JP6340523B2 - 希少脂肪酸を含む代謝改善剤 - Google Patents

Description

本発明は、希少脂肪酸を含む代謝改善剤に関する。より詳細には、オキソ脂肪酸、水酸化脂肪酸等の希少脂肪酸の生理機能、例えば、脂質、糖、エネルギーの代謝改善作用を利用した代謝改善剤に関する。本発明は当該剤を含む食品、医薬品、飼料等にも関する。

近年、過食・運動不足等による肥満、特に内臓脂肪の蓄積を伴う生活習慣病が社会的問題となっている。メタボリックシンドロームとは、内臓脂肪型肥満により、高血糖、高血圧、脂質異常症のうち２つ以上を合併し、動脈硬化が引き起こされやすくなった状態のことをいう。40〜74才の日本人、男性では２人に１人、女性では５人に１人が、メタボリックシンドローム及びその予備軍と推計されている。そのため、メタボリックシンドロームにおける脂質蓄積の進行防止・解消を目的に、食事療法により摂取カロリーの適正化を図ることの重要性が提唱されている。

食事において、脂質代謝改善作用や糖尿病改善作用等を有することが報告さている、共役リノール酸等の共役脂肪酸（非特許文献１）、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等のω3系多価不飽和脂肪酸（特許文献１）、中鎖脂肪酸（特許文献２）等を含む機能性脂質を摂取することに高い関心が寄せられている。

加えて、トマトに含有される９−オキソ−オクタデカジエン酸や１３−オキソ−オクタデカジエン酸等、一部のオキソ脂肪酸に、脂質代謝改善等の生活習慣病を改善する活性が報告されたことから（特許文献３、非特許文献２、３）、オキソ脂肪酸や水酸化脂肪酸等の希少脂肪酸の生理機能に対する注目も集まっている。
しかしながら、種々存在する希少脂肪酸について、より詳細な生理機能は、知られていない。

特表２００６−５２１３６８号公報 再表２００９／０９６５７０号公報 特開２０１１−１８４４１１号公報

Nagao K, (2005), J. Biosci. Bioeng., vol.100, no.2, p.152-157 Kim Y-I,(2011), Mol. Nutr. Food Res., vol.55, p.585-593 Kim Y-I,(2012), PLoS ONE, vol.7, no.2, e31317

本発明の目的は、希少脂肪酸を含む、脂質及び／又は糖等の代謝を改善する新規な代謝改善剤を提供することである。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究を行なった結果、オキソ脂肪酸、例えば、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸（以下、「KetoA」ともいう）、または、水酸化脂肪酸、例えば、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸(以下、「HYA」ともいう)が、従来知られていない生理機能である、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（以下、「PPAR」ともいう）活性化作用、血糖値上昇抑制作用、血中中性脂肪低下作用、耐糖能改善作用、エネルギー代謝亢進作用等を有することを見出した。

さらに、本発明者らは、Liver X Receptor（以下、「LXR」ともいう）アゴニストにより誘導される脂質合成促進に対し、HYA及びKetoA等の希少脂肪酸が、抑制作用を有することも見出した。

以上の知見に基づき、本発明が完成された。
即ち、本発明は下記のとおりである：
［１］10位又は12位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸、並びに／或いは、10位及び／又は12位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸を含む、代謝改善剤。
［２］前記オキソ脂肪酸及び／又は水酸化脂肪酸が、11位にトランス型二重結合、又は12位にシス型二重結合を有する［１］に記載の剤。
［３］オキソ脂肪酸が、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸（KetoA）、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸（αKetoA）、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸（γKetoA）、10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（sKetoA）、10-オキソオクタデカン酸（KetoB）、10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸（γKetoB）、10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸（αKetoB）又は10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸（sKetoB）、12-オキソオクタデカン酸（rKetoB）、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸（KetoC）、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（γKetoC）、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（αKetoC）、10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（sKetoC）、12-オキソ-シス-9-オクタデセン酸（KetoRA）からなる群から選択される少なくとも１種である［１］に記載の剤。
［４］水酸化脂肪酸が、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸（HYA）、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸（αHYA）、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸（γHYA）、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（sHYA）、10,12-ジヒドロキシオクタデカン酸（rHYA）、10-ヒドロキシオクタデカン酸（HYB）、10-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸（αHYB）、10-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸（γHYB）、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸（sHYB）、12-ヒドロキシオクタデカン酸（rHYB）、10-ヒドロキシ-トランス-11-オクタデセン酸（HYC）、10-ヒドロキシ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（αHYC）、10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（γHYC）、10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（sHYC）、リシノール酸（RA）からなる群から選択される少なくとも１種である［１］に記載の剤。
［５］肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種の予防又は改善に使用される［１］−［４］のいずれか１項に記載の剤。
［６］食品もしくは食品添加物である、［１］−［４］のいずれか１項に記載の剤。
［７］医薬品である、［１］−［４］のいずれか１項に記載の剤。
［８］飼料もしくは飼料添加物である、［１］−［４］のいずれか１項に記載の剤。
［９］哺乳動物における代謝を改善する方法であって、10位又は12位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸、並びに／或いは、10位及び／又は12位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸を、該哺乳動物に投与することを含む、方法。
［１０］代謝改善剤として使用するための、10位又は12位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸、並びに／或いは、10位及び／又は12位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸。
［１１］代謝改善剤の製造のための、10位又は12位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸、並びに／或いは、10位及び／又は12位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸の使用。
尚、本発明において「及び（並びに）／又は（或いは）」とは、いずれか一方、あるいは、両方を包含する意味で使用される。

本発明において、KetoA又はHYAのようなオキソ脂肪酸又は水酸化脂肪酸（以下、オキソ脂肪酸等ともいう）が、従来知られていなかった生理機能、例えば、PPAR活性化作用、血糖値上昇抑制作用、血中中性脂肪低下作用、耐糖能改善作用、エネルギー代謝亢進作用等を有することを見出した。さらに、これらのオキソ脂肪酸等が、LXRに対するアンタゴナイズ作用により、強い脂質合成抑制作用を有することも見出した。
本発明は、当該機能に基づき、オキソ脂肪酸等の希少脂肪酸を含む代謝改善剤を提供する。当該剤は、医薬品、食品、飼料等、様々な分野において使用し得ることからも、本発明は、産業上極めて有用である。

