CZ201466A3 - Deriváty tamoxifenu k léčbě neoplastických chorob, zejména s vyšší hladinou proteinu HER2 - Google Patents

Abstract

Předmětem vynálezu jsou nové mitochondriálně cílené E/Z izomery alifatických trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu, kde alifatický řetězec je alkyl nebo alkenyl, a jejich odpovídající sole terciálního aminu jsou vybrané ze skupiny organických solí jako je citrát, acetát, tartarát, oxalát, askorbát, mesylát, tosylát nebo anorganických solí jako například sulfát, halogenid, fosfát a/nebo jejich směs (MitoTAX), obecného vzorce I, kde n = 8 až 12 a kde Z je vybrané ze skupiny organických solí jako je citrát, acetát, laktát, tartarát, oxalát, askorbát, mesylát, tosylát nebo anorganických solí jako například sulfát, halogenid, fosfát a obecného vzorce IA, kde n = 6 až 10 a kde Z má vpředu uvedený význam. Jsou použitelné k léčbě nádorů, zejména s vyšší hladinou proteinu HER2. Léčivo k léčbě neoplastických chorob podle vynálezu obsahuje nejméně jeden E/Z izomer alifatických trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu obecného vzorce I a/nebo IA nebo jejich odpovídající sole terciálního aminu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových mitochondriálně cílených derivátů tamoxifenů k léčbě neoplastických chorob, zejména nádorů s vyšší hladinou proteinu HER2 (human epidermal growth factor receptor 2), který ovlivňuje spontánní dělení buněk a růst nádorů.

Dosavadní stav techniky

Současné pokroky v molekulární medicíně vedly k určitému zlepšení v diagnose a léčbě neoplastických chorob. Přes tyto dílčí úspěchy je tato oblast onemocnění stále obrovským problémem. U některých typů nádorových onemocnění dokonce současná léčba selhává z řady důvodů. Jednak je to vrozená rezistence nádorových buněk, jejich schopnost neustále mutovat a léčbě se ‘vyhnout’, jednak velká heterogenéfta nádorového prostředí (Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144:646-674). Bylo ukázáno, že nádory téhož typu se u jednotlivých pacientů velmi liší z hlediska genomického profilu (Jones S et al. Core signaling pathways in human pancreatic cancers revealed by globál genomic analyses. Science 2008;321:1801-1806. Parsons DW et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme. Science 2008;321:1807-1812.), což ukazuje na nutnost tak zvané ‘personální’ léčby. Ještě větším problémem je heterogeneita mutací v tomtéž nádoru, jak bylo nedávno ukázáno u nádoru ledvin (Gerlinger M et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366:883-892.) a tento jev lze očekávat i u jiných typů nádorů. Proto je nutné hledat nové přístupy a neměnné zásahové místo, které by bylo společné všem či většině maligních buněk v nádoru a které přednostně ovlivňuje zásadní funkce v rakovinných buňkách. Takovým zásahovým místem se jeví mitochondrie, tedy organely, které jsou zásadní pro tvorbu energie nutné pro veškeré fyziologické i patofyziologické • · • · • ·

procesy v buňce. Přestože nádorové buňky z velké části pro tvorbu energie využívají tzv. aerobní glykolýzu, mitochondriální respirace (tedy spotřeba kyslíku spojená s tvorbou ATP) je vlastní většině (teoreticky všem) typům nádorů (Ralph SJ et al. The causes of cancer revisited: mitochondrial malignancy and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy. Mol Aspects Med 2010;31:145-170.).

Skupina látek s protirakovinnou aktivitou byla definována pod názvem ‘mitokany’ (odvozeno od ‘mitochondria and cancer’) (Neužil J et al. Molecular mechanism of ‘mitocaď-induced apoptosis in cancer celíš epitomizes the multiple roles of reactive oxygen species and Bcl-2 family proteins. FEBS Lett 2008;580:5125-5129. Neužil J et al. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion 2013;13:199-208.). Tyto látky jsou rozděleny do několika skupin podle jejich mechanismu účinku. Jsou to: 1. Inhibitory hexokinázy; 2. Látky zacílené na proteiny z rodiny Bcl-2; 3. Redox-aktivní látky inhibující thioly; 4. Látky zacílené na proteiny VDAC a ANT; 5. Látky cílící na elektronový redoxní řetězec; 6, Lipofilní látky cílené na vnitřní mitochondriální membránu; 7. Látky cílené na Krebsův cyklus; 8. Látky cílené na mitochondriální DNA. 9. Látky nezařazené do žádné z těchto skupin. Příklady těchto látek a místo jejich působení jsou uvedeny v obrázku 1.

Nádor prsu je velmi těžko léčitelné neoplastické onemocnění postihující v současné době jednu z osmi žen. K léčbě rakoviny prsu se běžně používá tamoxifen (TAX). Pro zhruba 3φό případů této choroby je typická vysoká hladina proteinu HER2, který patří do skupiny receptorových tyrosinových kináz a který zvyšuje proliferační schopnost buněk zvyšující jejich maligní potenciál (Arteaga CL et al. Treatment of HER2-positive breast cancer: current status and future perspectives. Nat Rev Clin Oncol. 2011 ;9:16—32 ). Zavedená léčba, kdy hlavním používaným lékem je TAX je neúčinná, protože jsou vůči ní nádory s vysokou hladinou HER2 resistentní. TAX působí na estrogenní recetory v plasmatické membráně buněk rakoviny prsu, čímž inhibuje důležité procesy pro proliferační vlastnosti rakovinné buňky. V nedávné době bylo publikováno, že TAX při vyšší koncentraci působí nejen přes estrogenní receptor, ale také zasahuje do • · ···· ···· .

• · · · · · • ····· · · · • · · · · ···· ·· ·· ··· · mitochondriální vnitřní membrány, kde interaguje s komplexem I respiračního řetězce, který je umístěn právě ve vnitřní mitochondriální membráně (Moreira Pl et al. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J Biol Chem 2006;281:10143-10152.). K tomuto ovšem dochází pri farmakologicky nesnadno dosažitelných dávkách. Navíc lze při těchto vysokých dávkách očekávat zvýšenou toxicitu látky TAX.

Momentálně jsou nádory prsu s vysokou hladinou proteinu HER2 léčeny humanizovanou protilátkou trastuzumab, který inhibuje aktivitu HER2. Tato léčba je ekonomicky velmi náročná a vyznačuje se sekundární toxicitou; navíc významné procento pacientek s vysokou hladinou proteinu HER2 je vůči látce trastuzumab

V resistentní (odhaduje se kolem 30j%). Problematická je i nedávno zavedená látka lapatinib, která se vyznačuje inhibicí receptorových tyrozinových kináz (Ewer MS, Ewer SM. Cardiotoxicity of anticancer treatments: what the cardiologist needs to know. Nat Rev Cardiol 2010;7:564-575. Lín SX et al. Molecular therapy of breast cancer: progress and future directions. Nat Rev Endocrinol 2010;6:485-493. Ahn ER et al. Is the improved efficacy of trastuzumab and lapatinib combination worth the added toxicity? Breast Cancer 2012;6:191-207.). Problémem je, že lapatinib není specifickým inhibitorem HER2, což může vést k inhibicí i dalších receptorových tyrazinových kináz a k sekundární toxicitě a lze předpokládat i reálný vývoj rezistence vůči této léčbě (Wetterskog D et al. Identification of novel determinants of resistance to lapatinib in ERBB2-amplified cancers. Oncogene 2013; 1-11).

Podstata vynálezu

Z výše uvedených důvodů jsme navrhli a připravili skupinu látek, které jsou účinné proti nádorům s vysokou hladinou proteinu HER2, které cíleně působí přímo na mitochondrie, a které si poradí svýše uvedenými problémy. Uvedené nevýhody odstraňují E/Z izomery přes alifatický řetězec vázaných trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu, kde alifatický řetězec je alkyl nebo alkenyl, a jejich odpovídající sole tercialního aminu, vybrané ze skupiny organických solí jako například citrát, acetát, • · laktát, tartarát, oxalát, askorbát, mesylát, tosylát nebo anorganických solí jako například sulfát, halogenid, fosfát a/nebo jejich směs (MitoTAX), obecného vzorce l_z

kde n = 8 až 12, a kde Z je vybrané ze skupiny organických solí jako například citrát, acetát, laktát, tartarát, oxalát, askorbát, mesylát, tosylát nebo anorganických solí jako například sulfát, halogenid, fosfát a překřížená vazba v obecném vzorci I, nacházející se v subjednotce tamoxifenu zahrnuje uspořádání dvojné vazby jak v kofiguraci E tak Z, a obecného vzorce IA

kde n = 6 až 10, a kde Z má vpředu uvedený význam a překřížená vazba v obecném vzorci IA, nacházející se v postranním řetězci zahrnuje uspořádání dvojné vazby jak v konfiguraci E tak Z.

