JP6289906B2

JP6289906B2 - ヒト白血病阻害因子（ｌｉｆ）を認識する抗体および望ましくない細胞増殖に関連する疾患の治療における抗ｌｉｆ抗体の使用

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Description

本発明は一般に、ヒト白血病阻害因子（LIF）を認識するモノクローナル抗体を産生するためのハイブリッド細胞株（リンパ球ハイブリドーマ）；かかる抗体の均一集団；ならびにLIFのレベルまたは活性の改変に関連する疾患、例えば、望ましくない細胞増殖、さらに特に癌、およびさらに特にグリオーマに関連する疾患を予後判定、診断および治療するためのかかる抗体の使用に関する。

白血病阻害因子（LIF）は、様々な生物活性に関わりかつ色々な細胞型に効果を与えるインターロイキン6（IL-6）型サイトカインである。ヒトLIFは202個のアミノ酸からなるポリペプチドである。

LIFは重要なシグナル伝達分子であって；特に、望ましくない細胞増殖、例えば、様々な型の腫瘍に関連する疾患においてある役割を果たす。いくつかの腫瘍細胞の自己更新能力はLIFまたはSox2の誘導により増加することができる（Ikushima et al., Cell Stem Cell, 5:504-514, 2009；Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009）。LIFはまた他の生理活性、例えば、胚盤胞移植の阻害（Sengupta et al., 2006, Contraception, 74, 419-425）および上皮メラニン細胞の分化（Hirobe, 2002, J. Cell. Phys., 192:315-326）に関係があるとされている。

腫瘍において、癌開始細胞（CIC）は正常な幹細胞の特徴を有し、自己更新の持続を示しかつ元来の腫瘍の特徴と細胞多様性を再現する二次腫瘍を産生することができる亜集団である。CICは腫瘍発症、伝播、再発および化学および照射耐性に関わると考えられる（Bao et al., Nature, 444:7756-760, 2006；Dick, Blood, 112:4793-4807, 2008；Gupta et al., Nat. Mathods, 15:1010-1012, 2009；Visvader and Lindeman, Nat. Rev. Cancer, 8:755-768, 2008；Zhou et al., Nat. Rev. Drug Discov. 8:806-823, 2009）。全てのこれらの特徴は、CICが重要な治療標的でありかつCICの生物学の理解が抗癌治療を改善するために極めて重要であることを示す。CD133およびCD44を含むいくつもの細胞表面マーカーは色々な腫瘍型におけるCICの濃縮された細胞サブセットの単離に有用であることが示されている（Visvader and Lindeman, Nat. Rev. Cancer, 8:755-768, 2008）。

グリオーマは脳の最も普通の腫瘍である。最も攻撃的な型の腫、グリア芽細胞腫（GBM）とも呼ばれるグレードIVグリオーマは、生存メジアン値がおよそ14か月という最も致死性の癌の一つである（Stupp et al., N. Engl. J. Med., 352:987-996, 2005）。グリオーマの起源と進行に関わる分子機構の理解が進んでいるにも関わらず、この型の腫瘍の予後判定および治療には無効のままである。グリオーマ開始細胞（GIC）はその高い発癌潜在能力、その自己更新能力およびその複数細胞株への分化能力により特徴付けられる。腫瘍における幹細胞様細胞の数はその自己再生能力により調節される。GICおよび、一般に、癌幹細胞は対称的および非対称的分裂を経て、それにより、1つの幹細胞は2つのそれと同一のコピー、または、1つの幹細胞のコピーと1つのさらに分化した細胞のコピー（非対称的分裂）を産生する。癌幹細胞の自己再生能力は、対称的分裂と非対称的分裂の間のバランスにより調節され、前記自己更新を制御する機構の調節停止が腫瘍の発症に関わることはほとんど間違いなかろう。

GICは腫瘍の発症、伝播および再発に関わり、最も有効な治療法はグリオーマ幹細胞の区分化を指向した治療法から得られることを示すと考えられる。もしGICが除去されなければ、腫瘍は根絶されないであろう。

