JP6317354B2 - 血漿による胎児または腫瘍のメチロームの非侵襲的決定 - Google Patents
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Description
本開示は一般に、DNAのメチル化パターン(メチローム)の決定に関し、より詳しくは、別々のゲノムに由来(例えば胎児と母親にそれぞれ由来、または腫瘍と正常細胞にそれぞれ由来)するDNAの混合物を含む生物試料(例えば血漿)を解析して、少数のゲノムのメチル化パターン(メチローム)を決定することに関する。決定されたメチロームの使用についても記載する。
本願は、2013年6月3日出願の米国仮特許出願第61/830,571号「Tumor Detection In Plasma Using Methylation Status And Copy Number」と、2012年9月20日出願の米国仮特許出願第61/703,512号「Method Of Determining The Whole Genome DNA Methylation Status Of The Placenta By Massively Parallel Sequencing Of Maternal Plasma」の非仮出願でありその利益を主張する2013年3月15日出願の米国出願第13/842,209号「Non−Invasive Determination Of Methylome Of Fetus Or Tumor From Plasma」と、に対して優先権を主張するPCT出願であり、それらの全体はあらゆる目的のために参照によって本明細書に援用される。
胚および胎児の発生は複雑なプロセスであり、一連の高度に統制された遺伝的および後成的現象が関与している。がんの発生もまた、典型的に多重的な遺伝的および後成的過程が関与する複雑なプロセスである。発生プロセスの後成的制御における異常は、不妊症、自然流産、子宮内発育異常、および出生後経過に関係するとされる。DNAメチル化は、研究されることの最も多い後成的メカニズムのひとつである。DNAのメチル化は、CpGジヌクレオチドの間でシトシン残基の5’炭素にメチル基が付加されるという状況としてもっともよく起こる。シトシンメチル化は、遺伝子転写およびDNA機能に制御を一階層付加する。例えば、CpG島と称される、CpGジヌクレオチドの多い遺伝子プロモーターの高度メチル化は通常、遺伝子機能の抑制に関連づけられる。
数十年間の努力にもかかわらず、胎児または腫瘍のメチロームを研究するためおよび、妊娠中または悪性腫瘍等の疾患経過中を通して動的変化を監視するために、利用可能な実用的手段が何もなかった。したがって、胎児のメチロームおよび腫瘍のメチロームの全てまたは部分を非浸潤的に解析する方法を提供することが望まれている。
「メチローム」は、ゲノム内の複数の部位または遺伝子座におけるDNAメチル化量の尺度を与える。メチロームは、ゲノム全体、ゲノムの相当な部分、またはゲノムの比較的小さな部分に該当し得る。「胎児メチローム」は、妊娠女性の胎児のメチロームに該当する。胎児メチロームは、種々の胎児組織または胎児DNAの供給源、例えば、胎盤組織および母体血漿中の無細胞胎児DNAを用いて、決定することができる。「腫瘍メチローム」は、生物(例えば、ヒト)の腫瘍のメチロームに該当する。腫瘍メチロームは、腫瘍組織または母体血漿中の無細胞腫瘍DNAを用いて決定することができる。胎児メチロームおよび腫瘍メチロームは、目的のメチロームの例である。目的のメチロームの他の例は、体液(例えば、血漿、血清、汗、唾液、尿、生殖器分泌物、精液、便液(stools fluid)、下痢液(diarrheal fluid)、脳脊髄液、胃腸管分泌物、膵臓分泌物、腸分泌物、痰、涙、乳房からの吸引液および甲状腺等)にDNAを与え得る臓器のメチローム(例えば、脳細胞、骨、肺、心臓、筋肉および腎臓等のメチローム)である。臓器は移植された臓器であってもよい。
エピジェネティック機構は、胚発生および胎児発生において重要な役割を担う。しかし、ヒトの胚および胎児組織(胎盤組織を含む)は容易に利用できるものではない(米国特許第6,927,028号)。ある特定の実施形態は、母体循環系に存在する無細胞胎児DNA分子を含有する試料を分析することにより、この問題に取り組んだ。胎児メチロームは様々な方法で推定することができる。例えば、母体血漿メチロームは細胞メチローム(母親の血液細胞からの)と比較することができ、その差異は胎児メチロームと相関することが示されている。別の例として、胎児特異的対立遺伝子を用いることで、特定の遺伝子座での胎児メチロームのメチル化決定することができる。さらに、サイズおよびメチル化率間の相関が示されているため、断片のサイズはメチル化率の指標として用いることができる。
胎盤メチロームを調べるために無数のアプローチが用いられているが、それぞれのアプローチには限界がある。例えば、亜硫酸水素ナトリウムは、非メチル化シトシン残基をウラシルに変化させ、メチル化シトシンを変化させない化学薬品であるが、これは、シトシンメチル化における差異を、さらなる照合のための遺伝子配列差異へと変換する。シトシンメチル化を研究するゴールドスタンダードな方法は、組織DNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、その後、亜硫酸水素塩によって変換されたDNA分子の個々のクローンを直接配列決定することに基づいている。DNA分子の複数のクローンを解析した後、CpG部位あたりのシトシンメチル化のパターンおよび量的特性を得ることができる。しかし、クローニング化亜硫酸水素塩配列決定は、ゲノムワイドな規模に容易に応用することができない、ロースループットで非常に手間のかかる手順である。
ある特定の実施形態は、上記の問題を克服することが可能であり、胎児メチロームの照合を包括的、非侵襲、且つ連続的に可能にする。一実施形態では、妊娠女性の血行中に存在する無細胞胎児DNA分子を分析するために、ゲノムワイド亜硫酸水素塩配列決定が用いられた。血漿DNA分子が少量で断片化されていることから、母体血漿から高分解能胎児メチロームを構築することで、妊娠の進行に伴う変化を連続的に観察することができた。非侵襲的出生前検査(noninvasive prenatal testing:NIPT)への強い関心を考慮して、実施形態は、胎児生物マーカーを発見するための強力な新規の手段を提供する、または、胎児関連疾患もしくは妊娠関連疾患のNIPTを達成するための直接的なプラットフォームとして役立つことができる。胎児メチロームを得ることができる、種々の試料のゲノムワイド亜硫酸水素塩配列決定から得られたデータが、以下に提供される。一実施形態では、この科学技術は、子癇前症、または子宮内胎児発育遅延、または早産と合併した妊娠におけるメチル化プロファイリングに応用され得る。そのような合併妊娠において、この科学技術は、モニタリングおよび/または予後判定および/または治療に対する応答を可能にするために、その非浸潤的な性質から、連続的に用いることができる。
上記のように、メチル化プロファイリングは、亜硫酸水素塩によって変換された血漿DNAの大規模並列配列決定(MPS)を用いて実行することができる。亜硫酸水素塩によって変換された血漿DNAのMPSは、ランダムまたはショットガン様式で実行することができる。配列決定の深度は、目的の領域のサイズに応じて変動し得る。
いくつかの実施形態は、全ゲノム亜硫酸水素塩 配列決定を用いて、血漿DNAのメチル化特性を決定することができる。胎児のメチル化特性は、以下に記載される通りに母体血漿DNA試料を配列決定することによって決定することができる。従って、胎児DNA分子(および胎児メチローム)は、妊娠期間中に非侵襲的にアクセス可能であり、妊娠が進行するにつれて、変化が連続的にモニタリングされた。配列決定データの包括性のために、単一ヌクレオチド分解能において、ゲノムワイドな規模で母体血漿メチロームを研究することができた。
DNA分子は、低濃度で、断片化された形態で、典型的には、モノヌクレオソーム単位に類似した長さで、ヒト血漿中に存在する(YMD Lo et al. 2010 Sci Transl Med; 2: 61ra91; and YW Zheng at al. 2012 Clin Chem; 58: 549-558)。これらの制限にもかかわらず、ゲノムワイド亜硫酸水素塩配列決定パイプラインは、血漿DNA分子のメチル化を解析することが可能であった。さらに別の実施形態では、選択された単一分子配列決定プラットフォームは、DNA分子のメチル化状態を亜硫酸水素塩変換無しに直接的に解明できるようにすることから(BA Flusberg et al. 2010 Nat Methods; 7: 461-465; J Shim et al. 2013 Sci Rep; 3:1389. doi: 10.1038/srep01389)、そのようなプラットフォームの使用は、亜硫酸水素塩によって変換されていない血漿DNAを、血漿DNAのメチル化レベルを測定するため、または血漿メチロームを測定するために用いることを可能にする。そのようなプラットフォームは、異なる形態のメチル化の異なる生物学的機能に関連した、結果の改善(例えば、感度または特異度の改善)をもたらし得る、N6−メチルアデニン、5−メチルシトシン、および5−ヒロドキシメチルシトシンを検出することができる。そのような結果の改善は、実施形態を特定の障害(例えば子癇前症)または特定のがん型の検出またはモニタリングに適用する場合に有用であり得る。
大規模並列亜硫酸水素塩配列決定を用いて胎盤メチロームを研究した。さらに、ヒトゲノムにおける約480,000のCpG部位を網羅したオリゴヌクレオチドアレイプラットフォーム(イルミナ社)を用いて、胎盤メチロームを研究した(M Kulis et al. 2012 Nat Genet; 44: 1236-1242;およびC Clark et al. 2012 PLoS One; 7: e50233)。ビーズチップベースの遺伝子型同定およびメチル化解析を用いる一実施形態では、イルミナ社製HumanOmni2.5−8遺伝子型同定アレイを用い、製造業者のプロトコルに従って、遺伝子型同定を行った。遺伝子型は、Genome Studio Software(イルミナ社)のGenCallアルゴリズムを用いてコール(call)した。コールレイト(call rate)は99%超であった。マイクロアレイに基づくメチル化解析において、ゲノムDNA(500〜800ng)を、イルミナ社製Infinium Methylationアッセイ用に、製造業者の推奨に従って、Zymo EZ DNAメチル化キット(ジモ・リサーチ社(Zymo Research)、米国カリフォルニア州オレンジ)を用いて、亜硫酸水素ナトリウムで処理した。