• · · ·

Způsob přípravy alkyl trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu obecného vzorce I je založen na reakci ylidu generovaného z tert-butyldimethylsilyl-oxy-alkyl-trifenylfosfonia o obecném vzorci ll_z

kde n = 5 až 9 a X je I, Br, Cl nebo mesyl, v tetrahydrofuranu (THF) v atmosféře argonu při teplotě -78°C působením organické báze (s výhodou buthyl lithium) a následné kondenzací s aldehydem vzorce IIL

Na silylovaný derivát obecného vzorce IV se působí tetrabutylamonium fluoridem za vzniku alkenolu obecného vzorce V_x • ·

kde η = 5 až 9.

kde n = 5 až 9,

který se v atmosféře vodíku v přítomnosti katalyzátoru redukuje na alkohol obecného vzorce Vl_z

kde n = 5 až 9,

alkohol obecného vzorce VI se substitucí převede na příslušný derivát obecného VIl_z

kde n = 5 až 9

• · • · · · a X je I, Br, Cl nebo mesyl, který se zahříváním s trifenyl fosfinem převede na mitochondriálně cílený alkyl trifenylfosfoniový derivát tamoxifenii obecného vzorce I.

Alkenol obecného vzorce V lze připravit také přímo z aldehydu III reakcí s (9-hydroxyalkyl)trifenylfosfonium bromidem a působením báze (s výhodou lithium hexamethyldisilazan) při pokojové teplotě a při použití směsi THF a dimethylsulfoxidu (DMSO), která zvýší rozpustnost (9-hydroxynonyl)trifenylfosfonium bromidu. Syntéza se výrazně zkrátí a zlevní.

V případě použití alkenolu obecného vzorce V ve formě sole terciálního dusíku se zvýší výtěžek dalším výše uvedeným postupem získaného alkoholu obecného vzorce VI, ze kterého lze bez izolace látky obecného vzorce VII získat příslušnou sůl terciálního aminu trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu obecného vzorce I.

Způsob přípravy alkenyl trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu obecného vzorce IA je založen na přípravě ylidu generovaného z alkyl bis(trifenylfosfonia) o obecnem vzorci Vlil kde n = 7 až 11 a Xje I, Br, Cl nebo mesyl nebo jejich kombinace, ve směsi tetrahydrofuranu (THF) a dimethylsulfoxidu (DMSO) v atmosféře argonu při pokojové teplotě působením organické báze (s výhodou lithium hexamethyldisilazan) a jeho následné kondenzaci s aldehydem vzorce III.

o

Alkyl bis(trifenylffosfonium) obecného vzorce Vlil se připraví reakcí příslušného alkylu s trifenyl fosfinem za zvýšené teploty.

• · · ·

Kationická skupina trifenylfosfonia (TPP⁺) umožňuje interakci alkyl nebo alkenyl trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu látky obecného vzorce I nebo IA s mitochondriemi. Tyto látky byly připraveny adicí kationické skupiny alkyl-TPP⁺ k látce TAX. V biologickém prostředí je pozitivní náboj na fosforu TPP⁺ skupiny delokalizován, takže látka se chová neutrálně. Jedinou výjimkou jsou buněčné struktury s negativním potenciálem, což je vnitřní povrch plasmatické (buněčné) membrány a již výše zmíněná vnitřní mitochondriální membrána. V jejich blízkosti se náboj lokalizuje na fosforu a pozičně nabitá TPP⁺ skupina působí jako kotva, způsobující masivní koncentraci alkyl nebo alkenyl trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu obecného vzorce I nebo IA (MitoTAX) na interfázi mitochondriální matrix a vnitřní membrány mitochondrie.

Část molekuly MitoTAXu, na jejímž konci je skupina TPP+, je orientována do mitochondriální matrix, přičemž biologicky aktivní část je ve vnitřní mitochondriální membráně, kde je lokalizováno molekulární zásahové místo látky MitoTAX, jímž je mitochondriální komplex I. Pro fyzickou interakci biologicky aktivní části MitoTAXu, s mitochondriálním komplexem I, který je součástí vnitřní mitochondriální membrány, je nutné, aby mezi biologicky aktivní částí molekuly MitoTAXu a TPP+ skupinou byl alifatický řetězec o určité délce, zdá se, že není podstané zda alifatický řetězec je alkyl nebo alkenyl - viz příklad 24. Z hlediska biologických a fyzikálně-chemických vlastností mitochondriální membrány se jako ideální jeví délka alifatického řetězce o délce 8 až 12 uhlíků.

MitoTAX je výrazně účinnější při zabíjení buněk nádoru prsu než původní TAX. Dalším velmi významným zjištěním je poznatek, že MitoTAX účinněji zabíjí buňky rakoviny prsu s vysokou expresí proteinu HER2 než buňky s nízkou expresí proteinu HER2. U TAXu je tomu přesně naopak, proto je klinicky vůči rakovině prsu s vysokým HER2 neúčinný. Důvodem zvýšené citlivosti látky MitoTAX vůči buňkám nádoru prsu s vysokou hladinou proteinu HER2 tkví pravděpodobně v lokalizaci tohoto proteinu HER2 také v mitochondriích, přičemž u buněk s nižší či velmi nízkou expresí HER2 je tento onkoprotein lokalizován v plasmatické membráně nádorové buňky.

• · • · ···· · ·♦ · · • · · · ·· • ····· ·· · • · · ·· ···· ·· ·· · _e..

Látka trastuzumab, která je používána k léčbě rakoviny prsu s vysokou hladinou proteinu HER2, je v řadě případů neúčinná. Pravděpodobným důvodem je skutečnost, že v případě vysoké hladiny proteinu HER2 je jeho značná část lokalizovaná v mitochondriích a při působení látky trastuzumab na nádorovou buňku se protein HER2 tím více přesouvá do mitochondrií. Rakovinná buňka tak .skrývá¹ HER2 před látkou trastuzumab, který inhibuje jeho aktivitu. Mitochondriální asociace HER2 také mění mitochondriální metabolismus tak, že rakovinná buňka přechází na glykolýzu a lépe přežívá v prostředí chudém na živiny a kyslík.

Na rozdíl od látky trastuzumab MitoTAX vstupuje do buňky a akumuluje se v mitochondriích na základě negativního potenciálu na vnitřním povrchu vnitřní mitochondriální membrány. Buňky rakoviny prsu s vysokou hladinou proteinu HER2, v mnoha případech rezistentní k látce trastuzumab, jsou vůči látce MitoTAX citlivější.

Důležitou vlastností MitoTAXu, je účinná inhibice růstu spontáního nádoru prsu s vysokým HER2 v myším modelu kdy je růst inhibován asi z 90ztj %, přičemž účinnost látky TAX je zhruba 2Oaž 30/krát nižší. MitoTAX je vůči myším netoxický.

Nádory prsu jsou heterogenní z hlediska exprese proteinů HER2. Lze očekávat, že pouze část nádoru bude odpovídat na léčbu látkou trastuzumab, přičemž MitoTAX bude účinný. Zabíjí buňky jak s nízkou tak i s vysokou expresí proteinu HER2.

Jako mitokan, který působí na mitochondriální komplex II byl popsán vitamin E sukcinát (Dong LF et al. α-Tocopheryl succinate induces apoptosis by targeting ubiquinone—binding sites in mitochondrial respirátory complex II. Oncogene 2008;27:4324-4335.

Dong LF et al. Suppression of tumour growth in vivo by the mitocan a-tocopheryl succinate requires respirátory complex II. Clin Cancer Res 2009;15:1593-1600.). V nedávné době jsme připravili a testovali látku, která vznikla adici TPP+ skupiny k vitamin E sukcinátu. Tato nová látka cílí na stejné molekulární zásahové místo, jeho aktivita je ale vyšší než aktivita původního vitamin E sukcinátu díky zvýšené koncentraci této látky na interfázi vnitřní mitochondriální membrány a mitochondriální matrix. (Dong LF et al. Mitochondrial targeting of vitamin E succinate enhances its pro-apoptotic and anti-cancer activity via mitochondrial complex II. J Biol Chem 2011;286:3717-3728. Dong LF et al. Mitochondrial targeting of α-tocopheryl succinate enhances its proapoptotic efficacy: A new paradigm of efficient anti-cancer therapy. Free Rádie Biol Med 2011;50:1546-1555. Rohlena J et al Mitochondrially targeted α-tocopheryl succinate is antiangiogenic: Potential benefit against tumor angiogenesis but caution against wound healing. Antiox Redox Signál 2011;15:2923-2935.). Podobně jako vitamin E sukcinát s adicí TPP+ skupiny se i látka MitoTax zvýšenou měrou akumuluje na interfázi vnitřní mitochondriální membrány a mitochondriální matrix. MitoTAX podle předkládaného vynálezu však zasahuje mitochondriální komplex I, čímž se mění jeho spektrum účinků oproti TAX, který působí převážně na estrogenní recetory v plasmatické membráně buněk rakoviny prsu, čímž inhibuje jejich aktivitu důležitou pro proliferační vlastnosti rakovinné buňky.

