JP6375091B2 - 腫瘍性疾患であって特に高ｈｅｒ２タンパク質レベルの腫瘍性疾患を治療するためのタモキシフェン誘導体 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍性疾患であって、特に細胞の自然分裂及び腫瘍の成長に影響するＨＥＲ２（ヒト上皮細胞成長因子受容体２）タンパク質レベルの高い腫瘍である腫瘍性疾患を治療するための、新規のミトコンドリア標的型のタモキシフェン誘導体に関する。

分子医学の最近の進歩は、腫瘍疾患の診断及び治療における確かな改善へと繋がっている。こうした部分的な成功にもかかわらず、これらの病理学については相当な難題のままとなっている。特定の種類の癌において、場合により最新の治療は数多くの理由によって失敗する。一方で、腫瘍細胞の定常的な突然変異及び治療の回避に関する能力は、腫瘍細胞に生来の耐性であり、一方でまた、腫瘍環境の不均一性でもある（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＡ．Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ ２０１１；１４４：６４６−６７４）。同種の腫瘍が個々の患者において、ゲノムプロファイルの観点から非常に相違していることが明らかとなっており（Ｊｏｎｅｓ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８；３２１：１８０１−１８０６． Ｐａｒｓｏｎｓ ＤＷ ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８；３２１．１８０７−１８１２．）、このことはいわゆる「個人の」医療の必要性を示している。さらにより大きな問題は、近年腎臓の腫瘍において明らかにされたような、同じ腫瘍中における突然変異の不均一性であり（Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｒｅｇｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２；３６６：８８３−８９２．）、この状況は他の種の腫瘍においても同様に予期されうるものである。こうした理由から、新たなアプローチと、腫瘍中の全て又は殆どの悪性細胞に共通し望ましくは癌細胞の重要機能に影響する不変の介入点とを探し求めることが必要である。こうした介入点にミトコンドリア、すなわち細胞内の全ての生理学及び病態生理学的プロセスに必要なエネルギー産生の基盤となる細胞小器官が、該当しうるようである。腫瘍細胞は、エネルギー産生の大部分をいわゆる好気的解糖から使用しているが、ミトコンドリア呼吸（すなわち、ＡＴＰ産生に関連する酸素消費）は殆どの種類の腫瘍に生来するものである（Ｒａｌｐｈ ＳＪ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ："ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ"ａｎｄ ＲＯＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ − ｗｈｙ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｒｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｏｌ Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ ２０１０；３１：１４５−１７０．）。

抗癌活性を有する物質の一群は、「ミトカン（ｍｉｔｏｃａｎ）」の名前（「ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）及び癌（ｃａｎｃｅｒ）に由来）で定義された（Ｎｅｕｚｉｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ’ｍｉｔｏｃａｎ’−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｅｐｉｔｏｍｉｚｅｓ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ Ｂｃｌ−２ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００８；５８０：５１２５−５１２９． Ｎｅｕｚｉｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃａｎｓ，ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ２０１３；１３：１９９−２０８．）。これらの物質は活性の分子機序によって複数の群に分けられる。その群は以下のとおりである：（１）ヘキソキナーゼ阻害剤；（２）Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質を標的とする物質；（３）チオール阻害剤として作用する酸化還元活性をもつ物質；（４）ＶＤＡＣタンパク質及びＡＮＴタンパク質を標的とする物質；（５）電子伝達系を標的とする物質；（６）細胞内ミトコンドリア膜を標的とする脂溶性物質；（７）クエン酸回路を標的とする物質；（８）ミトコンドリアＤＮＡを標的とする物質；（９）これらの群に属さない物質。これらの物質及びその標的の例は図１に示されている。

乳癌は治療が非常に難しく女性の人生における８大疾病の１つに現在数えられる腫瘍疾患である。乳癌の治療は一般的にタモキシフェン（ＴＡＸ）治療に基いている。乳癌患者の約３０％は、ＨＥＲ２タンパク質が高レベルであると診断されるが、当該ＨＥＲ２タンパク質は受容体型チロシンキナーゼの群に属し、細胞の増殖能を向上させて悪性度を上昇させる（Ａｒｔｅａｇａ ＣＬ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＨＥＲ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１１；９：１６−３２．）。確立された治療法（そこではＴＡＸが主要な薬剤として使用される）は、高ＨＥＲ２レベルを特徴とする腫瘍においては当該治療法に比較的高い耐性を持つために効果的ではない。ＴＡＸは乳癌の細胞膜中のエストロゲン受容体に影響し、それによって癌細胞の増殖能に関連する重要なプロセスを抑制する。高濃度においてＴＡＸはエストロゲン受容体経由で作用するだけではなく、ミトコンドリア内膜まで移動し、そこで呼吸鎖の複合体Ｉと相互作用することが近年発表された（Ｍｏｒｅｉｒａ ＰＩ ｅｔ ａｌ．Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ａｎｄ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｉ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００６；２８１：１０１４３−１０１５２．）。しかしながら、この作用は薬理学的観点から達成することが容易ではない用量において生じるものである。さらに、そうした高用量の場合においてはＴＡＸの毒性が上昇することを予期することができる。

現時点においては、高ＨＥＲ２タンパク質の乳癌はヒト化抗体であり、ＨＥＲ２活性を抑制する「トラスツズマブ」によって治療されている。この治療法は経済的な要求が高く二次毒性を特徴とし、さらに高ＨＥＲ２タンパク質の患者の大きな割合（約３０％と見積もられている）がトラスツズマブに耐性を示す。また受容体チロシンキナーゼを抑制する最近導入された薬剤のラパチニブも困難が多い（Ｅｗｅｒ ＭＳ，Ｅｗｅｒ ＳＭ．Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ：ｗｈａｔ ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｉｓｔ ｎｅｅｄｓ ｔｏ ｋｎｏｗ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０１０；７：５６４−５７５． Ｌｉｎ ＳＸ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２０１０；６：４８５−４９３． Ａｈｎ ＥＲ ｅｔ ａｌ．Ｉｓ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ａｎｄ ｌａｐａｔｉｎｉｂ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｏｒｔｈ ｔｈｅ ａｄｄｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ？ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２．６：１９１−２０７．）。これに関連する事柄として、ラパチニブは特異的なＨＥＲ２阻害剤ではなく、このことが他の受容体チロシンキナーゼをも阻害し、二次毒性へと繋がる可能性があり、またこの治療法への耐性の発達も同様に予期されうることである（Ｗｅｔｔｅｒｓｋｏｇ Ｄ ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｌａｐａｔｉｎｉｂ ｉｎ ＥＲＢＢ２−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃａｎｃｅｒｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０１３；１−１１）。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１） 国際公開第９２／０６０６８号
（非特許文献）
（非特許文献１） ＭＯＲＥＩＲＡ ＰＩ ＥＴ ＡＬ．："Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ａｎｄ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｉ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆａｉｌｕｒｅ"，Ｊ ＢＩＯＬ ＣＨＥＭ，ｖｏｌ．２８１，２００６，ｐａｇｅｓ １０１４３−１０１５２
（非特許文献２） ＳＭＩＴＨ Ｒ Ａ Ｊ ＥＴ ＡＬ："ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＯＦ ＢＩＯＡＣＴＩＶＥ ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ ＴＯ ＭＩＴＯＣＨＯＮＤＲＩＡ ＩＮ ＶＩＶＯ"，ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ ＯＦ ＴＨＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＵＳ，ｖｏｌ．１００，ｎｏ．９，２９ Ａｐｒｉｌ ２００３（２００３−０４−２９），ｐａｇｅｓ ５４８７−５４１２

上述した理由から、我々は高レベルのＨＥＲ２タンパク質を示す腫瘍に対して有効な物質群を設計及び合成した。この物質群は直接的にミトコンドリアを標的とするものであり、上述の複雑な状況を乗り越える可能性がある。こうしたタモキシフェン（ＴＡＸ）に関連する不利益は、それを脂肪族鎖を介してトリフェニルホスホニウムにタグ付けすることで除去される（ＭｉｔｏＴＡＸと呼ばれる）が、その化合物では当該鎖はアルキル又はアルケニルであり、及びそれらの対応する第三級アミン塩であって、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩などの有機酸塩、又は硫酸塩、ハロゲン化物、リン酸塩などの無機酸塩の群から選択される前記第三級アミン塩、及び／又はこれらの混合物でも除去され、タモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体は一般化学式Ｉを有し、

式中、ｎ＝８〜１２であり、Ｚはクエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩などの有機酸塩、又は例えば硫酸塩、ハロゲン化物、リン酸塩などの無機酸塩の群から選択され、一般化学式Ｉ中のＴＡＸ部分に位置する交差した二重結合は、当該二重結合がＥ型及び／又はＺ型の配置をとりうることを示し、
タモキシフェンのアルケニルトリフェニルホスホニウム誘導体は一般化学式ＩＡを有し、