KetoA又はHYAのPPARα/γレポーター活性の結果を示す。cont.は陰性対照（エタノール添加）、Posiは陽性対照（PPARアゴニスト添加）を示す。縦軸は、相対的なルシフェラーゼ活性を示す。 KetoA又はHYAをマウスに与えた後のマウスの体重変化を示す。縦軸は、体重（g）、横軸は、経過期間（週）を示す。 KetoA又はHYAをマウスに与えた後の血糖値の変化を示す。縦軸は、血漿中のグルコース濃度（mg/dL）、横軸は、経過期間（週）を示す。 KetoA又はHYAをマウスに与えた後の酸素消費を示す。縦軸は、酸素消費量（mL/kg/hr）を示す。darkは暗期、lightは明期の測定値を示す。 KetoA又はHYAをマウスに与えた後の直腸温を示す。縦軸は、直腸温度（℃）を示す。 KetoA又はHYAをマウスに与えた後の白色脂肪重量値を示す。縦軸は、腹腔内白色脂肪重量（g）を示す。 KetoA又はHYAをマウスに与えた後の血中中性脂肪値を示す。縦軸は、血漿中トリグリセリドの濃度（mg/dL）を示す。 LXRアゴニストにより誘導されるSREBP-1ｃ mRNA発現に与えるKetoA又はHYAの影響を示す。縦軸はSREBP-1ｃ mRNAの相対的な発現を示す。 LXRアゴニストにより誘導される未成熟型SREBP-1発現に与えるKetoA又はHYAの影響を示す。縦軸は未成熟SREBP-1の相対的な発現を示す。グラフ上段は、ウェスタンブロッティング像を示す。 LXRアゴニストにより誘導される成熟型SREBP-1発現に与えるKetoA又はHYAの影響を示す。縦軸は成熟SREBP-1の相対的な発現を示す。グラフ上段は、ウェスタンブロッティング像を示す。 LXRアゴニストにより誘導されるSCD-1 mRNA発現に与えるKetoA又はHYAの影響を示す。縦軸はSCD-1 mRNAの相対的な発現を示す。 LXRアゴニストにより誘導されるFAS mRNA発現に与えるKetoA又はHYAの影響を示す。縦軸はFAS mRNAの相対的な発現を示す。 LXRアゴニストにより誘導されるACC1 mRNA発現に与えるKetoA又はHYAの影響を示す。縦軸はACC1 mRNAの相対的な発現を示す。 LXRアゴニストにより誘導されるACC2 mRNA発現に与えるKetoA又はHYAの影響を示す。縦軸はACC2 mRNAの相対的な発現を示す。 LXRアゴニストによるトリアシルグリセロール蓄積に与えるKetoA又はHYAの影響を示す。縦軸はトリアシルグリセロール量（μg/mg タンパク質）を示す。 ルシフェラーゼアッセイによるLXRに対するアンタゴナイズ作用の評価を示す。縦軸は、相対的なルシフェラーゼ活性を示す。

以下、本発明の詳細を説明する。

本発明において、「代謝改善」とは、脂質及び／又は糖及び／又はエネルギーの代謝が改善されることをいう。具体的には、例えば、脂質代謝改善とは、体組織、血中、又はリンパ組織中に存在する脂質の分解を促進する、脂質の合成を抑制する、脂肪組織等の体組織に脂質が蓄積することを予防及び／又は抑制する、若しくは、体組織等に蓄積した脂質を減少させることをいう。「脂質」とは、トリグリセリド、及び／又は、コレステロールをいい、脂肪酸を含む。
糖代謝改善とは、血中に存在する糖、及び／又は、糖化ヘモグロビン（HbA1c）の上昇を抑制する、空腹時血糖値を低下させる、若しくは、食事後の糖代謝を促進することをいう。さらに、糖代謝改善には、耐糖能異常（正常型と糖尿病型のいずれにも含まれない、糖尿病予備軍ともいえる病態）が改善されることも含まれる。「糖」とは、単糖、二糖または多糖をいう。
エネルギー代謝改善とは、摂取エネルギー量及び放出エネルギー量のバランスが、異常又は正常に調節できない状態を、正常な状態にする、又は近付けることをいう。

前記代謝改善の指標として、PPAR活性を測定することができる。PPAR には、少なくとも３種類のサブタイプPPARα、PPARδ（βと同一）、PPARγが存在することが知られている。PPARαは主に肝臓、心臓、腎臓、骨格筋、褐色脂肪細胞等で発現し、脂肪酸のβ酸化に関与する多くの遺伝子の調整に関与している。PPARδは、比較的全身（脳、脂肪組織、皮膚等）に発現している。PPARγには、少なくとも３種類のアイソフォームが存在し、主に白色脂肪細胞やマクロファージで発現し、脂肪細胞分化等に関与している。これらPPARの少なくとも１種以上に対し、リガンド（アゴニスト、アンタゴニスト）活性の有無を確認し、アゴニスト活性を示す場合、代謝改善効果を有する可能性が高い、又は代謝改善効果を有すると判断する。一例として、FEBS Letters 514 (2002) p.315-322に記載のPPARレポーターアッセイを行うことができるが、当該方法に限定されない。

あるいは、肥満・糖尿病モデル動物に、オキソ脂肪酸等を投与し、体重、臓器重量、血糖値、中性脂肪値、酸素消費量、直腸温度等を測定し、その変化の有無を確認することができる。肥満・糖尿病モデル動物としては、当該性質を示す動物であれば限定されない。例えば、前記モデル動物として、市販のKKAyマウス、NODマウス、NSYマウス、TSODマウス、ZDF/Crl-Leprfaラット、SDT/Jclラット等が挙げられる。体重、臓器重量、血糖値、中性脂肪値、酸素消費量、直腸温度等は、公知の方法で測定することができる。これらを指標に、体重又は臓器重量、若しくは血糖値、中性脂肪値の減少が認められる場合、あるいは、酸素消費量又は直腸温度の増加が認められる場合、代謝改善効果を有する可能性が高い、又は代謝改善効果を有すると判断する。