MitoTAX se akumuluje v mitochondriích, vyvolává buněčnou smrt selektivně v rakovinných buňkách, jejichž mitochondrie mají vyšší negativní potenciál ve srovnání s mitochondriemi normálních buňek. Zabíjí velmi účinně buňky rakoviny prsu s vysokým HER2 a je účinný proti rakovině prsu s vysokým HER2, kdy cílovým místem pro MitoTAX je mitochondriální komplex I (viz. Obr. 1).

MitoTax lze použít k přípravě léčiva pro léčbu neoplastických chorob, zejména karcinomů, sarkomů, lymfomů a leukémií, pro onemocnění vybraná ze skupiny: astrocytom, neuroblastom, glioblastom, mesotheliom, nádor prostaty, nemalobuněčný nádor plic, nádor děložního čípku, osteosarkoma, kolorektální nádor, hepatokarcinoma, leukémie.

Seznam použitých zkratek DCM dichlormetan

DMSO dimethylsufoxid

ERa estrogenní receptor-a

ESI MS hmotnostní spektrometrie s ionizací elektron sprejem

HER2 human epidermal growth factor receptor 2 • ·

IBX	n 2-jod^oxybenzoová kyselina
LiHMDS	lithium hexamethyldisilazan
MitoTAX	mitochondriálně cílený tamoxifen
MitoVES	mitochondriálně cílený vitamin E sukcinát
NMR	nukleární magnetická rezonance
TAX	tamoxifen
TBAF	tetrabutylamonium fluorid
THF	tetrahydrofuran
TLC	chromatografie na tenké vrstvě

Přehled obrázků

Obr. 1. znázorňuje klasifikaci jednotlivých tříd mitokanů, potenciálně protirakovinných látek působících na mitochondrie.

Obr. 2. znázorňuje přípravu sublinií lidského karcinomu prsu MCF7.

Obr. 3. znázorňuje vliv účinků MitoTAXu a TAXu na potlačení růstu experimentálního nádoru s vysokou expresí HER2.

Obr. 4. znázorňuje vliv účinků MitoTAXu a TAXu na apoptózu rakovinných buněk různých buněčných linií.

Obr. 5. znázorňuje vliv koncentrace MitoTAXu na účinnou apoptózu u různých buněčných linií buněk rakoviny prsu s vysokou hladinou HER2.

Obr. 6. znázorňuje jak koncentrace MitoTAXu ovlivňuje funkci mitochondriálního komplexu I a II, respektive respiraci nádorových buněk.

Obr. 7. ukazuje srovnání vlivu MitoTAXu a TAXu na tvorbu kyslíkových radikálů v buňkách rakoviny prsu.

Obr. 8. znázorňuje a porovnává vliv MitoTAXu a TAXu na pokles mitochondriálního potenciálu.

Obr. 9. ukazuje, že HER2 je u buněk s vysokou expresí HER2 lokalizován převážně v mitochondriích.

Obr. 10. znárorňuje vliv hladiny proteinu HER2 na délku mitochondrií.

• · • · ···· * · · · « • · · · · · • ····· · · · • · · · · ···· ·· ·· ··· ·

Obr. 11. ukazuje vliv hladiny proteinu HER2 na tvorbu laktátu a mitochondriální respiraci.

Obr. 12. ukazuje, že buňky s vysokou hladinou proteinu HER2 mají zvýšený příjem glukózy.

Obr. 13. ukazuje, že MitoTAX avšak nikoliv TAX snižuje expresi estrogenního receptoru

ERa.

Obr. 14. ukazuje, že protein HER2 je lokalizován v mitochondriích u spontánních nádorů s vysokou hladinou HER2.

Obr. 15. ukazuje, že jednotlivé oblasti nádoru mléčné žlázy u transgenní myši FVB/N c-neu se liší expresí genů důležitých pro vývoj a léčbu rakoviny prsu (HER2, ERa,

GATA3, Ki67).

Obr. 16. znázorňuje řezy jednotlivých oblasti nádoru prsu barvené metodou eosinhematoxylin, které ukazující morfologii nádoru.

Obr. 17. ukazuje řezy jednotlivých částí téhož nádorů s výrazně různou hladinou proteinu HER2.

Obr. 18. znázorňuje vliv účinků různých derivátů MitoTAXu na apoptózu rakovinných buněk MCF7 (A) a MCF7 HER2⁺(B).

Příklady provedení

Jako výchozí látka pro přípravu alkyl trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu obecného vzorce I a/nebo IA (MitoTAX) byl použit aldehyd vzorce lll_r \

• · • · · · • · ·· • · ·» • · · « ·· • ·· • · · · který byl připraven podle postupu publikovaného v roce 2003. ((Z)-Tamoxifen and Tetrasubstituted Alkenes and Dienes via a Regio- and Stereospecific Three-Component Magnesium Carbometalation Palladium(O) Cross-Coupling Stratégy ; Pierre E. Tessier, Andrea J. Penwell.Fabio E. S. Souza, and Alex G. Fallis*; ORGANIC LETTERS, 2003, Vol. 5, No. 17, 2989-2992.)

Výchozí aldehyd III, jak autoři předkládaného vynálezu zjistili, lze připravit za použití jiného oxidačního činidla než byl použit ve výše uvedené publikaci. Zjistili, že při použití r\

2-jodépxybenzoové kyseliny (IBX) místo Dess-Martinova činidla vzniká pouze jeden isomer na dvojné vazbě. Výtěžek je srovnatelný.

IBX (12,460 g, 44,498 mmol) a výchozí allylalkohol (5,54 g, 14,833 mmol) (viz. výše uvedená publikace) se rozpustí v ethylacetátu (120 ml). Suspenze se za stálého míchání refluxuje po dobu 3 hodin. Reakční směs se zchladí na pokojovou teplotu, zředí diethyl etherem (1 I) a opakovaně promyje nasyceným roztokem uhličitanu sodného (3jx 100 ml). Spojené vodné vrstvy se znovu extrahují ethylacetátem (3jx 80 ml). Spojená ethylacetatátová vrstva se suší nad síranem hořečnatým. Sušidlo se zfiltruje a roztok se zakoncetruje za sníženého tlaku. Tímto se získá 4,850 g (88 %) adehydu III ve formě nahnědlé pevné látky

Příklad 1 (9-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)nonyl)trifenylfosfonium bromid (634 mg, 1,057 mmol) se rozpustí v suchém tetrahydrofuranu (THF) (6 ml), překryje atmosférou argonu a ochladí v

na -7$fC. Do reakční směsi se pomalu pod atmosférou argonu přikape buthyl lithium (1,2 ml, 0,9 M roztok v THF). Roztok se nechá pomalu ohřát na dČC, zbarví se do tmavě červena a znovu se ochladí na -7^C a přikape se aldehyd vzorce III (160 mg, 0,430 mmol) rozpuštěný v suchém THF (3 ml). Reakční směs se nechá ohřát na laboratorní teplotu a pod atmosférou argonu se míchá po dobu 16 hodin. Průběh reakce se monitoruje pomocí chromatografie na tenké vrstvě (TLC) ve směsi chloroform - metanol (10:1). Poté se přidá nasycený roztok chloridu amonného, voda a extrahuje se ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje solankou a suší se nad síranem hořečnatým. Roztok se zfiltruje a zakoncentruje za sníženého tlaku. Chromatografií /4/ koncentrátu na sloupci silikagelu v systému dichlormetan (DCM)/metéinol (gradient 0 až 1(J% meféinolu) se získá 147 mg požadovaného produktu vzorce 4 (56% výtěžek).

