JP6361003B2 - 癌治療のための抗adam28抗体 - Google Patents
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Description
[1]ヒトADAM28に特異的に結合し、且つヒトADAM28の酵素活性を阻害する活性を有する、抗体。
[2]配列番号21、22又は23で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて、ヒトADAM28に結合する、[1]に記載の抗体。
[3]軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
(1)該軽鎖可変領域が、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む;
(2)該軽鎖可変領域が、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む
(但し、配列番号5、6及び7で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号8、9及び10で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している);
(3)該軽鎖可変領域が、配列番号11で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号12で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号13で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号14で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号15で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む;
(4)該軽鎖可変領域が、配列番号11で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号12で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号13で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号14で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号15で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む
(但し、配列番号11、12及び13で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号14、15及び16で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している);
(5)該軽鎖可変領域が、配列番号24で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号25で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号26で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号27で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号28で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号29で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む;又は
(6)該軽鎖可変領域が、配列番号24で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号25で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号26で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号27で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号28で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号29で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む
(但し、配列番号24、25及び26で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号27、28及び29で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している);
ことを特徴とする[1]に記載の抗体。
[4](1’)該軽鎖可変領域が配列番号17で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む;
(3’)該軽鎖可変領域が配列番号19で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号20で表されるアミノ酸配列を含む、又は
(5’)該軽鎖可変領域が配列番号30で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号31で表されるアミノ酸配列を含む、[3]に記載の抗体。
[5][1]〜[4]のいずれかに記載の抗体を含む医薬組成物。
[6][1]〜[4]のいずれかに記載の抗体を含む、癌の予防又は治療剤。
[7][1]〜[4]のいずれかに記載の抗体を含む、癌転移阻害剤。
[8]哺乳動物へ有効量の[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、該哺乳動物における癌の予防又は治療方法。
[9]哺乳動物がヒトである、[8]記載の方法。
[10]哺乳動物へ有効量の[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、該哺乳動物における癌転移阻害方法。
[11]哺乳動物がヒトである、[10]記載の方法。
[12]癌の予防又は治療において使用するための、[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体。
[13]癌転移阻害において使用するための、[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体。
[14]癌の予防又は治療剤の製造のための、[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体の使用。
[15]癌転移阻害剤の製造のための、[1]〜[4]のいずれかに記載の抗体の使用。
[16][1]〜[4]のいずれかに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
[17][16]に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[18][17]に記載のベクターを含む形質転換体。
(1)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体;
(2)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号5で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号6で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号7で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号8で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号9で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号10で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体
(但し、配列番号5、6及び7で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号8、9及び10で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している)。
(3)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号11で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号12で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号13で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号14で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号15で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体;