または、後述の実施例に記載のように、LXRアゴニストにより誘導される脂質合成促進作用が、オキソ脂肪酸等の添加により、抑制されるか否かを確認することができる。その手法は、例えば、Journal of Lipid Research 47,(2006) 2712-2717を参考に行うことができるが、当該方法に限定されない。前記文献に記載の手法としては、LXRアゴニストを添加し、(1)脂質合成関連因子、例えば、SREBP-1c、成熟型及び未成熟型のSREBP-1、SCD-1、FAS、ACC1及び/又はACC2のmRNA及び/又はタンパク質の発現量を測定する、(2)細胞内トリアシルグリセロール量を測定する、若しくは、(3)LXR応答配列を用いたルシフェラーゼアッセイを行うことができる。LXRアゴニストとしては、T0901317、22（R）-ヒドロキシコレステロール、24（S）-ヒドロキシコレステロール等が挙げられるが、これらに限定されない。脂質合成関連因子のmRNA及び/又はタンパク質の発現量等が低下する場合、脂質合成が抑制されたとし、代謝改善効果を有する可能性が高い、又は代謝改善効果を有すると判断する。

本発明において、オキソ脂肪酸とは、10位又は12位にカルボニル基を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo脂肪酸」、又は「12-oxo脂肪酸」と略記する場合がある）をいう。さらに、10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo,cis-12脂肪酸」と略記する場合がある）、10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo,trans-11脂肪酸」と略記する場合がある）、10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸（以下、「10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸」と略記する場合がある）も含まれる。
より具体的には、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸（KetoA）、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸（以下、「αKetoA」ともいう）、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸（以下、「γKetoA」ともいう）、10-オキソ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（以下、「sKetoA」ともいう）、10-オキソオクタデカン酸（以下、「KetoB」ともいう）、10-オキソ-シス-6-オクタデセン酸（以下、「γKetoB」ともいう）、10-オキソ-シス-15-オクタデセン酸（以下、「αKetoB」ともいう）、10-オキソ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸（以下、「sKetoB」ともいう）、12-オキソオクタデカン酸（以下、「rKetoB」ともいう）、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸（以下、「KetoC」ともいう）、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（以下、「γKetoC」ともいう）、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（以下、「αKetoC」ともいう）、10-オキソ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（以下、「sKetoC」ともいう）、12-オキソ-シス-9-オクタデカン酸（以下、「KetoRA」ともいう）等が含まれる。

本発明において、水酸化脂肪酸とは、10位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy脂肪酸」と略記する場合がある）、又は12位に水酸基を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「12-hydroxy脂肪酸」と略記する場合がある）をいう。ここで、10位及び12位に水酸基を有する「10,12-dihydroxy脂肪酸」も、「10-hydroxy脂肪酸」、「12-hydroxy脂肪酸」の一態様として包含される。さらに、10位に水酸化基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy,cis-12脂肪酸」と略記する場合がある）、10位に水酸基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy,trans-11脂肪酸」と略記する場合がある）、10位に水酸基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18の水酸化脂肪酸（以下、「10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸」と略記する場合がある）も含まれる。
より具体的には、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸（HYA)、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸（以下、「αHYA」ともいう）、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸（以下、「γHYA」ともいう）、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12,シス-15-オクタデカトリエン酸（以下、「sHYA」ともいう）、10,12-ジヒドロキシオクタデカン酸（以下、「rHYA」ともいう）、10-ヒドロキシオクタデカン酸（以下、「HYB」ともいう）、10-ヒドロキシ-シス-15-オクタデセン酸（以下、「αHYB」ともいう）、10-ヒドロキシ-シス-6-オクタデセン酸（以下、「γHYB」ともいう）、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-15-オクタデカジエン酸（以下、「sHYB」ともいう）、12-ヒドロキシオクタデカン酸（以下、「rHYB」ともいう）、リシノール酸（以下、「RA」ともいう）、10-ヒドロキシ-トランス-11-オクタデセン酸（以下、「HYC」ともいう）、10-ヒドロキシ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸（以下、「αHYC」ともいう）、10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸（以下、「γHYC」ともいう）、10-ヒドロキシ-シス-6,トランス-11,シス-15-オクタデカトリエン酸（以下、「sHYC」ともいう）等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明で使用するオキソ脂肪酸又は水酸化脂肪酸等の希少脂肪酸は、特願2012-108928に記載の手法により、又、HYAは、Biochemical and Biophysical Research Communications 416(2011)p.188-193等を参考に、調製することができる。あるいは、RA、rHYB等は市販品を使用することができる。KetoRA、rKetoBは、下記クロム酸酸化等を利用して、RAから調製することができる。

特願2012-108928に記載される具体的な手法は、下記のとおりである。

9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸（以下、「cis-9不飽和脂肪酸」と略記する場合がある）から、２段階の反応により、10-oxo脂肪酸を製造する。第１の反応（反応１）では、cis-9不飽和脂肪酸から、水和酵素反応により10-hydroxy脂肪酸が生成する。
反応１の「基質」は、9位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸であれば特に制限されず、例えばモノエン酸（18:1）、ジエン酸（18:2）、トリエン酸（18:3）、テトラエン酸（18:4）、ペンタエン酸（18:5）等が挙げられる。ジエン酸、トリエン酸、又はテトラエン酸がより好ましく、ジエン酸類、又はトリエン酸類が特に好ましい。尚、本明細書において「脂肪酸」という場合、遊離の酸のみならず、エステル体、塩基性化合物との塩等をも包含する。

モノエン酸としては、例えば、オレイン酸、リシノール酸等が挙げられる。
ジエン酸としては、例えば、リノール酸、シス-9,トランス-11-オクタデカジエン酸等が挙げられる。
トリエン酸類としては、例えば、α−リノレン酸、γ−リノレン酸等が挙げられる。
テトラエン酸としては、例えば、ステアリドン酸等が挙げられる。

