CN107674020B - 一种逆流色谱拆分反式帕罗醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用逆流色谱技术拆分反式帕罗醇的方法，本发明以反式帕罗醇为拆分对象，以羟丙基‑β‑环糊精作为手性试剂，将其添加到水相中，采用液‑液分配手性萃取拆分的方法筛选溶剂体系，并用逆流色谱法得到(+)‑帕罗醇和(‑)‑帕罗醇；本发明首次采用逆流色谱拆分含哌啶环的醇类化合物反式帕罗醇消旋体，本方法可以基本达到分离目的，可以分离得到(‑)‑帕罗醇和(+)‑帕罗醇的单体，其纯度均大于98％。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种外消旋体的拆分方法，具体涉及一种通过逆流色谱从反式帕罗醇中拆分出(+)-帕罗醇和(-)-帕罗醇的方法。
(二)背景技术
帕罗醇是一类含有哌啶环的醇类药物中间体，反式左旋帕罗醇是帕罗西汀合成的关键手性起始原料，盐酸帕罗西汀是5-羟色胺再摄取阻滞剂类抗抑郁药物，主要用于治疗抑郁症和伴有焦虑症的抑郁症患者。目前关于此类化合物的手性拆分方法研究较少。帕罗醇有2个手性中心，共有4个光学异构体，反式帕罗醇则具有2个光学异构体。根据开发立体异构新药的技术要求及确保药物的安全、有效，需要对手性起始原料的所有光学异构体进行检测。因此，对反式帕罗醇手性拆分建立一种快速、有效的方法是一个具有理论及实际意义的课题。目前，反式帕罗醇的拆分方法主要有化学拆分法、高效液相色谱法等。
逆流色谱(countercurrent chromatography，CCC)是一种连续的不需要固体载体的现代色谱分离技术，相比高效液相色谱而言，可避免固相吸附带来的污染和样品损失，且进样量大，运行成本低，是手性分离的一种理想的制备色谱技术。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种采用逆流色谱技术拆分反式帕罗醇的方法。本发明以反式帕罗醇为拆分对象，以羟丙基-β-环糊精作为手性试剂，将其添加到水相中，采用液-液分配手性萃取拆分的方法筛选溶剂体系，并用逆流色谱法得到(+)-帕罗醇和(-)-帕罗醇。
本发明的技术方案如下：
一种反式帕罗醇的手性拆分方法，所述方法按如下步骤进行：
(1)将有机溶剂与含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照体积比1：0.5～10(优选1：1)组成溶剂体系，混合均匀，静置分层，分液得到有机相和水相；
所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸异丁酯或乙酸丁酯，优选乙酸丁酯；
所述含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的pH值为9.1～9.3，优选pH值为9.2；
所述含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中羟丙基-β-环糊精的浓度为0.09～0.15mol/L，优选0.1mol/L；
(2)将反式帕罗醇用步骤(1)得到的水相溶解，制成样品；
所述样品中反式帕罗醇的浓度为1.0～4.0mg/mL，优选2.0mg/mL；
(3)采用逆流色谱法拆分反式帕罗醇：以步骤(1)得到的有机相为固定相，水相为流动相，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为5～10℃，开启速度控制器，转速为800～1000rpm(优选800rpm)，以1.5～2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后，即当流动相从色谱柱出口处流出时，将步骤(2)制得的样品由进样阀进样，紫外检测器在波长254nm下检测流出液，按照时间梯度，用自动部份收集器分别收集100min到260min之间梯度时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液，从而实现(-)-帕罗醇单体和(+)-帕罗醇单体的分离；
所述前峰是指对映体双峰中按时间顺序先出来的主峰，所述后峰是指对映体双峰中按时间顺序后出来的主峰；
推荐所述梯度时间间隔为每2～3min收集一次，优选每3min时间间隔收集一次洗脱液。
所述(-)-帕罗醇单体、(+)-帕罗醇单体可按如下方法分别从前峰洗脱液、后峰洗脱液中回收：将前峰洗脱液和后峰洗脱液分别用氨水调节pH值至10～11，再用氯仿萃取2～3次，合并氯仿层，用水洗涤至中性，再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸除溶剂，残余物质用二氯甲烷溶解后，进一步经硅胶柱层析纯化，即分别获得(-)-帕罗醇单体和(+)-帕罗醇单体。
本发明所述方法采用半制备型逆流色谱仪(半制备型分离柱柱体积为200mL)，逆流色谱仪由恒流泵、主机(分离柱)、紫外检测器、记录仪等组成。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明首次采用逆流色谱拆分含哌啶环的醇类化合物反式帕罗醇消旋体，本方法可以基本达到分离目的，可以分离得到(-)-帕罗醇和(+)-帕罗醇的单体，其纯度均大于98％。
(四)附图说明
图1：实施例1实验条件下的半制备型高速逆流色谱图；
图2：实施例2实验条件下的半制备型高速逆流色谱图；
图3：实施例3实验条件下的半制备型高速逆流色谱图；
图4：实施例4实验条件下的半制备型高速逆流色谱图；
图5：实施例5实验条件下的半制备型高速逆流色谱图；
图6：图3中A部分(100min～140min)洗脱液的高效液相色谱检测谱图，即(-)-帕罗醇；
图7：图3中B部分(141min～190min)洗脱液的高效液相色谱检测谱图，即(+)-帕罗醇。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1
(1)将乙酸乙酯和含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照1:1的体积比配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。平衡后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
其中，含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液由100mL 0.1mol/L碳酸钠水溶液、900mL 0.1mol/L碳酸氢钠水溶液、142g羟丙基-β-环糊精混合配制，pH＝9.2，羟丙基-β-环糊精浓度为0.10mol/L。
(2)称取20mg反式帕罗醇用10mL水相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