式中、ｎ＝６〜１０であり、Ｚは上述の意味を持ち、一般化学式ＩＡ中の側鎖に位置する交差した二重結合は、当該二重結合がＥ型及び／又はＺ型の配置をとりうることを示している。

一般化学式Ｉのタモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体の調製方法は、以下の一般化学式ＩＩのｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−オキシ−アルキル−トリフェニルホスホニウムであって、

式中、ｎ＝５〜９であり、
ＸはＩ、Ｂｒ、Ｃｌ、又はメシルである、前記ホスホニウムから、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中、アルゴン気体下、−７８℃下における有機塩基（好ましくはブチルリチウム）の処理下においてイリドを生成する反応と、その後化学式ＩＩＩのアルデヒドと縮合して、

一般化学式ＩＶのシリル化誘導体を生成することに基づき、

式中、ｎ＝５〜９である。

一般化学式ＩＶのシリル化誘導体はフッ化テトラブチルアンモニウムによって処理され、一般化学式Ｖのアルケノールを生成し、

式中、ｎ＝５〜９であり、
これは、触媒存在下の水素気体中において、一般化学式ＶＩのアルコールに還元され、

式中、ｎ＝５〜９であり、
一般化学式ＶＩのアルコールは、一般化学式ＶＩＩの適切な誘導体に置換され、

式中、ｎ＝５〜９であり、
ＸはＩ、Ｂｒ，Ｃｌ、又はメシルであり、
これは、トリフェニルホスフィンとともに加熱することによって、一般化学式Ｉのミトコンドリア標的型のタモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体へと変換される。

一般化学式Ｖのアルケノールはまた、室温下ＴＨＦ及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の混合物中において塩基（好ましくはヘキサメチルジシラザンリチウム）によって処理され、対応する臭化（ヒドロキシアルキル）トリフェニルホスホニウムと反応することによって、アルデヒドＩＩＩから直接的に調製することも可能であり、これは臭化（ヒドロキシアルキル）トリフェニルホスホニウムの溶解度を上昇させるこれは、前記合成を相当に迅速かつ安価にするものである。一般化学式Ｖのアルケノールが第三級窒素塩の形で使われるとき、上述の手法により得られた一般化学式ＶＩのアルコールの収量を上昇させ、対応する一般化学式Ｉのタモキシフェンのトリフェニルホスホニウム誘導体の第３級アミン塩を、一般化学式ＶＩＩの化合物を単離することなしに生成することができる。

一般化学式ＩＡのタモキシフェンのアルケニルトリフェニルホスホニウム誘導体の調製方法は、一般化学式ＶＩＩＩのアルキルビス（トリフェニルホスホニウム）であって、

式中、ｎ＝７〜１１であり、
ＸはＩ、Ｂｒ、Ｃｌ、又はメシル又はこれらの組合せである、前記ホスホニウムから、室温下、アルゴン気体下、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の混合物中の有機塩基（好ましくはヘキサメチルジシラザンリチウム）の処理下においてイリドを生成する反応と、その後の化学式ＩＩＩのアルデヒドとの縮合とに基づくものである。一般化学式ＶＩＩＩのアルキルビス（トリフェニルホスホニウム）は、高温において対応するアルキルとトリフェニルホスホニウムを反応させることによって調製される。

カチオン性のトリフェニルホスヘニウム（ＴＰＰ^＋）の残基は、ＴＡＸのアルキル又はアルケニルトリフェニルホスホニウム誘導体（一般化学式Ｉ又はＩＩの物質）のミトコンドリアとの相互作用を可能とする。これらの化合物を、アルキル−ＴＰＰ^＋のカチオン性残基をＴＡＸ分子に加えることによって調製した。生物学的な環境中においては、ＴＰＰ^＋残基のリンの正電荷は非局在化しており、このことは前記物質が中性的に振る舞うことを意味する。唯一の例外は、負電位を持つ細胞構造であり、これは細胞膜及び特にミトコンドリア内膜の内部表面である。こうした環境において、前記リンの電荷は局在化し、前記正に荷電したＴＰＰ^＋残基はアンカーとして働き、これによって一般化学式Ｉ又はＩＡのＴＡＸのアルキル又はアルケニルＴＰＰ^＋誘導体（ＭｉｔｏＴＡＸ）の、ミトコンドリア基質と内部ミトコンドリア膜との界面におけるかなりの濃度上昇が生じる。

このＭｉｔｏＴＡＸ分子は以下のような向きとなっている：前記ＴＰＰ^＋残基を持つ部位は前記ミトコンドリア基質内に位置し、生物学的に活性を持つ部位はミトコンドリア内膜中に位置し、当該ミトコンドリア内膜はＭｉｔｏＴＡＸの分子標的であるミトコンドリア複合体Ｉが存在する場所である。ＭｉｔｏＴＡＸの生物学的活性部位とミトコンドリア内膜の構成要素であるミトコンドリア複合体Ｉとの物理的相互作用のために、ある一定の長さの脂肪族鎖が、ＭｉｔｏＴＡＸの前記生物学的活性部位と前記ＴＰＰ^＋残基との間に位置することが必要であり、当該脂肪族鎖はアルキル又はアエルケニルであることは必須ではないと思われる（実施例２４を参照）。前記ミトコンドリア膜の生物学的特性及び物理化学的特性の観点から、前記脂肪族鎖の理想的な長さは、８〜１２炭素であると思われる。

ＭｉｔｏＴＡＸは、乳癌細胞を死滅させることにおいてオリジナルのＴＡＸに比べて明らかに効果的である。もう一つの非常に重要な知見は、細胞がＨＥＲ２タンパク質を高発現している場合、細胞がＨＥＲ２タンパク質を低発現している場合よりも、より効率的にＭｉｔｏＴＡＸが癌細胞を死滅させることである。しかしながら、ＴＡＸにおいてはこれは逆となっており、この理由からＴＡＸは高ＨＥＲ２の乳癌に対して医療的に効果が不十分である。高ＨＥＲ２タンパク質レベルの乳癌細胞がＭｉｔｏＴＡＸに対して高い感受性を示す理由は、ＨＥＲ２タンパク質がミトコンドリア中にも存在するためであると考えられ、ＨＥＲ２の発現が低いか非常に低い細胞の場合、この腫瘍性タンパク質は癌細胞の細胞膜中に局在する。

トラスツズマブ（ハーセプチン）として知られる物質は、高ＨＥＲ２タンパク質の乳癌の治療法として用いられるが、多くの場合において効果が不十分である。考えられる理由は、高ＨＥＲ２タンパク質である場合、その大部分がミトコンドリア中に局在し、癌細胞にトラスツズマブが作用する間、ＨＥＲ２タンパク質のミトコンドリア中への移動はさらに強まることである。このようにして、癌細胞はＨＥＲ２をその活性を阻害するトラスツズマブから「隠して」しまうのである。ＨＥＲ２のミトコンドリアへの関与はまた、癌細胞が解糖系に向けて動き、栄養及び酸素に乏しい環境中においてより良好に生存できるようにミトコンドリアの代謝を変化させる。

トラスツズマブとは異なり、ＭｉｔｏＴＡＸはミトコンドリア内膜の内部表面上の負電位に基づいて、細胞中に入りミトコンドリア内に蓄積する。高ＨＥＲ２タンパク質の乳癌細胞は、多くの場合トラスツズマブに耐性を示すが、ＭｉｔｏＴＡＸにはより高い感受性を示す。

ＭｉｔｏＴＡＸの重要な特性は、マウスモデルにおける高ＨＥＲ２タンパク質の自然発生乳癌の成長の効果的な阻害に見られ、成長は９０％阻害され、ＴＡＸの効果は約２０〜３０倍低いものである。さらに、ＭｉｔｏＴＡＸはマウスに対して非毒性であった。

乳癌はＨＥＲ２タンパク質の発現という観点において不均一性を示す。腫瘍の一部のみがトラスツズマブ治療に反応し、一方でＭｉｔｏＴＡＸは低い及び高いＨＥＲ２タンパク質発現の細胞の両方を死滅させるために有効であることが期待できる。

