選択可能である。
　培養槽１には、酸素及び二酸化炭素等を含む混合ガスを培養槽１内に供給する吸気口５と、混合ガスを培養槽１内から排出する排気口６と、液体状の培地２ｃを培養槽１内に供給する培地供給口７と、が設けられている。
　一実施形態において、吸気口５は、フィルタ１１を着脱可能に備えている。吸気口５がフィルタ１１を備えることによって、吸気口５を介して培養槽１に気体が供給される際に、微生物や不純物等の異物が、培養槽１に混入することを防ぐことができる。別の実施形態において、フィルタ１１は、吸気口５及び排気口６のいずれか一方のみに備えられていてもよく、吸気口５と排気口６の双方に備えられていてもよい。なお、吸気口５及び／又は排気口６へ異物が混入しない他の構造物があれば、当該吸気口５及び／又は排気口６にフィルタ１１が備えられていなくてもよい。
　フィルタ１１の孔の形状は、微生物、不純物等の異物の培養槽１への浸入を防ぐことができればいかなる形状であってもよく、例えば、円形、楕円形、矩形、多角形等が挙げられる。フィルタ１１の孔径とは、フィルタ１１の孔の形状が円形の場合には直径を意味し、フィルタの孔の形状が円形以外の場合には、孔の断面において当該孔の中心点を通過する任意の直線のうち最も長い直線の長さを意味する。フィルタ１１の孔径は、例えば０．０１μｍ～３０．０μｍの範囲内にすることができ、０．２μｍ以下とすることができる。フィルタ１１は例えば、滅菌フィルタとすることができる。
　分離管３は、培養槽１の内部から外部に延在して配置されている。分離管３の内径は、後述する調整具８によって内部を通過する培養上清を温度調整可能であれば特に制限はなく、分離管３の材質等によって適宜選択することができる。一実施形態に係る分離管３は、０．５ｃｍ～５ｃｍ、又は１ｃｍ～４ｃｍの内径を有する。０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管３を用いることにより、培養槽１における細胞培養のための領域を確保して効率よく細胞の培養を可能にすると共に、分離管３内部を通過する液体に対する外部環境の影響を小さくし、かつ、効率よく液体を排出することができる。また、分離管３の材質は、特に限定されず、例えば、ガラス、ＳＵＳ、樹脂等を挙げることができる。
　本明細書において、培養上清とは、細胞を一定期間培養した後に得られ、細胞の代謝物が蓄積された培地をいう。
　分離管３の培養槽１外部側端部における開口面は、培養上清を培養槽１外へ排出するため、ポンプ４に接続している。培養上清はポンプ４により回収タンク９に収容される。ポンプ４は、培養上清を回収タンク９へ排出可能であれば特に制限はなく、例えば、ペリスタルティックポンプ等の容積式ポンプを用いることができる。また、回収タンク９に収容する培養上清を培養槽１内部状態の分析に利用してもよく、回収タンク９に回収された培養上清を他の用途に利用してもよい。
　また、分離管３の培養槽１内部側端部における開口面は、培地２ｃ中に位置している。
　分離管３の培養槽１内部側端部における開口面と培養槽１の内底面との距離Ｄは、培養上清の排出が可能であり、沈殿、詰まり等が発生しない距離とすることができ、培養槽１の大きさ、細胞密度、排出速度等によって選択できる。距離Ｄは、例えば、０．１ｃｍ以上、０．５ｃｍ以上、又は１．０ｃｍ以上とすることができる。距離Ｄの上限は、ポンプ４の駆動によって培養槽１内に収容される培地２ｃの液面よりも分離管３の培養槽１内部側端部が上とならない位置であればよく、培養槽１内に収容される液体の量によって適宜選択できる。例えば、分離管３の培養槽１内部側端部が、培養槽１の内底面から培養槽１に収容された液体の液面との距離の８０％、８５％、９０％、又は９５％となる位置とすることができる。
　図１に示されるように、分離管３には、培養槽１の外側に延在した部分に、調整具８が備えられている。調整具８は、分離管３を一定の温度、例えば、３０℃～４５℃、３３℃～４２℃、又は３５℃～４０℃に調整することができる。通常、培養槽１の外側に延在する部分の分離管３では、培養槽１の外は外気によって外側から冷やされる。このため、分離管３内に液体が存在する場合には、分離管３の内壁近傍では下向き方向（培養槽外から培養槽内に向かう方向）に液流が発生し、中央近傍では上向き方向（培養槽内から培養槽外に向かう方向）の液流の速度が増大して、熱対流が発生することがある。