TGFβ（トランスフォーミング成長因子β）シグナル伝達経路は多くの細胞活性、例えば、標的遺伝子の調節を介する細胞の増殖および分化の調節に関わる。サイトカインのTGFβファミリーはTGFβ自体（例えばTGFβ1、TGFβ2、TGFβ3）、アクチビンおよび骨形態形成のタンパク質を含む。TGFβファミリーメンバーは細胞表面のセリン／トレオニンキナーゼ受容体の活性化を介して作用し、前記受容体は下流のエフェクターSMADに関わる細胞内シグナル伝達経路をトリガーし、前記経路が活性化すると直接核に伝達しかつ転写を活性化する。TGFβはLIFまたはSox2の誘導を介してGICの自己更新能力を増加しうることが示されている（Ikushima et al., Cell Stem Cell, 5:504-514, 2009；Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009）。癌シグナル伝達におけるTGFβの重要な役割（Massague, Cell, 134:215-230, 2008）は、TGFβに対する阻害化合物の設計に基づく抗癌計画の臨床開発を促進してきた（Seoane et al., Clin. Transl. Oncol., 10:14-19, 2008; Yingling et al., Nat. Rev. Drug Discov., 3:1011-1022, 2004）。グリオーマにおいて、TGFβ活性の上昇は患者における予後判定を劣化させ（Bruna et al., Cancer Cell, 11:147-160, 2007）、そして血管新生、免疫抑制、細胞浸潤および細胞増殖の誘導を含む多様な発癌性応答を示す（Bruna et al., Cancer Cell, 11:147-160, 2007; Rich, Front. Biosci. e245-260, 2003）。TGFβファミリーメンバーはDNA結合の阻害剤タンパク質1（Id1）の発現を調節する。DNA結合の阻害剤タンパク質類（Ids）は細胞周期および細胞分化を調節する転写因子であり、幹細胞自己更新の制御に重要な役割を有する（Perk et al., Nat. Rev. Cancer, 5:603-614, 2005；Ying et al., Cell, 115:281-292, 2003）。正常な上皮細胞において、TGFβはId1転写を抑制しそしてBMPはId1転写誘導する（Massague, Cell, 134:215-230, 2008）。しかし、内皮細胞およびいくつかの腫瘍細胞において、TGFβはId1発現を誘導することができる（Goumans et al.,EMBO J., 1743-1753, 2002; Padua et al., Cell, 133:66-77, 2008）。Id1はB1型の成人神経幹細胞において発現され、これらの細胞の自己更新能力の調節に重要な役割を有する（Nam and Benezra, Cell Stem Cell, 5:515-526, 2009）。癌において、Id1はいくつかの腫瘍でアップレギュレーションされているのが見出され（Perk et al., Cancer Res., 2006:10870-10877, 2006）、そして転移に関わると記載されている（Gupta et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:19506-19511, 2007）。

グリオーマに対する治療の選択は外科介入である。それでも外科処置は通常、薬理学的アジュバント処理または照射療法の手法を伴う。グリオーマの治療に選択される薬剤には、照射療法と組み合わせた、プロカルバジン、CCNU（ロムスチン）およびビンクリスチン、テモゾロミドを含むPCVと呼ばれる組み合わせが含まれる。

それ故に、当技術の現状で公知の治療の欠点を防止しかつ効率的にGICを除去することができる代わりの治療が必要である。

LIFに特異的ないくつかの抗体は、米国特許第5,654,157A号、米国特許第5,654,157号、Kimら（J. Immunol. Meth., 156: 9-17, 1992）、Alphonsoら（J. Leukocyte Biology （the 28th National Meeting of the Society for Leukocyte Biologyの抄録, vol. 0, no. SP.2 (1991) (NY, N.E., p. 49) (Mabs D4.16.9、D25.1.4、およびD62.3.2）、Senguptaら（Contraception 74:419-425, 2010）に記載されている。しかし、これらの抗体が結合するLIFタンパク質内の抗原性領域の詳しい特徴は明らかでない。さらに、癌、特にグリオーマ、およびさらに特にグリア芽細胞腫を治療するためのこれらの抗体の使用は開示されていない。当業者は当技術分野の他の例から、抗原のある特定領域またはエピトープとの結合が治療法の成功にとって決定的でありうることを理解するであろう。例えば、様々な抗HER2抗体は公知であり、その中でただ一つ、トラスツズマブだけが乳癌の治療用に特に有用であることが証明されている。