ビタミンＥコハク酸エステルは、ミトコンドリア複合体ＩＩに影響するミトカンとして記載されている（Ｄｏｎｇ ＬＦ ｅｔ ａｌ．ａ−Ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００８；２７：４３２４−４３３５． Ｄｏｎｇ ＬＦ ｅｔ ａｌ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃａｎ ｏｃ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；１５：１５９３−１６００．）。ごく最近に、我々はビタミンＥコハク酸エステルへのＴＰＰ^＋残基の付与により生成される物質を調製し検証している。この新規物質は同じ分子部位を標的にするが、その活性は親化合物であるビタミンＥコハク酸エステルの活性よりも高くなっており、これはミトコンドリア内膜とミトコンドリア基質との界面における当該物質の濃度上昇によるものである（Ｄｏｎｇ ＬＦ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｔｓ ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｖｉａ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１１；２８６：３７１７−３７２８． Ｄｏｎｇ ＬＦ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｔｓ ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ：Ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｏｆ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ ２０１１；５０：１５４６−１５５５． Ｒｏｈｌｅｎａ Ｊ ｅｔ ａｌ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａ−ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｉｓ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ： Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｂｅｎｅｆｉｔ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｕｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｂｕｔ ｃａｕｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ．Ａｎｔｉｏｘ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ ２０１１；１５：２９２３−２９３５．）。ＴＰＰ^＋残基を付与したビタミンＥコハク酸エステルと同様の方法で、ＭｉｔｏＴＡＸはミトコンドリア内膜とミトコンドリア基質との界面において多量に蓄積する。それにもかかわらず、本発明の通りＭｉｔｏＴＡＸはミトコンドリア複合体Ｉに影響し、それによってＴＡＸと比較してその効果スペクトルに変化が生じ、乳癌細胞の細胞膜中のエストロゲン受容体に支配的に影響し、したがって癌細胞の増殖特性に重要な活性を抑制する。

ＭｉｔｏＴＡＸは、癌細胞であってそのミトコンドリアが正常細胞のミトコンドリアと比較してより強い負電位を持つ癌細胞において、選択的にミトコンドリア内に蓄積する。、ＭｉｔｏＴＡＸは非常に効果的な方法で、高ＨＥＲ２の乳癌細胞を死滅させ、高ＨＥＲ２の乳癌に対して効果的であり、ＭｉｔｏＴＡＸの標的部位はミトコンドリア複合体Ｉである（図１を参照）。

ＭｉｔｏＴＡＸを用いて、腫瘍性疾患、特に癌腫、肉腫、リンパ腫及び白血病、すなわち、星状細胞腫、神経芽腫、膠芽腫、中皮腫、前立腺癌、非小細胞肺癌、子宮頚癌、骨肉腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、白血病の群から選択される疾患のための治療薬を調製することができる。

略語の一覧
ＤＣＭ ジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）
ＥＲα エストロゲン受容体α（ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−α）
ＥＳＩ ＭＳ エレクトロスプレーイオン化質量分析（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）
ＨＥＲ２ ヒト上皮成長因子受容体２（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）
ＩＢＸ ２−ヨードキシ安息香酸（２−ｉｏｄｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ）
ＬｉＨＭＤＳ ヘキサメチルジシラザンリチウム（ｌｉｔｈｉｕｍ ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｄｉｓｉｌａｚａｎ）
ＭｉｔｏＴＡＸ ミトコンドリア標的型タモキシフェン（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）
ＭｉｔｏＶＥＳ ミトコンドリア標的型ビタミンＥコハク酸エステル（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）
ＮＭＲ 核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）
ＴＡＸ タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）
ＴＢＡＦ フッ化テトラブチルアンモニウム（ｔｅｔｒａｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）
ＴＨＦ テトラヒドロフラン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）

抗癌物質としてミトコンドリアにおいて作用する可能性のあるミトカンの各分類への区分を図示している。 ヒト乳癌ＭＣＦ７亜株の調製を図示している。 ＭｉｔｏＴＡＸ及びＴＡＸの、高ＨＥＲ２発現の実験用腫瘍の成長への影響を図示している。 異なる細胞腫におけるＭｉｔｏＴＡＸ及びＴＡＸにより誘導された細胞死を図示している。 高ＨＥＲ２レベルの様々な乳癌細胞株における、ＭｉｔｏＴＡＸによる濃度依存的なアポトーシス誘導を図示している。 腫瘍細胞においてＭｉｔｏＴＡＸが異なる濃度においてどのようにミトコンドリア複合体Ｉ及びＩＩを介して呼吸に影響するかを図示している。 ＭｉｔｏＴＡＸ及びＴＡＸに曝された乳癌細胞における酸素ラジカル形成の比較を示している。 ＭｉｔｏＴＡＸ及びＴＡＸに反応したミトコンドリア電位の低下を図示している。 高ＨＥＲ２発現の乳癌細胞のミトコンドリア中に選択的に局在化するＨＥＲ２を示している。 ＨＥＲ２タンパク質レベルのミトコンドリアの全長に対する影響を図示している。 ＨＥＲ２タンパク質レベルの乳酸塩生成及びミトコンドリア呼吸への影響を示している。 高ＨＥＲ２タンパク質の細胞が高いグルコース取込量を特徴とすることを示している。 ＭｉｔｏＴＡＸはエストロゲン受容体αの発現を減少させるがＴＡＸは発現を減少させないことを示している。 高ＨＥＲ２レベルの自然発生腫瘍中の癌細胞のミトコンドリアに局在化するＨＥＲ２タンパク質を示している。 乳癌の成長及び治療に重要な遺伝子（ＨＥＲ２、ＥＲα、ＧＡＴＡ３、Ｋｉ６７）の発現が異なるＦＶＢ／Ｎ ｃ−ｎｅｕトランスジェニックマウスにおける乳腺癌のそれぞれの面積を示している。 乳癌のそれぞれの領域の切片について、当該切片の形態学を明らかにするためヘマトキシリン・エオジン法を用いて染色したものを示している。 同一の腫瘍の顕著に異なるＨＥＲ２タンパク質レベルを持つ個々の部分の切片を示している。 様々なＭｉｔｏＴＡＸ誘導体に曝したＭＣＦ７細胞（Ａ）及びＭＣＦ７ ＨＥＲ２^＋細胞（Ｂ）におけるアポトーシスレベルを示している。

化学式ＩＩＩのアルデヒドであって、２００３年に発表された手順により調製されたアルデヒドを（（Ｚ）−Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ａｎｄ Ｔｅｔｒａｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ａｌｋｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｉｅｎｅｓ ｖｉａ ａ Ｒｅｇｉｏ− ａｎｄ Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｈｒｅｅ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｃａｒｂｏｍｅｔａｌａｔｉｏｎ Ｐａｌｌａｄｉｕｍ（Ｏ） Ｃｒｏｓｓ−Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｙ；Ｐｉｅｒｒｅ Ｅ．Ｔｅｓｓｉｅｒ， Ａｎｄｒｅａ Ｊ．Ｐｅｎｗｅｌｌ．Ｆａｂｉｏ Ｅ．Ｓ．Ｓｏｕｚａ，ａｎｄ Ａｌｅｘ Ｇ．Ｆａｌｌｉｓ^＊；ＯＲＧＡＮＩＣ ＬＥＴＴＥＲＳ，２００３，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．１７，２９８９−２９９２．）、一般化学式Ｉ及び／又はＩＡのタモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体（ＭｉｔｏＴＡＸ）を調製するための出発物質として用いた。

前記出発物質のアルデヒドＩＩＩは、本発明の著者が発見したとおり、上述の文献において使用されているものとは別の酸化剤を使用して調製することができる。彼らは、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬の代わりに２−ヨード安息香酸（ＩＢＸ）を適用することで、二重結合が１つだけの異性体を生成することを発見した。収量は同等である。

ＩＢＸ（１２．４６０ｇ、４４．４９８ｍｍｏｌ）及び出発物質のアルキルアルコール（５．５４ｇ、１４．８３３ｍｍｏｌ）（上述の文献を参照）を、アセチル酸エチル（１２０ｍｌ）に溶解した。この懸濁液を、常時撹拌の状態で３時間還流した。この反応混合物を室温まで冷却し、ジエチルエーテル（１ｌ）で希釈し、炭酸ナトリウムの飽和溶液で洗浄した（３ｘ１００ｍｌ）。合わせた水性層を、酢酸エチルで再抽出した（３ｘ８０ｍｌ）。合わせた酢酸エチル層を、硫酸マグネシウムで乾燥した。この乾燥剤をろ過して除き、この溶液を減圧下で濃縮し、褐色固体の形で４．８５０ｇ（８８％）のアルデヒドＩＩＩを生成した。

実施例１
臭化（９−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ノニル）トリフェニルホスホニウム（６３４ｍｇ、１．０５７ｍｍｏｌ）を、乾燥したテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、アルゴン気体で包み−７８℃まで冷却した。この反応混合物に対して、アルゴン気体下でブチルリチウム（１．２ｍｌ、ＴＨＦ中０．９Ｍ溶液）をゆっくりと滴加した。この溶液を０℃まで温めると色が暗赤色に変化し、もう一度−７８℃まで冷却し、乾燥ＴＨＦに溶解した化学式ＩＩＩのアルデヒド（１６０ｍｇ、０．４３０ｍｍｏｌ）を滴加した。次いで、この反応混合物を研究室室温まで温め、アルゴン気体下で１６時間撹拌した。反応の進行をクロロホルム−メタノール（１０：１）混合物の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で監視した。次いで、塩化アンモニウムと水の飽和溶液をこの反応混合物に加え、サクセアンエチルで再抽出した。この酢酸エチル層を食ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。この溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）／メタノール（メタノールの勾配０％〜１０％）のシステムのシリカゲルカラム上でこの濃縮物のクロマトグラフィーを行い、化学式４の生成物１４７ｍｇ（５６％収率）を生成した。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｃｄｃｌ３）δ７．４２−７．３６（ｍ，５Ｈ），７．１８−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．７，２Ｈ），６．７３（ｄ，Ｊ＝８．７，２Ｈ），６．１９（ｄ，Ｊ＝１１．５，１Ｈ），５．４７（ｄｔ，Ｊ＝１１．５，７．４，１Ｈ），４．０９（ｔ，Ｊ＝５．８，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝６．６，２Ｈ），２．８０（ｔ，Ｊ＝５．８，２Ｈ），２．４２（ｓ，６Ｈ），１．６９−１．５７（ｍ，４Ｈ），１．４８−１．１３（ｍ，１０Ｈ），１．０３（ｓ，９Ｈ），０．１８（ｓ，６Ｈ）。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ ＭＳ）：６１２。
臭化（９−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ノニル）トリフェニルホスホニウムは、文献で公開された手順にしたがって調製された（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１０，５１，４９，６４２６−６４２８）。