反応１を触媒する水和酵素としては、上記のcis-9不飽和脂肪酸を基質として利用し、10-hydroxy脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来の脂肪酸−ヒドラターゼ（CLA-HY）、より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-HYであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-HYである。CLA-HYは、特開2007-259712号公報に記載される方法等により取得することができる。

水和酵素の添加量は、例えば、0.001〜10 mg/mL、好ましくは0.1〜5 mg/mL、より好ましくは0.2〜2 mg/mLである。

反応１には「補因子」を用いてよく、例えば、NADH、NADPHやFADH₂等を用いることができる。その添加濃度は水和反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.001〜20 mM、より好ましくは0.01〜10 mMである。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、モリブデン酸カリウム、モリブデン(VI)酸二ナトリウム無水和物、モリブデン(VI)酸二ナトリウム二水和物、オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、メタバナジン（Ｖ）酸ナトリウム、タングステン（VI）酸カリウム、タングステン(VI)酸ナトリウム無水和物、及びタングステン(VI)酸ナトリウム二水和物からなる群から選ばれる１又は２以上の化合物が挙げられる。その添加濃度は水和反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.1〜20 mM、より好ましくは1〜10 mMである。

例えば、rHYA は、RAに大腸菌で発現させた水和酵素（湿菌体重量 0.7 g）、NADH (33 mg)、FAD (0.8 mg)、リシノール酸(1 g)、BSA(0.2 g)を含む100 mM リン酸カリウムバッファー(pH 6.5)で全量を10 mlとし、嫌気的に37℃で63時間、225 rpmで振とう反応することで、得ることができる。
一方、12-hydroxy脂肪酸は、例えば、それを構成脂肪酸として含むトリグリセリドエステルを主成分とする天然油から、加水分解により得ることができる。例えば、RAはヒマシ油、rHYBは硬化ヒマシ油の加水分解により得ることができる。

第２の反応（反応２）では、10-hydroxy脂肪酸から、脱水素酵素反応又はクロム酸を用いた化学的酸化により、10-oxo脂肪酸が生成する。

反応２を触媒する脱水素酵素としては、10-hydroxy脂肪酸を基質として利用し、10-oxo脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来の水酸化脂肪酸−デヒドロゲナーゼ（CLA-DH）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-DHであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-DHである。CLA-DHは、特開2007-259712号公報に記載される方法等により取得することができる。

脱水素酵素の添加量は、例えば、0.001〜10 mg/mL、好ましくは0.1〜5 mg/mL、より好ましくは0.2〜2 mg/mLである。

反応２には「補因子」を用いてよく、例えば、NAD、NADPやFAD等を用いることができる。その添加濃度は酸化反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.001〜20 mM、より好ましくは0.01〜10 mMである。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。

また、第２の反応は化学的酸化により行うことができる。
化学的酸化としては、自体公知の方法、例えばクロム酸酸化、好ましくはジョーンズ酸化等が挙げられる。クロム酸としては、無水クロム酸CrO₃、クロム酸H₂CrO₄、二クロム酸H₂Cr₂O₇といった化合物の塩や錯体を使用することができる。

同様に、12-hydroxy脂肪酸から12-oxo脂肪酸を得ることができる。例えば、KetoRAは、以下の方法で得ることができる。
具体的には、無水クロム酸2.67 gに硫酸 2.3 ml、水 7.7 mlを加えた物を、アセトンを90 ml加えてクロム酸溶液を作製する。三角フラスコに、5 gのRAと、100 mlのアセトンを加え、氷上にてスターラーで撹拌しながら上記のクロム酸溶液を１滴ずつ加える。溶液が青緑色から薄いオレンジ色になったらクロム酸溶液の滴下をやめ、イソプロピルアルコールを用いて反応を停止し、析出した沈殿を遠心により除去し、得られた遠心上清を分液ロートに入れてヘキサン（100 ml）及びミリQ水（100 ml）を加えてよく混和する。遠心によりヘキサン層を回収し、ミリQ水で数回洗浄したのち、ヘキサン層をロータリーエバポレーターにて濃縮することにより、反応産物及び未反応の基質を抽出する。抽出物の約98％がKetoRAであることが確認できる。当該抽出物(KetoRAを含む混合物)の20〜30倍重量のシリカゲル（Wakogel(r)C-100）をヘキサンで膨潤させガラスカラムに詰め、硫酸ナトリウム（無水）を重層する。ヘキサン：ジエチルエーテル=8:2の溶出液で上記より得られた抽出物(KetoRAを含む混合物)を懸濁し、カラムにアプライする。溶出液を流速約2 mlで流し、カラムから出てきた溶液をフラクションに分けて回収し、回収した各フラクションをLC/MS及びガスクロマトグラフィーにより分析し、KetoRAのみが含まれたフラクションを集めてロータリーエバポレーターにて濃縮し、純度99％以上のKetoRAを得ることができる。
rKetoBについても、同様にしてrHYBをクロム酸酸化することにより得ることができる。

10位にカルボニル基を有し12位にシス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸から、異性化酵素反応（反応３）により、10-oxo,trans-11脂肪酸を製造する。
反応３の「基質」としては、上記反応１及び２により、9位及び12位にシス型二重結合を有する炭素数18の不飽和脂肪酸から誘導される10-oxo,cis-12脂肪酸であれば特に制限されず、リノール酸から誘導されるKetoA、α−リノレン酸から誘導されるαKetoA、γ−リノレン酸から誘導されるγKetoA、ステアリドン酸から誘導されるsKetoA等が挙げられる。当該基質は反応１及び２以外の方法により得られたものであってもよい。

反応３を触媒する異性化酵素としては、上記の10-oxo,cis-12脂肪酸を基質として利用し、10-oxo,trans-11脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来のオキソ脂肪酸−イソメラーゼ（CLA-DC）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-DCであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-DCである。CLA-DCは、特開2007-259712号公報に記載される方法により取得することができる。