米国特許第5,654,157A号米国特許第5,654,157号

Ikushima et al., Cell Stem Cell, 5:504-514, 2009 Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009 Sengupta et al., 2006, Contraception, 74, 419-425 Hirobe, 2002, J. Cell. Phys., 192:315-326 Bao et al., Nature, 444:7756-760, 2006 Dick, Blood, 112:4793-4807, 2008 Gupta et al., Nat. Mathods, 15:1010-1012, 2009 Visvader and Lindeman, Nat. Rev. Cancer, 8:755-768, 2008 Zhou et al., Nat. Rev. Drug Discov. 8:806-823, 2009 Visvader and Lindeman, Nat. Rev. Cancer, 8:755-768, 2008 Stupp et al., N. Engl. J. Med., 352:987-996, 2005 Massague, Cell, 134:215-230, 2008 Seoane et al., Clin. Transl. Oncol., 10:14-19, 2008 Yingling et al., Nat. Rev. Drug Discov., 3:1011-1022, 2004 Bruna et al., Cancer Cell, 11:147-160, 2007 Rich, Front. Biosci. e245-260, 2003 Perk et al., Nat. Rev. Cancer, 5:603-614, 2005 Ying et al., Cell, 115:281-292, 2003 Goumans et al.,EMBO J., 1743-1753, 2002 Padua et al., Cell, 133:66-77, 2008 Nam and Benezra, Cell Stem Cell, 5:515-526, 2009 Perk et al., Cancer Res., 2006:10870-10877, 2006 Gupta et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104:19506-19511, 2007 Kim et al., J. Immunol. Meth., 156: 9-17, 1992Alphonso et al.,J. Leukocyte Biology, the 28th National Meeting of the Society for Leukocyte Biologyの抄録, vol. 0, no. SP.2 (1991) (NY, N.E., p. 49) (Mabs D4.16.9、D25.1.4、およびD62.3.2） Sengupta et al., Contraception 74:419-425, 2010

第1の態様において、本発明はヒト白血病阻害因子（LIF）に対するモノクローナル抗体に関する。

他の態様において、本発明はヒト白血病阻害因子（LIF）に対する均一な抗体（本明細書では以後、抗LIF抗体と呼ぶ）の集団を産生するハイブリドーマ細胞株に関する。その特別な実施形態において、本発明は、2010年4月1日にthe Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けた受託番号DSM ACC3054のハイブリドーマ細胞株に関する。

他の態様において、本発明は前記抗体を含む免疫分析試験に関する。

他の態様において、本発明は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を治療するための抗LIF抗体の治療上有効量に関する。

さらに特別な態様において、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を治療するための、本発明の意味における、治療上有効量の抗LIF抗体に関する。

他の態様において、本発明は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を治療するための、本発明による前記抗体の治療上有効量および製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。

他の態様において、本発明は被験者における望ましくない細胞増殖に関連する疾患を診断するための、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者の素因を決定するための、または被験者の前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患の段階もしくは重篤度を決定するための、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患をもつ被験者に投与した治療法の効果をモニタリングするためのin vitro方法であって、前記被験者から得た生体サンプルにおけるLIFの、またはその機能的に等価な変異体の、またはこれら分子の組み合わせのレベルを定量するステップを含むものである前記in vitro方法に関する。他の態様において、本発明は被験者における癌を診断するために前記被験者から得た生体サンプルにおけるLIFの、またはその機能的に等価な変異体の、またはこれら分子の組み合わせのレベルを定量するための、または前記癌を患う被験者の素因を決定するための、または被験者の前記癌の段階もしくは重篤度を決定するための、または前記癌を患う被験者の生存の確率もしくは予想される平均余命を予測するための、または前記癌の被験者に投与した治療法の効果をモニタリングするための試薬を含むキットの使用であって、ここで、もし試薬がLIFのまたはその機能的に等価な変異体の、またはこれら分子の組み合わせの発現の対照サンプルに対する増加を検出すれば、前記被験者は望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患いうるか、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患うより大きい素因を示すか、または前記疾患のより高い重篤度を示すか、または投与した治療法が有効なものでない前記キットの使用に関する。

他の態様において、本発明は望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う患者の平均余命の予後判定をするin vitro方法であった、前記患者から得た生体サンプル中のLIFのまたはその機能的に等価な変異体の、またはこれら分子の組み合わせを定量するステップを含むものである前記in vitro方法に関する。