培養槽１内で細胞を培養し、分離管３を用いて培養上清を抜き取る場合、分離管３内部の培養上清にこの熱対流が生じると、加速した上向き方向の液流に伴って、培養上清と共に培養槽１内の細胞が分離管３に引き込まれてしまう。これに対して、本培養装置では、分離管３が調整具８を備えることによって、分離管３の内壁近傍と中央近傍との間での温度差を調整し、熱対流の発生を防ぐことができる。調整具８が調整する分離管３の温度は、内部に配置される液体において、分離管３の内壁近傍と中央近傍との温度差を小さくできればよく、上述した温度範囲に限定されない。培養槽１内部に収容される液体の温度、培養槽１内部空間の温度、培養槽１外部の温度、細胞培養装置２０の設置場所の温度等によって、適宜選択できる。
　調整具８は、分離管３の少なくとも一部に設けられていればよく、例えば、図１の細胞培養装置２０のように、調整具８は、培養槽１外に位置する分離管３の一部に設けられてもよいし、図示とは異なり全域（培養槽１とポンプ４との間における分離管３の全域）に設けられていてもよく、また、培養槽１内の液体に触れない領域に位置する分離管３の全域又はその一部に設けられていてもよく、これらの１つ以上の領域の組み合わせとして２カ所以上の領域に設けられていてもよい。各領域において調整具８は、１つ又は２つ以上備えられていてもよい。調整具８としては、分離管３を保温又は加温するものであればよく、例えば、断熱材、ヒーター等を挙げることができる。
　本実施形態の細胞培養装置２０によれば、分離管３において熱対流の発生を抑制することができる。このため、培養槽１内で細胞、例えば細胞支持体に付着した細胞を培養しても、細胞が分離管３に引き込まれにくく、効率よく細胞と培養上清とを分離することができる。また、培地を追加しながら分離管３を介して培養上清のみを引き抜いて細胞を培養する場合、すなわち灌流培養の場合には、調整具８を設けない培養装置と比較して、より速い速度で培養上清を引き抜くことができ、その分、より速い速度で新鮮な培地を追加できる。
　＜培養方法＞
　本実施形態に係る培養方法について説明する。以下、図１で示した細胞培養装置２０を参照しつつ、培養方法を説明するが、本実施形態に係る培養方法は、図１に示した細胞培養装置２０を用いる方法に限定されることはない。
　本実施形態は、分離管３を内部から外部に延在させて備える培養槽１内で、細胞支持体に接着した細胞を浮遊させて培養すること、及び培養槽１内の培養上清を、分離管３を通して培養槽１外へ排出すること、及び培養上清を分離管３を通過させる際に３０～４５℃の温度に調整することを含む。
　本開示に係る実施形態に係る細胞培養装置を用いて培養可能な細胞としては、浮遊培養が可能な細胞であれば特に制限はなく、浮遊性細胞であっても、接着性細胞であってもよい。細胞は、浮遊培養中に複数の細胞が接触して凝集体を形成するか、又は培養担体に接着して細胞と培養担体との複合体を形成するものであってもよく、培養中に単一の細胞として懸濁液中に浮遊してもよい。接着性細胞は、細胞支持体に接着可能な接着性細胞であればよく、例えば、体細胞、幹細胞等が挙げられる。体細胞として、例えば、内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、心筋細胞、筋芽細胞、神経細胞、骨細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、肝細胞、腎細胞、膵細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、樹状細胞、マクロファージ等が挙げられる。
　接着性細胞は、動物由来の細胞であることが好ましく、哺乳動物由来の細胞であることがより好ましい。哺乳動物として、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ネコ等が挙げられる。接着性細胞は、例えば、皮膚、肝臓、腎臓、筋肉、骨、血管、血液、神経組織等の組織に由来する細胞であってよい。
　接着性細胞は、１種を単独で、又は、２種以上を組み合わせて用いることができる。一実施形態において、接着性細胞は、幹細胞であってよい。幹細胞としては、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の体性幹細胞などを挙げることができ、間葉系幹細胞、又は骨髄間葉系幹細胞とすることができる。間葉系幹細胞とは、個体の様々な組織に存在し、骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞等の間葉系の細胞の全て又はいくつかへの分化が可能な体性幹細胞を広義に意味する。幹細胞には、更に、人工多能性幹細胞（Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＥＳ細胞）が含まれていてもよい。