実施例２
化学式４のシリル化誘導体をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解し、次いでアルゴン気体で包み、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）（２６０μｌ、ＴＨＦ中１Ｍ溶液）を０℃撹拌下において滴加した。この反応混合物を次いで研究室室温まで温め、もう６時間撹拌した。反応の進行をクロロホルム−メタノール（１０：１）の混合物中の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で監視した。次いで水を加え、この混合物を酢酸エチルで抽出した。この酢酸エチル層を、ソーダ及びブラインの飽和溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。この乾燥剤をろ過して除き、この溶液を減圧下で濃縮した。この濃縮物をクロロホルム／メタノール（メタノールの勾配０％〜１０％）のシステムのシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、１１５ｍｇ（９６％収率）の必要な化学式５のアルケノールを生成した。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｃｄｃｌ３）δ７．４３−７．１４（ｍ，５Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝８．５，２Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．５，２Ｈ），６．２０（ｄ，Ｊ＝１１．５，１Ｈ），５．４８（ｄｔ，Ｊ＝１１．５，７．４，１Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝５．９，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝６．６，２Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝５．９，２Ｈ），２．４６（ｓ，６Ｈ），１．７１−１．５８（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．１０（ｍ，１０Ｈ）。ＥＳＩ ＭＳ：４９８。

実施例３
化学式５のアルケノール誘導体（１１５ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）を、無水エタノール（６ｍｌ）に溶解し、アルゴン気体で包んだ。この混合物に１０％Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を加え、反応懸濁物のフラスコを排気し水素気体で包むことを数回繰り返した。次いで、この反応混合物を研究室室温において水素気体下で２４時間撹拌した。反応の進行をクロロホルム−メタノール（１０：１）の混合物中の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で監視した。この混合物をセライト層でろ過し、エタノールで数回洗浄した。エタノールを蒸発させ、１０１ｍｇ（８７％収率）の必要な化学式６のアルコールを生成した。これは合成の次の段階のためにこれ以上精製することなく使用される。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｃｄ３ｏｄ）δ７．４０−７．０１（ｍ，１０Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．１，２Ｈ），６．６８（ｄ，Ｊ＝８．１，２Ｈ），４．２０（ｓ，２Ｈ），３．５５（ｔ，Ｊ＝６．４，２Ｈ），３．４６（ｓ，２Ｈ），２．８９（ｓ，６Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７．８，２Ｈ），１．５７−１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３８−１．１１（ｍ，１２Ｈ）。ＥＳＩ ＭＳ：５００。

実施例４
化学式６のアルコール（２３０ｍｇ、０．４６０ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ（１０ｍｌ）に溶解した。この混合物にＣＢｒ_４（４８０ｍｇ、１．４４７ｍｍｏｌ）を、研究室室温アルゴン気体下において加えた。次いで、ＤＣＭ（３ｍｌ）に溶解したトリフェニルホスフィン（４００ｍｇ、１．５２５ｍｍｏｌ）を滴加した。この混合物を研究室室温において２時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。反応の進行をクロロホルム−メタノール（１０：１）の混合物中の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で監視した。ＤＣＭ／メタノール（勾配０％〜１０％）のシステムのシリカゲルカラム上でこの濃縮物のクロマトグラフィーを行い、必要な化学式７の臭化物２７３ｍｇ（９２％収率）を生成した。臭化物は長期保管すること無く、次の反応にかけられた。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｃｄｃｌ３）δ７．４６−６．９６（ｍ，１０Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），４．２９（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ２Ｈ），３．４７−３．２８（ｍ，４Ｈ），２．８２（ｓ，６Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），１．８０（ｑ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），１．４６−０．９８（ｍ，１４Ｈ）。ＥＳＩ ＭＳ：５６１。

実施例５
化学式６のアルコール（１０２ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（６ｍｌ）に溶解した。この混合物にトリフェニルホスフィン（８３ｍｇ、０．３１６ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（２７ｍｇ、０．３９７ｍｍｏｌ）を室温において加え、この反応混合物を氷浴中で４℃まで冷却した。この冷却した反応混合物にヨウ素（７６ｍｇ、０．３０２）を加え、研究室室温において４時間撹拌した。反応の進行をクロロホルム−メタノール（１０：１）の混合物中の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で監視した。この反応混合物をジクロロメタンに溶解し、チオ硫酸塩で抽出した。さらにこの有機層をソーダ及びブラインの飽和溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。ＤＣＭ／メタノール（勾配０％〜１０％）のシステムのシリカゲルカラム上でこの濃縮物のクロマトグラフィーを行い、必要な化学式８のヨウ化物１００ｍｇ（８０％収率）を生成した。ヨウ化物は長期保管すること無く、次の反応にかけられた。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｃｄｃｌ３）δ７．４０−７．３２（ｍ，２Ｈ），７．３１−７．２２（ｍ，４Ｈ），７．２２−７．０８（ｍ，４Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．９５（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），３．１９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４７−２．３７（ｍ，２Ｈ），２．３１（ｓ，６Ｈ），１．８１（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．５２−１．００（ｍ，１４Ｈ）。ＥＳＩ ＭＳ：６１０。

実施例６
トリフェニルホスフィン（３００ｍｇ、１．４４４ｍｍｏｌ）を化学式７の臭化物（２７３ｍｇ、０．４２５ｍｍｏｌ）に加え、この混合物を８５℃アルゴン気体下において１２時間撹拌した。反応の進行をクロロホルム−メタノール（１０：１）の混合物中の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で監視した。この反応混合物を研究室室温まで冷却して最小量のＤＣＭに溶解し、０℃において常時撹拌の状態でヘキサン溶液（５０ｍｌ）に滴加した。生成した沈殿物をろ過して最小量のＤＣＭに再度溶解し、０℃において常時撹拌の状態でジエチルエーテル溶液（５０ｍｌ）に滴加した。この沈殿物をろ過して減圧下で乾燥し、黄色粉末の形で２８１ｍｇ（７３％収率）の必要な化学式９の化合物を生成した。

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ｃｄ３ｏｄ）δ７．８９−７．７４（ｍ，１５Ｈ），７．３７−７．０５（ｍ，１０Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝８．７，２Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝８．７，２Ｈ），４．２４（ｔ，Ｊ＝５．０，２Ｈ），３．５７（ｔ，Ｊ＝５．０，２Ｈ），３．４３（ｍ，２Ｈ），２．９７（ｓ，６Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝７．９，２Ｈ），１．７４−１．６０（ｍ，２Ｈ），１．５９−１．４９（ｍ，２Ｈ），１．３６−１．０５（ｍ，１２Ｈ）。ＥＳＩ ＭＳ：７４４。

実施例７
実施例６において始まる手順と同様の手順を適用することで、化学式８のヨウ化物から化学式１０の化合物を得ることが出来る。

実施例２１
化学式５の化合物は、化学式ＩＩＩのアルデヒドから直接的に、臭化（９−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）ノニル）トリフェニルホスホニウムの代わりに、臭化（９−ヒドロキシノニル）トリフェニルホスホニウムと反応させることで得ることができる。こうした合成はより短く、より経済的である。主な違いは溶解性を挙げるためのＴＨＦ及びＤＭＳＯの混合物の使用であり、臭化（９−ヒドロキシノニル）トリフェニルホスホニウムとの反応を直接的に実行できる。これは実質ＴＨＦでは不可能であったこの手順は−７８℃の代わりに室温で実行される。この手順はまた、必要な化合物の調製にかかる総時間をかなり減少させることに繋がる。