<⁴) ¹H NMR (500 MHz, cdcl3) δ 7,42-7,36 (m, 5H), 7,18-7,28 (m, 5H), 6,94 (d, J = 8,7, 2H), 6,73 (d, J = 8,7, 2H), 6,19 (d, J = 11,5, 1H), 5,47 (dt, J = 11,5, 7,4, 1H), 4,09 (t, J = 5,8, 2H), 3,72 (t, J = 6,6, 2H), 2,80 (t, J = 5,8, 2H), 2,42 (s, 6H), 1,69 - 1,57 (m, 4H), 1,48 -1,13 (m, 10H), 1,03 (s, 9H), 0,18 (s, 6H). Hmotnostní spektrometrie s ionizací electron sprejem (ESI MS): 612.

(9-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)nonyl)trifenylfosfonium bromid byl připraven podle postupu publikovaném v literatuře. (Tetrahedron Letters, 2010, 51,49, 6426-6428.)

Příklad 2

Silylovaný derivát vzorce 4 (147 mg, 2,240 mmol) se rozpustí vTHF (5 ml), překryje atmosférou argonu a za stálého míchání se při teplotě (^C přikape tetrabutylamoniumfluorid (TBAF) (260 μΙ, 1M roztok vTHF). Reakční směs se nechá ohřát na laboratorní teplotu a míchá se dalších 6 hodin. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi chloroform - methanol (10:1). Poté se přidá voda a směs se extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje nasyceným roztokem sody, solanky a suší se nad síranem hořečnatým. Sušidlo se zfiltruje a roztok se zakoncetruje za sníženého tlaku. Koncentrát se přečistí sloupcovou chromatografií na silikagelu v systému chloroform/meíanol (gradient 0 až 1$/o metéínolu). Tímto se získá 115 mg λ (96% výtěžek) požadovaného alkenolu vzorce 5.

• · • · • ·· · · ··· • · · · · · • · · · · · · · · • · · · · •··· ·· ·· ···

(5) ¹H NMR (500 MHz, cdcl3) δ 7,43 - 7,14 (m, 5H), 6,94 (d, J = 8,5, 2H), 6,72 (d, J = 8,5, 2H), 6,20 (d, J = 11,5, 1H), 5,48 (dt, J = 11,5, 7,4, 1H), 4,12 (t, J = 5,9, 2H), 3,72 (t, J = 6,6, 2H), 2,86 (t, J = 5,9, 2H), 2,46 (s, 6H), 1,71-1,58 (m, 4H), 1,51 - 1,10 (m, 10H). ESI MS: 498.

Příklad 3

Alkenol derivát vzorce 5 (115 mg, 0,231 mmol) se rozpustí v absolutním etanolu (6 ml) a překryje se atmosférou argonu. Ke směsi se přidá 10% Pd/C (10 mg) a baňka s reakční suspenzí se několikrát opakovaně evakuuje a překryje atmosférou vodíku. Poté se reakční směs míchá při laboratorní teplotě pod atmosférou vodíku po dobu 24 hodin. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi chloroform - methanol (10:1). Směs se přefiltruje přes vrstvu Celitu a několikrát promyje etanolem. Odpařením etanolu se získá 101 mg (87% výtěžek) požadovaného alkoholu vzorce 6, který se použije bez dalšího čištění k další syntéze.

(θ) ¹H NMR (500 MHz, cd3od) δ 7_r40 - 7,01 (m, 10H), 6,85 (d, J = 8,1, 2H), 6,68 (d, J = 8,1, 2H), 4,20 (s, 2H), 3,55 (t, J = 6,4, 2H), 3,46 (s, 2H), 2,89 (s, 6H), 2,42 (t, J = 7,8, 2H), 1,57-1,48 (m, 2H), 1,38-1,11 (m, 12H). ESI MS: 500.

··· ·· · · · · • ····· · · · «···· • · · · · · · ···· ·· ·· ··« · · · ·

Příklad 4

Alkohol vzorce 6 (230 mg, 0,460 mmol) se rozpustí v DCM (10 ml). Do směsi se za laboratorní teploty a pod atmosférou argonu přidá CBr₄ (480 mg, 1,447 mmol). Poté se přikape trifenylfosfin (400 mg, 1,525 mmol) rozpuštěný v DCM (3 ml). Směs se míchá při laboratorní teplotě 2 hodiny a poté se zakoncentruje za sníženého tlaku. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi chloroform - metanol (10:1). Chromatografií koncentrátu na sloupci silikagelu v systému DCM/meranol (gradient 0-10^o) se získá 273 mg (92% výtěžek) požadovaného bromidu vzorce 7. Bromid je podstoupen další reakci bez dlouhého skladování.

¹H NMR (400 MHz, cdcl3) δ 7,46 - 6,96 (m, 10H), 6,78 (d, J = 8_r9 Hz, 2H), 6.,53 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 4,29 (t, J = 6,6 Hz 2H), 3,47 - 3,28 (m, 4H), 2,82 (s, 6H), 2,38 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 1,80 (q, J = 7,8 Hz, 2H), 1,46-0,98 (m, 14H). ESI MS : 561.

Příklad 5

Alkohol vzorce 6 (102 mg, 0,204 mmol) se rozpustí v DCM (6 ml). Do směsi se za laboratorní teploty přidá trifenylfosfin (83 mg, 0,316 mmol) a imidazol (27 mg, 0,397 mmol) a reakční směs se ochladí v ledové lázni na $C. Do vychlazené reakční směsi se přisype jod (76 mg, 0,302) a míchá se při laboratorní teplotě po dobu 4 hodin. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi chloroform - metanol (10:1). Reakční směs se zředí dichlormethanem a extrahuje se thiosíranem. Organická fáze se dále promyje nasyceným roztokem sody a solanky a suší se nad síranem hořečnatým. Chromatografií koncentrátu na sloupci silikagelu v systému DCM/meranol (gradient 0 až 10(%) se získá 100 mg (80% výtěžek) požadovaného jodidu vzorce 8. Jodid je podstoupen další reakci bez dlouhého skladování.

• ·· · · ··· • · · · ·· • ····« · ·9 • · · ·· ···· ·· · · ···

¹H NMR (400 MHz, cdcl3) δ 7,40 - 7_f32 (m, 2H), 7,31 - 7,22 (m, 4H), 7,22 - 7,08 (m, 4H), 6,78 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 6,57 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 3,95 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 3,19 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2,68 (t, J = 5,8 Hz, 2H), 2,47 - 2,37 (m, 2H), 2,31 (s, 6H), 1,81 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 1,52 - 1,00 (m, 14H). ESI MS: 610.

Příklad 6

K bromidu vzorce 7 (273 mg, 0,425 mmol) se přidá trifenyl fosfin (300 mg, 1,144 mmol) a směs se míchá při teplotě 85^0 pod atmosférou argonu po dobu 12 hodin. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi chloroform - metanol (10:1). Reakční směs se nechá ochladit na laboratorní teplotu, rozpustí se v minimálním množství DCM a přikape do roztoku hexanu (50 ml) za stálého míchání při teplotě OPC. Vzniklý precipitát se zfiltruje, opět rozpustí v minimálním množství DCM a přikape do roztoku diethyletheru (50 ml) za stálého míchání při teplotě QfC. Precipitát se zfiltruje a usuší pod vakuem. Takto se získá 281 mg (73% výtěžek) požadované látky vzorce 9 ve formě slabě žlutého prášku.

¹H NMR (500 MHz, cd3od) δ 7,89 - 7,74 (m, 15H), 7,37 - 7,05 (m, 10H), 6,85 (d, J = 8,7, 2H), 6,71 (d, J = 8_f7, 2H), 4,24 (t, J = 5,0, 2H), 3,57 (t, J = 5,0, 2H), 3,43 (m, 2H), • · • ·

(m, 12H). ESI MS: 744.

Příklad 7

Obdobným postupem jako v příkladu 6 se získá z jodidu vzorce 8 látka vzorce 10

Příklad 21

Látku vzorce V lze získat přímo z látky vzorce III reakcí s (9-hydroxynonyl)triphenylphosphonium bromidem místo s (9-((tert-butyldimethylsilyl)oxy)nonyl)trifenylfosfonium bromidem. Syntéza se zkrátí a zlevní.

Hlavní změnou je použití směsi THF a DMSO, čímž se zvýší rozpustnost a reakci lze provést přímo s (9-hydroxynonyl)triphenylphosphonium bromidem, což bylo v v samotném THF nemožné. Postup je proveden za pokojové teploty místo -78rC. Výrazně se také zkrátí celkový čas přípravy požadované látky.