異性化酵素の添加量は、例えば、0.001〜10 mg/mL、好ましくは0.1〜5 mg/mL、より好ましくは0.2〜2 mg/mLである。

異性化酵素反応には「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。

10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（10-oxo,trans-11脂肪酸）から、飽和化酵素反応（反応４）により、10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸を製造する。
反応４の「基質」としては、上記反応３により生成し得る10-oxo,trans-11脂肪酸であれば特に制限されず、KetoAから誘導されるKetoC、αKetoAから誘導されるαKetoC、γKetoAから誘導されるγKetoC、sKetoAから誘導されるsKetoC等が挙げられる。当該基質は反応３以外の方法により得られたものであってもよい。

反応４を触媒する飽和化酵素としては、上記の10-oxo,trans-11脂肪酸を基質として利用し、10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来のオキソ脂肪酸−エノンレダクターゼ（CLA-ER）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-ERであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-ERである。

上記酵素「CLA-ER」は、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ上記反応４を触媒する酵素活性を有するタンパク質、あるいは
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつ上記反応４を触媒する酵素活性を有するタンパク質である。

上記（ｂ）に関し、より具体的には、（i）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。性質の似たアミノ酸（例えば、グリシンとアラニン、バリンとロイシンとイソロイシン、セリンとトレオニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、リシンとアルギニン、システインとメチオニン、フェニルアラニンとチロシン等）同士の置換等であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。
上記のようにアミノ酸が欠失、置換又は挿入されている場合、その欠失、置換、挿入の位置は、上記酵素活性が保持される限り、特に限定されない。

上記（ｃ）において「ストリンジェントな条件」とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士、例えば70、80、90、95又は99％以上の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件、具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1xSSC、0.1％SDS、好ましくは、0.1xSSC、0.1％SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1xSSC、0.1％SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件等が挙げられる。

CLA-ERは、例えば、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549株の菌体や培養液から、自体公知のタンパク質分離精製技術により、例えば上記反応４を触媒する酵素活性を指標にして、単離することができる。あるいは、配列番号１に示される塩基配列情報をもとにして、CLA-ERのコード領域の全塩基配列を合成するか、あるいは該コード領域を含むCLA-ER遺伝子断片を増幅できるプライマーを設計し、上記菌株から調製したcDNAもしくはゲノムDNAを鋳型としたPCRを実施し、得られた増幅断片を適当な発現ベクターにクローニングして宿主細胞に導入し、該細胞を培養することによって、組換え生産することもできる。

上記CLA-ERをコードする核酸を含むベクターは、目的（例えば、タンパク質の発現）に応じて、ベクターを導入する宿主細胞に適したものを適宜選択し、使用することができる。当該ベクターは適切なプロモーター、転写終結シグナル、選択マーカー遺伝子（薬剤耐性遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）も含むこともできる。また、発現したタンパク質の分離・精製に有用なタグ配列をコードする配列等を含んでもよい。あるいは、ベクターは、対象宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。そして、当該ベクターは、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法等、自体公知の形質転換法で、対象宿主細胞内に導入することができる。

上記「宿主細胞」は、上記CLA-ERをコードする核酸を含むベクターを発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌及び高等真核細胞等が挙げられる。細菌の例としては、バチルス又はストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。CLA-ERをコードする核酸を含むベクターが導入された組換え細胞は、宿主細胞に適した自体公知の方法により培養することができる。

上記CLA-ERの「精製」は、自体公知の方法、例えば、遠心分離等で集菌した菌体を、超音波又はガラスビーズ等で摩砕した後、遠心分離等により細胞片等の固形物を除き、粗酵素液を調製し、さらに、硫安、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニテイクロマトグラフィー等のクロマトグラフ法、ゲル電気泳動法等を用いることができる。

飽和化酵素の添加量は、例えば、0.001〜10 mg/mL、好ましくは0.1〜5 mg/mL、より好ましくは0.2〜2 mg/mLである。

反応４には「補因子」を用いてよく、例えば、NADH等を用いることができる。その添加濃度は酸化反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.001〜20 mM、より好ましくは0.01〜10 mMである。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。

10位にカルボニル基を有し11位にトランス型二重結合を有する炭素数18のオキソ脂肪酸（10-oxo,trans-11脂肪酸）から、脱水素酵素反応（反応５）により、10-hydroxy,trans-11脂肪酸を製造、あるいは、10位にカルボニル基を有し11及び12位に二重結合を持たない炭素数18のオキソ脂肪酸（10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸）から、脱水素酵素反応（反応６）により、10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸を製造する。
反応５の「基質」としては、上記反応３により生成し得る10-oxo,trans-11脂肪酸であれば特に制限されず、KetoAから誘導されるKetoC、αKetoAから誘導されるαKetoC、γKetoAから誘導されるγKetoC、sKetoAから誘導されるsKetoC等が挙げられる。当該基質は反応３以外の方法により得られたものであってもよい。
一方、反応６の「基質」としては、上記反応４により生成し得る10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸であれば特に制限されず、KetoCから誘導されるKetoB、αKetoCから誘導されるαKetoB、γKetoCから誘導されるγKetoB、sKetoCから誘導されるsKetoB等が挙げられる。当該基質は反応４以外の方法により得られたものであってもよい。

反応５又は反応６を触媒する脱水素酵素としては、10-oxo,trans-11脂肪酸又は10-oxo,11,12-飽和化脂肪酸を基質として利用し、10-hydroxy,trans-11脂肪酸又は10-hydroxy,11,12-飽和化脂肪酸に変換し得る酵素であれば特に制限はないが、例えば、乳酸菌由来の水酸化脂肪酸−デヒドロゲナーゼ（CLA-DH）が好ましい。より好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）由来のCLA-DHであり、特に好ましくは、Ｌ．プランタルムFERM BP-10549菌株由来のCLA-DHである。CLA-DHは、上記反応２における酸化反応を触媒するが、逆反応として、反応５又は反応６の還元反応を触媒することもできる。

脱水素酵素の添加量は、例えば、0.001〜10 mg/mL、好ましくは0.1〜5 mg/mL、より好ましくは0.2〜2 mg/mLである。

反応５及び反応６には「補因子」を用いてよく、例えば、NADH、NADPHやFADH₂等を用いることができる。その添加濃度は還元反応が効率良く進む濃度であればよい。好ましくは0.001〜20 mM、より好ましくは0.01〜10 mMである。
さらに、酵素反応に「活性化剤」を用いてよく、例えば、上記反応１で例示されたのと同様の化合物を、同様の添加濃度で使用することができる。