図3Aおよび図3Bは、成人男性および非妊娠成人女性から採取された血漿および血液細胞における、メチル化されたCpG部位の割合の棒グラフを示している:(A)常染色体、(B)X染色体。図表は、男性および非妊娠女性の血漿メチロームおよび血液メチローム間の類似性を示している。男性および非妊娠女性の血漿試料におけるメチル化されたCpG部位の全体的な割合は、対応する血液細胞DNAとほぼ同じであった(表100並びに図2Aおよび図2B)。
次に、メチル化レベルを決定するために、母体血漿DNA、母体血細胞、および胎盤組織のDNAメチル化レベルを調べた。反復領域、非反復領域、および全域におけるレベルを決定した。
実施形態によって、同一のプラットフォームを用いて胎盤組織、血液細胞および血漿のメチロームを決定することができる。従って、それらの生物試料型のメチロームの直接比較が可能であった。男性および非妊娠女性における血液細胞および血漿のメチローム間、並びに母体血細胞および出産後母体血漿試料間の高レベルの類似によって、造血細胞がヒト血漿におけるDNAの主な供給源であることがさらに確認された(YW Zheng at al. 2012 Clin Chem; 58: 549-558)。
実施形態は、血漿DNAのMPS解析を通じて、DNAメチロームを構築することに成功している。母体血漿から胎盤メチロームまたは胎児メチロームを決定する能力は、子癇前症、子宮内胎児発育遅延、早産等の妊娠関連状態と関連する異常なメチル化特性を決定、検出およびモニタリングするための非浸潤的方法を提供する。例えば、疾患特異的な異常なメチル化サインの検出は、そのような妊娠関連状態の検診、診断およびモニタリングを可能にする。母体血漿メチル化レベルの測定は、そのような妊娠関連状態の検診、診断およびモニタリングを可能にする。妊娠関連状態の研究への直接適用に加えて、前期アプローチは、血漿DNA解析を目的とした他の医学領域に応用することができる。例えば、がんのメチロームは、がん患者の血漿DNAから決定することができる。本明細書に記載される、血漿からのがんメチローム解析は、血漿からのがんゲノム解析に対して相乗的な科学技術になり得る(KCA Chan at al. 2013 Clin Chem; 59: 211-224およびRJ Leary et al. 2012 Sci Transl Med; 4:162ra154)。
上記のように、非妊娠健常人において、血漿メチロームは血液メチロームに一致する。しかし、妊娠女性においては、これらのメチロームは異なる。胎児DNA分子が、大部分の母体DNAバックグラウンドの中、母体血漿内を循環している(YMD Lo et al. 1998 Am J Hum Genet; 62: 768-775)。それ故、妊娠女性において、血漿メチロームは、大部分は胎盤メチロームおよび血液メチロームの混成である。従って、血漿から胎盤メチロームを抽出することができる。
一方の対立遺伝子(B)の量がもう一方の対立遺伝子(A)の量よりも有意に少ない、2つの異なる対立遺伝子を有する遺伝子座を、生物試料の配列決定の結果から特定した。B対立遺伝子を被覆するリードは胎児特異的(胎児特異的リード)と見なした。母親はAについてホモ接合性であり、胎児はA/Bについてヘテロ接合性であることが決定されたことから、A対立遺伝子を被覆するリードは母親および胎児によって共有されていた(共有リード)。
一実施形態において、母体血漿から胎児メチロームを構築するため、少なくとも1つの有益な胎児SNP部位を被覆し、同一リード内に少なくとも1つのCpG部位を含有する配列リードを選別した。胎児特異的対立遺伝子を示したリードは、胎児メチロームの構築に含まれた。共有対立遺伝子(すなわち非胎児特異的対立遺伝子)を示したリードは、母体由来DNA分子から主に成る非胎児特異的メチロームの構築に含まれた。
上記の手法を用いることで、腫瘍メチル化特性を決定することもできる。胎児および腫瘍のメチル化特性を決定する方法を以下に記載する。
上記において、血漿由来の胎児特異的リードが胎盤メチロームと相関することが示された。母体血漿メチロームの母体成分は主に血液細胞によって与えられるため、血漿メチロームおよび血液メチローム間の差異を用いることで、胎児特異的対立遺伝子の位置だけでなく、全ての遺伝子座の胎盤メチロームを決定することができる。血漿メチロームおよび血液メチローム間の差異を用いることで、腫瘍のメチロームを決定することもできる。
図10は、本発明の実施形態に従って、生物の生物試料から第一メチル化特性を決定する方法1000を示す、フローチャートである。生物試料(例えば、血漿)には、第一組織由来および第二組織由来の無細胞DNAの混合物を含む無細胞DNAが含まれる。第一メチル化特性は、第一組織(例えば、胎児組織または腫瘍組織)のメチル化特性に対応する。方法1200は、母体血漿由来の示差的にメチル化された領域の推論を可能にし得る。
第一期予測値=D×1.6+0.2
第三期予測値=D×1.2+0.05
上記のように、方法1000を用いることで、母体血漿から胎盤のメチル化状況を推定することができる。血漿中の循環DNAは、主に造血細胞に由来する。なお、未知の他の内部臓器から与えられる無細胞DNAの割合は未知である。さらに、胎盤由来無細胞DNAは、母体血漿中の全DNAのおよそ5〜40%を占め、平均値はおよそ15%である。従って、母体血漿中のメチル化レベルは、上記のように、既存のバックグラウンドのメチル化+妊娠中の胎盤の寄与に等しいと仮定することができる。
一実施形態では、第一組織由来の胎児DNAの割合は、男児胎児のY染色体を用いることができる。母体血漿試料中のY染色体配列の割合(Y染色体率)は、男児胎児由来のY染色体リードおよびY染色体に誤整列した母体(女性)リードの数の混成であった(RWK Chiu et al. 2011 BMJ; 342: c7401)。従って、試料中のY染色体率および胎児DNA濃度分率(f)間の関連性は、以下で与えられ得、
胎盤ゲノムは母体ゲノムよりもより低メチル化状態である。前述の通り、妊娠女性の血漿のメチル化は、母体血漿中の胎盤由来胎児DNAの濃度分率に依存する。従って、染色体領域のメチル化密度の解析を通じて、胎児組織の母体血漿への寄与における差異を検出することが可能である。例えば、トリソミー胎児(例えば、トリソミー21またはトリソミー18またはトリソミー13を抱える胎児)を身籠っている妊娠女性において、胎児は、二染色体性染色体と比較した場合に、三染色体性染色体から母体血漿にさらなる量のDNAを与える。この状況において、三染色体性染色体(または増幅を有するあらゆる染色体領域)の血漿メチル化密度は、二染色体性染色体のそれよりもより低くなる。差異の程度は、血漿試料中の胎児DNA濃度分率を考慮することにより、数学的計算によって予測することができる。血漿試料中の胎児DNA濃度分率が高くなるほどに三染色体性染色体および二染色体性染色体間のメチル化密度における差異はより大きなものになる。欠失を有する領域については、メチル化密度はより高くなる。
例えば、下記式は、メチル化密度を正規化するために適用することができ、
上記で言及したように、胎児ゲノムのある特定の部分は、母体ゲノムと異なるようにメチル化されている。これらの差異は妊娠全体にわたって一般的であり得る。異なるメチル化の領域は、胎児由来のDNA断片を特定するために用いることができる。
胎盤は組織特異的なメチル化サインを有する。胎児特異的DNAメチル化マーカーは、胎盤組織および母体血細胞間で示差的にメチル化された遺伝子座に基づいて、母体血漿検出のために、および非浸潤的出生前診断適用のために、開発された(SSC Chim et al. 2008 Clin Chem; 54: 500-511; EA Papageorgiou et al 2009 Am J Pathol; 174: 1609-1618;およびT Chu et al. 2011 PLoS One; 6: e14723)。そのような示差的にメチル化された領域(DMR)をゲノムワイドに探索する実施形態が提供される。
試料の胎児DNA濃度分率も既存であるならば、胎盤組織DMRを母体血漿DNAの亜硫酸水素塩配列決定データから直接的に特定できるはずである。胎盤は母体血漿中の胎児DNAの主な供給源であり得るため(SSC Chim et al. 2005 Proc Natl Acad Sci USA 102, 14753-14758)、本研究において、母体血漿中の胎児特異的DNAのメチル化状態が胎盤メチロームと相関することが示された。
CVSにおけるメチル化CpGの全割合は55%であり、一方、妊娠末期胎盤におけるメチル化CpGの全割合は59%であった(図1の表100)。より低メチル化状態のDMRは妊娠末期胎盤よりもCVSから特定され得たが、高度メチル化DMRの数はそれら2つの組織において同様であった。従って、CVSが妊娠末期胎盤よりもより低メチル化状態であることは明らかであった。この妊娠性傾向は母体血漿データにおいても明白であった。胎児特異的リード間のメチル化CpGの割合は、第一期母体血漿においては47.0%であったが、第三期母体血漿においては53.3%であった。確認された高度メチル化遺伝子座の数は、第一(1,457遺伝子座)および第三期(1,279遺伝子座)母体血漿試料において同様であったが、第三期試料(12,677遺伝子座)よりも第一試料(21,812遺伝子座)において実質的により多くの低メチル化遺伝子座が存在した(図16の表1600)。