化学式５の化合物の調製

臭化（９−ヒドロキシノニル）トリフェニルホスホニウム（３．９２０ｇ、８．０８２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に溶解し、次いでＴＨＦ（３０ｍｌ）を加えた。この反応混合物にＬｉＨＭＤＳ溶液（１４．８００ｍｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）を３分間かけて滴加した。この反応混合物の色が明橙色に変化した。次いで、この反応混合物にＴＨＦ（１５ｍｌ）中の化学式ＩＩＩのアルデヒド（１．０００ｇ、２．６９４ｍｍｏｌ）を滴加し、この反応物を研究室室温においてもう１０分間撹拌した。反応の進行をクロロホルム−メタノール（１０：１）の混合物中の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で監視した。この反応混合物を、冷却した塩化アンモニウム（１００ｍｌ）の飽和溶液に注ぎ、ジエチルエーテル（５ｘ１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し、硫酸マグネシウムで乾燥した。この乾燥剤をろ過して除き、この生成物を減圧下で濃縮した。材料をジエチルエーテル（１０ｍｌ）に溶解し、ＨＣｌの飽和エーテル溶液を滴加した。沈殿した生成物をろ過し、ＮａＯＨ溶液（５ｍｌ、１Ｍ）及びジエチルエーテル（２５ｍｌ）で抽出した。この有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した。この乾燥剤をろ過して除き、この生成物を減圧下で濃縮し、以降の反応に適した淡黄色のオイルの形で１，１０２ｇ（８２％収率）の化学式５の化合物を生成した。

実施例２２
化学式６の化合物から化合物９ａ（第３級アミン塩酸塩）を、化合物７を単離する必要なしに調製することができる。調製時間は短縮され、収量はより高い。

化学式９ａの化合物の調製
ジエチルエーテル（６ｍｌ）中に溶解した化学式６のアルコール（３００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）に、ＨＣｌ（６ｍｌ）の飽和エーテル溶液を加えた。この混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（６ｍｌ）に溶解した。この反応混合物にＣＢｒ_４（２９８ｍｇ、０．９０１ｍｍｏｌ）を加え完全に溶解させた後、トリフェニルホスフィン（２５２ｍｇ、９６０ｍｍｏｌ）を加えた。この反応を５分後にメタノール（１ｍｌ）及びＨＣｌの飽和エタノール溶液（３ｍｌ）の添加によって停止させた。この溶液を減圧下で濃縮し、トリフェニルホスフィン（２．０００ｇ、７．６２５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を１００℃の温度においてオーバーナイトで混合した。この混合物を室温まで冷却し、次いでＤＣＭ（１０ｍｌ）中に溶解した。この混合物を次いで室温まで冷却し、ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、冷却し強く撹拌しているジエチルエーテル（１００ｍＬ）に滴加した。この沈殿物をろ過して減圧下で乾燥し、白色のやや油っぽい固体の形で３３４ｍｇ（７４％）の公式９ａの生産物を生成した。この生産物 を、ＤＣＭ（２ｍｌ）への溶解とその後のジエチルエーテル（２０ｍｌ）中への沈殿とを繰り返すことで再精製してもよい。

実施例２３
化学式１１の化合物の調製−タモキシフェンのアルケニルトリフェニルホスホニウム異性体の誘導体
臭化ノナン−１，９−ジイルビス（トリフェニルホスホニウム）を、１，９−ジブロモノナン及びトリフェニルホスフィンの混合物をジメチルホルムアミド溶液中で１００℃において１６時間撹拌しその後酢酸エチルで結晶化させることによって調製した。
臭化ノナン−１，９−ジイルビス（トリフェニルホスホニウム）（５４５ｍｇ、６７４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍｌ）に溶解し、次いでＴＨＦ（３ｍｌ）を加えた。この反応混合物にＬｉＨＭＤＳ溶液（６７０μｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）を３分間かけて滴加した。この反応混合物の色が明橙色に変化した。次いで、この反応混合物にＴＨＦ（１ｍｌ）中の化学式ＩＩＩのアルデヒド（１００ｍｇ、０．２６９ｍｍｏｌ）を滴加し、この反応物を室温においてもう１０分間撹拌した。反応の進行をクロロホルム−メタノール（１０：１）の混合物中の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で監視した。この反応混合物を、冷却した塩化アンモニウム（１０ｍｌ）の飽和溶液に注ぎ、ジエチルエーテル（５ｘ２０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥し、硫酸マグネシウムで乾燥した。この乾燥剤をろ過して除き、この生成物を減圧下で濃縮した。クロロホルム／メタノール（勾配０％〜１０％）のシステムのシリカゲルカラム上でこの濃縮物のクロマトグラフィーを行い、必要な化学式１１の生産物５６ｍｇ（３０％）を生成した。

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｃｄｃｌ３）δ８．００−７．５２（ｍ，１５Ｈ），７．２５−７．１１（ｍ，６Ｈ），７．１１−６．９６（ｍ，４Ｈ），６．７２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．５３（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．００（ｄ，Ｊ＝１１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．２６（ｄｔ，Ｊ＝１１．５，７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８０−３．５３（ｍ，２Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（ｓ，６Ｈ），２．０６−１．７９（ｍ，２Ｈ），１．６４−１．３６（ｍ，４Ｈ），１．３８−１．０５（ｍ，４Ｈ），１．０６−０．７３（ｍ，４Ｈ）。ＥＳＩ ＭＳ：７４２。

ミトコンドリア標的型のタモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体（ＭｉｔｏＴＡＸ）の生物学的試験、タモキシフェン（ＴＡＸ）との比較研究

以下の実施例８〜２０を、一般化学式ＩのＭｉｔｏＴＡＸ物質によって実施した。なおこれらの実施例においてｎ＝１０である。

実施例８
実施例６にしたがって調製したＭｉｔｏＴＡＸについて、乳癌細胞株への影響の試験を行った。異なるレベルのＨＥＲ２タンパク質発現及びエストロゲン受容体（ＥＲα）を示す細胞株を用いた。細胞株ＭＣＦ７は、比較的低いＨＥＲ２タンパク質の発現を特徴とする。異なるＨＥＲ２タンパク質レベルの乳癌細胞のＭｉｔｏＴＡＸによる死滅試験のために、我々はＨＥＲ２⁻及びＨＥＲ^＋のＭＣＦ７細胞を準備した。ＭＣＦ７細胞に対して「サイレンシング無し（ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」（ＮＳ）配列を持つベクター、ＨＥＲ２発現を減衰させる「ショートヘアピン（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ）」（ｓｈ）配列を持つベクター、及びＨＥＲ２遺伝子を持つベクターによって遺伝子導入した。図２は、ウェスタンブロッティング法による前記異なる亜株中のＨＥＲ２タンパク質の発現を示している。その後の試験においては、前記亜株のＮＳ、Ｓｈ１ ２６（クローン２６）、及び＋１１（クローン１１）を用いた。

実施例９
我々は、様々な乳癌細胞株においてＴＡＸ及びＭｉｔｏＴＡＸのＩＣ_５０値を評価した。それぞれの値について、クリスタルバイオレット法を用いて両物質の様々な濃度における細胞の生存曲線から決定した。我々は様々なレベルのＨＥＲ２及びＥＲαタンパク質の細胞株、ＥＲα^＋／ＨＥＲ２^ｌｏｗ（ＭＣＦ７_ｐａｒ）、ＥＲα^＋／ＨＥＲ２^＋（ＭＣＦ７_{ＨＥＲ２＋}、ＢＴ４７４、ＮｅｕＴＬ−乳腺癌のネズミの細胞株）、ＥＲα^＋／ＨＥＲ２⁻（ＭＣＦ７_{ＨＥＲ２−}、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ７５−１）、ＥＲα−／ＨＥＲ２^＋（ＳＫ−ＢＲ−３）、ＥＲα−／ＨＥＲ−（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）を用いた。表Ｉから、ＩＣ_５０値がＭｉｔｏＴＡＸにおいて、ほぼ１オーダーの規模で著しく低くなっているのは明らかである。最も感受性が高いものは、ＥＲα^＋／ＨＥＲ２^＋の遺伝子型を持つＭＣＦ７_{ＨＥＲ２＋}亜株である。対応するＥＲα^＋／ＨＥＲ２⁻（ＭＣＦ７_{ＨＥＲ２−}）及びＥＲα^＋／ＨＥＲ２^ｌｏｗ（ＭＣＦ７_ｐａｒ）の遺伝子型を持つ細胞株は、約２倍高いＩＣ_５０値を特徴としており、これは高いＨＥＲ２タンパク質レベルがＭｉｔｏＴＡＸへの感受性の上昇に繋がることを示している。一方でＭｉｔｏＴＡＸとは逆に、高ＨＥＲ２細胞のＴＡＸへの感受性は減少している。このことは、（我々の知る限りにおいて）他のいかなる抗癌物質においても報告されていないＭｉｔｏＴＡＸの特性を示している。