上記各反応において、酵素（水和酵素、脱水素酵素、異性化酵素、飽和化酵素）は、それをコードする核酸を含む発現ベクターが導入された組換え細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等）の形態で反応系に提供される。この場合、当該細胞の培養に適した液体培地に、基質及び必要に応じて補因子や活性化剤を添加して、当該細胞を培養することにより、反応を行うこともできる。また、上記酵素はいずれも、精製されたものであっても、粗精製されたものであってもよい。あるいは、大腸菌等の菌体に発現させ、その菌体自体を用いても、培養液を用いてもよい。さらには、該酵素は遊離型のものでもよく、各種担体によって固定化されたものでもよい。

本発明のオキソ脂肪酸等を含む代謝改善剤は、生活習慣病の改善に適用することもできる。「生活習慣病」とは、食習慣、運動習慣、休養、喫煙、飲酒等の生活習慣がその発症、進行に関与する疾患群をいい、成人肥満、小児肥満、栄養失調症、拒食症、胃がん、大腸がん、痛風、高血圧、動脈硬化症、腎臓結石、心筋梗塞、狭心症、胃潰瘍、腎臓病、骨粗しょう症、歯周囲炎、アルコール性肝炎、肝硬変、肝臓がん、肺がん、気管支炎、肺気腫、歯周病、脳卒中、脳梗塞、動脈瘤、過労死、不眠症等の病態が挙げられる。

さらに、本発明の代謝改善剤は、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病、妊婦糖尿病等）、糖尿病合併症（動脈硬化性疾患、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性神経障害等）、脂質代謝異常、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、脂肪肝の予防又は改善に使用することもできる。
あるいは、ヒト、又はヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ニワトリ、インコ、九官鳥、ヤギ、ウマ、ヒツジ、サル等）に本発明の代謝改善剤を投与し、肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、インスリン抵抗性、脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種を予防又は治療するために、使用することができる。

本発明のオキソ脂肪酸等を含む代謝改善剤は、例えば、医薬品、食品、飼料、化粧品等として、あるいはそれらに配合して使用することができる。
当該医薬品の剤型としては、散剤、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製されるが、オキソ脂肪酸等は水に難溶性であるため、植物性油、動物性油等の非親水性有機溶媒に溶解するか又は、乳化剤、分散剤もしくは界面活性剤等とともに、ホモジナイザー（高圧ホモジナイザー）を用いて水溶液中に分散、乳化させて用いる。

製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、いわし油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、Ｄ−マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、ｐＨ調整剤、香料等を挙げることができる。なお、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても良い。

注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与のいずれであってもよい。

本発明の代謝改善剤を食品もしくは食品添加物として使用する場合、当該食品は、溶液、懸濁物、粉末、固体成形物等、経口摂取可能な形態であればよく、特に限定するものではない。具体例としては、サプリメント（散剤、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、栄養飲料、アルコール飲料等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー、キャラメル、和菓子、スナック菓子等）、即席食品類（即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品等）、油、油脂食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）、小麦粉製品（パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉等）、調味料（ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、つゆ類等）、畜産加工品（畜肉ハム・ソーセージ等）が挙げられる。

上記食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。

本発明の代謝改善剤を飼料もしくは飼料添加物として使用する場合、当該飼料としては、ペットフード、畜産又は水産養殖飼料添加物等が挙げられる。

本発明の代謝改善剤を化粧品もしくは化粧品添加物として使用する場合、当該化粧品としては、クリーム、ゲル、乳液、美容液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、パック、ファンデーション、口紅、アイシャドー、シャンプー、コンディショナー、入浴剤等が挙げられ、香料等を混合してもよい。

本発明の医薬品、食品、飼料、化粧品等に配合されるオキソ脂肪酸等は、1種類のみであってもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明の医薬品の投与量又は本発明の食品の摂取量は、患者又は摂取者の年齢及び体重、症状、投与時間、剤型、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して適宜決定できる。例えば、本発明の医薬品を経口投与する場合、有効成分であるオキソ脂肪酸等の総量として、成人1日当たり0.02〜100mg／kg体重、好ましくは0.2〜50mg／kg体重の範囲で、また、非経口的に投与する場合は0.002mg〜50mg／kg体重、好ましくは0.02〜50mg／kg体重の範囲で、１日1回もしくは数回（2〜5回）に分けて投与することができる。また、食品として摂取する場合には、有効成分であるオキソ脂肪酸等の総量が、成人1人1日当たり1〜6000mgの範囲、好ましくは10〜3000mgの範囲の摂取量となるように、食品に配合することができる。本発明の飼料の摂取量及び本発明の化粧品の使用量についても、それぞれ上記食品の摂取量及び上記医薬品の投与量に準じて適宜決定することができる。

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

本発明で使用したKetoA、HYA、γHYA、γKetoA、rHYA等の希少脂肪酸は、上記方法（特願2012-108928に記載の方法）に基づき調製した。KetoRAは、上記方法に基づきリシノール酸（RA）から調製した。GW7647（PPARαアゴニスト）、Troglitazone（PPARγアゴニスト）は、シグマ−アルドリッチ、T0901317(LXRアゴニスト)はCayman Chemical社から、RAはNU-CHEK PREP, INC. (USA)社から（品番：U-50-A）、EPAはNU-CHEK PREP, INC. (USA)社から（品番：U-99-A）、LAはシグマ−アルドリッチから（品番：L1376）、その他の試薬は和光純薬又はナカライテスク等から購入した。