Příprava látky vzorce 5

NOH

(9-hydroxynonyl)triphenylphosphonium bromid (3,920 g, 8,082 mmol) se rozpustí v DMSO (10 ml) a poté se přidá THF (30 ml). Do reakční směsi se po dobu 3 minut přikapává roztok LiHMDS (14,800 ml, 1M v THF). Barva reakční směsi se změní na výrazně oranžovou. Poté se do reakční směsi přikape roztok aldehydu vzorce lil (1₍000 g, 2_}694 mmol) v THF (15 ml) a reakce se nadále míchá po dalších deset minut při ··· · · · · · · • ····· · · · ····· • · · · · · · ···· ·· · · ··· ··· · laboratorní teplotě. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi chloroform -methanol (10:1). Reakční směs se nalije do studeného nasyceného roztoku chloridu amonného (100 ml) a extrahuje se diethyletherem (5?x 100 ml). Spojené organické vrstvy se suší nad síranem hořečnatým. Sušidlo se zfiltruje a produkt se zakoncentruje pod vakuem. Surový materiál se rozpustí v diethyletheru (10 ml) a po kapkách se přidá nasycený etherový roztok HCI (5 ml). Precipitovaný product se zfiltruje a extrahuje roztokem NaOH (5 ml, 1M) a diethyl etherem (25 ml). Organická vrstva se suší nad síranem hořečnatým. Sušidlo se zfiltruje a product se zakoncetruje pod vakuem. Tímto postupem, se získá 1,102 g (82%) produktu vzorce 5 ve formě slabě nažloutlého oleje, který je tak připraven pro další reakce.

Příklad 22

Z látky vzorce 6 lze připravit látku vzorce 9a (hydrochlorid tercialního aminu) bez nutnosti izolovat látku 7. Zkrátí se doba přípravy a zvýší se výtěžek.

Příprava látky vzorce 9a

K alkoholu vzorce 6 (300 mg, 0,600 mmol) rozpuštěnému v diethyťetheru (6 ml) se přidá nasycený etherový roztok HCI (6 ml), směs se zakoncentruje pod vakuem a znovu rozpustí v DCM (6 ml). K reakční směsi se přidá CBu (298 mg, 0,901 mmol) a po jeho úplném rozpuštění se přidá ještě trifenyl fosfin (252 mg, 960 mmol). Reakce se ukončí za 5 minut přidáním metanolu (1 ml) a nasyceného etherového roztoku HCI (3 ml). Roztok se zakoncetruje pod vakuem a přidá se trifenyl fosfin (2,000 g, 7,625 mmol). Reakční směs se míchá přes noc při teplotě 10(^C. Směs se zchladí na pokojovou teplotu a rozpustí se v DCM (10 ml). Roztok se za stálého míchání přikape do ledovou lázní chlazeného roztoku diethyl etheru (100 ml). Vznilý precipitát se zfiltruje a usuší pod vakuem. Takto se získá 334 mg (74%) produktu vzorce 9a ve formě bílé slabě olejovité pevné látky. Produkt může být přečištěn opakovaným rozpuštěním v DCM (2 ml) a následným vysrážením v diethyl etheru (20 ml).

• ·

Příklad 23

Příprava látky vzorce 11 - isomerního alkenyltrifenylfosfonivého derivátu tamoxifenu

Nonan-1,9-diylbis(trifenylfosfonium)bromid se připraví působením trifenylfosfinu na 1,9-dibromnonan v roztoku dimethylformamidu při teplotě 1OOJJC po dobu 16 hodin a následnou krystalizací z ethylacetátu.

Nonan-1,9-diylbis(trifenylfosfonium)bromid (545 mg, 674 mmol) se rozpustí v DMSO (1 ml) a poté se přidá THF (3 ml). Do reakční směsi se po dobu 3 minut přikapává roztok LiHMDS (670 μΙ, 1M v THF). Barva reakční směsi se změní na výrazně oranžovou. Poté se do reakční směsi přikape roztok aldehydu vzorce III (100 mg, 0,269 mmol) v THF (1 ml) a reakce se nadále míchá po dalších deseti minut při pokojové teplotě. Průběh reakce se monitoruje pomocí TLC ve směsi chloroform - methanol (10:1). Reakční směs se nalije do studeného nasyceného roztoku chloridu amonného (10 ml) a extrahuje se dichlormethanem (5// 20 ml). Spojené organické vrstvy se suší nad síranem hořečnatým. Sušidlo se zfiltruje a produkt se zakoncetruje pod vakuem. Chromatografií koncentrátu na sloupci silikagelu v systému chloroform/meí^nol v

(gradient 0-10J7o) se získá 56 mg (30%) požadovaného produktu vzorce 11.

¹H NMR (400 MHz, cdcl3) δ 8₍00 - 7,52 (m, 15H), 7,25 - 7,11 (m, 6H), 7,11 -6,96 (m, 4H), 6,72 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 6,53 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 6,00 (d, J = 11,5 Hz, 1H), 5,26 (dt, J = 11,5, 7,4 Hz, 1H), 4,02 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 3,80 - 3,53 (m, 2H), 2,88 (t, J = 5,3 Hz, 2H), 2,42 (s, 6H), 2,06 - 1,79 (m, 2H), 1,64 - 1,36 (m, 4H), 1,38 - 1,05 (m, 4H), 1,p6 - 0,73 (m, 4H). ESI MS: 742.

Biologické testy mitochondriálně cíleného alkyl trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu (MitoTAX), srovnávací studie s tamoxifenem (TAX)

Následující příklady 8-20 byly provedeny s látkou MitoTAX obecného vzorce I, kde n = 10.

Příklad 8

MitoTAX připravený podle příkladu 6 byl testován z hlediska vlivu na buněčné linie rakoviny prsu. Byly použity linie s různou hladinou exprese proteinu HER2 a estrogenního receptoru a. (ERa). Buněčná linie MCF7 má relativně nízkou expresi proteinu HER2. Pro testování vlivu MitoTAXu na zabíjení buněk rakoviny prsu s různou hladinou proteinu HER2 jsme připravili HER2’ a HER⁺ MCF7 buňky. MCF7 buňky byly transfekovány vektorem s ‘non-silencing’ sekvencí (NS), se ‘short hairpin sekvencí utlumující expresi HER2 (sh) a vektorem s genem pro HER2. Obr. 2 ukazuje na expresi proteinu HER2 v různých subliniích za použití metody ‘western blotting’. V další práci byly použity buněčné sublinie NS, Sh1 26 (klon 26) a +11 (klon 11).

Příklad 9

Zjišťovali jsme IC₅₀ hodnoty pro látky TAX a MitoTAX pro řadu linií rakoviny prsu. Jednotlivé hodnoty byly stanoveny z křivek přežívání buněk při různých koncentracích obou látek pomocí metody .crystal violeť. Použili jsme buněčné linie s různou kombinací exprese proteinu HER2 a ERa: ERa⁺/HER2^low (MCF7par), ERa⁺/HER2⁺ (MCF7Her₂₊, BT474, NeuTL - myší linie rakoviny mléčné žlázy), ERo7HER2' (MCF7her2-, T47D, ZR75-1), ERa7HER2⁺ (SK-BR-3), ERaVHER’ (MDA-MB-231, MDA-MB-453, MDA-MB436). Z tabulky I. je patrné, že IC50 hodnota je výrazně nižší pro látku MitoTAX, a to zhruba o řád. Nejcitlivější je linie MCF7her2+, která má genotyp ERa⁺/HER2⁺. Odpovídající linie s genotypem ERa⁺/HER2‘ (MCF7Her2-) a genotypem ERa⁺/HER2^low (MCF7_par) mají IC₅₀ hodnoty zhruba 2jJ<rát vyšší, což ukazuje na skutečnost, že zvýšení hladiny proteinu HER2 vede ke zvýšení citlivosti k MitoTAXu. Na druhou stranu se snižuje citlivost k tomuto molekulárnímu cíli látky TAX, kde trend hodnot IC50 je opačný. To ukazuje na jedinečnou vlastnost MitoTAXu, která (pokud je nám známo) zatím nebyla u jiných protirakovinných látek zjištěna.