実施例１０
我々はＭｉｔｏＴＡＸが腫瘍の成長を抑制するかどうかについても同様に調べた。ＭｉｔｏＴＡＸの抗癌効果についてはＦＶＢ／Ｎ ｃ−ｎｅｕトランスジェニックマウス系列を用いて試験した。このマウス系列は、腫瘍無しで産まれ、成体時にはエストロゲンの作用によるＨＥＲ２タンパク質発現の上昇を特徴としている（Ｇｕｙ ＣＴ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９２；８９：１０５７８−１０５８２．）。これらのマウスは乳腺の部位において、生後３から４ヶ月に異形成及び次いで過形成をきたし、生後６ヶ月に明白な腫瘍を形成する。重要なことには、これは免疫システムが機能している状況において発生する。この乳（乳腺）癌モデルは「非浸潤性乳管癌（ｄｕｃｔａｌ ｉｎ ｓｉｔｕ）」タイプの高ＨＥＲ２タンパク質ヒト乳癌についての非常に優れた近似となる。我々の結果（図３）は、これらの腫瘍の成長に対するＭｉｔｏＴＡＸの非常に優れた効果を示している。一用量３μｍｏｌのＴＡＸ及び０．５μｍｏｌのＭｉｔｏＴＡＸを週２回２週間かけてマウスに投与した。高精度非侵襲で深部を含めて腫瘍を可視化できる超音波撮像を用いて、腫瘍体積を定量化した。ＭｉｔｏＴＡＸがＴＡＸに対して約２０倍から３０倍効果的であることが明らかであり、両物質間の差異は非常に大きいものである。^（＊）の記号は処理した動物とコントロールの動物との間で有意な差があることを示しており、^（＊＊）の記号はＴＡＸで処理した動物とＭｉｔｏＴＡＸで処理した動物との間で有意な差があることを示している。これらの実験動物において明らかな毒性は観察されなかった。図の下の写真は、各動物グループにおける代表的な腫瘍を示している。

実施例１１
ＭｉｔｏＴＡＸの重要な側面は、ＨＥＲ２癌遺伝子の発現が上昇した系に対してより高い成長抑制活性を示すことである。このことは図４に示されており、ここではまた、ＨＥＲ２癌遺伝子の発現が減少した系（クローン２６）が、ＭｉｔｏＴＡＸにより低い応答性を示し、対してＴＡＸについては完全にこれと逆であることが示されている。これらの実験のために、我々はまた親株のＭＣＦ７細胞を高用量のＴＡＸに長期間曝すことによりＴＡＸに耐性を持ったＭＣＦ７亜株を準備した。これらのＴＡＸ耐性を持つ細胞が、ＭｉｔｏＴＡＸに感受性を示すことがわかる（図４）。図４の結果は、様々な遺伝子型のＭＣＦ７細胞に由来する乳癌亜株の生存率を図示している（ＥＲα^＋／ＨＥＲ２^ｌｏｗ、ＭＣＦ７_ｐａｒ；ＥＲα^＋／ＨＥＲ２^＋、ＭＣＦ７^{ＨＥＲ２＋}−クローン２６；ＥＲα^＋／ＨＥＲ２⁻、ＭＣＦ７^{ＨＥＲ２−}−クローン１１；ＥＲα^＋／ＨＥＲ２^ｌｏｗ、ＭＣＦ７^{ＴＡＸ−Ｒ}）。この結果は、様々な濃度のＭｉｔｏＴＡＸ及びＴＡＸ存在下において、生細胞と死細胞を識別することを可能にするクリスタルバイオレット法を用いて得られた。

実施例１２
癌細胞に細胞死をもたらす抗がん物質において細胞死の機序は重要な特徴である。この理由から、我々はＭｉｔｏＴＡＸがアポトーシスを引き起こすかどうかを試験した。アポトーシスは言い換えればプログラム細胞死であり、細胞が死ぬときに制御されており、そのアポトーシスの残骸の細胞体は組織から炎症反応無しで食細胞により取り除かれる。図５は、この物質が実際にアポトーシスを引き起こしていることを示している。アポトーシスの評価は、フローサイトメトリーの方法により、細胞膜の外側の部分においてアネキシンＶを持つ細胞の割合を見積もることによって行われた。もう一度見ると、この結果は、ＭｉｔｏＴＡＸは高ＨＥＲ２タンパク質細胞への高い効果を持ち、一方で低ＨＥＲ２タンパク質細胞はＭｉｔｏＴＡＸにより高い耐性を示す（アポトーシスは行われつつも）ことを示している。

実施例１３
過去の発表（Ｍｏｒｅｉｒａ ＰＩ ｅｔ ａｌ．Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ａｎｄ ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｉ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｆａｉｌｕｒｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００６；２８１：１０１４３−１０１５２．）は、ＴＡＸが高濃度においてミトコンドリア内の標的を複合体Ｉとすることを示唆している。我々はこれがＭｉｔｏＴＡＸにおいても同じであることを明らかにし、図６において示している。この図はまた、ＴＡＸ（左）及びＭｉｔｏＴＡＸ（右）の複合体Ｉ及びＩＩを介した呼吸に対する抑制効果を示している。ＴＡＸが２０μＭ超の濃度において、複合体ＩＩよりも複合体Ｉを好んで抑制することがわかる。ＭｉｔｏＴＡＸも同様に複合体ＩＩよりも複合体Ｉを好んで抑制するが、約１〜２μＭというより大幅に低い濃度において抑制している。これらのアッセイのために、ＭＣＦ７細胞をＯｘｙｇｒａｆ装置の容器内に置き、高用量のＴＡＸ（左）及びＭｉｔｏＴＡＸ（右）における呼吸量を決定した。呼吸量（ＡＴＰ産生に繋がる酸素消費）は１０^６細胞において関連付けられ、最初の呼吸レベルを１とした相対値として示されている。

実施例１４
多くのミトカンと一般的に関連する特性は、癌細胞選択的な酸化ストレスの上昇（活性酸素種（ＲＯＳ）の形成）能力であり、特にその作用は酸化的リン酸化に関与するミトコンドリア複合体に関連するものである。これは通常ミトコンドリア電位の低下と関係している（Ｎｅｕｚｉｌ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｔｏｃａｎｓ，ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ ２０１３；１３：１９９−２０８． Ｋｌｕｃｋｏｖａ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ ＩＩ，ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎｔｒｉｇｕｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ ａｇｅｎｔｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０１３； １８２７：５５２−５６４．）。我々はＲＯＳの形成についてＭｉｔｏＴＡＸにおいても試験した。図７は、ＨＥＲ２レベルの異なるＭＣＦ７亜株において、ＴＡＸ又はＭｉｔｏＴＡＸ（両者とも５μＭ）への暴露１時間後のＲＯＳ産生を示している。ＴＡＸは同濃度のＭｉｔｏＴＡＸに比べて明らかに効果がより低いことがわかる。別の重要な知見は、ＭｉｔｏＴＡＸが高ＨＥＲ２レベルの細胞において、より高いＲＯＳ産生を誘導し、それに対して低ＨＥＲ２細胞においてはより低いＲＯＳ産生を誘導することである。ＴＡＸはこの傾向にはしたがわない。全ての場合において、ミトコンドリア呼吸の脱共役剤（ＣＣＣＰ）は、ミトコンドリア電位を基礎値まで低下させる。図８は、ＭｉｔｏＴＡＸが既に５μＭで１時間以内にミトコンドリア電位を低下させる（ＴＡＸは低下させない）ことを示している。

実施例１５
高ＨＥＲ２タンパク質レベルの乳癌細胞において、当該タンパク質はミトコンドリア中に好んで局在化している。これは図９に示されており、図９ではオリジナルのＭＣＦ７株、ＨＥＲ２^＋ＭＣＦ７（クローン１１）、及びＨＥＲ２⁻ＭＣＦ７（クローン２６）のウェスタンブロットが示されており、またここでは現存の亜株（クローンＴＡＭ−Ｒ）はＴＡＸに耐性を示していると見られる。クローン１１はミトコンドリア、細胞質、及び核内分画においてＨＥＲ２タンパク質（矢印でマークされている）の発現上昇を特徴としていることがわかる。下の図は細胞膜がより長い時間暴露されたときのミトコンドリア分画を示しており、この結果ミトコンドリア中においては、かなり低いレベルではあるものの、ＨＥＲ２タンパク質は親株のＭＣＦ７細胞及びＴＡＸ耐性の細胞において存在しているが、低ＨＥＲ２の細胞（クローン２６）においては存在していない。この驚くべき結果は、最近発表された研究と一致している（Ｄｉｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ＥｒｂＢ２ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｉｎｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１２；３：１２７１）。この発表においてまた、ＨＥＲ２タンパク質を高発現しミトコンドリア中に大部分局在化する乳癌細胞がトラスツズマブに耐性を持つことが示されている。トラスツズマブの癌細胞への適用の間、より多くのＨＥＲ２タンパク質がミトコンドリアに移動した（Ｄｉｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ＥｒｂＢ２ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ ｉｎｔｏ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１２；３：１２７１．）。乳癌細胞がＨＥＲ２タンパク質をその表面（細胞膜）から遠ざけて移動させ、その結果当該タンパク質はトラスツズマブによる影響を受けられなくなる。ＨＥＲ２抑制の結果の一つは、細胞周期の抑制因子であるｐ２７タンパク質の活性化であり、細胞の悪性性質を減少させることである（Ｙａｎｇ ＨＹ， Ｓｈａｏ Ｒ，Ｈｕｎｇ ＭＣ， Ｌｅｅ ＭＨ．ｐ２７ Ｋｉｐ１ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００１；２０：３６９５−３７０２．）。これは、癌細胞が高い増殖状態を維持するよう進化的にプログラムされているため高ＨＥＲ２タンパク質レベルの癌細胞に負の影響を持つ（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ ＲＡ．Ｔｈｅ ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｅｌｌ ２０００；１００：５７−７０）。したがって我々は、トラスツズマブの標的であるＨＥＲ２タンパク質が巨視的に見て細胞膜に存在しないため、細胞はトラスツズマブへの耐性を獲得するのであろうと推測することが出来る。にもかかわらず、このプロセスの間にもミトコンドリア中への浸透を可能にしたＭｉｔｏＴＡＸへの感受性は上昇し、このことはＭｉｔｏＴＡＸの特別な性質をさらに際立たせる。