示差的にメチル化されたマーカー、またはDMRは、いくつかの態様において有用である。母体血漿中のそのようなマーカーの存在により、胎児DNAまたは胎盤DNAの存在が示され、確認される。この確認は、非侵襲的出生前検査の精度管理として用いることができる。DMRは、母体血漿中の一般的な胎児DNAマーカーとして役立ち、遺伝子多型に基づくマーカーまたはY染色体に基づくマーカー等の母親および胎児の間の遺伝子型の差異に依存するマーカーに優る利点を有し得る。DMRは、あらゆる妊娠に有用な一般的な胎児マーカーである。遺伝子多型に基づくマーカーは、胎児がその父親から該マーカーを受け継いでおり、その母親がそのゲノム内に該マーカーを保有していない、一部の妊娠にのみ適用可能である。さらに、それらのDMRに由来するDNA分子を定量化することによって、母体血漿試料中の胎児DNA濃度を測定することができる。正常妊娠に期待されるDMRの特性を知ることで、母体血漿DMR特性またはメチル化特性の、正常妊娠に期待される該特性からの逸脱を観察することによって、妊娠関連合併症、特に胎盤組織変化を伴う妊娠関連合併症を、検出することができる。胎盤組織変化を伴う妊娠関連合併症としては、限定はされないが、胎児染色体異数性が挙げられる。例として、21トリソミー、子癇前症、子宮内胎児発育遅延および早産が挙げられる。
実施形態は、本明細書に記載の方法および他の適用可能な方法を実行するための組成物およびキットを提供し得る。キットは、胎児DNA(例えば、母体血漿中の無細胞胎児DNA)を分析するアッセイを実行するために用いることができる。一実施形態では、キットは、本明細書で同定される一つまたは複数の遺伝子座との特異的なハイブリダイゼーションに有用な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含み得る。キットは、一つまたは複数の参照遺伝子座との特異的なハイブリダイゼーションに有用な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドも含み得る。一実施形態では、胎盤高度メチル化マーカーが測定される。検査座位は母体血漿中のメチル化DNAであり得、参照座位は母体血漿中のメチル化DNAであり得る。血漿中の腫瘍DNAを分析するために類似のキットを構成することができる。
血漿DNA分子は、短い分子の形態で循環血液中に存在することが知られており、大部分の分子は約160bpの長さを有している(YMD Lo et al. 2010 Sci Transl Med; 2: 61ra91, YW Zheng at al. 2012 Clin Chem; 58: 549-558)。興味深いことに、我々のデータは、血漿DNA分子のメチル化状態およびサイズの間の関連性を明らかにした。このように、血漿DNA断片長はDNAメチル化レベルと関連している。血漿DNA分子の特徴的なサイズ特性は、大部分が、アポトーシス中の酵素的分解から生じ得るモノヌクレオソームと関連があることを示唆している。
図17Aは、母体血漿DNA、非妊娠女性対照血漿DNA、胎盤DNAおよび末梢血DNAのサイズ分布を示す、プロット1700である。母体試料および非妊娠女性対照血漿において、これら2つの亜硫酸水素塩処理血漿試料は、最も豊富な166〜167bp長の全体配列および143bpよりも短いDNA分子の10bpの周期性(periodicity)を有する、先に報告された(YMD Lo et al. 2010 Sci Transl Med; 2: 61ra91)ものと同じ特徴的なサイズ分布を示した。
従って、サイズ分布を用いることで、血漿試料の全体メチル化率を推定することができる。このメチル化測定値は次に、妊娠中、がんのモニタリング中、または図18Aおよび図18Bに示される関連性による、血漿DNAのサイズ分布の連続測定による処理中に、追跡することができる。メチル化測定値は、目的の臓器または組織からのDNA放出の増加または減少を探すことにも用いることができる。例えば、特定の臓器(例えば肝臓)に特有のDNAメチル化サインを具体的に探して、血漿中のこれらのサインの濃度を測定することができる。DNAは細胞が死ぬ際に血漿中に放出されるため、レベルの増加は、その特定の臓器または組織における細胞死または細胞傷害の増加を意味し得る。特定の臓器からのレベルの減少は、その臓器における傷害または病理過程に対抗する処置が制御下にあることを意味し得る。
母体血漿中の母親と同じ遺伝子型を共有するが異なるエピジェネティックサインを有する胎児由来DNA分子は、検出が可能である(LLM Poon et al. 2002 Clin Chem; 48: 35-41)。配列決定アプローチが母体血漿中の胎児由来DNA分子の捕捉において感度が高いことを示すために、同じ戦略を、母体血漿試料中の刷り込み胎児対立遺伝子の検出に適用した。2つのゲノム刷り込み領域が特定された:H19(11番染色体:1,977,419〜1,977,821、NCBI Build36/hg18)およびMEST(7番染色体:129,917,976〜129,920,347、NCBI Build36/hg18)。それらは共に、母体配列および胎児配列を区別するための有益なSNPを含有している。母体で発現される遺伝子であるH19に関して、領域内のSNP rs2071094(11番染色体:1,977,740)について、母親はホモ接合性(A/A)であり、胎児はヘテロ接合性(A/C)であった。A母体対立遺伝子の一方は充分にメチル化されており、他方は非メチル化状態であった。しかし、胎盤においては、対立遺伝子Aは非メチル化状態であったが、一方、父親から遺伝したC対立遺伝子は充分にメチル化されていた。胎盤由来の刷り込まれた父性対立遺伝子に対応するC遺伝子型を有する2つのメチル化リードを母体血漿中で検出した。
いくつかの実施形態は、循環血漿/血清DNAのメチル化解析を用いたがんの検出、検診、モニタリング(例えば、再発、軽快、または治療に対する応答(例えば、存在または不在)の)、病期分類、分類(例えば、最も適切な治療法の選択を助けるための)および予後判定に、用いることができる。
血漿中の腫瘍由来DNA分子のサイズはまた、モノヌクレオソーム単位のサイズに似ており、がん患者の血漿中に同時に存在しているバックグラウンド非腫瘍由来DNA分子よりも短い。サイズパラメーターは、米国特許出願公開第13/789,553号(あらゆる目的で参照によって組み込まれる)に記載されているように、がんと関連があることが示されている。
この例において、肝細胞癌(HCC)患者の血漿および組織試料を解析した。腫瘍の外科的切除の前、およびその1週間後にHCC患者から血液試料を採取した。血液試料の遠心分離後に血漿および軟膜を収集した。切除腫瘍および隣接非腫瘍性肝組織を採取した。血漿および組織試料から抽出したDNA試料を、事前の亜硫酸水素塩処理有りおよび無しの大規模並列配列決定を用いて解析した。がんを有さない4人の健常人から得られた血漿DNAも、対照として解析した。DNA試料の亜硫酸水素塩処理により、非メチル化シトシン残基はウラシルに変換される。下流のポリメラーゼ連鎖反応および配列決定において、これらのウラシル残基はチミジンとして振る舞う。一方、亜硫酸水素塩処理によってメチル化シトシン残基がウラシルに変換されない。大規模並列配列決定の後、配列決定リードをMethy−Pipeを用いて解析して(P Jiang, et al. Methy-Pipe: An integrated bioinformatics data analysis pipeline for whole genome methylome analysis, paper presented at the IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine Workshops, Hong Kong, 18 to 21 December 2010)、全てのCGジヌクレオチド位置(すなわち、CpG部位)におけるシトシン残基のメチル化状態を決定した。
2100に示されるように、手術前血漿DNAのメチル化密度は、がん患者における非悪性組織のメチル化密度よりも低かった。これは、低メチル化状態であった腫瘍組織由来DNAの存在が原因であり得る。このより低い血漿DNAメチル化密度は、潜在的に、がんの検出用およびモニタリング用の生物マーカーとして用いることができる。がんのモニタリングにおいて、がんが進行中である場合、血漿中のがん由来DNAの量の経時的な増加が起こる。この例において、血漿中の循環がん由来DNAの量の増加は、ゲノムワイドなレベルでの血漿DNAメチル化密度におけるさらなる減少に繋がる。
図28は、本発明の実施形態に従って、生物の生物試料を解析してがんのレベルの分類を決定する、方法2800のフローチャートである。生物試料は、正常細胞由来のDNA含み、がんと関連する細胞由来のDNAを潜在的に含み得る。DNAの少なくとも一部は、生物試料中で無細胞DNAであり得る。
血漿DNAのメチル化レベルを用いてがんを検出するアプローチの感度を測定する1つの方法は、対照の血漿DNAメチル化レベルと比較した場合の血漿DNAメチル化レベルにおける変化を明らかにするのに必要な、最小の腫瘍由来DNA濃度分率と関連している。検査感度は、健常対照群または血液細胞DNAにおける腫瘍組織およびベースライン血漿DNAメチル化レベル間のDNAメチル化における差異の程度にも依存している。血液細胞は、健常人の血漿中のDNAの主な供給源である。差異が大きいほど、がん患者は非がん性個体からより容易に区別され得、血漿中の腫瘍由来物のより低い検出限界およびがん患者を検出する際のより高い臨床的感度として反映されるだろう。さらに、健常対象または異なる年齢の対象における血漿DNAメチル化の変動(G Hannum et al. 2013 Mol Cell; 49: 359-367)も、がんの存在と関連するメチル化変化を検出する感度に影響するだろう。健常対象における血漿DNAメチル化の変動が小さいほど、少量のがん由来DNAの存在によって引き起こされる変化の検出はより容易になるだろう。
本明細書に記載のメチル化解析アプローチは、血漿中の腫瘍由来DNAの遺伝子変化に基づく他の方法と併用して用いることができる。そのような方法の例には、がん関連染色体異常(KCA Chan et al. 2013 Clin Chem; 59:211-224; RJ Leary et al. 2012 Sci Transl Med; 4:162ra154)および血漿におけるがん関連単一ヌクレオチド変異(KCA Chan et al. 2013 Clin Chem; 59:211-224)の解析が含まれる。メチル化解析アプローチにはそれらの遺伝学的アプローチに優る利点が存在する。