抗LIF抗体（α-LIF）はアミノ酸160〜202に含まれるヒトLIFタンパク質のC末端ドメインと結合する。（A）LIF遺伝子二次構造およびLIF-EGFP融合タンパク質で行われた配列欠失を示す図である。（B）293T細胞を、示した構築物で形質転換した。48時間後、細胞を溶解し、1μgの抗LIF抗体を用いて一晩4℃にて免疫沈降した。次いで、プロテインA/Gを溶菌液に加え、免疫沈降物を溶出した。LIF断片を抗EGFP抗体を用いて免疫ブロットにより検出した。（C）抗LIF抗体結合ドメインを示す図である。抗LIF抗体はグリオーマ細胞株U373におけるLIFによるホスホ-Stat3の誘導および患者由来のGBMニューロスフェア中のホスホ-Stat3の基底レベルを遮断する。A）U373細胞をヒト組換えLIFを用いてまたは用いないで15分間、示したモノクローナル抗体およびホスホ-Stat3の存在および非存在で処理し、チューブリンレベルをウェスタンブロットにより測定した。アイソタイプの整合したIgGを対照として用いた。B）GBMニューロスフェアを解離して、無処理で放置するかまたは抗LIFモノクローナル抗体またはアイソタイプ対照IgGの存在のもとで一晩インキュベートして、ホスホ-Stat3およびチューブリンのレベルをウェスタンブロットにより測定した。患者由来のGBMニューロスフェアはCD44^high/Id1^high細胞コンパートメントを含有する。CD44レベルのFACS分析をGBMニューロスフェアにおいて実施した（図3A）。アイソタイプ対照による染色を示す。GBMニューロスフェアをCD44レベルによるFACSによりソーティングし、CD44、ID1、ID2およびID3転写物レベルをqRT-PCRおよびウェスタンブロット分析により確認した（図3Bおよび3C）。 GBMニューロスフェア中のCD44^high/Id1^high集団はグリオーマ開始細胞が濃縮されている。（A）10％FBSの存在または非存在において10日間培養したGBM1ニューロスフェアについて、CD44レベルのFACS分析を実施した。（B）GBM1細胞をCD44レベルによってソーティングし、ニューロスフェア形成アッセイを播種した。7日後、ニューロスフェアの数を測定した（C、D および E）。ニューロスフェア細胞をCD44レベルによってソートし、表示した細胞数を免疫無防備状態のマウスの脳に接種した。（C）手術後40日に、10⁵細胞を接種した全マウス脳からの画像をMRIにより得た（矢印は腫瘍を示す）。（D）腫瘍発生率を示す。（E）示したタンパク質の免疫組織化学および腫瘍のH＆E染色を実施した。抗LIF抗体はGBMニューロスフェア中のCD44^high/Id1^high集団のレベルを低下する。 GBMニューロスフェアを解離して抗LIFモノクローナル抗体またはアイソタイプ対照IgGの存在のもとで7日間、EGFおよびFGFの存在（A）または非存在（B）で培養した。細胞をヨウ化プロピジウムの存在のもとで抗CD44-FITCモノクローナル抗体によって染色し、死滅細胞を排除し、CD44の高い細胞をFACSにより測定した。

抗LIF抗体は患者由来のCD44およびId1のレベルを低下する。GBMニューロスフェアを解離し、抗LIFモノクローナル抗体またはアイソタイプ対照IgGの存在のもとで7日間EGFおよびFGFの非存在で培養し、そして表示した遺伝子のmRNAレベルをqRT-PCRにより分析した。GAPDHを内部規準化対照として用いた。抗LIF抗体によるin vivo処理はCD44^high/Id1^high細胞コンパートメントを低下する。（A）実験手順を示すスキームである。（B）GBMニューロスフェアを免疫無防備状態のマウスの脳に接種した。接種後30日に腫瘍が生じ、そして腫瘍が形成されるとマウスを毎3日、10日間にわたってPBSまたは抗LIFモノクローナル抗体の500gを用いて処理した。マウス脳を解離し、ヒト腫瘍細胞をMHC-Iポジティブ細胞のソートにより単離した。ID1およびCD44mRNA発現のレベルをqRT-PCRにより測定した。GAPDHを内部規準化対照として用いた。グリオーマ患者のLIF mRNAレベルは平均余命と関係がある。カプラン・マイヤー曲線は、≧2倍にアップレギュレーションされたLIF mRNAレベルをもつグリオーマ患者の全生存は対数-ランク試験によりその他の患者より有意に低い（p＝7.2E-8）ことを示す。データはthe National Cancer Instituteからの分子脳神経性データ保存庫（REMBRANDT）プログラムより得たものである。グリア芽細胞腫（GBM）患者のLIF mRNAレベルは平均余命と関係がある。カプラン・マイヤー曲線は、≧9倍にアップレギュレーションされたLIF mRNAレベルをもつGBM患者の全生存は、対数-ランク試験によりその他の患者より有意に低い（p＝6.9E-4）ことを示す。データはthe National Cancer Instituteからの分子脳神経性データ保存庫（REMBRANDT）プログラムより得たものである。

本発明による抗体
本発明者らはヒト白血病阻害因子（LIF）に対する新規のモノクローナル抗体を作製した。

それ故に、第1の態様において本発明はヒトLIFに対するモノクローナル抗体に関する。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団であって、その集団に関わる個々の抗体分子はわずかな量で存在しうるいずれかの天然で可能性のある突然変異を除いて、アフィニティおよび特異性において本質的に同一である前記集団を意味する。

モノクローナル抗体は抗原の単一エピトープにとって特異的な均一な集団である。本発明において、用語「モノクローナル抗体」は広く解釈されなければならない、そしてこれには、LIFを特異的に認識できることを条件として、多特異的抗体およびその断片（F(ab')₂、Fab）などが含まれる。本発明の意味におけるモノクローナル抗体の断片は、限定されるものでないが、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの中に組込むことができる。