　浮遊性細胞としては、いずれの細胞であってもよい。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　ｃｅｌｌ；ＣＨＯ細胞）、ベロ細胞（Ｖｅｒｏ　ｃｅｌｌ）、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ６０、ＦＭ３Ａ等が挙げられるが、これらに限定されない
　細胞を浮遊させて培養する場合には、細胞の種類、細胞支持体の有無等によって異なるが、例えば、１×１０３～１×１０８細胞／ｍＬの細胞濃度の細胞懸濁液として培養を開始することができる。
　細胞を培養するために用いられる培地は、無機塩、アミノ酸、糖、及び水を含有することが好ましい。培地は、血清、ビタミン、ホルモン、抗生物質、増殖因子、接着因子等の任意の成分を更に含有してもよい。培地として、細胞培養用の基礎培地として知られている培地を使用することができる。
　培地として、選択された細胞を培養するために用いられることが知られているものであれば特に制限なく使用することができ、例えば、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＭＥＭ（イーグル最小必須培地）、αＭＥＭ培地（イーグル最小必須培地α改変型）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　培養に用いられる培地は、異種由来成分を含まないものとすることができる。異種由来成分を含まない培地としては、無血清培地、限定培養培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。異種由来成分を含まない培地は、動物由来の血清の代わりに、血清の代替添加物（例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）等）を含むことができる。
　細胞培養に使用可能な細胞支持体は、マイクロキャリアともいわれ、例えば、直径数百μｍのビーズの形態を採る。目的の細胞が培養される際、培地中を浮遊するビーズ上に細胞を接着させて増殖させることで、当該細胞を、高い培養面積、且つ高密度で得ることができる。
　細胞支持体の材質は、有機物、無機物又はこれらの複合材料であってよく、溶解性又は不溶解性のいずれであってもよい。有機物としては、例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、（メタ）アクリル系ポリマー、（メタ）アクリルアミド系ポリマー、シリコーン系ポリマー、エポキシ樹脂、ウレタン樹脂等の合成高分子、セルロース、デキストラン、コラーゲン、ポリガラクツロン酸、ポリアルギン酸、ゼラチン等の天然高分子などが挙げられるがこれらに限定されない。無機物としては、例えば、ガラス、セラミック、金属、合金、金属酸化物等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい一態様の担体として、少なくともポリスチレンを含むものが用いられる。
　細胞支持体からの細胞の脱離は、担体と細胞との結合を酵素によって分解することによって行うことができる。細胞支持体が例えばアルギン酸である場合、分解に用いられる酵素はトリプシンである。
　細胞支持体には、細胞と担体との接着性を向上させるために、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン等の細胞接着性ペプチド又はその部分ペプチドを結合させてもよい。
　本実施形態に係る培養方法では、培養槽１に、所定量の培地と、細胞支持体と、細胞を収容して細胞の培養を行う。細胞は、培地中で細胞支持体に付着し、培養槽１の攪拌機１０が駆動することによって、細胞支持体と共に培地中に浮遊しながら、成育し、増殖する。