腫瘍由来細胞は隣接臓器または遠隔臓器に浸潤および転移する。浸潤された組織または転移巣は、細胞死の結果としてDNAを血漿中に供給する。がん患者の血漿中のDNAのメチル化特性を解析し、組織特異的メチル化サインの存在を検出することにより、疾患経過に関与する組織型を検出することができる。このアプローチは、がん過程に関与する組織の非浸潤性解剖学的走査を提供することで、原発部位および転移部位として関わる臓器の特定に役立つ。また、血漿中の病変臓器のメチル化サインの相対濃度をモニタリングすることにより、それらの臓器の腫瘍量を評価し、その臓器におけるがん過程が増悪中であるまたは改善中であるまたは治癒が完了しているかどうかを決定することが可能となる。例えば、遺伝子Xが肝臓において特異的にメチル化されているとする。その場合、がん(例えば、結腸直腸がん)によるその肝臓の転移性関与は、血漿中の遺伝子X由来のメチル化配列の濃度を増加させると予想される。遺伝子Xと似たメチル化特徴を有する別の配列または配列群も存在するだろう。その場合、そのような配列から得られた結果を組み合わせることができる。同様の考察が、他の組織、例えば、脳、骨、肺および腎臓等に適用可能である。
上記およびLun et al(FMF Lun et al. Clin. Chem. 2013; doi:10.1373/clinchem.2013.212274)に記載されているように、メチル化密度(例えば、血漿DNAのメチル化密度)はDNA断片のサイズと相関している。より短い血漿DNA断片のメチル化密度の分布は、より長い断片のメチル化密度よりも有意により低かった。血漿DNAの異常な断片化パターンを有するいくつかの非がん性状態(例えば、全身性エリテマトーデス(SLE))が、より低メチル化状態であるより大量の短い血漿DNA断片の存在により、見かけの血漿DNA低メチル化を示し得ることを提唱する。言い換えれば、血漿DNAのサイズ分布は、血漿DNAのメチル化密度の交絡因子であり得る。
全体的な低メチル化に加えて、CG島の高度メチル化が、がんにおいて共通して観察される(SSB Baylin et al. 2011 Nat Rev Cancer; 11: 726-734; PA Jones et al. 2007, Cell; 128: 683-692; M Esteller et al. 2007 Nat Rev Genet 2007; 8: 286-298; M Ehrlich et al. 2002 Oncogene 2002; 21: 5400-5413)。このセクションでは、がんを検出およびモニタリングするためのCG島高度メチル化のゲノムワイド解析の使用について記載する。
i. 参照群(例えば健常対象)におけるCG島の平均メチル化密度が5%未満
ii. 参照群(例えば健常対象)の血漿におけるメチル化密度の解析の変動係数が30%未満。これらのパラメーターは特定の適用のために調整され得る。我々のデータセットから、ゲノム内の454のCG島がこれらの判定基準を満たした。
i. そのメチル化密度が参照群の平均値よりも2%より高く、
ii. Zmethが3より大きい。
また、これらのパラメーターは特定の適用のために調整され得る。
上記のように、本明細書に記載のメチル化解析アプローチは、血漿中の腫瘍由来DNAの遺伝子変化に基づく他の方法と併用して用いられ得る。そのような方法の例には、がん関連染色体異常の解析が含まれる(KCA Chan et al. 2013 Clin Chem; 59: 211-224; RJ Leary et al. 2012 Sci Transl Med; 4: 162ra154)。コピー数異常(CNA)の側面は、米国特許出願公開第13/308,473号に記載されている。
コピー数異常は、ゲノムの特定部分に整列するDNA断片を計数し、その計数を正規化し、その計数ををカットオフ値と比較することにより検出され得る。種々の実施形態において、正規化は、ゲノムの同一部分の別のハプロタイプに整列したDNA断片の計数によって(相対ハプロタイプ適用量(relative haplotype dosage:RHDO))またはゲノムの別の部分に整列したDNA断片の計数によって、行われ得る。
ゲノムワイドな低メチル化およびCNAは、腫瘍組織において頻繁に観察され得る。ここで、CNAおよびがん関連メチル化変化の情報が血漿DNAの亜硫酸水素塩配列決定から同時に得られ得ることを示す。それら2つのタイプの解析は同じデータセットに対して実行することができるため、CNA解析のための追加のコストは実質的に存在しない。他の実施形態では、メチル化情報および遺伝情報を得るために異なる手順が用いられ得る。他の実施形態では、CNA解析と組み合わせて、がん関連高度メチル化に対する同様の解析が行われ得る。
上記のように、CNAの解析は各1Mb領域内の配列リードの数の計数を含み得るが、一方、メチル化密度の解析は、メチル化されているCpGジヌクレオチドにおけるシトシン残基の割合の検出が含まれ得る。これら2つの解析の組み合わせは、がんの検出において相乗的な情報を与え得る。例えば、メチル化分類およびCNA分類が用いられることで、がんのレベルの第三の分類が決定され得る。
血漿におけるがん関連CNAおよび/またはメチル化変化の存在は、がん患者の循環血液中の腫瘍由来DNAの存在を示す。これらのがん関連変化の減少または排除が、処置(例えば、外科手術)後に期待される。一方、処置後における血漿中のこれらの変化の持続は、身体からの全腫瘍細胞の不完全な除去を示し得、疾患再発の有用な予後判定因子となり得る。
CNAおよびメチル化解析における異なる数の配列リードおよび異なる数のビンサイズの診断能が以下に記載される。
一実施形態に従って、32人の健常対照患者、26人の肝細胞癌を有する患者および他のがん型(例えば、上咽頭癌、乳がん、肺がん、神経内分泌がんおよび平滑筋肉腫)を有する20人の患者の、血漿DNAが解析された。32人中22人の健常対象が参照群として無作為に選択された。これら22人の参照個体の平均値および標準偏差(SD)が、メチル化密度およびゲノム表現(genomic representation)の正常範囲を決定するために用いられた。各個体の血漿試料から抽出されたDNAが、イルミナ社製ペアエンド配列決定キットを用いる配列決定ライブラリー(sequencing library)構築のために用いられた。配列決定ライブラリーは次に、非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩処理を受けた。各血漿試料の亜硫酸水素塩処理された配列決定ライブラリーは、イルミナ社製HiSeq2000配列決定装置の1レーンを用いて配列決定された。
ゲノムの1Mbビンへの分割の他に、より小さなビンサイズが使用可能であるかどうかも調べられた。理論上は、より小さなビンの使用は、ビン内のメチル化密度における変動性を減少させ得る。これは、メチル化密度が異なるゲノム領域間で大きく異なり得るためである。ビンがより大きい場合、異なるメチル化密度を有する領域を含む確率は増加するため、ビンのメチル化密度における変動性の全体的な増加に繋がる。
メチル化およびCNAの領域の量は、様々な値であり得る。上記例により、試料ががんと関連しているかどうかを分類するためのパラメーターとしての、カットオフ値を超過する領域の数、または有意な低メチル化もしくはCNAを示した領域の割合が説明された。そのようなアプローチは、個々のビンにおける異常の規模を考慮していない。例えば、−3.5のZmethを有するビンと、−30のZmethを有するビンは、共に有意な低メチル化を有すると分類されるため、同一である。しかし、血漿中の低メチル化変化の程度(すなわち、Zmeth値の規模)は、試料中のがん関連DNAの量によって影響され、そのため、異常を示すビンの割合の情報を補足して、腫瘍量を反映し得る。血漿試料中の腫瘍DNAのより高い濃度分率は、より低いメチル化密度をもたらし、これはより低いZmeth値に換算される。
異常の規模から得られる情報を利用するため、累積確立(CP)スコアと称されるアプローチが開発される。正規分布確率関数に基づいて、各Zmeth値が、そのような観察が偶然に得られる確率に換算された。
連続試料が、処置の前および後にHCC患者TBR34から採取された。これらの試料は、全体的な低メチル化について解析された。
がんのレベルの各分類を決定するためのCNAおよびメチル化の使用(ここで、これらの分類は組み合わされることで第三の分類を与える)が、上に記載された。そのような組み合わせに加え、CNAは、メチル化解析におけるカットオフ値を変化させるために、および異なるCNA特徴を有する領域群のメチル化レベルを比較することにより偽陽性を特定するために、用いられ得る。例えば、過剰なメチル化レベル(例えば、3超のZCNA)は、正常な存在量のメチル化レベル(例えば、−3<ZCNA<3)と比較され得る。まず、メチル化レベルに対するCNAの影響が記載される。
腫瘍組織は概して全体的な低メチル化を示すため、がん患者の血漿中の腫瘍由来DNAの存在は、非がん対象と比較した場合、メチル化密度の減少をもたらす。がん患者の血漿中の低メチル化の程度は、理論上は、血漿試料中の腫瘍由来DNAの濃度分率に比例する。
上記のように、腫瘍組織におけるコピー数異常を有する領域において血漿メチル化密度が変化することが示された。腫瘍組織におけるコピー数増加を有する領域において、血漿への低メチル化腫瘍DNAの寄与の増加は、コピー数異常を有さない領域と比較して、血漿DNAのより大きな程度の低メチル化をもたらす。逆に、腫瘍組織におけるコピー数減少を有する領域において、血漿への低メチル化がん由来DNAの寄与の減少は、血漿DNAのより低度の低メチル化をもたらす。血漿DNAのメチル化密度および相対的な提示の間のこの関連性は、潜在的に、がん関連DNAの存在に伴う低メチル化の結果と、血漿DNA中の低メチル化の他の非癌性の原因(例えば、SLE)とを区別するために、用いられ得る。
生物ががんを有するかどうかを決定することに加えて、実施形態では、試料と関連するがん型が特定され得る。このがん型の特定では、全体的な低メチル化、CG島高度メチル化、および/またはCNAのパターンが用いられ得る。前記パターンには、測定された領域メチル化レベル、領域の各CNA値、およびCG島のメチル化レベルを用いた既知の診断を有する患者のクラスタリングが含まれ得る。下記の結果は、類似のがん型を有する生物が、領域およびCG島において類似の値を有すること、並びに非がん患者が類似の値を有することを示している。クラスタリングにおいて、領域または島におけるこれらの値のそれぞれは、クラスタリング過程において、別々の次元であり得る。