実施例１６
高ＨＥＲ２タンパク質の乳癌細胞における感受性上昇の理由の一つは、癌細胞のミトコンドリアにおける生体エネルギー学と形態学の変化である。ミトコンドリア中でのＨＥＲ２タンパク質の高レベルは、ミトコンドリアの機能と同様に形態学も変化させる。図１０は、ＨＥＲ２^＋細胞（クローン１１）のミトコンドリアがＨＥＲ２⁻細胞（クローン２６）のミトコンドリアに比べて約２倍短くなっていることを示している。これらのミトコンドリア全長を、ミトコンドリア標的性のＧＦＰタンパク質（緑色蛍光によってミトコンドリアを可視化する）を遺伝子導入した細胞株の共焦点顕微鏡観察により見積もった。Ｆｕｊｉ Ｆｒｅｅｈａｎｄ Ｌｉｎｅｓ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ｔｏｏｌのソフトウェアを用いて、ランダムに選択した５０細胞のミトコンドリアを解析することによって全長を決定した。これは、ミトコンドリア呼吸の減少と関係しており、ミトコンドリア電位の低下及び乳酸塩の高産生（有酸素解糖系代謝への転換の兆候）に関連している。この場合において、高ＨＥＲ２タンパク質レベルの細胞は、親株細胞及び低ＨＥＲ２タンパク質レベルの細胞に比べて約２倍多い乳酸塩を産生することが示されている。呼吸の場合は、状況は全く逆となっている。高ＨＥＲ２タンパク質レベルの細胞は呼吸がより少なくなる（ＡＴＰ産生量がより低い酸素消費と関連している）。高ＨＥＲ２タンパク質レベルを特徴とする細胞のＡＴＰ産生における解糖系の割合がより高くなることは、グルコースの取込量が上昇することにもまた関連している（図１２）。

実施例１７
高ＨＥＲ２タンパク質レベルのＨＥＲ２^＋細胞がＭｉｔｏＴＡＸに対して高い感受性を示すもう一つの理由は、この物質のエストロゲン受容体に対する効果であり、抗アポトーシス効果を持つことである（Ｔｈｏｍａｓ Ｃ，Ｇｕｓｔａｆｆｓｏｎ Ｊ．Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＥＲ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１１ ；１１：５９７−６０８． Ｄｅｂｌｏｉｓ Ｄ，Ｇｉｇｕｅｒｅ Ｖ．Ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１３；１３：２７−３６．）。これは図１３に示されており、ＭｉｔｏＴＡＸが既に１μＭにおいてＥＲαの発現を約３倍低下させ、一方でＴＡＸは効果が無いことがわかる。これらの結果はリアルタイムＰＣＲ法を用いて得られた。

実施例１８
上述のＦＶＢ／Ｎ ｃ−ｎｅｕマウス系列におけるＭｉｔｏＴＡのＨＥＲ２タンパク質高発現腫瘍に対する高い効果は非常に重要である。ＨＥＲ２タンパク質高発現のヒト腫瘍に対応するこの腫瘍について、ＨＥＲ２タンパク質及びその他の幾つかの遺伝子の発現を分析した。図１４は、腫瘍を持つ代表的なＦＶＢ／Ｎ ｃ−ｎｅｕマウス（左上図）と、同様に摘出した腫瘍（左下図）とを示している。腫瘍のウェスタンブロッティングによる分析の結果は、腫瘍が高いレベルのＨＥＲ２タンパク質を含み、乳腺の正常組織においては殆ど検知不能であることを示している。この図はまた、ミトコンドリア分画（Ｍｉｔｏ）及び細胞質ゾル分画（Ｃｙｔｏ）の分析結果を示している。ある特定のタンパク質に対する抗体がミトコンドリア分画のマーカーとして使用されている。ＨＥＲ２タンパク質の絶対多数がミトコンドリア中に局在化していることが明らかである。これらの実験的な腫瘍から得られた結果は、ＨＥＲ２高発現乳癌細胞から得られた結果に対応している。

実施例１９
腎臓癌において同一の腫瘍が突然変異プロファイルの異なる領域を含むことが最近示されている（Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｒｅｇｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２；３６６：８８３−８９２．）。腫瘍の不均一性（Ｓｔｉｎｇｌ Ｊ，Ｃａｌｄａｓ Ｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００７；７：７９１−７９９．）及びこの現象は、乳癌腫の場合においても同様に確認された。この知見は興味深いことにＦＶＢ／Ｎ ｃ−ｎｅｕトランスジェニックマウスにおける自然発生腫瘍が幾つかの重要な遺伝子の発現がｍＲＮＡのレベルで異なる領域を含むという知見と相関しており、これは乳がん治療に大いに影響する可能性がある。この知見は、ＥＲα、ＨＥＲ２、Ｋｉ６７（高ＨＥＲ２レベルの場合において高くなる増殖マーカー）、及びＧＡＴＡ３（ＨＥＲ２発現に正の影響を与える転写活性化因子）に関係している。これは図１５に示されている。この実験において、二つの腫瘍を幾つかの部分に分け、これらの部分をリアルタイムＰＣＲを用いて上述の遺伝子の発現について分析した。この結果は、腫瘍の核領域において前記遺伝子の発現が非常に異なっており、最大で５倍まで変化していることを示している。実験のＦＶＢ／Ｎ ｃ−ｎｅｕマウスにおける腫瘍の各部分のＨＥＲ２遺伝子の発現が異なるもう一つの証拠が、以下の図において示されており、そこにおいては、ヘマトキシリン・エオジン染色に基づく腫瘍の形態学と（図１６）、ＨＥＲ２タンパク質発現の免疫組織化学分析とを見ることができる（図１７）。これらの明らかな違いは、腫瘍の各部分におけるｍＲＮＡレベルでのＨＥＲ２発現の差異と対応しており、腫瘍間の不均一性についての公表データと一致している（Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｒｅｇｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２；３６６：８８３−８９２． Ｓｔｉｎｇｌ Ｊ，Ｃａｌｄａｓ Ｃ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２００７；７：７９１−７９９．）。図１７は、腫瘍の外側部位、外部領域（部分１ａ）、中間領域（部分１ｂ）、及び内部領域（部分１ｃ）の間でＨＥＲ２タンパク質発現が非常に大きく異ることを示している。このことは、腫瘍のある領域がＴＡＸ治療に耐性を持ち（高ＨＥＲ２タンパク質発現の領域）、ある別の領域がトラスツズマブ治療に耐性を持つ（低ＨＥＲ２タンパク質発現の領域）であろうことを意味している。さらに、トラスツズマブの作用がＨＥＲ２タンパク質のミトコンドリアへの移動増加を伴うものであり、それによって高ＨＥＲ２タンパク質発現の腫瘍領域がこの種の治療に耐性を獲得することは予期されうることである。一方で、ＭｉｔｏＴＡＸは、ミトコンドリアにおいて作用し、高ＨＥＲ２タンパク質発現を特徴とする細胞を、当該タンパク質が低発現の細胞よりも効果的に死滅させるものであり、トラスツズマブに耐性を持つ腫瘍領域にも対処することが可能である。

実施例２０
乳癌細胞を効果的に死滅させるＭｉｔｏＴＡＸは、その他の種類の癌細胞に対しても効果的である。このことは表２に示されており、癌腫、肉腫、及び白血病を含む様々な種類の癌を死滅させるためのＭｉｔｏＴＡＸ及びＴＡＸのＩＣ_５０値を見ることが出来る。ＩＣ_５０値は全ての場合においてＴＡＸよりもＭｉｔｏＴＡＸについて低い値となった。