Tabulka I. IC50 hodnoty (μΜ) pro buněčné linie rakoviny prsu s rozdílnou expresí proteinu HER2 a ERa

Buněčná linie	Status	TAX	MitoTAX
MCF7par	ERa+/HER2l0W	15,2	1,25
MCF7her2-	ERa+/HER2‘	14,1	1,45
MCF7her2+	ERa+/HER2+	21,6	0,65
T47D	ERa+/HER2'	17,3	3,4
MDA-MB-231	ERa/HER-	35,8	6,2
MDA-MB-453	ERa/HER’	17,5	2,5
MDA-MB-436	ERa/HER	12,6	3,4
ZR75-1	ERa+/HER2‘	16,9	2,7
SK-BR-3	ERa/HER2+	28,3	3,5

• to • ·· · · · · · · to to • · · toto to ··· • ····· · · · · ····

BT474	ER+/HER2+	29,8	2,4
NeuTL	ERa7HER2+	35,6	4,5

Příklad 10

Dále jsme zjištovali, zda MitoTAX potlačuje růst nádorů. Proti rakovinná účinnost látky MitoTAX byla testována za použití transgenní myší linie FVB/N c-neu, která je charakteristická tím, že se rodí zdravá a u níž v dospělosti dojde ke zvýšené expresi proteinu HER2 působením estrogenu (Guy CT et al. Expression of the neu protooncogene in the mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease. Proč Nati Acad Sci USA 1992;89:10578-10582.). U těchto myší dochází k dysplazii a poté hyperplazii v oblasti mléčné žlázy v době 3 až 4 měsíce po narození a k tvorbě hmatatelných nádorů po 6-ti měsících, a to v kontextu funkčního imunitního systému. Tento model nádoru prsu (mléčné žlázy) je velmi dobrou aproximací lidského nádoru prsu s vysokou hladinou proteinu HER2 typu ‘ductal in šitu’. Naše výsledky (Obr. 3) ukazují velmi dobrou účinnost látky MitoTAX na růst těchto nádorů. Myším byla podávána dávka 3 μηηοΙ látky TAX a 0,5 μηηοΙ látky MitoTAX dvakrát týdně po dobu dvou týdnů. Objem nádorů byl kvantifikován pomocí ultrazvukového zobrazovacího přístroje, který velmi precizně a neinvazivně zobrazuje nádory a to včetně částí, které jsou zanořené v těle pokusného zvířete. Je patrné, že MitoTAX je zhruba 20-až 3($krát účinnější než TAX, přičemž rozdíly mezi působením obou látek jsou signifikantní. Symbol naznačuje signifikantní rozdíly mezi léčenými a kontrolními zvířaty, symbol ,**‘ signifikantní rozdíly mezi zvířaty léčenými látkou TAX a látkou MitoTAX. Přitom nebyla u experimentálních zvířat pozorována žádná zjevná toxicita. Fotografie pod grafem ukazují representativní nádory z jednotlivých skupin zvířat.

Příklad 11

Důležitým aspektem látky MitoTAX je její vyšší protirůstová aktivita vůči liniím se zvýšenou expresí onkogenu HER2. To je ukázáno v Obr. 4, který také dokumentuje, že linie se sníženou expresí onkogenu HER2 (klon 26) je vůči látce MitoTAX méně účinná, přičemž pro látku TAX je tomu naopak. Také jsme pro tyto pokusy připravili sublinii linie MCF7 rezistentní vůči látce TAX, a to dlouhodobým působením na původní linii MCF7 • · • · · · · · ·· · • ····· · · · ··· · • · · · · ·· • ··· · · ·· · · ···· · látkou TAX o zvyšující se koncentraci. Je vidět, že tyto buňky, rezistentní k látce TAX, byly citlivé k látce MitoTAX (Obr. 4). Výsledky v Obr. 4 znázorňují přežívání sublinií rakoviny prsu odvozené z MCF7 buněk o rozlišných genotypech (ERa⁺/HER2^l0W, MCF7_par; ERa⁺/HER2⁺, MCF7^HER2+ - klon 26; ERa⁺/HER2', MCF7^HER2’ - klon 11; ERa⁺/HER2^l0W, MCF7^TAX'^R). Výsledky byly získány pomocí metody ‘crystal violeť, která umožňuje stanovení živých a mrtvých buněk, v tomto případě v přítomnosti různých koncentrací látek MitoTAX a TAX.

Příklad 12

Důležitou vlastností protirakovinných látek, které způsobuií smrt rakovinných buněk, je způsob buněčné smrti. Proto jsme testovali, zda látka MitoTAX vyvolává apoptózu, tedy programovanou buněčnou smrt, kdy buňka umírá řízeným způsobem a její ‘zbytky’, tzv. apoptotická tělíska, jsou z tkáně odstraňovány fagocytickými buňkami, aniž dochází k masivním zánětům. Obr. 5 ukazuje, že látka skutečně vyvolává apoptózu. Tento způsob buněčné smrti byl vyhodnocen na základě stanovení procenta buněk s proteinem annexin V ve vnější části plasmatické membrány metodou průtokové cytometrie. Výsledky opět ukazují na jasnou zvýšenou aktivitou látky MitoTAX vůči buňkám s vysokou hladinou proteinu HER2, přičemž buňky se sníženou hladinou proteinu HER2 jsou výrazně rezistentnější (přičemž i tak tyto buňky zabíjí).

Příklad 13

Předchozí publikace (Moreira Pl et al. Tamoxifen and estradiol interact with the flavin mononucleotide site of complex I leading to mitochondrial failure. J Biol Chem 2006;281:10143-10152.) naznačila, že cílovým místem v mitochondriích je při vysoké koncentraci látky TAX komplex I. Zjistili jsme, že tak je tomu i pro MitoTAX, což je dokumentováno v Obr. 6. Zde je ukázán vliv látky TAX (vlevo) a MitoTAX (vpravo) na respiraci přes mitochondriální komplex I a II. Je vidět, že TAX inhibuje přednostně komplex I před komplexem II, a to při koncentracích nad 20 μΜ. Látka MitoTAX rovněž inhibuje komplex I přednostně před komplexem II, ale při značně nižších koncentracích kolem 1 až 2 pM. Pro tato měření byly MCF7 buňky umístěny v komůrce přístroje Oxygraf a stanovena respirace při zvyšujících se dávkách látek TAX (vlevo) a MitoTAX ··· ··· ··· • ····· · · · · ···· • · · · · · · ···· ·· ·· ··· · · ♦ · (právo). Respirace (spotřeba kyslíku spřažena s tvorbou ATP) je vztažena na 10⁶ buněk a je vynesena jako relativní hodnota s počáteční hladinou respirace označenou relativní hodnotou 1.

Příklad 14

Vlastností některých mitokanů je jejich schopnost zvyšovat oxidativní stress (tvorbu radikálů kyslíku, ROS), selektivně v rakovinných buňkách, zejména spojený s působením na mitochondriální komplexy účastnící se oxidativní fosforylace. S tím je většinou spojen pokles mitochondriálního potenciálu (Neužil J et al. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion 2013;13:199-208. Kluckova Ket al. Mitochondrial complex II, a novel intriguing target for anti-cancer agents. Biochim Biophys Acta 2013;1827:552-564.). Tvorbu kyslíkových radikálů jsme testovali i u látky MitoTAX. Obr. 7 ukazuje tvorbu kyslíkových radikálů u sublinií MCF7 buněk lišících se hladinou HER2, a to po 1-hodinovém působení látek TAX či MitoTAX (obě v koncentraci 5 μΜ). Je vidět, že TAX je při stejné koncentraci výrazně méně účinná než MitoTAX. Dalším důležitým zjištěním je, že MitoTAX indukuje tvorbu více kyslíkových radikálů v buňkách s vysokou hladinou HER2, zatímco v buňkách s nízkou hladinou HER2 dochází k nižší produkci radikálů. Látka TAX tento trend nenásleduje. Ve všech případech rozpojovač mitochondriální respirace, látka CCCP, snižuje mitochondriální potenciál na bazální hodnotu. Obr. 8 ukazuje, že MitoTAX nikoliv však TAX snižuje mitochondriální potenciál a to již při koncentraci 5 μΜ a působení po dobu 1 h.