PPARα、γリガンド活性の測定
オキソ脂肪酸等の機能を評価するため、まず、PPARα、γの活性化能を測定した。当該測定は、Nobuyuki Takahashiら、FEBS Letters 514 (2002) p.315-322,「Dual action of isoprenols from herbal medicines on both PPARgamma and PPARalpha in 3T3-L1 adipocytes and HepG2 hepatocytes.」のMaterials and Methods 「Reporter plasmids and luciferase assays」の欄を参照して行った。具体的には、アフリカミドリザル腎臓由来のCV-1細胞に、PPARα、γリガンド結合領域とGAL4 DNA結合領域の融合タンパク質をコードするDNAを含むプラスミド（pM-hPPARαまたはpM-hPPARγ）と、GAL4結合DNA配列にルシフェラーゼを繋いだレポータープラスミド（p4xUASg-tk-luc）、及びトランスフェクション効率を標準化するための内部対照（pRL-CMV）を導入した。当該細胞に、以下に記載のリガンドを添加して、24時間インキュベートした後にルシフェラーゼ活性を測定した。リガンドとして、KetoA及びHYAは、それぞれ30μM添加した。
サンプルはエタノールを用いて濃度調整を行った。陰性対照にはエタノール、陽性対照にはPPARα、γのアゴニストとして、GW7647（10nM）、Troglitazone（5μM）をそれぞれ用いた。結果を図１に示す。
図１から、KetoAに強いPPARα及びγアゴニスト活性が、HYAにPPARαアゴニスト活性と若干のPPARγアゴニスト活性が認められた。
同様の手法で、αKetoA、γKetoA、sKetoA、KetoB、γKetoB、αKetoB、sKetoB、rKetoB、KetoC、γKetoC、αKetoC、sKetoC、KetoRA、αHYA、γHYA、sHYA、rHYA、HYB、αHYB、γHYB、sHYB、rHYB、RA、HYC、αHYC、γHYC、sHYC についてもルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、KetoC、αKetoC、 KetoRA、γKetoCにPPARα及びγアゴニスト活性が、HYB、KetoB、αHYA、γHYA、ｒHYB、RA、rKetoB、ｒHYAにPPARαアゴニスト活性が、αKetoA、γKetoAにPPARγアゴニスト活性が認められた。

肥満・糖尿病モデルマウスにおける効果
（１）肥満・糖尿病モデルマウスであるKKAyマウスを用いて、KetoA、HYAの効果を評価した。KKAyマウス（KKAy/TaJcl、オス、４週齢で日本クレアから購入し、個別飼育した）を、市販の普通飼育飼料（ND）で１週間予備飼育した後５群に分け、それぞれ高脂肪飼料（HFD）を基本飼料として、無添加飼料（対照群）、異なる量のKetoA又はHYA添加飼料を４週間投与し、飼育した。KetoA、HYA添加飼料は、KetoA、HYAを、添加量が0.05％（ｗ/ｗ）（0.05％群）又は0.1％（ｗ/ｗ）（0.1％群）となるようにHFDに添加して調製した。

（２）KKAyマウスの体重及び血糖値の推移を測定した。また試験飼料飼育開始１６〜１９日目に酸素消費量の測定、２４日目に経口糖負荷試験、２６日目に直腸温の測定を行なった。また、実験飼育終了の翌日にKKAyマウスを解剖し、臓器重量、血漿中の中性脂肪値について測定した。

（３）KKAyマウスの体重の推移を図２に示す。KetoA添加飼料群において、0.05％群にて体重増加の抑制傾向が、0.1％群にて体重増加の有意な抑制が認められた。また、HYA添加飼料群では、0.05％群にて有意な体重増加の抑制が認められた。図中、＊はP＜0.05を、＊＊はP＜0.01を示す（以下、図３〜７においても同様）。

KKAyマウスの血糖値の推移を図３に示す。試験食摂取４週目において、対照群と比較して0.05％ KetoA群で、血糖上昇の抑制傾向が認められた。さらに、0.1％ KetoA群では、より強い有意な血糖降下作用が認められた。一方、HYA群では、有意差はないが血糖値の上昇抑制傾向が認められた。KKAyマウスの酸素消費量を、図４に示す。また、KKAyマウスの直腸温度の結果を図５に示す。対照群と比較し、KetoA群で酸素消費量が増加していることが認められ、直腸温度の上昇も認められた。この結果は、KetoA群において、熱産生が亢進していることを示している。KKAyマウスの臓器重量（腹腔内白色脂肪重量）の結果を図６に、血漿中の中性脂肪の結果を図７に示す。腹腔内白色脂肪重量及び血漿中の中性脂肪値のいずれの値も、0.1％ KetoA群では有意な低下が確認された。

（４）以上の結果から、KetoA摂取群では、肥満に伴う代謝異常の改善が認められた。酸素消費量の増加及び直腸温度の上昇が認められたことから、熱産生の亢進がKetoAによる代謝異常症の改善に寄与しているものと考えられる。

LXRアゴニストによる脂肪酸合成の誘導に対する効果
ヒト肝ガン由来HepG2細胞(細胞番号；JCRB1054、ヒューマンサイエンス研究資源バンク)を用いて、LXRアゴニストによって誘導される脂肪酸合成促進に対する抑制効果の評価をZaimaらの方法を参考に行った（Journal of Lipid Research 47, 2712-2717, 2006）。
HepG2細胞（2.0×10⁵ cells/mL）を、10％FBSを含むDMEM培地で24時間培養後、10nM LXRアゴニストT0901317（Cayman Chemicals）と60μM各種脂肪酸を含む0.1％BSA含有DMEM培地に交換した。24時間培養後、細胞を回収し、セパゾール試薬（ナカライテスク）を用いて総RNAを抽出した。DNase処理後にSuperScriptII(インビトロジェン)で逆転写し、cDNA溶液を得た。SYBR Green Mix(バイオラッド)と遺伝子特異プライマー（表１）を用いて、リアルタイムPCRを以下の通りに行った。

1. 96℃で15分間反応、2. 96℃で15秒間反応、3. 60℃で30秒間反応、4. 蛍光を測定、5. 2〜4を40回繰り返し、6. 65℃から95℃まで0.4℃間隔でメルティングカーブを測定した。内部標準として18S rRNAを用いた。測定した脂肪酸合成に関わる遺伝子は、Sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c)、Stearoyl coenzyme A desaturase-1 (SCD-1)、Fatty acid synthase (FAS)、Acetyl CoA carboxylase-1 および-2 (ACC-1、2)である。細胞内TGの蓄積量については、脂質をクロロホルム-メタノールによって抽出後、トリグリセリド-Ｅテストワコー（和光純薬）を用いて定量した。