(3)采用半制备型逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-200V)拆分反式帕罗醇：分离柱体积为200mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为5℃，开启速度控制器，转速为800rpm，以2mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集100min到260min之间每3min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图(见图1所示)对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即140～195min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即196～240min内收集的洗脱液合并即得含目标组(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液。将含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液和含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于98％。高效液相色谱法检测条件为：InertSustain C18(5μm,250mm×4.6mm)色谱柱；柱温：20℃；流动相：0.1％磷酸水-甲醇(70:30，v/v，含有0.75g/L羧甲基-β-环糊精，三乙胺调节pH7.2)等度洗脱；流速0.6mL/min；检测波长210nm；进样量：20μL。
实施例2
(1)将乙酸异丁酯和含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照1:1的体积比配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。平衡后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
其中，含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液由100mL 0.1mol/L碳酸钠水溶液、900mL 0.1mol/L碳酸氢钠水溶液、142g羟丙基-β-环糊精混合配制，pH＝9.2，羟丙基-β-环糊精浓度为0.10mol/L。
(2)称取20mg反式帕罗醇用10mL水相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
(3)采用半制备型逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-200V)拆分反式帕罗醇：分离柱体积为200mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为5℃，开启速度控制器，转速为800rpm，以2mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集100min到260min之间每3min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图(见图2所示)对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即100～165min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即166～240min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液。将含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液和含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于98％。高效液相色谱法检测条件同实施例1。
实施例3
(1)将乙酸丁酯和含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照1:1的体积比配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。平衡后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
其中，含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液由100mL 0.1mol/L碳酸钠水溶液、900mL 0.1mol/L碳酸氢钠水溶液、142g羟丙基-β-环糊精混合配制，pH＝9.2，羟丙基-β-环糊精浓度为0.10mol/L。
(2)称取20mg反式帕罗醇用10mL水相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
(3)采用半制备型逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-200V)拆分反式帕罗醇：分离柱体积为200mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为5℃，开启速度控制器，转速为800rpm，以2mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集100min到260min之间每3min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图(见图3所示)对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即100～140min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即141～190min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液。将含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液和含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于98％。高效液相色谱法检测条件同实施例1。
实施例4
(1)将乙酸丁酯和含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照1:1的体积比配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。平衡后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
其中，含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液由100mL 0.1mol/L碳酸钠水溶液、900mL 0.1mol/L碳酸氢钠水溶液、142g羟丙基-β-环糊精混合配制，pH＝9.2，羟丙基-β-环糊精浓度为0.10mol/L。
(2)称取20mg反式帕罗醇用10mL水相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
(3)采用半制备型逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-200V)拆分反式帕罗醇：分离柱体积为200mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为5℃，开启速度控制器，转速为800rpm，以1.5mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集100min到260min之间每3min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图(见图4所示)对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即110～195min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即196～260min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液。将含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液和含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于98％。高效液相色谱法检测条件同实施例1。
