JP6364479B2 - Ｒ型レスベラトロール二量体の調製方法 - Google Patents
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Description
本発明は天然薬物化学の分野に関し、具体的にレスベラトロール二量体（7R，8R）-trans-δ-viniferin、その調製方法及びその血糖降下用途に関する。
キラル化合物、特にキラル薬物の鏡像異性体の分離は、薬物研究と製薬産業の発展で重要な意義を持つ。キラル中心を含む薬物は、薬理と毒性作用には差異があり、常に立体異性体は薬効を有するが、その鏡像分子は薬効が非常に小さく、ひいては、薬効を全く持たないかあるいは副作用を有する。キラル分離技術において、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は極めて重要な役割を発揮するが、価格が高く、HPLC法を採用して調製的分離を行う際の溶媒の消耗量もかなり大きい。
高速向流クロマトグラフィーは、2つの相が互いに混じり合わない溶媒の間でサンプルの分配係数が異なることに基づいて分離と調製を実現する新技術である。向流クロマトグラフィーをキラル化合物の分離に応用すると、化学的手段を採用してキラル試薬を固体媒体に結合する必要がなくなり、適当なキラル試薬を液体固定相又は移動相に添加すればよい。一本の向流クロマトグラフィー用分離カラムを繰り返して複数回の異なるキラル化合物の分離に用いることができ、適当な二相溶媒系とキラル試薬を選択すれば良い。同時に、固定相又は移動相に添加されたキラル試薬の量を調整すれば、一本の向流クロマトグラフィー用カラムはキラル分析に用いることができ、更にキラル化合物の調製的分離に用いることもできる。
化合物trans-δ-viniferin（TVNと略称する）はレスベラトロール二量体である。
現在、当該化合物の活性に対する報告は強い酸化防止作用のみに限定され、本発明者らが先に出願した特許出願（特許文献１）において、インビトロ活性テストにより、本発明者らは、TVNラセミ体のα-グリコシダーゼに対する阻害能力がアカルボースの254倍であることを見出した。
本発明は、TVNの光学異性体、即ち、構造式Iの（7R，8R）-trans-δ-viniferinを開示する。これは（R，R）-TVNと略称され、構造式は以下の通りである。
本発明は構造式Iの（7R，8R）-trans-δ-viniferinのキラル調製方法及びその医薬用途を更に開示する。
ラセミ体であるTVNに対する高速向流クロマトグラフィー（HSCCC）によるキラル分離により、（7R，8R）-trans-δ-viniferin（I，（R，R）-TVN）及び（7S，8S）-trans-δ-viniferin（（S，S）-TVN）という2種類の光学的に純粋な化合物を得る。
ニガウリペルオキシダーゼを利用してレスベラトロールを生物変換し、変換生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより処理し、クロロホルム：メタノールを溶離液として用いて洗浄し、更にHPLCによる調製により、TVNラセミ体を取得する。TVNラセミ体を高速向流クロマトグラフィーにより処理することにより、（R，R）-TVNと（S，S）-TVNという2種類の光学的に純粋な化合物を取得することができる。高速向流クロマトグラフィーの操作ステップは、n-ヘキサン：酢酸エチル：水＝4.8〜5.2：4.8〜5.2：9.8〜10.2の体積比で二相溶媒を配合し、上相が固定相であり、下相に22〜28mmol/Lのヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを移動相として添加し、ヘッドエンドから高速向流クロマトグラフへ固定相を圧送し、管路に固定相が完全に充填されると、カラムユニットを回転させるとともに、移動相を圧送し、管路の出口から明らかに移動相が流出すると、TVNラセミ体を少量の上相に溶解してサンプルセルに注入し、同時にデータを収集し始め、ピークに従って目標成分を受け取ることを含む。
薬力学試験の結果から明らかなように、（R，R）-TVNによれば、ショ糖によるマウスの高血糖を顕著に低下させることができ、その効果はTVNラセミ体よりも強い。しかし、その鏡像異性体である（S，S）-TVNは、ショ糖によるマウスの高血糖を顕著に低下させることができない。
以下は一部の薬力学試験及び結果である。
マウスの平均体重は22〜25gである。ランダムに6組に分け、各組の動物数は10である。各組の動物を12時間断食させた後、薬物を胃内投与する。
正常対照組：陽性対照と等体積の0.5%CMC-Na溶液を投与する。
陰性対照組：陽性対照と等体積の0.5%CMC-Na溶液を投与する。
アカルボース組：0.5%CMC-Na溶液で配合された0.33mg/mLのアカルボース懸濁液を0.3mL/体重10g投与する。
TVNラセミ体組：0.5%CMC-Na溶液で配合された0.33mg/mlのTVNラセミ体懸濁液を0.3ml/体重10g投与する。
（S，S）-TVN組：0.5%CMC-Na溶液で配合された0.33mg/mlの（S，S）-TVN懸濁液を0.3ml/体重10g投与する。
（R，R）-TVN組：0.5%CMC-Na溶液で配合された0.33mg/mlの（R，R）-TVN懸濁液を0.3ml/体重10g投与する。
30分後、正常組以外の各組の動物に6.7%ショ糖溶液を0.3ml/体重10g胃内投与し、正常組の動物に等体積の水を胃内投与する。それぞれ、動物にショ糖溶液を胃内投与してから0、0.5、1及び2時間後という4つの時点で眼窩の周囲から血液を採集し、遠心分離して、2μLの血清を取り、96ウェルプレートに入れ、更に200μLのグルコースキット試薬を添加し、505nmマイクロプレートリーダーで吸光度を測定し、検量線により血糖濃度を取得する。以下の表に示す。