また、未成熟型および成熟型SREBP-1cのタンパク質発現量を測定した。上記と同様に処理した細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む緩衝液A（250 mM スクロース、10 mM HEPES-KOH、10 mM KCl、1.5 mM MgCl₂、1 mM EDTA-Na、1 mM EGTA-Na、 pH 7.6）に分散し、23ゲージの注射針に20回通した後、遠心処理し（1,000×g、4℃、5分間）、上清1と沈殿1に分けた。この沈殿1を緩衝液B（20 mM HEPES-KOH、0.42 M NaCl、2.5％グリセロール、1.5 mM MgCl₂、1 mM EDTA-Na、1 mM EGTA-Na、 pH 7.6）に再溶解し、遠心処理した（10⁵×g、4℃、15分間）。得られた上清2を核画分（成熟型を含む）とした。一方、上清1をさらに遠心処理し（10⁵×g、4℃、15分間）、得られた沈殿2を細胞溶解液（10 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1％SDS、1 mM EDTA-Na、1 mM EGTA-Na）で溶解したものを膜画分（未成熟型を含む）とした。これらを試料とし、抗SREBP-1ポリクローナル抗体（Santa Cruz）を用いたウェスタンブロット法により測定した。Dual luciferase system (Promega)を用いて、LXRに対するアンタゴナイズ作用についてルシフェラーゼアッセイにより評価した。HepG2細胞にp3xIR1-tk-Luc、pCMX-hLXRa、pRL-CMXを導入した。各種脂肪酸とT0901317を含む0.1％ BSA含有無血清培地で、24時間培養後、ルシフェラーゼ活性を測定した。

図8にSREBP-1c mRNAの発現変動の結果を示した。T0901317により、その発現は7倍程度に上昇したが、HYA及びKetoAに強い抑制作用が認められた。ウエスタンブロッティングの結果からも、HYA及びKetoAはT0901317によって誘導される成熟型および未成熟型のSREBP-1発現促進を強く抑制した（図9、10）。また、SREBP-1cによって転写制御される脂質合成関連遺伝子（SCD-1、FAS、ACC1、2）もこれらの脂肪酸により下方制御することが示された（図11-14）。さらに細胞内トリアシルグリセロール量もまたT0901317によって増加したが（図15）、これらの脂肪酸が共存することにより、その上昇が有意に抑制された。SREBP-1cを制御している核内受容体LXRに対するアンタゴナイズ作用をルシフェラーゼアッセイにより調べたところ、これらの脂肪酸はT0901317の作用を有意に抑制し、LXRに対してアンタゴナイズすることが示された（図16）。
図８〜１６において、＊はP＜0.05を、＊＊はP＜0.001を、＊＊＊はP＜0.0001を示す（vs. T0901317添加・脂肪酸非添加）。
同様の手法で、αKetoA、γKetoA、sKetoA、KetoB、γKetoB、αKetoB、sKetoB、rKetoB、KetoC、γKetoC、αKetoC、sKetoC、KetoRA、αHYA、γHYA、sHYA、rHYA、HYB、αHYB、γHYB、sHYB、rHYB、RA、HYC、αHYC、γHYC、sHYCについてもSREBP-1c、成熟型および未成熟型のSREBP-1発現、SCD-1、FAS、ACC1、2、細胞内トリアシルグリセロール量、並びに、LXRに対するアンタゴナイズ作用をルシフェラーゼアッセイにより測定した。その結果、γHYA、γKetoA、αKetoA、HYB、rHYB、RA、rKetoBもLXRに対するアンタゴナイズ作用により、脂質合成抑制作用を示した。

以上の結果から、今回調べた脂肪酸の中でHYA及びKetoAは、LXRに対するアンタゴナイズ作用により、強い脂質合成抑制作用を有することが示された。同様に、γHYA、γKetoA、αKetoA、HYB、rHYB、RA、rKetoB等の希少脂肪酸も脂質合成抑制作用を有することが示された。

本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本出願は、2012年10月29日付で日本国に出願された特願2012-237933号を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。

本発明は、オキソ脂肪酸等の生理機能として、従来知られていない、脂質及び／又は糖及び／又はエネルギー代謝改善効果を有することを明らかにした。当該オキソ脂肪酸等を含む脂質及び／又は糖及び／又はエネルギー代謝改善剤は、医薬品、食品、飼料等様々な分野へ適用可能であり、本発明は産業上極めて有用である。

Claims (9)

10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、並びに／或いは、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸を含む、代謝改善剤。

肥満、糖尿病、脂質代謝異常、高脂血症、及び脂肪肝からなる群から選択される少なくとも１種の予防又は改善に使用される請求項１に記載の剤。

食品もしくは食品添加物である、請求項１に記載の剤。

医薬品である、請求項１に記載の剤。

飼料もしくは飼料添加物である、請求項１に記載の剤。

代謝改善剤の製造のための、10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、並びに／或いは、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸の使用。

10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、10-オキソオクタデカン酸、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸、12-オキソオクタデカン酸、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、12-オキソ-シス-9-オクタデカン酸、10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸、および10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸から成る群から選択される少なくとも1つの脂肪酸を含むPPARα活性化剤。

10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-12,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-オキソ-トランス-11-オクタデセン酸、10-オキソ-トランス-11,シス-15-オクタデカジエン酸、10-オキソ-シス-6,トランス-11-オクタデカジエン酸、12-オキソ-シス-9-オクタデカン酸、および10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸から成る群から選択される少なくとも1つの脂肪酸を含むPPARγ活性化剤。

10-オキソ-シス-12-オクタデセン酸、10-オキソ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、12-オキソオクタデカン酸、 10-ヒドロキシ-シス-12-オクタデセン酸、10-ヒドロキシ-シス-6,シス-12-オクタデカジエン酸、10-ヒドロキシオクタデカン酸、12-ヒドロキシオクタデカン酸、およびリシノール酸から成る群から選択される少なくとも1つの脂肪酸を含むLXR阻害剤。