(4)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号11で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号12で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号13で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号14で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号15で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体
(但し、配列番号11、12及び13で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号14、15及び16で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している);
(5)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号24で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号25で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号26で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号27で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号28で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号29で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体;及び
(6)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号24で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号25で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号26で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号27で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号28で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号29で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む、抗体
(但し、配列番号24、25及び26で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加しており、且つ/或いは、
配列番号27、28及び29で表されるアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列において、1〜3個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加している)。
(3)及び(4)の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のVk2(Kabat database)のFRが、重鎖については、好ましくはヒト抗体のVH6(Kabat database)のFRが用いられる。
(5)及び(6)の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のVk2(Kabat database)のFRが、重鎖については、好ましくはヒト抗体のVH3(Kabat database)のFRが用いられる。
(5)及び(6)の抗体においては、軽鎖については、好ましくはヒト抗体のCκの定常領域が、重鎖については、好ましくはヒト抗体のCγ1の定常領域が用いられる。
(1’)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号17で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号18で表されるアミノ酸配列を含む、抗体;
(3’)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号19で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号20で表されるアミノ酸配列を含む、抗体;及び
(5’)軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、該軽鎖可変領域が配列番号30で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号31で表されるアミノ酸配列を含む、抗体。
抗原および抗体作製
(1)ヒトADAM28組み換えタンパク質(rhADAM28)の作製
完全長rhADAM28は、Biochem Biophys Res Commun. 2004; 315: 79-84に記載の方法にしたがって、作製および精製された。
精製したrhADAM28は、EZ−Link NHS−PEO4−Biotin(Thermo Scientific)の標準プロトコールに従ってビオチン化し、BCA Protein Assay Kit(PIERCE社製)を用いて濃度を決定した。
ビオチン化したrhADAM28は、ストレプトアビジンコート磁性体ビーズ(Dynabeads MyOne Streptavidin T1 磁性体ビーズ、Invitrogen社製)100μlに4℃、1時間固相化し、1mlのPBST(0.05% Tween 20含有PBS)で5回洗浄した。ヒト抗体ファージライブラリーにはHuCAL GOLD(MorphoSys社製)を用い、WO2007/042309及びWO2006/122797等に記載された方法に従って抗体選択を行った。ファージライブラリーにrhADAM28固相化ビーズを加えて抗原特異的抗体を結合させた。磁性体ビーズを回収し、数回洗浄を行った後、ファージを磁性体ビーズから溶出させた。溶出したファージは、大腸菌に感染させ、37℃で一晩培養した。尚、ファージ感染大腸菌からのファージレスキュー操作は一般的な方法に従った(Molecular cloning third. Ed. Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)。以上に記載した選択ラウンドを複数回繰り返して抗原特異的抗体を提示するファージの濃縮操作を行った。
濃縮操作後に得られたFab遺伝子のプールを大腸菌発現ベクターにサブクローニングした。WO2006/122797等に記載の手法に従って、Fab抗体を発現させ、ELISA法により抗原特異的抗体のスクリーニングを行った。Fab抗体は大腸菌破砕液の可溶性画分よりStrep−Tactinカラム(IBA社製)の標準法に従い精製を行った。また、SDS−PAGEによって精製抗体の純度を確認し、BCA Protein Assay Kit(PIERCE社製)を用いて濃度を決定した。
得られた2クローン(211−12、211−14)の大腸菌を培養し、プラスミドを回収(QIAprep Spin MiniPrep kit:QIAGEN社製)して塩基配列解析に使用した。表1に、それぞれのクローンのCDR(相補性決定領域)のアミノ酸配列を示す。また、各クローンの可変領域の全長アミノ酸配列を配列番号17〜20に示す。
得られた2クローンのFab抗体遺伝子をサブクローニングすることでIgG発現ベクター(重鎖の定常領域はIgG1)を構築した。これらの発現ベクターをLipofectamine(Invitrogen社製)の標準方法に従ってHEK293T細胞にトランスフェクションし、72時間培養後の培養上清を回収した。尚、培地にはUltra Low IgG FBS(Invitrogen社製)を10%で添加したDMEM(Sigma)を用いた。この培養上清からrProteinA Sepharose Fast Flow(GE healthcare社製)を用いた標準方法によってIgG抗体を精製した。精製後のタンパク質はSDS−PAGEによって単一バンドであることを確認し、BCA Protein Assay Kit(PIERCE社製)を用いて濃度を決定した。