　培養中では、所定の時期に培地供給口７から新鮮な培地が供給され、一方で、所定の時期にポンプ４が駆動し、分離管３を通して培養上清が培養槽１外に排出される。ポンプ４による培養上清の排出速度（以降、ドレインレートともいう）は、分離管３に培養上清を通す際に入り込む細胞２ｂ（及び細胞支持体２ａ）の沈降速度以下であればよく、例えば、線速度で２．５ｃｍ／ｍｉｎ以下である。
　培養上清を、培養槽１外に排出する分離管３を通過させる際に、３０℃～４５℃に温度を調整する。例えば、培養槽１外における分離管３の少なくとも一部に対して調整具８を用いることにより、培養上清を当該温度範囲に調整することができる。
　調整具８により、分離管３の内壁近傍の培養上清の温度と分離管３の中央近傍の培養上清の温度との温度差を小さくすることができ、これにより、熱対流を抑制することができる。この結果、培養槽１内で細胞、例えば細胞支持体に付着した細胞を培養しても、細胞が分離管３に引き込まれにくくなり、効率よく細胞と培養上清とを分離することができる。また、培地を追加しながら分離管３を介して培養上清のみを引き抜いて細胞を培養する場合には、調整具８を設けない培養装置と比較して、より速い速度で培養上清を引き抜くことができ、その分、より速い速度で新鮮な培地を追加できる。
　このように、培養上清の排出と新鮮な培地の供給を、より速く行うことによって、培地中の細胞密度をより高くすることができ、効率よく細胞培養を行うことができる。
　本実施形態では、図１に示される細胞培養装置２０を用いて説明したが、分離管３内部での熱対流の発生を抑制して下向きの液流の寄与を低減し、細胞支持体に付着した細胞の分離管３内部への引き込みが抑制可能であれば、細胞培養装置２０の構成に限定されない。例えば、分離管３の直径が培養槽１の外部となる位置から小さくなる分離管を備える実施形態、分離管３の向きが培養槽１の外部となる位置から水平方向に変更された分離管を備える実施形態、これらを組み合わせた実施形態であってもよい。
　本開示の他の実施形態は、容量が０．５Ｌ～５０Ｌの培養槽と、培養槽の内部から外部に延在して配置され、０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管と、分離管に接続されたポンプと、培養槽に設けられた吸気口及び排気口と、培養槽に設けられた培地供給口と、分離管の少なくとも一部に設けられ、分離管を３０℃～４５℃に調整する調整具と、培地成分の濃度測定装置及び細胞の観察装置の少なくとも一方とを備える、細胞培養装置を提供することができる。
　この実施形態において、吸気口は、フィルタを備えてもよい。調整具は、培養槽外に位置する分離管の一部を３０℃～４５℃に調整してもよい。分離管の培養槽内部側端部における開口面と培養槽の内底面との距離は少なくとも０．１ｃｍであってよい。
　この実施形態に係る細胞培養装置の一例を示す概略図を図２に示す。なお、図２において図１と共通する構成要件には同一の参照符号を付して、説明を省略することがある。
　図２に示す細胞培養装置２２は、培養槽１と、分離管３と、ポンプ４と、吸気口５及び排気口６と、培地供給口７と、調整具８と、培地成分の濃度測定装置１６と、観察装置１８とを備える。培養槽１と、分離管３と、ポンプ４と、吸気口５及び排気口６と、培地供給口７と、調整具８とについては、上記図１で説明したものを用いてよい。
　濃度測定装置１６は、培養槽内の培地における少なくともひとつ以上の培地成分の濃度を測定する。濃度測定装置１６としては、特に制限はなく、例えば、近赤外分光法（near‐infrared spectroscopy：ＮＩＲ）、ラマン分光法、酵素電極法等による測定装置を用いることができる。これにより、培地成分を測定することによって、培地成分の濃度変化をモニタリングすることができる。培地成分の濃度変化をモニタリングする際には、検量モデルを用いて培地成分の濃度を定量してもよい。検量モデルとは、スペクトル強度や電流値、電圧値等の濃度測定装置により取得された測定値に基づいて培地成分濃度を算出するモデルを意味する。検量モデルの作製には、例えば、Anal. Chem. 2020, 92, 2946-2952に記載された方法を用いることができるが、これに限定されない。
　観察装置１８は、培養槽内の細胞の状態を観察する。観察装置１８としては、細胞の状態を観察可能な装置であれば、特に制限されず、カメラ等の撮像装置であってもよく、電気計測部を備える電気計測装置であってもよく、これらの双方であってもよく、その他の装置であってもよい。電気計測部は、例えば、培養槽に設けられた２つ以上の導電部と接続可能であり、２つ以上の電極間で、直流又は交流電流を印可し、電気容量又は導電率を、電圧、電流、周波数等を変えることで、培養器内部の観察が可能にするものが挙げられる。