キメラ抗体は、異なる動物種からの抗体のクローニングまたは組換えの手法により構築したモノクローナル抗体である。典型的であるが非限定的な本発明の形態において、キメラ抗体は、本発明の意味でのモノクローナル抗体の一部、一般に抗原認識と結合のための部位を含む可変フラグメント（Fv）、およびヒト抗体に対応する他の部分、一般に定常領域および隣接定常領域を含む。

ヒト化抗体は、本発明の意味でのマウスモノクローナル抗体の超可変相補性決定領域（CDR）をヒトの超可変CDR領域の代わりにヒト抗体中にクローニングおよび移植することにより構築したモノクローナル抗体である。

本明細書で使用する用語「ヒト抗体」は完全なヒトモノクローナル抗体を意味しうる。かかるヒト抗体は、ヒト抗体を産生するように改変された遺伝子操作で作られたマウス、いわゆるトランスジェニックマウスにより産生することができる抗体である。マウスからヒト抗体を得る技法は、例えば、LonbergおよびHuszar（Int. Rev. Immunol., 1995; 13(1):65-93）に記載されており、これは最初にMcCaffertyら（1990, Nature 348 (6301): 552-554）が記載した技法に基づいている。

さらに、本発明の文脈においては、用語「抗体」はまた、糖鎖パターンが変化した変異体、ならびにタンパク質からまたは組換え技術を用いて得られる糖鎖付加された、または糖鎖付加されていない抗体フラグメントであって、(i)結合ペプチドにより互いに結合された抗体の可変領域(scFv)、(ii)システインにより、もしくは結合ペプチドとジスルフィド結合により軽鎖に結合された重鎖(Fd)のCH1定常領域を一緒に含む可変領域(scFab)、(iii)単一重鎖などの新規変異体、または(iv)それらをより類似するか、免疫原性をより低くするか(ヒト化)、もしくは生物学的液体中でより安定化し；そして本発明の文脈においては、LIFがその機能(活性)を実施する、すなわち、JAK-STATシグナリング経路の活性化を誘導するのを阻害する目的で抗体フラグメントに対してなされた任意の改変からなってよい前記フラグメントも含む。

当業者であれば理解できるように、従来の遺伝子工学技術もしくは組換え技術、抗体産生技術、生物学的液体もしくは組織からの抽出および精製のための技術を用いて、または当業者には広く知られたタンパク質および抗体を取得するための任意の他の従来技術により、本発明の意味における抗体の変異体を取得することができる。技術の例示的な非限定例は、遺伝子工学技術を用いて様々なサイズ、組成および構造の組換え抗体の産生のために設計されたベクター中でそれらを再設計し、発現させることができる。抗体の産生および精製のための主な方法の概説については、例えば、次に見出すことができる：
・“Handbook of Therapeutic Antibodies”, by S. Duebel. Editor: Wiley-VCH, 2007, Vol: I to III (ISBN 978-3527314539)；
・“Antibodies: Volume 1: Production and Purification” by G. Subramanian Ed., Editor: Springer, 1st Ed, 2004 (ISBN 978-0306482458)；
・“Antibodies: Volume 2: Novel Technologies and Therapeutic Use”, by G. Subramanian Ed., Editor: Springer, first edition, 2004 (ISBN 978-0306483158)；
・“Molecular Cloning: a Laboratory manual”, by J. Sambrook and D.W. Russel Eds., Publisher: Cold Spring Harbor Laboratory Press, third edition, 2001 (ISBN 978-0879695774)
特別な実施形態において、本発明は、全長ヒトLIFを認識するがアミノ酸1〜72に対応するLIF断片を認識しない、そして、より好ましくは、アミノ酸1〜127に対応するLIF断片を認識しない、そしてさらにより好ましくはアミノ酸1〜160に対応するLIF断片を認識しない抗体に関する。

本発明の意味では、ヒトLIFのアミノ酸160〜202が構成する領域は前記モノクローナル抗体がLIFまたはその断片を認識するために必要である（図1）。それ故に、特別な実施形態において、本発明はヒトLIFのアミノ酸160〜202が構成する領域内のエピトープを認識する抗体に関する。

さらになお特別な実施形態において、前記抗体はヒトLIFのアミノ酸160〜180に対応する領域、アミノ酸170〜190に対応する領域領域、アミノ酸180〜200に対応する領域、アミノ酸182〜202に対応する領域に含まれる領域が構成するエピトープを認識する。

本発明者らはヒトLIFを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を作製した。前記抗体はIgG 1アイソタイプである。この抗体はアミノ酸残基1〜160の配列を含まないLIF断片を認識する。それ故に、他の実施形態において、本発明は前記抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関する。かかる抗体を産生する受託番号DSM ACC3054をもつハイブリドーマ細胞株は、Vall d'Hebron Institute of Oncologyによって2010年4月1日にthe Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けられた。それ故に、受託番号DSM ACC3054をもつハイブリドーマ細胞株は本発明に含まれる。このハイブリドーマ細胞株はまた欧州特許出願公告10 380 049.6に記載されている。