A. 亜硫酸水素塩処理DNAライブラリーの作製および配列決定
0.5%(w/w)非メチル化λDNA(プロメガ社)を加えられたゲノムDNA(5μg)を、Covaris S220 System(コバリス社(Covaris))でおよそ200bp長に断片化した。メチル化されたアダプター(イルミナ社)をDNA断片にライゲーションした以外は製造業者の取扱説明書に従い、Paired−End Sequencing Sample Preparation Kit(イルミナ社)を用いて、DNAライブラリーを作製した。AMPure XP磁気ビーズ(ベックマン・コールター社)を用いた2回の精製の後、ライゲーション産物を2つの部分に分割し、その一方を、EpiTect Bisulfite Kit(キアゲン社)を用いる2回の亜硫酸水素塩修飾にかけた。インサート内のCpG部位における非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンはそのままにした。亜硫酸水素ナトリウムで処理された、または処理されていないアダプター連結DNA分子を、以下のレシピを用いて10サイクルのPCRで富化した:50μlの反応液中の2.5UのPfuTurboCxホットスタートDNAポリメラーゼ(アジレント・テクノロジー社)、1×PfuTurboCx反応緩衝液、25μMのdNTP、1μlのPCR Primer PE 1.0および1μlのPCR Primer PE 2.0(イルミナ社)。熱サイクルプロファイルは、95℃を2分間、98℃を30秒間 、次に98℃を15秒間、60℃を30秒間および72℃を4分間の10サイクル、そして最終ステップである72℃を10分間であった(R Lister, et al. 2009 Nature; 462: 315-322)。AMPure XP磁気ビーズを用いてPCR産物を精製した。
ベースコールの後、断片末端のアダプター配列および低クオリティ塩基(low quality base)(すなわち、クオリティスコアが20未満)が除去された。FASTQ形式のトリミングされたリードは次に、Methy−Pipeと称されるメチル化データ解析パイプラインによって処理された(IEEE International Conference on Bioinformatics and Biomedicine Workshops(香港、2010年12月18〜21日)で発表された論文である、P Jiang, et al. Methy-Pipe: An integrated bioinformatics data analysis pipeline for whole genome methylome analysis)。亜硫酸水素塩変換した配列決定リードを整列させるために、最初に、参照ヒトゲノム(NCBI build 36/hg18)を用いて、ワトソン鎖およびクリック鎖上で別々に、全シトシン残基のチミンへのインシリコ変換が行われた。次に、処理された全てのリードにおいて各シトシンのチミンへのインシリコ変換が行われ、それぞれの変換された残基の位置情報が保持された。SOAP2R Li, et al. 2009 Bioinformatics; 25: 1966-1967)が、変換されたリードを2つの事前変換された参照ヒトゲノムに整列させるために用いられ、最高2つのミスマッチが整列されたリードのそれぞれに許された。ユニークなゲノム位置にマッピング可能なリードのみが、選択された。ワトソン鎖およびクリック鎖の両方にマッピングされるあいまいなリード、並びに同一の開始および終止ゲノム位置を有する重複(クローン)リードは排除された。600bp以下のインサートサイズを有する配列決定されたリードが、メチル化解析およびサイズ解析のために保持された。
本明細書に記載の実施形態の使用により、例えば対象の血漿を用いた、がんの非侵襲的な検診、検出、モニタリングまたは予後判定が可能となる。母体血漿から得られる胎児DNAのメチル化特性を推定することにより、胎児の出生前の検診、診断、調査またはモニタリングの実行も可能となる。本アプローチの能力を説明するために、胎盤組織の研究を通じ従来法で得られた情報が、母体血漿から直接的に評価され得ることが示された。例えば、遺伝子座の刷り込み状態、胎児DNAおよび母体DNA間で示差的なメチル化を有する遺伝子座の特定、並びに遺伝子座のメチル化特性における妊娠性変動が、母体血漿DNAの直接的な解析を通じて達成される。本アプローチの主な利点は、胎児メチロームを、妊娠に対する混乱または胎児組織の浸潤的試料採取の必要無しに、妊娠中に、包括的に評価できることである。DNAメチル化状態の変化および多くの妊娠関連状態の間の既知の関連性を考慮すると、本研究において記載されるアプローチは、それらの状態における生物マーカーの病態生理の調査およびそれらの生物マーカーの特定のための、重要な手段として機能し得る。刷り込み遺伝子座に焦点を当てることにより、父系伝達性の胎児メチル化特性および母系伝達性の胎児メチル化特性の両方が、母体血漿から評価可能であることが示された。このアプローチは、刷り込み疾患の研究に潜在的に有用であり得る。実施形態は、胎児疾患または妊娠関連疾患の出生前評価に直接適用することもできる。
本明細書において言及されたコンピューターシステムのいずれも、あらゆる適切な数のサブシステムを利用し得る。そのようなサブシステムの例は、コンピューターデバイス3300において、図33に示される。いくつかの実施形態において、コンピューターシステムには、サブシステムが構成要素であり得る単一のコンピューターデバイスが含まれ得る。他の実施形態では、コンピューターシステムには、それぞれが内部構成要素を有するサブシステムである、複数のコンピューターデバイスが含まれ得る。
Claims (122)
- 生物の生物試料を解析する方法であって、
前記生物試料は正常細胞に由来するデオキシリボ核酸(DNA)分子と、がんに関連した細胞に由来する可能性のあるDNA分子とを含み、前記DNA分子の少なくともいくらかは前記生物試料において無細胞であるものであり、
前記生物試料から複数のDNA分子を解析するステップであって、解析された複数のDNA分子は無細胞DNA分子を含み、複数のDNA分子のそれぞれを解析することは、
前記生物のゲノムにおけるDNA分子の位置を決定することと;
前記DNA分子が一つまたは複数の部位でメチル化されているか否かを決定することと、を含む、DNA分子を解析するステップと;
複数の部位のそれぞれについて、
前記部位でメチル化されている生物試料由来のそれぞれのDNA分子数を決定するステップと;
前記複数の部位でメチル化されている前記それぞれのDNA分子数に基づいて第一のメチル化レベルを計算するステップと;
前記第一のメチル化レベルを第一のカットオフ値と比較するステップと;
前記比較に基づいてがんのレベルの第一の分類を決定するステップと、
を含む、生物の生物試料を解析する方法。 - 前記DNA分子が一つまたは複数の部位でメチル化されているか否かを決定することは、メチル化認識配列決定を実行することを含む、請求項1に記載の方法。
- メチル化認識配列決定を実行することは、
前記DNA分子を亜硫酸水素ナトリウムで処理することと;
前記処理したDNA分子の配列決定を実行することと、
を含む、請求項2に記載の方法。 - 前記DNA分子を亜硫酸水素ナトリウムで処理することは、5−ヒドロキシメチルシトシンの検出をするためのTet補助亜硫酸水素塩変換または酸化的亜硫酸水素塩配列決定の一部である、請求項3に記載の方法。
- 前記それぞれのDNA分子数を、前記メチル化認識配列決定から得られる配列リードを整列させることによって決定する、請求項2に記載の方法。
- 一つまたは複数の部位でDNA分子がメチル化されているか否かを決定することは、メチル化感受性制限酵素消化、メチル化特異的PCR、メチル化依存的DNA沈降、メチル化DNA結合タンパク質/ペプチド、または、亜硫酸水素ナトリウム処理なしの単一分子配列決定、を用いることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ゲノムの第一の複数の領域のそれぞれについて、
前記領域に由来する生物試料由来のそれぞれのDNA分子数を決定し;
前記それぞれの数からそれぞれの正規化数を計算し;
前記領域に由来するDNA分子のそれぞれの正規化数を参照値と比較して、前記領域が欠失または増幅を示すか否かを決定するステップと;
欠失または増幅を示すと決定されるゲノムの第一の複数の領域の第一の量の領域を決定するステップと;
前記第一の量を第一の閾値と比較してがんのレベルの第二の分類を決定するステップと;
前記第一の分類と前記第二の分類とを用いてがんのレベルの第三の分類を決定するステップと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第一の閾値は、欠失または増幅を示すと決定される前記第一の複数の領域のパーセンテージである、請求項7に記載の方法。
- 前記第三の分類は、前記第一の分類と前記第二の分類の両方ががんを示す場合にのみ、
がん陽性である、請求項7に記載の方法。 - 前記第三の分類は、前記第一の分類と前記第二の分類のいずれかががんを示す場合に、
がん陽性である、請求項7に記載の方法。 - 前記第一の分類は前記生物にがんが存在することを示すものであり、
前記第一のメチル化レベルを、他の生物から決定される対応する値と比較することによって、前記生物に関連するがんの型を特定するステップであって、前記他の生物の少なくとも2つが異なる型のがんを有していると特定されるステップ、をさらに含む、請求項7に記載の方法。 - 前記第三の分類は前記生物にがんが存在することを示すものであり、
前記第一の量の領域を、前記他の生物から決定される対応する値と比較することによって、前記生物に関連する前記型のがんを特定するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。 - 前記第一のメチル化レベルを計算するステップは、
前記ゲノムの第二の複数の領域を特定することと;
前記第二の複数の領域のそれぞれの中の一つまたは複数の部位を特定することと;
第二の複数の領域の各領域について領域メチル化レベルを計算することと、を含み、前記第一のメチル化レベルは第一の領域についてのものであり、