　本開示の実施形態に係る細胞培養装置のさらに他の例を、図３に示す概略図を用いて説明する。なお、図３において図１又は図２と共通する構成要件には同一の参照符号を付して、説明を省略することがある。
　図３に示す細胞培養装置３０は、培養槽１と、培地供給路３２と、排出流路３４と、濃度測定装置であるＮＩＲの測定部３６と、電気計測装置のキャパシタンスセンサプローブ３８とを備える。特に説明しない部材には上記図１及び図２で説明したものを用いてよく、上記図１及び図２で説明した部材を図３に示す細胞培養装置３０に適用してもよい。
　培地供給路３２は新鮮な培地を収容する収容部３２ａから培養槽１に導通し、ポンプ３２ｂの駆動によって新鮮な培地を収容部３２ａから培養槽１に供給する。この培地供給路３２の培養槽１側の開口部は、培地供給口として機能する。
　排出流路３４は培養槽１から排出培地を収容する収容部３４ａに導通し、ポンプ３４ｂの駆動によって排出された培地を培養槽１から収容部３４ａに排出する。この排出流路３４の培養槽１の内部から外部へ延在する部分は、分離管としても機能する。
　培養槽１には、培地３９ｃと支持体に接着した細胞３９ｄとが収容される。培養槽１は、攪拌翼等の攪拌機４０をさらに備えてもよく、これによって細胞培養中に培地を攪拌することができる。
　図３には、ＮＩＲによるモニタリングが可能な細胞培養装置３０が示されている。細胞培養装置３０には、培養槽１へ新鮮な培地を供給する培地供給路３２と、培養槽１から使用済み培地（培養上清）を排出する排出流路３４とが備えられている。排出流路３４の培養槽１側は、分離管３（図１参照）を兼ねている。排出流路３４上に、ＮＩＲによる測定部３６が備えられており、培養槽１から排出される培地中の成分の濃度、例えば、培地成分のうちのグルタミンの濃度が測定される。細胞培養装置３０では、この測定結果に基づいて、例えば、細胞培養装置３０に設けられたポンプの駆動が制御される。駆動が制御されるポンプは、培地供給路３２用のポンプ３２ｂであってもよく、排出流路３４用のポンプ３４ｂであってもよく、これらの組み合わせであってもよい。これにより、モニタリングされた培地成分の濃度変化に応じて、培養槽１へ供給される新鮮な培地の供給量が調整され、培養槽１内の培地成分の量の適正化が行われる。また、培地成分の濃度に関して予め上限値又は下限値を設定することで、測定対象となる培地成分を所定範囲内の濃度を調整することができる。これにより、培地成分の濃度変化をモニタリングしながら、細胞の浮遊培養を効率よく行うことができる。例えば、図３に示すフィードバックのように、測定部３６で得られた情報に基づいて培地供給路３２のポンプ３２ｂを制御することができる。
　また、細胞培養装置３０には、電気計測装置としてキャパシタンスセンサプローブ３８が備えられており、培養槽１内の細胞数（細胞濃度）が電気的に計測される。細胞培養装置３０では、この計測結果に基づいて、例えば、培養槽１における攪拌機１０の駆動が制御され、培養槽１内の細胞数の適正化が行われる。これにより、培養槽１内の細胞数をモニタリングしながら、細胞の浮遊培養を効率よく行うことができる。細胞数のモニタリングは、電気的に計測される結果をモニターによってリアルタイムにモニターしてもよい。
　細胞培養装置３０において、測定部３６（濃度測定装置）及びセンサプローブ３８（観察装置）は、それぞれポンプ及び攪拌翼の駆動を制御するものであるが、培養槽１内の培地成分の濃度調整及び培養槽１内の細胞状態を制御可能であれば、これに限定されない。細胞培養装置３０では、濃度測定装置及び観察装置を共に備えているが、いずれか一方であってもよい。細胞培養装置３０において測定部３６は、培養槽１へ供給される培地中の培地成分の濃度を測定してもよい。これにより、培養槽１へ供給される培地中の培地成分の濃度と培養槽１から排出される培地成分の濃度とから、より正確に培養槽１内の培地成分の濃度変化をモニタリングすることができ、培養槽１内の培地成分の濃度調整をより精密に行うことができる。