実施例２４
図１８は、ＭＣＦ７乳癌細胞（Ａ）及び高ＨＥＲ２タンパク質レベルのＭＣＦ細胞亜株（Ｂ）における、表３に示されているＭｉｔｏＴＡＸのアルキル及びアルケニルトリフェニルホスホニウム誘導体の効果により誘導されたアポトーシスを示している。フローサイトメトリーを用いたアネキシンＶの外部局在化レベルの評価に基づく特定のアポトーシスアッセイを利用して、アポトーシスを起こした細胞の割合を決定した。ＭＣＦ７及びＭＣＦ７ＨＥＲ２^＋細胞を、それぞれのＭｉｔｏＴＡＸ誘導体に２μＭの濃度で２４時間暴露した。「ＣＴＲＬ」の列は、試験した物質の添加無しの細胞集団におけるアポトーシスを起こした細胞の割合を示しており、よってこれはアポトーシスの基準値と対応している。全ての試験したＭｉｔｏＴＡＸ誘導体がアポトーシスを誘導した。

結論として、我々は発病率が上昇中の疾病である乳癌の治療法として頻繁に使用される薬剤であるＴＡＸに基づいた全く新しい化合物を調製したと総括することができる（ＤｅＳａｎｔｉｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１１．ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２０１１；１：４０９−４０１８．）。本発明による上述のタモキシフェンのアルキル及びアルケニルトリフェニルホスホニウム誘導体は、標的部位であるミトコンドリア複合体が位置するミトコンドリア中に好適に蓄積する。ＭｉｔｏＴＡＸの複合体Ｉとの相互作用は、酸素分子と相互作用する電子伝達の阻害を引き起こす。これはＲＯＳ産生の増加につながり、その結果として細胞死を誘発する。ＭｉｔｏＴＡＸは、現行の治療法を大幅に複雑化させているＨＥＲ２タンパク質が低レベルの乳癌と高レベルの乳癌との両方において効果的である。したがって、ＭｉｔｏＴＡＸは癌治療におけるＴＡＸ及びトラスツズマブの両方を補助又は置換することができる。

本発明の使用
本発明による一般化学式Ｉ及びＩＡの新規タモキシフェン誘導体は、医療の現場における癌治療法のために、及び製薬業界において効果的ながん治療薬を調製するために適用することができる。

Claims (14)

1. タモキシフェン由来のトリフェニルホスホニウムが付加された脂肪族鎖を持つ、ミトコンドリア標的型のＥ型及び／又はＺ型異性体であって、前記脂肪族鎖はアルキル又はアルケニルである前記異性体、及び
   それらの対応する第三級アミン塩であって、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩などの有機酸塩、又は硫酸塩、ハロゲン化物、リン酸塩などの無機酸塩の群から選択される前記第三級アミン塩、及び／又は
   これらの混合物であって、
   タモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体は以下の一般化学式Ｉを有し、
   

   

   式中、ｎ＝８〜１２であり、Ｚはクエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、アスコルビン酸塩、メシル酸塩、トシル酸塩などの有機酸塩、又は硫酸塩、ハロゲン化物、リン酸塩などの無機酸塩の群から選択され、
   一般化学式Ｉ中のタモキシフェン部分に位置する交差した二重結合は、当該二重結合がＥ型及び／又はＺ型の配置をとりうることを示し、
   タモキシフェンのアルケニルトリフェニルホスホニウム誘導体は一般化学式ＩＡを有し、
   

   

   式中、ｎ＝６〜１０であり、Ｚは上述の意味を持ち、
   一般化学式ＩＡ中の側鎖に位置する交差した二重結合は、当該二重結合がＥ型及び／又はＺ型の配置をとりうることを示す、
   異性体、及びそれらの対応する第三級アミン塩、及び／又はこれらの混合物。
2. 請求項１記載の一般化学式Ｉのタモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体を調整する方法であって、前記方法は、一般化学式ＩＩのｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−オキシ−アルキル−トリフェニルホスホニウムであって、
   

   

   式中、ｎ＝５〜９であり、
   ＸはＩ、Ｂｒ、Ｃｌ、又はメシルである、前記ホスホニウムから、テトラヒドロフラン中、アルゴン気体下、−７８℃下における有機塩基の処理下において生成されるイリドが、化学式ＩＩＩのアルデヒドと縮合して、
   

   

   一般化学式ＩＶのシリル化誘導体を生成し、
   

   

   式中、ｎ＝５〜９であり、
   一般化学式ＩＶのシリル化誘導体はフッ化テトラブチルアンモニウムによって処理され、一般化学式Ｖのアルケノールを生成し、
   

   

   式中、ｎ＝５〜９であり、
   これは、触媒存在下の水素気体中において、一般化学式ＶＩのアルコールに還元され、
   

   

   式中、ｎ＝５〜９であり、
   一般化学式ＶＩのアルコールは、一般化学式ＶＩＩの適切な誘導体に置換され、
   

   

   式中、ｎ＝５〜９であり、
   ＸはＩ、Ｂｒ、Ｃｌ、又はメシルであり、
   これは、トリフェニルホスフィンとともに加熱することによって、一般化学式Ｉのミトコンドリア標的型のタモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体へと変換される
   ことを特徴とする、方法。
3. 請求項１記載の一般化学式Ｉのタモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウム誘導体を調整する方法であって、前記方法は、対応する臭化（ヒドロキシアルキル）トリフェニルホスホニウムが塩基によって処理され、室温下テトラヒドロフラン及びジメチルスルホキシドの混合物中において化学式ＩＩＩのアルデヒドと縮合し、一般化学式Ｖのアルケノールを生成し、当該アルケノールから、請求項２記載の方法を用いることによって一般化学式Ｉのタモキシフェンのアルキルトリフェニルホスホニウムが得られることを特徴とする、方法。
4. 請求項１記載の一般化学式ＩＡのタモキシフェンのアルケニルトリフェニルホスホニウム誘導体を調整する方法であって、前記方法は、一般化学式ＸＩＩのアルキルビス（トリフェニルホスホニウム）であって、
   

   

   式中、ｎ＝７〜１１であり、
   ＸはＩ、Ｂｒ、Ｃｌ、又はメシル又はこれらの組合せである、前記ホスホニウムから、室温下、アルゴン気体下、テトラヒドロフラン及びジメチルスルホキシドの混合物中の有機塩基の処理下において生成されるイリドが、その後化学式ＩＩＩのアルデヒドと縮合して、一般化学式ＩＡのタモキシフェンのアルケニルトリフェニルホスホニウムを生成することを特徴とする、方法。
5. 腫瘍性疾患を治療する薬剤を調製するための、請求項１記載の一般化学式Ｉ及び／又はＩＡの、タモキシフェンの脂肪族トリフェニルホスホニウム誘導体のミトコンドリア標的型のＥ型及び／又はＺ型異性体、またはそれらの混合物の使用。
6. 癌腫、肉腫、リンパ腫、及び白血病の治療薬を調製するための請求項５記載の使用。
7. 星状細胞腫、神経芽腫、膠芽腫、中皮腫、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌、子宮頚癌、骨肉腫、結腸直腸癌、肝細胞癌、白血病を含むがこれらに限定されない腫瘍性疾患の治療薬を調製するための請求項５記載の使用。
8. 請求項１記載の一般化学式Ｉ及び／又はＩＡの、タモキシフェンの脂肪族トリフェニルホスホニウム誘導体のミトコンドリア標的型のＥ型及び／又はＺ型異性体、またはそれらの混合物の使用であって、ＨＥＲ２、ＥＲα、ＧＡＴＡ３又はＫｉ６７タンパク質の異なるレベルでの発現に関係なく、乳癌腫瘍の様々な領域中の癌細胞を死滅させる薬剤を調製するための使用。
9. 請求項１記載の一般化学式Ｉ及び／又はＩＡの、タモキシフェンの脂肪族トリフェニルホスホニウム誘導体のミトコンドリア標的型のＥ型及び／又はＺ型異性体、またはそれらの混合物の使用であって、エストロゲン受容体ＥＲαを抑制する薬剤を調製するための使用。
10. 請求項１記載の一般化学式Ｉ及び／又はＩＡの、タモキシフェンの脂肪族トリフェニルホスホニウム誘導体のミトコンドリア標的型のＥ型及び／又はＺ型異性体、またはそれらの混合物の使用であって、ミトコンドリア複合体Ｉを介した呼吸を阻害する薬剤を調製するための使用。
11. 請求項１記載の一般化学式Ｉ及び／又はＩＡのタモキシフェンの脂肪族トリフェニルホスホニウム誘導体のＥ型及び／又はＺ型異性体の少なくとも一つを含有することを特徴とする、腫瘍性疾患を治療するための薬剤。
12. 請求項１１記載の薬剤であって、腫瘍性疾患が高ＨＥＲ２タンパク質レベルの乳癌であることを特徴とする、薬剤。
13. 請求項１１記載の薬剤であって、腫瘍性疾患が低ＨＥＲ２タンパク質レベルの乳癌であることを特徴とする、薬剤。
14. 請求項１１記載の薬剤であって、低及び高ＨＥＲ２タンパク質レベルの乳癌以外の腫瘍性疾患に対して有効であることを特徴とする、薬剤。

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