当業者は、重複するもしくは部分的に重複する抗原のエピトープと結合する抗体はその抗原との結合に対してお互いに競合することを理解するであろう。当業者はまた、2つの本質的に同一の抗体分子、例えば、同じハイブリドーマ細胞株により産生された2つのモノクローナル抗体は、抗原のエピトープとの結合をお互いに競合して阻害しうることも理解するであろう。従って、例として挙げれば、本発明のハイブリドーマ細胞株DSM ACC3054が産生した1つの抗体分子の結合は、同じ細胞株によりヒトLIFに対して産生されたいずれか他の個別の抗体分子の結合を競合して阻害する。また、DSM ACC3054以外の他の供給源からのいずれか他の抗体分子の結合も、他の抗体分子が一般に同じもしくは重複するエピトープと結合することができる限り、競合して阻害しうる。本発明者らはそのエピトープを含有するLIFの領域を特徴づけた。それ故に、上記抗体によりヒトLIFとのその結合を競合して阻害されるいずれの抗体もまた、本発明による抗体である。特に、2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けられた受託番号DSM ACC3054をもつハイブリドーマ細胞株により産生される抗体により、ヒトLIFとのその結合を競合して阻害されるいずれの抗体もまた、本発明による抗体と考えられる。

他の実施形態において、本発明は、イムノアッセイ、例えばウェスタンブロット、免疫組織化学またはELISAにおける前記抗体の使用に関する。

本発明の治療法
本発明は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患うヒト患者における抗LIF抗体、好ましくは、本発明による抗LIF抗体の効果の基礎となる分子機構を明確にするものである。

本発明の文脈において、「望ましくない細胞増殖に関連する疾患」には癌および腫瘍の成長、進行および転移が含まれる。本発明に記載の方法により治療することができる、望ましくない細胞増殖に関連する疾患の例は、癌、再狭窄、動脈硬化、血管形成疾患、線維症、皮膚疾患、例えば乾癬および炎症性疾患である。

本発明の特別な実施形態において、望ましくない細胞増殖に関連する疾患は癌である。この実施形態は好ましい。

用語「癌」および「腫瘍」は無規制の細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的症状に関する。癌は細胞群が無制限の増殖または欲しない増殖を示す疾患の一種類である。無制限の増殖は、これらの細胞が隣接組織に侵襲し、侵入しかつ破壊すら引き起しうる。癌細胞はまた、他位置へ広がり、そして転移の形成を導きうる。身体における癌細胞の伝播は、例えば、リンパ液または血液を介して起こる。無制御の増殖、侵入および転移形成は癌の悪性の特徴とも呼ばれる。この悪性の特徴が癌を典型的には侵害または転移しない良性腫瘍と区別する。本発明の化合物は、限定されるものでないが、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣および肝臓の腫瘍から選択される癌の治療にとって有用である。特に、本発明の化合物を用いて治療することができる腫瘍には、腺腫、腺癌、血管肉腫、星細胞腫、上皮癌、胚細胞腫、グリア芽細胞腫、グリオーマ、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫および奇形腫が含まれる。特に、腫瘍／癌は、末端性黒子性黒色腫、光線角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、アデノーマ、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管カルチノイド、癌腫、癌肉腫、胆管癌、軟骨肉腫、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣肉腫、スウィング肉腫、限局性結節性過形成、ガストロノーマ、生殖細胞腫瘍、グリア芽細胞腫、グルカゴノーマ、血管芽細胞腫、血管内皮腫、血管腫、肝細胞腺腫、肝細胞腺腫症、肝細胞癌、インスリン炎、上皮内癌、上皮内扁平細胞癌、浸潤性扁平上皮癌、大細胞癌、脂肪肉腫、肺癌、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、神経鞘腫瘍、髄芽腫、髄様上皮腫、中皮腫、粘膜表皮癌、骨髄性白血病、神経芽腫、神経上皮腺癌、結節型黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、乳頭漿液性腺癌、下垂体部腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、前立腺癌、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性腺癌、扁平細胞癌、小細胞癌、柔組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、扁平細胞癌、未分化癌、ぶどう膜黒色腫、いぼ状癌、膣／外陰部癌、ビポーマ、ウィルムス腫瘍の群より選択される。さらにより好ましくは、本発明の化合物を用いて治療しようとする腫瘍／癌には、脳癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、急性骨髄性白血病、プレB細胞急性リンパ芽球性白血病、膀胱癌、星状細胞腫、好ましくは、グレードII、IIIまたはIV星状細胞腫、グリア芽細胞腫、好ましくは、多形成グリア芽細胞腫、小細胞癌、および非小細胞癌、好ましくは、非小細胞肺癌、肺腺癌、転移性黒色腫、アンドロゲン非依存的転移性前立腺癌、アンドロゲン依存的転移性前立腺癌、前立腺腺癌および乳癌、好ましくは、乳管癌または乳癌が含まれる。