　細胞培養装置３０では、濃度測定装置１６と細胞の観察装置１８とをそれぞれ１つずつ備えるが、それぞれ独立に一つ又は複数備えていてもよい。また、細胞培養装置３０では、濃度測定装置１６と細胞の観察装置１８とを共に備えるが、濃度測定装置１６のみ、又は細胞の観察装置１８のみであってもよい。また、細胞培養装置３０では、培地排出の際に細胞の巻き込みを防止する調整具が備えられていてもよく、他の巻き込み防止装置を有していれば、調整具を備えていなくてもよい。他の巻き込み防止装置としては、例えば、排出流路の培養槽側の開口部近傍に設けられるフィルタ、培養槽内の対流を制御するバッフル等が挙げられる。
　すなわち、本開示の他の実施形態は、容量が０．５Ｌ～５０Ｌの培養槽と、培養槽の内部から外部に延在して配置され、０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管と、分離管に接続されたポンプと、培養槽に設けられた吸気口及び排気口と、培養槽に設けられた培地供給口と、培地成分の濃度測定装置及び細胞の観察装置の少なくとも一方とを備える、細胞培養装置を提供することができる。
　本開示のさらに他の実施形態は、０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管を内部から外部に延在させて備える培養槽内で、細胞支持体に接着した細胞を浮遊させて培養すること、培養槽内の培養上清を、分離管を通して培養槽外に排出すること、及び、細胞数及び培地成分の少なくとも一方のモニタリングを行うこと、を含む、培養方法を提供することができる。
　この実施形態では、培養上清を、培養槽外へ排出する分離管の少なくとも一部を通過させる際に、３０℃～４５℃の温度に調整することを含んでもよい。この培養槽の容量は０．５Ｌ～５０Ｌであってよい。
　この実施形態に係る培養方法は、上記図２及び図３に示す細胞培養装置を用いて行うことができ、詳細な方法は上記方法に従って行うことができるが、これに限定されない。細胞数及び培地成分の少なくとも一方のモニタリングを行う方法には、例えば、上記した培地成分の濃度測定装置、細胞の観察装置、又はこれらの組み合わせを用いることができる。
　上記した細胞培養装置は、いずれも潅流培養を行うことができる。上記した培養方法は、いずれも潅流培養を行う方法に適用することができる。
　本明細書において、「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。本明細書に段階的に記載されている数値範囲において、ある段階の数値範囲の上限値又は下限値は、他の段階の数値範囲の上限値又は下限値と任意に組み合わせることができる。本明細書に例示する材料は、特に断らない限り、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。本明細書において、組成物中の各成分の含有量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
　以下、実施例により、本開示の実施形態を更に詳しく説明するが、本開示に係る技術思想を逸脱しない限り、本開示に係る実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。
　（実施例１）
　上述の細胞培養装置を用いて細胞を培養した。具体的には、容量２Ｌの培養槽で、ヒト間葉系幹細胞を培養した。培地としては、ＦＢＳを１０％添加した１．０ＬのαＭＥＭとした。培地には、細胞と共に、細胞支持体である可溶性マイクロキャリア(コーニング)を投入し、温度を３７℃に維持した。培養槽内に設けられた攪拌翼は１４０ｒｐｍで回転させた。
　分離管の培養槽内部側端部における開口面と培養槽の内底面との距離Ｄは約９ｃｍであり、培養槽外における分離管には、調整具である断熱材が設けられている。また、分離管の培養槽内部側端部における開口面は、培地２ｃの液面から約１ｃｍであった。
　（実施例２）
　距離Ｄを約５ｃｍに変更した以外は実施例１と同様にして細胞を培養した。また、分離管の培養槽内部側端部における開口面は、培地２ｃの液面から約５ｃｍであった。
　（比較例１）
　調整具である断熱材を設けていない点以外は実施例１と同様にして細胞を培養した。
　＜評価＞