精製したrhADAM28を抗原として用いて、ヒトADAM28タンパク質に対するモノクローナル抗体を樹立した。rhADAM28を用いたELISAによりまず5つのクローン選抜し、クローン297-2F3をヒトADAM28に対する抗体の候補として選択した。モノクローナル抗体(297-2F3)の単一反応性を、組み換え型ヒトADAM28のイムノブロッティングにより決定した。
抗ヒトADAM28抗体のヒトADAM28酵素活性抑制効果
rhADAM28と抗ADAM28抗体を、図中に示す重量比で2時間インキュベート後、IGFBP-3(100ng)を加えて37℃で24時間インキュベートし、5mMのEDTAを含むSDS-sample bufferで反応を終了させた。その後、反応産物をSDS-PAGE(10% アクリルアミドゲル)し、抗IGFBP-3抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)を用いたイムノブロット法によりIGFBP-3分解の程度を検出した(図1)。211-14及び211-12のいずれの抗体も、ヒトADAM28によるIGFBP-3の分解を抑制した。
乳癌細胞株に対する抗ヒトADAM28抗体の増殖抑制効果
MDA-MB231細胞に対するIGF-Iの細胞分裂促進効果を、製造者の指示書に従い、5-bromo-2’deoxy-uridine (BrdUrd) Labeling and Detection Kit III (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland)を用いて測定した。同期化及び増殖停止の後、細胞を1%FBSを含有するDMEM中の1μg/mlのIGF-1により処理した。6時間後、BrdUrd(10μmol/L)を培地へ添加し、更に42時間培養した。IGF-Iの細胞分裂促進効果へのADAM28活性の寄与を調べるため、細胞をIGF-I処理の30分前に、1又は5μg/mlの抗ADAM28抗体とともにインキュベートし、次に、IGF-Iの存在下で、42時間、BrdUrdと反応させた(図2)。211-14、211-12及び297-2F3のいずれの抗体もMDA-MB231細胞のインビトロ増殖を抑制した。
抗ヒトADAM28抗体のインビボにおける癌細胞増殖抑制効果
レンチウイルスベクターによりルシフェラーゼを恒常的に発現するADAM28高発現乳癌細胞株MDA-MB231 ffLuc-cp156を作製し、NOD/SCIDマウス(Six-week-old male, Charles River Laboratories International Inc, Washington, MA)の乳房皮下組織に移植(2 x 10e6個)した。移植後、抗ADAM28抗体(2mg/kg/mice)を2日間隔で5回局所注射し、腫瘍増殖の抑制効果を検討した。D-ルシフェリン(150mg/Kg)(Promega Co, Madison, MI)を腹腔内投与後in vivo imaging system (IVIS)-100 (Xenogen Co., Alameda, CA)にて発光を検出した(図3)。211-14及び211-12のいずれの抗体も、インビボにおけるMDA-MB231 ffLuc-cp156の増殖を抑制した。
抗ヒトADAM28抗体のインビボにおける癌細胞転移抑制効果
雄のNOD/SCIDマウス(6週齢)(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA)の尾静脈中に、PC-9ffLuc-cp156細胞(300μlのPBS中に、1x106個)を注射した。製造者の指示書に従い、肺転移を、ルシフェラーゼ活性の検出のためのIn Vivo Imaging System (IVIS)-100カメラシステム(Xenogen Co., Alameda, CA)を用いた生物発光イメージングによりモニターした。イメージングの間、マウスを、イソフルランで麻酔し、D-ルシフェリン(150 mg/kg; Promega Co., Madison, WI)を腹腔内へ注射し、1分後、動物全身からの光子をカウントした。抗ADAM28中和抗体の、肺転移への効果を調べるため、PC-9ffLuc-cp156細胞を5μg/mlのマウス抗ヒトADAM28モノクローナル抗体(297-2F3)、又は5μg/mlの非免疫IgGとともに2時間、4℃にてインキュベートし、マウスへ静注した(1群あたりn = 9匹)(図4)。297-2F3投与によって癌転移が抑制された。
また、実施例4において、癌細胞移植後6週間後のマウスの各臓器から抽出したRNAから、ルシフェラーゼ特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行い、腫瘍由来の遺伝子発現の有無を確認し、自然転移の有無を検討した(図5)。211-14及び211-12のいずれの抗体も、癌細胞の微小転移を抑制した。
上記実施例1(7)において得られた、マウス抗ヒトADAM28モノクローナル抗体297-2F3を産生するハイブリドーマのcDNAより、当該抗体の可変領域をPCR増幅し、クローニングベクターへサブローニングし、当該領域の塩基配列を解析した。表2に、CDR(相補性決定領域)のアミノ酸配列を示す。また、軽鎖及び重鎖可変領域の全長アミノ酸配列を配列番号146及び147にそれぞれ示す。
次に、WO98/13388に記載の方法を参照しつつ、マウス抗ヒトADAM28モノクローナル抗体297-2F3の各CDRを、ヒト抗体フレームにグラフティングし、ヒト化を行った。この結果得られたヒト化297-2F3の軽鎖及び重鎖可変領域の全長アミノ酸配列を配列番号30及び31にそれぞれ示す。
エピトープの同定(1)
ヒトADAM28sの部分ペプチドを固定化したペプチドアレイを用いて、抗ヒトADAM28抗体211-12及び297-2F3について、エピトープマッピングを行った。具体的には、下記の表のように、ヒトADAM28sのプロテアーゼドメインからC末端までをカバーする配列に対して、残基数が12アミノ酸残基でオフセットが3アミノ酸残基のペプチド群からなるペプチドアレイを作製した。HRP標識した抗ヒトADAM28s抗体をペプチドアレイと反応させた。
エピトープの同定(2)
MBPのC末端に、ヒトADAM28s(配列番号4)の以下の領域の部分配列を付加した融合タンパク質を、それぞれ調製した。
399-540、399-497、491-540、491-510、501-520、511-530、521-540、513-522、515-524、517-526、519-528
また、コントロールとして、MBPのC末端に、ヒトADAM28m(配列番号2)の以下の領域の部分配列を付加した融合タンパク質を調製した。
517-526(ヒトADAM28m、コントロールとして)
Claims (13)
- ヒトショート分泌型ADAM28に配列番号22で表されるアミノ酸配列を含むエピトープにおいて特異的に結合し、且つヒトショート分泌型ADAM28の酵素活性を阻害する活性を有する、抗体。
- 軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
該軽鎖可変領域が、配列番号11で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号12で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号13で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含み、且つ
該重鎖可変領域が、配列番号14で表されるアミノ酸配列を有するCDR1、配列番号15で表されるアミノ酸配列を有するCDR2及び配列番号16で表されるアミノ酸配列を有するCDR3を含む
ことを特徴とする請求項1に記載の抗体。 - 該軽鎖可変領域が配列番号19で表されるアミノ酸配列を含み、且つ、該重鎖可変領域が配列番号20で表されるアミノ酸配列を含む
請求項2に記載の抗体。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体を含む、癌の予防又は治療剤。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体を含む、癌転移阻害剤。
- 癌の予防又は治療において使用するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 癌転移阻害において使用するための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体。
- 癌の予防又は治療剤の製造のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 癌転移阻害剤の製造のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項11記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項12記載のベクターを含む形質転換体。
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