特別な実施形態において、癌は、次のうちの1つである：グリオーマ、プレB細胞急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、結腸直腸癌、肺腺癌、前立腺腺癌、膀胱癌、乳管癌または乳癌。さらにより好ましくは、前記グリオーマはグレードIVグリオーマである。

TGF-βはLIFのSmad依存性誘導を介して癌幹細胞の自己更新能力を誘導することができる。LIFは、順に、JAK-STAT経路の活性化に関わり、こうして細胞増殖プロセスおよび腫瘍幹細胞（癌幹細胞）の増加を誘導する（Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009）。STATファミリーメンバー、例えばStat 3の活性化は、典型的には、それらのリン酸化を介して起こる。

本明細書の冒頭で表明したように、本発明者らは、本明細書に記載の本発明によって、望ましくない細胞増殖に関連する疾患、例えば、癌、とりわけ高レベルのLIFのまたはその機能的に同一の変異体に関連する癌の治療における新しい治療ウインドウを開いた。いずれかの理論により拘束されることなく、LIFのおよびその阻害剤の腫瘍増殖に与える影響はLIFの腫瘍幹細胞増殖を促進する能力に基づくと考えられる。本発明者らは、抗LIF抗体、好ましくは本発明による抗LIF抗体による治療は、細胞培養におけるStat3のLIF依存性リン酸化を低下させることを示す（図2）。抗LIF阻害性抗体は腫瘍幹細胞の増殖を阻害することができ、その結果、これらの抗体の使用は、特に幹細胞増殖の阻害から恩恵を得ることができる疾患の治療に有用である。上記のように、本発明の抗体は、ヒトLIFの1〜160に対するアミノ酸残基を含む領域に含まれないLIF断片を認識する特性を有し、これは、順に、これらの抗体がLIFのC末端に結合することを意味する。本発明者らは、驚くことに、この特徴を有する抗体は、癌を含む前記疾患の治療に特に有用であることを示した（図2、図6）。

それ故に、他の態様において、本発明は望ましくない細胞増殖に関連する疾患、例えば、癌、とりわけ高レベルのLIFに関連する癌を治療するための阻害性抗体に関する。

用語「阻害性抗体」は本発明の文脈において、LIFと結合することができてそれによりLIFがその機能を果たすのを阻害することができる抗体と解釈される。「中和化抗体」は同義である。

乳癌において、TGFβと細胞表面マーカーCD44の高レベルを特徴とする細胞集団（CD44^high集団）との間の繋がりが記載されている。TGFβは上皮-間葉移行（EMT）を介してCICの濃縮されたCD44^high細胞集団を増加することが示されている（Gupta et al., Cell, 138, 645-659, 2009；Mani et al., Cell, 133:504-715, 2008）。しかし、グリオーマにおけるCD44^highコンパートメントは徹底して研究されてない。本発明はId1とCD44を、グリオーマにおける癌幹細胞、もっと具体的にはグリア芽細胞腫の新規マーカーと特定する（図3）。特に、本発明者らはCD44^high/CD44^high細胞集団がグリオーマ開始細胞において濃縮されていることを示す（GIC、図4）。

限定されるものでなく単なる説明のための例において、抗LIF抗体、好ましくは本発明による抗LIF抗体は、グリオーマ開始細胞（GIC）で濃縮されたCD44とId1の発現を特徴とする細胞集団を標的化する。特に、抗LIF抗体、好ましくは本発明による抗LIF抗体はId1およびId3の抑制を介してCD44^high/Id1^highGICを標的化する（図5）。さらに、前記抗体はCD44^high/Id1^highGIC集団を枯渇させることができる。それ故に、本発明者らは、抗LIF抗体、好ましくは本発明による抗LIF抗体は、トランスフォーミング成長因子beta（TGFβ）ファミリーメンバーにより調節される経路の阻害剤として機能することを見出した。それ故に、特別な実施形態において、本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントまたは医薬組成物であって、高レベルのCD44およびId1を特徴とする細胞集団を低減することができる前記抗体またはそのフラグメントまたは医薬組成物に関する。その例示の実施例を図5に示した。GBMニューロスフェアは、高レベルのCD44およびId1を特徴とする細胞集団の好ましい例である。例えば、グリア芽細胞腫患者由来の細胞株において、抗LIF抗体、好ましくは本発明による抗LIF抗体は、Id1およびCD44の発現レベルを低下させる（図6）。