前記領域メチル化レベルのそれぞれをそれぞれの領域カットオフ値と比較するステップであって、前記第一のメチル化レベルを前記第一のカットオフ値と比較することを含むステップと;
前記それぞれの領域カットオフ値を超える領域メチル化レベルを有すると決定される第二の複数の領域の第二の量の領域を決定するステップと;
前記第二の量の領域を第二の閾値と比較して、前記第一の分類を決定するステップと、
をさらに含む、請求項1または7に記載の方法。 - 前記それぞれの領域カットオフ値を超える領域メチル化レベルを有すると決定される領域は第一の一連の領域に対応するものであり、
前記第一の一連の領域の領域メチル化レベルを、他の生物の、前記第一の一連の領域に対応する領域メチル化レベルと比較するステップであって、前記他の生物は、第一の型のがん、がん不存在、および第二の型のがんの少なくとも2つを有する、ステップと;
前記比較に基づいて、前記生物が前記第一の型のがん、がん不存在、または前記第二の型のがんを有するか否かを決定するステップと、
をさらに含む、請求項13の方法。 - 前記他の生物の第一の一連の領域の対応する領域メチル化レベルに基づいて前記他の生物をクラスタリングするステップであって、クラスターの2つは、前記第一の型のがん、がん不存在、および前記第二の型のがんのいずれか2つに対応するステップをさらに含み、
前記第二の複数の領域の前記領域メチル化レベルの比較は前記生物がどちらのクラスターに属するかを決定する、請求項14に記載の方法。 - 前記他の生物のクラスタリングは前記生物の領域メチル化レベルを用いる、請求項15に記載の方法。
- 前記ラスターは、前記第一の型のがんに対応する第一のクラスターと、前記第二の型
のがんに対応する第二のクラスターと、がん不存在に対応する第三のクラスターとを含む、請求項15に記載の方法。 - 前記他の生物のクラスタリングは前記他の生物の第二の一連の領域のそれぞれの正規化数にさらに基づき、前記第二の一連の領域は、欠失または増幅を示すと決定される領域に対応し、領域に対する前記それぞれの正規化数は前記領域に由来するそれぞれのDNA分子数から決定されるものであり、
前記第二の一連の領域のそれぞれについて、
前記領域に由来するそれぞれのDNA分子数を決定し;
前記由来のDNA分子のそれぞれの数からそれぞれの正規化数を計算するステップと;
前記生物がどのクラスターに属するかを決定することの一部として、前記生物についての前記第二の一連の領域の前記それぞれの正規化数を、前記他の生物の前記それぞれの正規化数と比較するステップと、
をさらに含む、請求項15に記載の方法。 - 前記他の生物のクラスタリングは、高度メチル化CpG島のそれぞれのメチル化密度にさらに基づくものであり、
前記高度メチル化CpG島のそれぞれについて、
それぞれのメチル化密度を決定するステップと、
前記生物がどのクラスターに属するかを決定することの一部として、前記生物について前記高度メチル化CpG島のそれぞれのメチル化密度を、前記他の生物のメチル化密度と比較するステップと、
をさらに含む、請求項18に記載の方法。 - 前記他の生物のクラスタリングは、低度メチル化CpG島のそれぞれのメチル化密度にさらに基づくものであり、
前記低度メチル化CpG島のそれぞれについて、
それぞれのメチル化密度を決定するステップと、
前記生物がどのクラスターに属するかを決定することの一部として、前記生物について前記低度メチル化CpG島のそれぞれのメチル化密度を、前記他の生物のメチル化密度と比較するステップと、
をさらに含む、請求項18に記載の方法。 - 前記第二の複数の領域のそれぞれについて、
前記領域メチル化レベルと前記それぞれの領域カットオフ値との間のそれぞれの差異を算出するステップと、
前記それぞれの差異に対応するそれぞれの確率を計算するステップと、をさらに含み、
前記第二の量の領域を決定することは、前記それぞれの確率を含む累積スコアを計算することを含む、請求項13の方法。 - 前記累積スコアを計算することは、
第二の複数の領域のそれぞれの領域のそれぞれの確率の対数を取ってそれぞれの対数の結果を得るステップと;
前記それぞれの対数の結果を含む合計を計算するステップと、
を含む、請求項21に記載の方法。 - 前記累積スコアは前記それぞれの対数の結果の合計の負値である、請求項22に記載の方法。
- 第二の複数の領域のそれぞれの領域の各差異は前記それぞれの領域カットオフ値に関連する標準偏差で正規化される、請求項21に記載の方法。
- 前記それぞれの確率は、統計分布に従って前記それぞれの差異についての確率に対応する、請求項21に記載の方法。
- 前記第二の閾値は、前記他の生物の試料の参照群に由来する最も高い累積スコアに対応する、請求項21に記載の方法。
- 前記第一の複数の領域のそれぞれについて、
前記それぞれの正規化数と前記参照数との間のそれぞれの差異を算出するステップと;
前記それぞれの差異に対応するそれぞれの確率を計算するステップと、をさらに含み;
前記第一の量の領域を決定することは、前記それぞれの確率を含む第一の合計を計算することを含む、請求項13に記載の方法。 - 前記それぞれの領域カットオフ値は参照メチル化レベルに由来する特定量である、請求項13に記載の方法。
- 前記第二の閾値はパーセンテージであり、前記第二の量の領域を第二の閾値と比較することは、
前記第二の閾値と比較する前に前記第二の量の領域を前記第二の複数の領域の第二の数で割ることを含む、請求項13に記載の方法。 - 前記第二の数は前記第二の複数の領域の全てに対応する、請求項29に記載の方法。
- 前記第一の複数の領域は前記第二の複数の領域と同じであり、前記それぞれの領域カットオフ値は、前記それぞれの領域が欠失または増幅を示すか否かに依存する、請求項13に記載の方法。
- それぞれの領域カットオフ値の1つは、前記それぞれの領域が増幅を示さない場合より増幅を示す場合のほうがより大きい値を有し、それぞれの領域カットオフ値の第2は、前記それぞれの領域が欠失を示さない場合より欠失を示す場合のほうがより小さい値を有する、請求項31に記載の方法。
- それぞれの領域カットオフ値は前記第二の複数の領域の低メチル化について試験されたことがあり、それぞれの領域カットオフ値の第3は、前記それぞれの領域が増幅を示さない場合より増幅を示す場合のほうがより大きい負値を有し、それぞれの領域カットオフ値の第4は、前記それぞれの領域が欠失を示さない場合より欠失を示す場合のほうがより小さい負値を有する、請求項32に記載の方法。
- 前記生物試料は処理の前に取られるものであり、
処理の後に取られる別の生物試料に対して請求項13の方法を繰り返して、
欠失または増幅を示すと決定される後続の第一の量の領域と、
前記それぞれの領域カットオフ値を超える領域メチル化レベルを有すると決定される後続の第二の量の領域と、を得るステップと;
前記第一の量を前記後続の第一の量と、前記第二の量を前記後続の第二の量と比較して前記生物の予後を決定するステップと、
をさらに含む、請求項13に記載の方法。 - 前記第一の量を前記後続の第一の量と、前記第二の量を前記後続の第二の量と比較して前記生物の予後を決定することは、
前記第一の量と前記後続の第一の量との間の第一の差異を決定するステップと;
前記第一の差異を一つまたは複数の第一の差異閾値と比較するステップと;
前記第二の量と前記後続の第二の量との間の第二の差異を決定するステップと;
前記第二の差異を一つまたは複数の第二の差異閾値と比較するステップと、
を含む、請求項34に記載の方法。 - 前記第一の差異が1つの第一の差異閾値を下回る場合のほうが、前記第一の差異が前記1つの第一の差異閾値を上回る場合よりも、前記予後は悪化すると予測され、前記第二の差異が1つの第二の差異閾値を下回る場合のほうが、前記第二の差異が前記1つの第二の差異閾値を上回る場合よりも、前記予後は悪化すると予測される、請求項35に記載の方法。
- 前記1つの第一の差異閾値および前記1つの第二の差異閾値はゼロである、請求項36に記載の方法。
- 前記処理は免疫療法、外科手術、放射線療法、化学療法、抗体に基づく治療、エピジェネティック治療法、または標的療法である、請求項34に記載の方法。
- 前記第一のカットオフ値は、健常生物から得られる生物試料により確定される参照メチル化レベルから特定の隔たりがある、請求項1に記載の方法。
- 前記特定の隔たりは、前記参照メチル化レベルからの標準偏差の特定の数である、請求項39に記載の方法。
- 前記第一のカットオフ値は、前記生物試料が試験される前に得られる前記生物の試験前生物試料から決定される参照メチル化レベルより確定される、請求項1に記載の方法。
- 前記第一のメチル化レベルを前記第一のカットオフ値と比較することは、
前記第一のメチル化レベルと参照メチル化レベルとの間の差異を決定するステップと;
前記差異を、前記第一のカットオフ値に対応する閾値と比較するステップと、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記生物試料における腫瘍DNAの濃度分率を決定するステップと;
前記濃度分率に基づいて前記第一のカットオフ値を計算するステップと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記生物試料における腫瘍DNAの濃度分率が最小値より大きいか否かを決定するステップと;
前記濃度分率が前記最小値より大きくない場合に前記生物試料にフラグを付けるステップと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 腫瘍について参照メチル化レベルと比較したメチル化レベルの所期の差異に基づいて前記最小値を決定する、請求項44に記載の方法。
- 前記複数の部位に存在するDNA分子のサイズを測定するステップと;
前記第一のメチル化レベルを前記第一のカットオフ値と比較する前に、前記DNA分子の前記測定されたサイズに基づいて前記第一のメチル化レベルを正規化するステップと、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 前記測定されたサイズに基づいて前記第一のメチル化レベルを正規化することは、
第一のサイズを有するDNA分子を選択するステップと;