实施例5
(1)将乙酸丁酯和含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照1:1的体积比配制于分液漏斗中，摇匀后静置分层。平衡后，将上下相分开，有机相作为固定相，水相作为流动相。
其中，含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液由100mL 0.1mol/L碳酸钠水溶液、900mL 0.1mol/L碳酸氢钠水溶液、142g羟丙基-β-环糊精混合配制，pH＝9.2，羟丙基-β-环糊精浓度为0.10mol/L。
(2)称取20mg反式帕罗醇用10mL水相溶解，溶解后制成样品溶液，待用。
(3)采用半制备型逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司，仪器型号TBE-200V)拆分反式帕罗醇：分离柱体积为200mL，进样前，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为10℃，开启速度控制器，转速为800rpm，以2mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后(即当流动相从色谱柱出口处流出时)，由进样阀开始进样。然后以波长254nm的紫外检测器(上海金达生化仪器有限公司，仪器型号UVD-200UV)检测流出液，并按照时间梯度，用自动部份收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司，仪器型号SBS-100)分别收集100min到260min之间每3min时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图(见图5所示)对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段，即100～140min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段，即141～180min内收集的洗脱液合并即得含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液。将含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液和含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液进行高效液相检测，两个单体洗脱液的纯度均大于98％。高效液相色谱法检测条件同实施例1。
对比例
卢铁刚，杨茂俊[羧甲基-β-环糊精手性流动相添加剂法拆分帕罗西汀及其中间体对映体.色谱,2007,25(6):830-833.]建立了帕罗醇的高效液相色谱手性拆分分析方法。选用C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为0.1％磷酸-甲醇(体积比为65∶35,含0.38g/L羧甲基-β-环糊精，以三乙胺调pH 7.2)，柱温25℃，检测波长210nm，帕罗醇达到基线分离，进样浓度为0.05mg/mL，进样量20μL。
本发明与现有方法相比，不需要色谱柱耗材，两相体系溶剂价格低，操作简单，且进样量大大增加，能实现制备型分离高纯度的帕罗醇。
Claims (8)
1.一种反式帕罗醇的手性拆分方法，其特征在于，所述方法按如下步骤进行：
(1)将有机溶剂与含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照体积比1：0.5～10组成溶剂体系，混合均匀，静置分层，分液得到有机相和水相；
所述有机溶剂为乙酸异丁酯或乙酸丁酯；
所述含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的pH值为9.1～9.3；
所述含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中羟丙基-β-环糊精的浓度为0.09～0.15mol/L；
(2)将反式帕罗醇用步骤(1)得到的水相溶解，制成样品；
所述样品中反式帕罗醇的浓度为1.0～4.0mg/mL；
(3)采用逆流色谱法拆分反式帕罗醇：以步骤(1)得到的有机相为固定相，水相为流动相，将逆流色谱分离柱填满固定相，柱温为5～10℃，开启速度控制器，转速为800～1000rpm，以1.5～2.0mL/min的流速将流动相泵入柱内，待两相溶剂体系达到流体动力学平衡后，即当流动相从色谱柱出口处流出时，将步骤(2)制得的样品由进样阀进样，紫外检测器在波长254nm下检测流出液，按照时间梯度，用自动部份收集器分别收集100min到260min之间梯度时间间隔的洗脱液，并根据紫外检测谱图中对映体双峰出现的时间段，将前峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分(-)-帕罗醇单体的前峰洗脱液，将后峰对应时间段内收集的洗脱液合并即得含目标组分(+)-帕罗醇单体的后峰洗脱液，从而实现(-)-帕罗醇单体和(+)-帕罗醇单体的分离；
所述前峰是指对映体双峰中按时间顺序先出来的主峰，所述后峰是指对映体双峰中按时间顺序后出来的主峰。
2.如权利要求1所述的反式帕罗醇的手性拆分方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂与含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液按照体积比1：1组成溶剂体系。
3.如权利要求1所述的反式帕罗醇的手性拆分方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为乙酸丁酯。
4.如权利要求1所述的反式帕罗醇的手性拆分方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液的pH值为9.2。
5.如权利要求1所述的反式帕罗醇的手性拆分方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含有羟丙基-β-环糊精的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中羟丙基-β-环糊精的浓度为0.1mol/L。
6.如权利要求1所述的反式帕罗醇的手性拆分方法，其特征在于，步骤(2)中，所述样品中反式帕罗醇的浓度为2.0mg/mL。
7.如权利要求1所述的反式帕罗醇的手性拆分方法，其特征在于，步骤(3)中，所述自动部份收集器按每2～3min梯度时间间隔收集一次洗脱液。
8.如权利要求1所述的反式帕罗醇的手性拆分方法，其特征在于，步骤(3)中，所述(-)-帕罗醇单体、(+)-帕罗醇单体按如下方法分别从前峰洗脱液、后峰洗脱液中回收：将前峰洗脱液和后峰洗脱液分别用氨水调节pH值至10～11，再用氯仿萃取2～3次，合并氯仿层，用水洗涤至中性，再经无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸除溶剂，残余物质用二氯甲烷溶解后，经硅胶柱层析纯化，即分别获得(-)-帕罗醇单体和(+)-帕罗醇单体。
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