ショ糖負荷試験曲線をプロットして、曲線下面積を計算し、図1に示す。
正常のマウスの経口ショ糖負荷試験における血糖濃度の変化テーブルにおいて、SPSS11.5ソフトウェアによる計算により、アカルボース組、TVNラセミ体組の0.5時間後の血糖低下率は、陰性対照組と比べてそれぞれ18.97%と13.98%であり、且つP＜0.05であり、即ち有意な差異がある。それらの1時間後の血糖低下率は陰性対照組と比べてそれぞれ21.66%と14.60%であり、即ち有意な差異がある。（R，R）-TVN組は、0.5時間後、1時間後の血糖低下率が陰性対照組と比べてそれぞれ30.20%と22.79%であり、且つP＜0.01であり、即ち極めて有意な差異がある。（S，S）-TVN組は、0.5時間後、1時間後の血糖低下率が陰性対照組と比べてそれぞれ0.08%と3.01%であり、陰性対照組とはほぼ差異がない。
図1において、ショ糖負荷試験曲線下面積を計算することにより、試験全体での耐糖能を研究し、陰性対照組と比べて、TVNラセミ体組、（R，R）-TVN組及び陰性対照組の耐糖能曲線下面積はそれぞれ18.3、16.7及び21.0mmol h/Lであり、且つP＜0.01であり、即ち極めて有意な差異がある。（S，S）-TVN組の耐糖能曲線下面積は20.9mmol h/Lであり、陰性対照組とはほぼ差異がない。
結論：（R，R）-TVNにより、ショ糖によるマウスの高血糖を顕著に低減することができ、しかし、その鏡像異性体である（S，S）-TVNにより、ショ糖によるマウスの高血糖を顕著に低減することができない。且つ、それらの混合物であるTVNラセミ体の血糖降下活性は両者の間にある。
実施例1
高速向流クロマトグラフィーによるTVNラセミ体の分離：
サンプル溶液の調製：20mgのTVNラセミ体を10mLの上相である有機相に溶解する。
高速向流クロマトグラフィーによるTVNラセミ体の分離：
サンプル溶液の調製：20mgのTVNラセミ体を10mLの上相である有機相に溶解する。
1200mLの二相溶媒系：n-ヘキサン：酢酸エチル：25mmol/Lのヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン水溶液（5：5：10、体積比）を2000mLの分液漏斗に置いて一晩十分に平衡させた後、分液し、超音波処理を30分間施す。上相溶媒を固定相として、30mL/minの流速で高速向流クロマトグラフィーの管路システム全体に完全に充填する。カラムユニットを回転させてその回転速度を800回転/分に保持する。カラムオーブンを開けてその温度を5℃に保持する。下相溶媒を移動相とし、1mL/minの流速で高速向流管路に下相を注入し、管路の出口から明らかに下相が流出すると、サンプル溶液をサンプルセルに注入する。流分を313nmの紫外検出で収集し、向流図を図2に示し、1が（S，S）-TVNであり、2が（R，R）-TVNである。収集したサンプルに少量の塩酸を添加して酸性化させ、酢酸エチルで3回抽出し、そして、真空濃縮により粗生成物を取得し、更に、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより処理し、ジクロロメタン：メタノール（15：1、体積比）で洗浄して少量のヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンを除去し、高純度のサンプル：8.2mgの（S，S）-TVN及び9.4mgの（R，R）-TVNを取得する。回収率は80%を超える。
（R，R）-TVNと（S，S）-TVNは以下の方法で検証できる。
図3に示すように、HPLCによりTVNラセミ体及びHSCCCにおける2つの流分を検証する。図3において、（a）がTVNラセミ体であり、（b）HSCCCに含まれる（S，S）-TVNの流分であり、（c）HSCCCに含まれる（R，R）-TVNの流分であり、HPLC条件：Agilent 1200 HPLCでAgilent HPLCワークステーションを配置し、クロマトグラフィーカラムはAgilent Zorbax SB-C18カラム（4.6mmx250mm、5μm）であり、温度が30℃であり、移動相が25mmolL-1のHP-β-CD水溶液：アセトニトリル（75：25，v/v）であり、流速が1.0mLmin-1であり、検出波長が320nmである。
図3において、（R，R）-TVN（t＝21.493min）の保留時間は（S，S）-TVN（t＝19.247min）の保留時間よりも長く、同時に、2つの化合物の純度はいずれも98%を超えて、それらの鏡像体過剰率（ee）が100%に達する。
図4は2つの化合物の円偏光二色性スペクトル図（CD）であり、両者は、濃度が同じである場合には、CD曲線がほぼ完全に対称となる。点線はHSCCCに含まれる（S，S）-TVN流分のCD図であり、実線はHSCCCに含まれる（R，R）-TVN流分のCD図であり、濃度はいずれも0.2mg/mlである。
Claims (1)
- 下記構造式（Ｉ）：
ｎ−ヘキサン：酢酸エチル：水を４．８〜５．２：４．８〜５．２：９．８〜１０．２の体積比で二相溶媒に配合し、
上相が固定相であり、下相に２２〜２８ｍｍｏｌ／Ｌのヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを移動相として添加し、
ヘッドエンドから高速向流クロマトグラフへ固定相を圧送し、
管路に固定相が完全に充填されると、カラムユニットを回転させるとともに、移動相を圧送し、
管路の出口から明らかに移動相が流出すると、下記構造式：
ピークに従って目標成分を受け取り、上記構造式（Ｉ）で表される化合物を取得することを含む、調製方法。
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