前記選択されたDNA分子を用いて前記第一のメチル化レベルを計算するステップであって、前記第一のカットオフ値は前記第一のサイズに対応するステップと、
を含む、請求項46に記載の方法。 - 前記第一のサイズは或る範囲の長さである、請求項47に記載の方法。
- 前記DNA分子は、サイズに依存する物理的分離に基づいて選択される、請求項47に記載の方法。
- 第一のサイズを有するDNA分子を選択することは、
前記複数のDNA分子のペアエンド大規模並列配列決定(paired−end massively parallel sequencing)を実行して、複数のDNA分子のそれぞれについて配列の対を得るステップと;
複数のDNA分子の配列の対を参照ゲノムと比較することによってDNA分子のサイズを決定するステップと;
前記第一のサイズを有するDNA分子を選択するステップと、
を含む、請求項47に記載の方法。 - 前記測定されたサイズに基づいて前記第一のメチル化レベルを正規化することは、
サイズとメチル化レベルとの間の関数関係を得るステップと;
前記関数関係を用いて前記第一のメチル化レベルを正規化するステップと、
を含む、請求項46に記載の方法。 - 前記関数関係は、それぞれのサイズに対応するスケーリング値を提供する、請求項51に記載の方法。
- DNA分子に対応する平均サイズを算出して、これを用いて前記第一のメチル化レベルを計算するステップと;
前記第一のメチル化レベルに、前記対応するスケーリング値を掛けるステップと、
をさらに含む、請求項52に記載の方法。 - 前記複数の部位のそれぞれについて、
前記部位に位置する前記DNA分子のそれぞれについて、
前記部位における前記DNA分子のそれぞれのサイズを得るステップと;
前記それぞれのサイズに対応する前記スケーリング値を用いて、前記部位でメチル化される前記それぞれのDNA分子数への前記DNA分子の寄与を正規化するステップと、
をさらに含む、請求項52に記載の方法。 - 前記複数の部位はCpG部位を含み、前記CpG部位は複数のCpG島に組織化され、
各CpG島は一つまたは複数のCpG部位を含み、前記第一のメチル化レベルは複数のCpG島のうちの第一のCpG島に対応する、請求項1に記載の方法。 - 前記CpG島のそれぞれは、他の生物の試料の参照群に第一のパーセンテージより低い平均メチル化密度を有し、前記CpG島のそれぞれは、前記参照群における平均メチル化密度に対する変動係数を有し、前記変動係数は第二のパーセンテージよりも低い、請求項55に記載の方法。
- 前記CpG島のそれぞれについて、
前記CpG島のメチル化レベルをそれぞれのカットオフ値と比較することによって、前記CpG島が他の生物の試料の参照群と比較して高度メチル化されているか否かを決定するステップと;
前記高度メチル化CpG島のそれぞれについて、
それぞれのメチル化密度を決定するステップと;
前記それぞれのメチル化密度から累積スコアを計算するステップと;
前記累積スコアを累積カットオフ値と比較して前記第一の分類を決定するステップと、
をさらに含む、請求項55に記載の方法。 - 前記それぞれのメチル化密度から前記累積スコアを計算することは、
前記高度メチル化CpG島のそれぞれについて、
前記それぞれのメチル化密度と参照密度との間のそれぞれの差異を計算し;
前記それぞれの差異に対応するそれぞれの確率を計算するステップと;
前記それぞれの確率を用いて前記累積スコアを決定するステップと、
を含む、請求項57に記載の方法。 - それぞれの高度メチル化CpG島について、
前記累積スコアを、
それぞれの高度メチル化CpG島のそれぞれの確率の対数を取ってそれぞれの対数の結果を得るステップと;
前記それぞれの対数の結果を含む合計を計算するステップと、
によって決定し、前記累積スコアは前記合計の負値である、
請求項58に記載の方法。 - 各差異それぞれは、前記参照密度に関連する標準偏差で正規化される、請求項58に記載の方法。
- 前記累積カットオフ値は、前記参照群からの最も高い累積スコアに対応する、請求項57に記載の方法。
- 前記第一のCpG島が高度メチル化されているか否かを決定することは、
前記第一のメチル化レベルを前記第一のカットオフ値および第三のカットオフ値と比較するステップを含み、
前記第一のカットオフ値は、前記参照群についてのメチル化密度の平均に特定のパーセンテージを足したものに対応し、前記第三のカットオフ値は、特定の標準偏差数に前記参照群についてのメチル化密度の前記平均を足したものに対応する、
請求項57に記載の方法。 - 前記特定のパーセンテージは2%である、請求項62に記載の方法。
- 前記特定の標準偏差数は3である、請求項62に記載の方法。
- 前記CpG島のそれぞれは、他の生物の試料の参照群に第一のパーセンテージを超える平均メチル化密度を有し、前記CpG島のそれぞれは、前記参照群における前記メチル化密度に対する変動係数を有し、前記変動係数は第二のパーセンテージよりも低い、請求項55に記載の方法。
- 前記CpG島のそれぞれについて、
前記CpG島のメチル化レベルをそれぞれのカットオフ値と比較することによって、前記CpG島が他の生物の試料の参照群と比較して低度にメチル化されているか否かを決定するステップと;
前記低度メチル化CpG島のそれぞれについて、
それぞれのメチル化密度を決定するステップと;
前記それぞれのメチル化密度から累積スコアを計算するステップと;
前記累積スコアを累積カットオフ値と比較して前記第一の分類を決定するステップと、
をさらに含む、請求項55に記載の方法。 - 前記それぞれのメチル化密度から前記累積スコアを計算することは、
前記低度メチル化CpG島のそれぞれについて、
前記それぞれのメチル化密度と参照密度との間のそれぞれの差異を計算し;
前記それぞれの差異に対応するそれぞれの確率を計算するステップと;
前記それぞれの確率を用いて前記累積スコアを決定するステップと、
を含む、請求項66に記載の方法。 - 低度メチル化CpG島のそれぞれについて、
前記累積スコアを、
前記それぞれの確率の対数を取ってそれぞれの対数の結果を得るステップと;
前記それぞれの対数の結果を含む合計を計算するステップと、
によって決定し、前記累積スコアは前記合計の負値である、
請求項67に記載の方法。 - 前記ゲノムの第一の複数の領域のそれぞれについて、
前記領域に由来するそれぞれのDNA分子数を決定し;
前記それぞれの数からそれぞれの正規化数を計算し;
前記それぞれの正規化数を参照値と比較して、前記領域が欠失又は増幅を示すか否かを決定するステップと;
全て、欠失、増幅、または正常な表現の1つを示すと決定される第一の一連の領域を決定するステップであって、前記第一のメチル化レベルは前記第一の一連の領域に対応するステップと;
全て、欠失、増幅、または正常な表現のいずれか2つ目を示すと決定される第二の一連の領域を決定するステップと;
前記第二の一連の領域の部位においてメチル化される前記それぞれのDNA分子数に基づいて第二のメチル化レベルを計算するステップと、をさらに含み、
前記第一のメチル化レベルを前記第一のカットオフ値と比較することは、
前記第一のメチル化レベルと前記第二のメチル化との間のパラメーターを算出することと;
前記パラメーターを前記第一のカットオフ値と比較することと、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記第一のメチル化レベルは前記第一の一連の領域のそれぞれの領域について計算される領域メチル化レベルの統計値であり、前記第二のメチル化レベルは前記第二の一連の領域のそれぞれの領域について計算される領域メチル化レベルの統計値である、請求項69に記載の方法。
- 前記統計値を、スチューデントt検定、分散分析(ANOVA)検定、またはクラスカル・ワリス検定を用いて決定する、請求項70に記載の方法。
- 前記パラメーターは、第一のメチル化レベルと第二のメチル化レベルとの比率または差異を含む、請求項69に記載の方法。
- 前記パラメーターを算出することは確率分布を前記比率または前記差異に適用することを含む、請求項72に記載の方法。
- 第一の分類が、がんが生物に存在することを示し、当該方法が、更に、
第一のメチル化レベルを生物から決定された対応する値と比較することによって、生物に関連するがん種を同定するステップであって、ここで、他の生物の少なくとも2つは異なったがん種を有すると同定される、ステップ
を含む、請求項1に記載の方法。 - 生物の生物試料から第一のメチル化特性を決定する方法であって、前記生物試料は、第一の組織および第二の組織に由来する無細胞DNA分子の混合物を含む無細胞DNAを含み、
前記第二の組織のDNA分子に対応する第二のメチル化特性を得るステップであって、前記第二のメチル化特性は、前記生物のゲノムの複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子座における第二のメチル化密度を提供し、それぞれの遺伝子座における前記第二のメチル化密度は、メチル化されている前記第二の組織のDNA分子の割合に対応する、ステップと;
前記混合物の前記無細胞DNA分子から無細胞メチル化特性を決定するステップであって、前記無細胞メチル化特性は前記複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子座における混合メチル化密度を提供するステップと;
前記第一の組織に由来する前記混合物における前記無細胞DNA分子のパーセンテージを決定するステップと;
前記第一の組織の前記第一のメチル化特性を決定するステップと;
前記複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子座について、
前記第二のメチル化特性の第二のメチル化密度と前記無細胞メチル化特性の混合メチル化密度との間のパーセンテージ単位で決められる差異を含む示差パラメーターを計算することによって、前記第一の組織の前記第一のメチル化特性を決定するステップと、
を含む、方法。 - 前記第一のメチル化特性から第一のメチル化レベルを決定するステップと;
前記第一のメチル化レベルを第一のカットオフ値と比較して、前記比較に基づいてがんのレベルの分類を決定するステップと、
をさらに含む、請求項75に記載の方法。 - 前記第一のメチル化特性を変換して、補正された第一のメチル化特性を得るステップをさらに含む、請求項75に記載の方法。
- 前記変換は線形の変換である、請求項77に記載の方法。