Příklad 15

V buňkách rakoviny prsu s vysokým obsahem proteinu HER2 je tento protein přednostně lokalizován v mitochondriích. To je ukázáno v Obr. 9, kde je ‘western bloť původní linie MCF7 i sublinií HER2⁺ MCF7 (klon 11), HER2’ MCF7 (klon 26) a sublinie rezistentní vůči látce TAX (klon TAM-R). Je vidět, že buňky klonu 11 mají zvýšenou expresi proteinu HER2 (označené šipkou) v mitochondriální, cytoplasmatické (obsahuje plasmatickou membránu) i nukleární frakci. Spodní obrázek je mitochondriální frakce, kdy membrána byla exponována delší dobu, aby bylo zřetené, že v mitochondriích, byť • · • ·· · · ··· ··* • · · · ♦ ··»· • · · · · · · · ······ • · · · ·« · •··· ·· ·9 ··· ··9· ve značně menší míře, je protein HER2 i u parentálních MCF7 buněk a buněk rezistentních k látce TAX, nikoliv u buněk se sníženou hladinou HER2 (klon 26). Tento překvapivý výsledek je ve shodě s nedávno publikovanou prací (Ding Y et al. Receptor tyrosine kinase ErbB2 translocates into mitochondria and regulates cellular metabolism. Nat Commun 2012;3:1271). Tato publikace také ukazuje, že buňky rakoviny prsu s vysokou expresí onkogenu a proteinu HER2 lokalizovaného z větší části v mitochondriích, jsou rezistentní k látce trastuzumab. Při aplikaci látky trastuzumab na rakovinovou buňku dochází k tomu, že se ještě vice onkogenu HER2 přesouvá do mitochondria (Ding Y et al. Receptor tyrosine kinase ErbB2 translocates into mitochondria and regulates cellular metabolism. Nat Commun 2012;3:1271.). Je pravděpodobné, že buňky rakoviny prsu přesouvají z povrchu (membrány) HER2 proto, aby tento onkogen nemohl být inhibován látkou trastuzumab. Jeden z dopadů inhibice HER2 je aktivace proteinu p27, což je inhibitor buněčného cyklu, který snižuje malignost buněk (Yang HY, Shao R, Hung MC, Lee MH. p27 Kip1 inhibits HER2/neu-mediated cell growth and tumorigenesis. Oncogene 2001;20:3695-3702.). To má na rakovinné buňky s vysokou expresí proteinu HER2 negativní dopad, neboť rakovinné buňky jsou ‘evolučně naprogramované’ na proliferační statut (Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000;100:57-70). Lze očekávat, že jelikož protein HER2 - cíl látky trastuzumab, není v membráně ve větším měřítku přítomen, získá buňka rezistenci vůči látce trastuzumab. Přitom ale zvýší svou citlivost vůči látce MitoTAX, který je schopen proniknout až do mitochondrií, což ukazuje na jeho výjimečnost.

Příklad 16

Jedním z důvodů zvýšené citlivosti buněk rakoviny prsu s vysokou expresí proteinu HER2 je jejich změněná mitochondriální bioenergetika a morfologie. Vysoké množství proteinu HER2 v mitochondriích mění jejich morfologii i funkci. Obr. 10 ukazuje, že mitochondrie v HER2⁺ buňkách (klon 11) jsou asi 2^krát kratší než v HER2' buňkách (klon 26). Délka mitochondria byla odhadnuta za pomoci konfokální mikroskopie buněčných linií transfekovaných mitochondriálně cíleným proteinem GFP (který v tomto případě působí zelenou fluorescenci mitochodnrií). Délka byla určena analýzou mitochondrií v 50-ti náhodně vybraných buňkách za použití software ‘Fuji Freehand

Lineš Measurement Tools’. To souvisí s jejich sníženou mitochondriální respirací a s tím souvisejícím nižším potenciálem a vyšší produkcí laktátu (znak přesunu k aerobně glykolytickému metabolismu) (Obr. 11). Zde je ukázáno, že buňky se zvýšenou hladinou n proteinu HER2 produkují asi 2{krát více laktátu než buňky parentální a buňky se sníženou hladinou proteinu HER2. V případě respirace je tomu naopak. Buňky se zvýšenou hladinou proteinu HER2 respirují méně (ATP produkce je spřažena s nižší spotřebou kyslíku). S vyšším podílem glykolýzy na tvorbě ATP u buněk se zvýšenou hladinou proteinu HER2 souvisí též jejich zvýšený příjem glukózy (Obr. 12).

Příklad 17

Dalším možným důvodem zvýšené citlivosti HER2⁺ buněk s vyšší hladinou proteinu HER2 vůči látce MitoTAX je její působení na estrogenní receptor ERa, který působí anti-apoptoticky (Thomas C, Gustaffson J. The different roles of ER subtypes in cancer biology and therapy. Nat Rev Cancer 2011;11:597-608. Deblois D, Giguere V. Oestrogen-related receptors in breast cancer: control of cellular metabolism and beyond. Nat Rev Cancer 2013;13:27-36.). To ukazuje Obr. 13, kde je vidět, že MitoTAX snižuje expresi ERa již při koncentraci 1 μΜ zhruba 3íkrát, zatímco látka TAX je neúčinná. Tyto výsledky byly získány pomocí metody ‘real-time PCR’.

Příklad 18

Velmi důležitá je výše uvedená vysoká účinnost látky MitoTAX vůči nádorům s vysokou expresí onkogenu HER2 v myší linii FVB/N c-neu. Tento nádor, který velmi dobře odpovídá lidskému nádoru s vysokou expresí proteinu HER2, byl analyzován z hlediska exprese proteinu HER2 a dalších genů. Obr. 14 ukazuje representativní FVB/N c-neu myš, kde je znázorněn nádor (horní obrázek vlevo) a také vlastní nádor (obrázek dole vlevo). Výsledky analýzy nádoru pomocí metody ‘western blottingdokládá, že nádor obsahuje vysokou hladinu proteinu HER2, který je téměř nedetekovatelný v normální tkáni mléčné žlázy. Dále jsou zde výsledky analýzy mitochondriální (Mito) a cytosolické (Cyto) frakce. Jako markéry pro mitochondriální frakci jsou použity protilátky vůči proteinům. Je zřejmé, že naprostá většina proteinu HER2 je lokalizována v • · · · · • · ♦ · · · · • · · · •··· ·· ·* mitochondriích. Tyto výsledky získané z experimentálníhonádoru odpovídají výsledkům z buněk rakoviny prsu s vysokou expresí HER2.

Příklad 19

Nedávno bylo ukázáno na nádorech ledvin, že tentýž nádor obsahuje oblasti, které se liší mutačním profilem (Gerlinger M et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366:883-892.). V případě karcinomů prsu byla také zjištěna nádorová heterogeneita (Stingl J, Caldas C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer 2007;7:791-799.). S tím koreluje velice zajímavě zjištění, že u spontánních nádorů mléčné žlázy v transgenní myši FVB/N c-neu jsou oblasti s rozdílnou expresí několika důležitých genů na úrovni mRNA, které zásadním způsobem ovlivňují léčbu rakoviny prsu. Jedná se o geny ERa, HER2 (Ki67, ‘markér’ proliferace, která je vyšší v případě vyšší hladiny HER2) a GATA3 (transkripční aktivátor, který se positivně účastní regulace exprese HER2). Toto je ukázáno v Obr. 15. V tomto pokusu byly dva nádory rozděleny na několik částí, které byly analyzovány pomocí metody ,real-time PCR‘ na expresi proteinu výše uvedených genů. Uvedený obrázek ukazuje, že exprese je v jednotlivých oblastech nádoru velmi odlišná, a to až ^krát. Obdobně se liší v jednotlivých částech nádorů všechny studované geny. Dalším důkazem odlišné exprese proteinu HER2 v jednotlivých částech nádoru v experimentální myší linii FVB/N c-neu je ukázána v následujících obrázcích, kde je vidět jednak morfologie nádoru na základě barvení hematoxylinem a eosinem (Obr. 16) a imunohistochemická analýza exprese proteinu HER2 (Obr. 17). Tyto jednoznačné rozdíly odpovídají rozdílné expresi v jednotlivých částech nádoru na úrovni mRNA a také publikovaným údajům o intranádorové heterogeneitě (Gerlinger M et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med 2012;366:883-892. Stingl J, Caldas C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer 2007;7:791-799.). Obr. 17 ukazuje, že mezi vnější částí nádoru (část 1a), střední částí (část 1b) a vnitřní částí (část 1c) jsou velmi výrazné rozdíly v expresi proteinu HER2. Toto znamená, že některé obasti nádoru budou rezistentní k léčbě látkou TAX (oblasti s vysokou expresí proteinu HER2), jiné vůči látce • · • · trastuzumab (oblasti s nízkou hladinou proteinu HER2). Navíc lze očekávat, že při působení látky trastuzumab dojde ke zvýšenému přesunu proteinu HER2 do mitochondrií, čímž obasti nádoru s vysokou expresí proteinu HER2 získají rezistenci vůči léčbě látkou trastuzumab. Naproti tomu, látka MitoTAX, která působí na mitochondrie a která zabíjí buňky s vysokou expresí proteinu HER2 účinněji než buňky s nízkou expresí tohoto proteinu si s oblastmi nádorů rezistentních vůči látce trastuzumab .poradí¹.

Příklad 20

Látka MitoTAX, která účinně zabíjí buňky rakovinný prsu, je účinná i proti jiným typům rakovinných buněk. To je ukázáno v Tabulce 2, kde jsou uvedeny IC50 hodnoty látek MitoTAX a TAX. Jsou zde linie různých typů rakoviny, a to včetně karcinomů, sarkomů a novotvarů oběhového systému (leukémie). Ve všech případech jsou hodnoty IC50.