　実施例１、実施例２及び比較例１における培養効率を、ポンプを駆動して回収タンクに引き込まれる細胞支持体の量に基づいて評価した。なお、回収タンクにて回収された細胞支持体には、細胞が付着されていた。実施例１、実施例２及び比較例１の細胞培養装置において、ドレインレートを表１に示すとおりに変更し、各ドレインレートにて培養上清を排出した際の回収タンクに到達する細胞支持体の濃度（ｇ／Ｌ）を測定した。結果を表１に示す。なお表１中「－」は測定していないことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１より、分離管に断熱材を設けた実施例１及び２は、分離管に断熱材を設けていない比較例１に比べて、同一のドレインレートでは、回収タンクに回収される細胞支持体の量が低いことがわかる。また、例えば０．２５３ｇ／Ｌの細胞支持体が回収されるドレインレートで比較した結果、比較例１が１．５ｍＬ／ｍｉｎであったところ、実施例１では２倍以上の３．７ｍＬ／ｍｉｎであり、実施例２では、実施例１よりも更に速い速度でも、細胞支持体と良好に分離しながら培養上清を排出できることがわかった。
　これにより、比較例１よりも実施例１及び実施例２の方が、より効率よく細胞と培養上清とを分離できることが分かった。また、分離管の開口部は、培養槽の内底面に近い方がより効率よく細胞と培養上清とを分離できることが分かった。したがって、本細胞培養装置を用いることによって、効率よく細胞を培養することができる。
　また、上記した実施例において、近赤外分光法による培地の濃度測定装置が分離管に備えられる装置を用いる場合においても細胞培養を行うことができる。
　図面の符号は次の通りである。１　培養槽；２ａ　細胞支持体；２ｂ　細胞；２ｃ　培地；３　分離管；４　ポンプ；５　吸気口；６　排気口；７　培地供給口；８　調整具；９　回収タンク；１０　攪拌機（攪拌翼）；１１　フィルタ；１６　濃度測定装置；１８　観察装置；２０　細胞培養装置；２２　細胞培養装置；３０　細胞培養装置；３２　培地供給路；３４　排出流路；３６　測定部；３８　センサプローブ。
　本開示は、以下の日本国特許出願に基づくものであって、当該日本国特許出願による優先権の利益を享受するものである。また、以下の日本国特許出願の全体の内容が参照により本開示に組み入れられる。
　（１）２０２０年３月３１日に提出された日本国特許出願第２０２０－０６２７６１
　（２）２０２０年９月２９日に提出された日本国特許出願第２０２０－１６２８５８
　本開示に記載されたすべての文献、特許出願、及び技術規格は、参照によりその全体が本開示に組み入れられる。

Claims (8)

  1. 　容量が０．５Ｌ～５０Ｌの培養槽と、
    　前記培養槽の内部から外部に延在して配置され、０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管と、
    　前記分離管に接続されたポンプと、
    　前記培養槽に設けられた吸気口及び排気口と、
    　前記培養槽に設けられた培地供給口と、
    　前記分離管の少なくとも一部に設けられ、分離管を３０℃～４５℃に調整する調整具と、を備える、細胞培養装置。
  2. 　前記吸気口は、フィルタを備える、請求項１に記載の細胞培養装置。
  3. 　前記調整具は、前記培養槽外に位置する前記分離管の一部を３０℃～４５℃に調整する、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
  4. 　前記分離管の培養槽内部側端部における開口面と前記培養槽の内底面との距離は少なくとも０．１ｃｍである、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  5. 　０．５ｃｍ～５ｃｍの内径を有する分離管を内部から外部に延在させて備える培養槽内で、細胞支持体に接着した細胞を浮遊させて培養すること、
    　前記培養槽内の培養上清を、前記分離管を通して培養槽外に排出すること、及び、
    　前記培養上清を、培養槽外へ排出する分離管の少なくとも一部を通過させる際に、３０℃～４５℃の温度に調整すること、を含む、培養方法。
  6. 　前記培養槽の容量は０．５Ｌ～５０Ｌである、請求項５に記載の培養方法。
  7. 　更に、培地成分の濃度測定装置及び細胞の観察装置の少なくとも一方を備える、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  8. 　更に、細胞数及び培地成分の少なくとも一方のモニタリングを行うこと、を含む請求項５又は６記載の培養方法。
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