- 遺伝子座についての前記示差パラメーターDは、
と定義される、請求項75に記載の方法。 - CNは、前記遺伝子座において二染色体である前記第一の組織のコピー数についてのものである、請求項79に記載の方法。
- Dが閾値を超える領域を特定することをさらに含む、請求項79に記載の方法。
- 次の基準:
50%より大きいGC含量;
第一の閾値より小さいか第二の閾値より大きい、前記第二のメチル化特性の第二のメチル化密度;
前記遺伝子座によって定義される、領域内の最低5つのCpG部位;
のいずれか一つまたは複数を有する遺伝子座を選択することによって前記複数の遺伝子座を特定するステップ、
をさらに含む、請求項75に記載の方法。 - 前記生物試料は胎児を妊娠している女性対象に由来し、前記第一の組織は前記胎児または胎盤に由来し、前記第二の組織は前記女性対象に由来する、請求項75に記載の方法。
- 前記第一のメチル化特性から第一のメチル化レベルを決定するステップと;
前記第一のメチル化レベルを第一のカットオフ値と比較して病状の分類を決定するステップと、
をさらに含む、請求項83に記載の方法。 - 前記病状は子癇前症、または前記第一の組織における染色体異常である、請求項84に記載の方法。
- 前記第一の組織は前記生物内の腫瘍に由来し、前記第二の組織は前記生物の非悪性組織に由来する、請求項75に記載の方法。
- 前記生物試料はまた、前記第二の組織に由来するDNA分子を含み、
前記第二のメチル化特性を得ることは、
前記第二の組織に由来する前記DNA分子を解析して前記第二のメチル化特性を決定することを含む、請求項75に記載の方法。 - 前記得られた第二のメチル化特性は、対照試料の群より得られる平均メチル化特性に対応する、請求項75に記載の方法。
- 前記複数の遺伝子座の第一の遺伝子座について前記無細胞メチル化特性の混合メチル化密度を決定することは、
前記第一の遺伝子座に由来する前記無細胞DNA分子の第一の数を決定するステップと;
前記第一の数の各DNA分子が一つまたは複数の部位でメチル化されるか否かを決定して、メチル化DNA分子の第二の数を得るステップと;
前記第一の数および前記第二の数から前記混合メチル化密度を計算するステップと、
を含む、請求項75に記載の方法。 - 前記一つまたは複数の部位はCpG部位である、請求項89に記載の方法。
- 前記無細胞メチル化特性を決定することは、
前記無細胞DNA分子を亜硫酸水素ナトリウムで処理するステップと;
前記処理されたDNA分子の配列決定を実行するステップと、
を含む、請求項75に記載の方法。 - 前記無細胞DNA分子の処理は、Tet支援(Tet−assisted)亜硫酸水素塩変換の一部であるか、または、前記無細胞DNA分子を過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)で処理することを含む、請求項91に記載の方法。
- 前記無細胞メチル化特性を決定することは、
前記DNAの単一分子配列決定を実行するステップであって、前記単一分子配列決定は、DNA分子の少なくとも1つの部位がメチル化されているか否かを決定することを含むステップを含む、請求項75に記載の方法。 - 生物の生物試料から第一のメチル化特性を決定する方法であって、前記生物試料は第一の組織および第二の組織に由来する無細胞DNAの混合物を含み、
複数のDNA分子からDNA分子を解析するステップであって、DNA分子を解析することは:
前記生物のゲノムにおける前記DNA分子の位置を決定することと;
前記DNA分子の遺伝子型を決定することと;
前記DNA分子が一つまたは複数の部位でメチル化されているか否かを決定することと、
を含む、ステップと;
それぞれの第一の対立遺伝子およびそれぞれの第二の対立遺伝子について前記第一の組織の第一のゲノムがヘテロ接合性であり、前記それぞれの第一の対立遺伝子について前記第二の組織の第二のゲノムがホモ接合性である、複数の第一の遺伝子座を特定するステップと;
前記第一の遺伝子座のそれぞれについて:
前記遺伝子座に関連する一つまたは複数の部位のそれぞれについて:
前記部位においてメチル化され、前記遺伝子座の前記それぞれの第二の対立遺伝子に対応するDNA分子の数を決定し、
前記遺伝子座の前記一つまたは複数の部位でメチル化され、前記遺伝子座の前記それぞれの第二の対立遺伝子に対応するDNA分子の数に基づいてメチル化密度を計算するステップと;
前記第一の遺伝子座についてのメチル化密度から、前記第一の組織の前記第一のメチル化特性を作成するステップと、
を含む、方法。 - 前記生物試料は胎児を妊娠している女性対象に由来し、前記第一の組織は前記胎児または胎盤に由来し、前記第二の組織は女性対象に対応する、請求項94に記載の方法。
- 前記部位はCpG部位に対応する、請求項94に記載の方法。
- 各遺伝子座は少なくとも1つのCpG部位を含む、請求項94に記載の方法。
- 各遺伝子座は少なくとも1つのCpG部位に隣接する、請求項94に記載の方法。
- 生物の生物試料から染色体異常を検出する方法であって、前記生物試料は、第一の組と第二の組織とに由来する無細胞DNAの混合物を含む無細胞DNAを含み、
DNA分子を複数のDNA分子から解析するステップであって、DNA分子を解析することは、
参照ゲノムにおける前記DNA分子の位置を決定することと;
前記DNA分子が一つまたは複数の部位においてメチル化されているか否かを決定することと、を含む、ステップと;
複数の部位のそれぞれについて:
前記部位においてメチル化されているそれぞれのDNA分子数を決定するステップと;
前記第一の染色体領域内の部位においてメチル化される前記それぞれのDNA分子数に基づいて第一の染色体領域の第一のメチル化レベルを計算するステップと;
前記第一のメチル化レベルをカットオフ値と比較するステップと;
前記比較に基づいて前記第一の染色体領域について前記第一の組織における異常の分類を決定するステップと、
を含む、方法。 - 前記第一のメチル化レベルをカットオフ値と比較することは、
前記第一のメチル化レベルを正規化することと、前記正規化された第一のメチル化レベルを前記カットオフ値と比較することと、を含む、請求項99に記載の方法。 - 前記正規化は第二の染色体領域の第二のメチル化レベルを用いる、請求項100に記載の方法。
- 前記正規化は前記第一の組織に由来する無細胞DNAの濃度分率を用いる、請求項100に記載の方法。
- 第一のメチル化レベルを計算することは、
前記生物のゲノムの複数の領域を特定するステップと;
前記複数の領域のそれぞれの領域中の一つまたは複数の部位を特定するステップと;
複数の領域メチル化レベルを作製するために複数の領域の各領域について領域メチル化レベルを計算するステップと、を含み、
前記第一のメチル化レベルは第一の領域についてのものであり、
前記第一のメチル化レベルを第一のカットオフ値と比較することは、
前記領域メチル化レベルのそれぞれをそれぞれの領域カットオフ値と比較するステップと;
領域メチル化レベルが前記それぞれの領域カットオフ値を超える領域の第一の数を決定するステップと;
前記第一の数を閾値と比較して前記分類を決定するステップと、
を含む、請求項99に記載の方法。 - 前記閾値はパーセンテージであり、
前記第一の数を閾値と比較することは、前記閾値と比較する前に前記第一の領域数を第二の領域数で割ることを含む、請求項103に記載の方法。 - 前記第二の領域数は前記特定された複数の領域の全てである、請求項104に記載の方法。
- 前記それぞれの領域カットオフ値は、参照メチル化レベルに由来する特定の量である、
請求項103に記載の方法。 - 前記生物試料は胎児を妊娠している女性対象に由来し、前記第一の組織は前記胎児または胎盤に由来し、前記第二の組織は前記女性対象に由来し、前記染色体異常は胎児の染色体異常である、請求項99に記載の方法。
- 前記カットオフ値は、前記女性対象に由来する前記第二の組織のDNAに関連するバックグラウンドメチル化レベルに基づく、請求項107に記載の方法。
- 前記カットオフ値は、前記第一の染色体領域について染色体異常のない胎児を懐妊している他の女性妊娠対象から決定される、請求項107に記載の方法。
- 前記染色体異常は、21番染色体トリソミー、18番染色体トリソミー、13番染色体トリソミー、ターナー症候群またはクラインフェルター症候群である、請求項107に記載の方法。
- 前記第一の組織は前記生物内の腫瘍に由来し、前記第二の組織は前記生物の非悪性組織に由来する、請求項99に記載の方法。
- 前記カットオフ値は、がんを有さない他の生物から決定される、請求項99に記載の方法。
- カットオフ値は、前記生物試料における前記第一の組織に由来する無細胞DNAの濃度に基づく、請求項99に記載の方法。
- 前記カットオフ値は、異常のタイプに対応するスケーリング因子に基づき、前記異常のタイプは欠失または重複である、請求項113に記載の方法。
- 参照ゲノムにおける前記DNA分子の位置を決定することは、前記位置が前記第一の染色体領域内にあるか否かを決定することを含む、請求項98に記載の方法。
- 前記参照ゲノムにおける前記DNA分子の位置を決定することは、前記DNA分子が前記第一の染色体領域に位置するか否かを決定することによって成される、請求項115に記載の方法。
- 前記染色体異常は、染色体内欠失、または染色体内重複、またはディジョージ症候群である、請求項99に記載の方法。
- 前記生物試料が、生物試料中の無細胞である核酸分子を取得するプロセスから採取される、請求項1〜117のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物試料が、血漿及び血清から成る群より選ばれる、請求項118に記載の方法。
- 前記生物試料が、遠心分離から採取される、請求項118に記載の方法。
- 請求項1、7〜49、51〜90、及び94〜120のいずれか1項に記載の方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
- 1又はそれ以上のプロセッサ、及び請求項121に記載のプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な媒体を含むシステム。
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