Tabulka 2

Buněčná linie - typ nádoru	TAX	MitoTAX
1321 n1 - astrocytoma	17,97	1,54
SHSY5Y - neuroblastoma	11,16	1.76
U87 - glioblastoma	32,44	1,96
H28 - mesothelioma	39,74	2,53
LnCAP - nádor prostaty	36,70	0,86
H1299 - nemalobuněčný nádor plic	38,53	1,80
Hela - nádor děložního čípku	30,28	2,68
MG-63 - osteosarcoma	19,94	1,47
HCT116 - kolorektální nádor	28,91	1,81
HepG2 - hepatokarcinoma	17,56	1,05
MOLT-4 - leukémie	12,9	0,37

• · · ·

Příklad 24

Na Obr. 18 je znázorněn účinek alkyl a alkenyl trifenylfosfoniových derivátů MitoTAXu, jak je ukázáno v Tabulce 3, na apoptózu buněk rakoviny prsu MCF7 (A) a sublinie buněk MCF7 se zvýšenou hladinou proteinu HER2 (B). Procento apoptotických buněk bylo stanoveno na základě barvení indikátoru apoptózy annexinu V metodou průtokové cytometrie. Buňky MCF7 a MCF7 HER2⁺ byly vystaveny jednotlivým derivátům MitoTAXu v koncentraci 2μΜ po dobu 24 hodin. Sloupec „CTRL“ označuje procento apoptotických buněk v populaci buněk bez přidání testovaných látek a odpovídá tak bazální hladině apoptózy v testovaných liniích. Všechny testované deriváty MitoTAXu vyvolávají apoptózu.

• ·

Závěrem lze říci, že jsme připravili zcela nové látky, které vycházejí z látky TAX, což je běžně používané terapeutikum k léčbě rakoviny prsu, onemocnění, které je na vzestupu (DeSantis C et al. Breast cancer statistics, 2011. CA Cancer J Clin 2011;1:409-4018.). Výše popsané alkyl a alkenyl trifenylfosfoniové deriváty tamoxifenu (MitoTAX) dle vynálezu se přednostně akumulují v mitochondriích, kde je jejich zásahové místo komplex I. Interakcí MitoTaxu s komplexem I dojde k přerušení toku elektronů, které reagují s molekulárním kyslíkem. Tím dojde ke vzniku kyslíkových radikálů, které pak vyvolají buněčnou smrt. MitoTAX je účinný vůči nádorům prsu s nízkou i vysokou hladinou proteinu HER2, který velmi komplikuje dosavadní způsoby léčby. MitoTAX může doplnit či nahradit v léčbě nádorů jak látku TAX tak i látku trastuzumab.

• · ·

♦

Využiti vynálezu

Nové deriváty tamoxifenu, obecného vzorce I a IA podle vynálezu jsou využitelné k léčbě rakoviny ve zdravotnictví a ve farmaceutickém průmyslu k přípravě léků pro léčbu rakoviny.

Claims (14)

1. Patentové nároky

   1. Mitochondriálně cílené E a/nebo Z izomery přes alifatický řetězec vázaných trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu, kde alifatický řetězec je alkyl nebo alkenyl, a jejich odpovídající sole tercialního aminu, vybrané ze skupiny organických solí jako je citrát, acetát, laktát, tartarát, oxalát, askorbát, mesylát, tosylát nebo anorganických solí jako například sulfát, halogenid, fosfát a/nebo jejich směs (MitoTAX), kde n = 8 až 12, a kde Z je vybrané ze skupiny organických solí jako je citrát, acetát, laktát, tartarát, oxalát, askorbát, mesylát, tosylát nebo anorganických solí jako například sulfát, halogenid nebo fosfát a překřížená vazba v obecném vzorci I, nacházející se v subjednotce tamoxifenu zahrnuje uspořádání dvojné vazby v kofiguraci E a/nebo Z a obecného vzorce IA, kde n = 6 až 10, a kde Z má vpředu uvedený význam a překřížená vazba v obecném vzorci IA, nacházející se v alkenylovém řetězci zahrnuje uspořádání dvojné vazby v konfiguraci E a/nebo Z.

   • ·
2. 2. Způsob přípravy alkyl trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu obecného vzorce I podle nároku 1 vyznačující se tím, že ylid generovaný z tert-butyldimethylsilyl-oxy-alkyltrifenylfosfonia obecného vzorce II, kde n = 5 až 9 a X je I, Br, Cl nebo mesyl, v tetrahydrofuranu v atmosféře argonu při teplotě -78^C působením organické báze kondenzuje s aldehydem vzorce lll_z \

   za vzniku silylovaného derivátu obecného vzorce IV_X kde n = 5 až 9, na silylovaný derivát obecného vzorce IV se působí tetrabutylamonium fluoridem za vzniku alkenolu obecného vzorce V_x kde n = 5 až 9,

   M, který se v atmosféře vodíku v přítomnosti katalyzátoru redukuje na alkohol obecného kde n = 5 až 9, alkohol obecného vzorce VI se substitucí převede na příslušný derivát obecného VIl_x kde n = 5 až 9 a X je I, Br, Cl nebo mesyl, který se zahříváním s trifenyl fosfinem převede na mitochondriálně cílený alkyl trifenylfosfoniový derivát tamoxifenu obecného vzorce I.

   • · • · • · · ·
3. 3. Způsob přípravy alkyl trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu obecného vzorce I podle nároku 1 vyznačující se tím, že se na aldehyd vzorce III působí (9-hydroxyalkyl)trifenylfosfonium bromidem a bází při pokojové teplotě ve směsi tetrahydrofuranu a dimethylsulfoxidu, za vzniku alkenolu obecného vzorce V, z něhož se dále postupem popsaným v nároku 2 získá alkyl trifenylfosfoniový derivát tamoxifenu obecného vzorce I.
4. 4. Způsob přípravy alkenyl trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu obecného vzorce IA podle nároku 1 vyznačující se tím, že ylid generovaný z alkyl bis(trifenylfosfonia) o obecnem vzorci XII kde n = 7 až 11 a X je I, Br, Cl nebo mesyl nebo jejich kombinace, ve směsi tetrahydrofuranu a dimethylsulfoxidu v atmosféře argonu při pokojové teplotě působením organické báze se následně kondenzuje s aldehydem vzorce III za vzniku alkenyl trifenylfosfoniových derivátů tamoxifenu obecného vzorce IA.
5. 5. Použití mitochondriálně cíleného E a/nebo Z izomeru allifatického trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu nebo jejich směsi obecného vzorce I a/nebo IA k léčbě neoplastických chorob.
6. 6. Použiti podle nároku 5 k přípravě léčiva pro léčbu karcinomů, sarkomů, lymfomů a leukémií.
7. 7. Použití podle nároku 5 k přípravě léčiva pro léčbu nádorových onemocnění vybraných ze skupiny: astrocytom, neuroblastom, glioblastom, mesotheliom, nádor prostaty, nemalobuněčný nádor plic, nádor děložního čípku, osteosarkoma, kolorektální nádor, hepatokarcinoma, leukémie.
8. 8. Použití mitochondriálně cíleného E/Z izomeru alifatického trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu nebo jejich směsi obecného vzorce I a/nebo IA k přípravě léčiva pro • · • · · · zabíjení rakovinných buňek v různých oblastech nádoru prsu bez ohledu na rozdílnou hladinu proteinů jako jsou HER2, ERa, GATA3 či KÍ67.
9. 9. Použití mitochondriálně cíleného E a/nebo Z izomeru alifatického trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu nebo jejich směsi obecného vzorce I a/nebo IA k přípravě léčiva pro potlačení exprese estrogenního receptoru ERa.
10. 10. Použití mitochondriálně cíleného E a/nebo Z izomeru alifatického trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu nebo jejich směsi obecného vzorce I a/nebo IA k přípravě léčiva pro inhibici respirace přes mitochondriální komplex I.
11. 11. Léčivo pro léčení neoplastických chorob vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jeden E/Z izomer alifatického trifenylfosfoniového derivátu tamoxifenu obecného vzorce I a/nebo I A, podle nároku 1.
12. 12. Léčivo podle nároku 11 vyznačující se tím, že neoplastickou chorobou je rakovina prsu s vysokou hladinou proteinu HER2 v nádorových buňkách.
13. 13. Léčivo podle nároku 11 vyznačující se tím, že neoplastickou chorobou je rakovina prsu s nízkou hladinou proteinu HER2 v nádorových buňkách.
14. 14. Léčivo podle nároku 11 vyznačující se tím, že neoplastickou chorobou je rakovina s nízkou i vysokou hladinou proteinu HER2 v nádorových buňkách jiných než jsou nádory prsu.