さらに、抗LIF抗体、好ましくは本発明による抗LIF抗体によるin vivo処理はCD44^high/Id1^high細胞コンパートメントを減少させることを示す（図7）。それ故に、抗LIF抗体、好ましくは本発明による抗LIF抗体の投与は、腫瘍発症を予防することができ、腫瘍再発を確かに予防すると思われる。

本発明の特別な実施形態において、癌または癌に存在する腫瘍形成細胞は高レベルのLIFを示すことを特徴とする。本発明の文脈において、「高レベル」のLIFは、LIFの濃度が対照サンプル中に存在するLIFの濃度より、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも110％、少なくとも120％、少なくとも130％、少なくとも140％、少なくとも150％以上だけ高いと解釈される。

対照サンプルは、試験サンプル中のLIFの相対的レベルを決定するための参照として用いられるLIFのレベルを有するサンプルと解釈される。前記参照サンプルは典型的には臨床の視点から文献に十分記載されたかつ病気でない患者から得られる。前記サンプルにおいて、バイオマーカー濃度は、例えば、参照集団中の平均濃度の決定の技法により決定することができる。ある特定マーカーの参照濃度の決定において、サンプルの型のいくつかの特徴、例えば、年齢、性別、物理的状態などを考慮することも必要である。例えば、参照サンプルは、その集団が統計的に有意となるように、少なくとも2、少なくとも10、少なくとも100〜1000以上の個体の同一量の群から得ることができる。

LIFの濃度は細胞内で、間隙中で、または抽出物（細胞内と間隙中の両方のタンパク質が見出される）で定量することができる。LIFのレベルは免疫学的方法を用いてタンパク質の量を測定する手法により定量することができる。

さらに特別な実施形態において、LIFレベルを定量する免疫学的方法は、抗LIF抗体を含むものであり、そしてさらに特別な実施形態において、それは本発明による抗体を含むものである。

他の態様において、本発明は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を治療するための、治療上有効量の本発明による阻害剤と共に製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物に関する。望ましくない細胞増殖に関連する疾患の例は本明細書において先に記載されている。

本発明の文脈において、「治療上有効量」はこの特定の事例においては、望ましくない細胞増殖に関連する疾患の治療で望ましい効果を達成するのに必要である、LIFの発現および／または活性を阻害する薬剤の量と解釈される。一般に、投与される本発明に記載の抗体の治療上有効量は、他の因子のうち、治療しようとする個体、前記個体が罹患している疾患の重篤度、選択される剤形などに依存するであろう。この理由から、本発明に記載の用量は、当業者にとっての指針に過ぎないことを考慮しなければならず、後者は先に記載した変数に従って用量を調整しなければならない。それでも、本発明に記載の抗体は1日に1回以上、例えば、1日に1、2、3または4回投与することができる。

本明細書の文脈において、用語「治療」または「治療する」とは、望ましくない細胞増殖に関連する疾患または1以上の症候を防止、軽減または除去するための本発明に従う抗体の投与を意味する。「治療」はまた、前記疾患の生理学的後遺症を防止、軽減または除去することを含む。本発明の文脈において、用語「軽減する」とは、主観的（患者の感覚もしくは患者について）および客観的（測定したパラメーター）に、治療される患者の状況のいずれかの改善を意味すると解釈される。

用語「ビヒクル、アジュバントおよび／または担体」は、活性成分と共に投与される分子的実体または物質に関する。かかる医薬ビヒクル、アジュバントまたは担体は、無菌液、例えば、水および油（石油または動物、植物もしくは合成起源の油を含む）、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、賦形剤、崩壊剤、湿潤剤または希釈剤であってもよい。好適な医薬担体は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。

本発明の文脈において、用語「製薬上許容しうる」は、生理学的に許容しうるものであり、典型的には、それらをヒトに投与した場合、アレルギー反応または消化管障害、眩暈などの同様の副作用を引き起こさない分子的実体および組成物に関する。用語「製薬上許容しうる」は、連邦もしくは州政府の規制当局により認可されるか、または米国薬局方もしくは動物、およびより具体的には、ヒトにおける使用のための他の一般に認識された薬局方に含まれることを意味することが好ましい。

抗体、ならびに前記抗体を含有する医薬組成物は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患の治療において有用な他のさらなる薬剤と一緒に用いることができる。前記さらなる薬剤は同じ医薬組成物の一部を形成してもよく、あるいは、前記抗体を含む医薬組成物の投与と同時であってもまたはなくてもよいそれらの投与のために、別の組成物の剤形で提供してもよい。

望ましくない細胞増殖に関連する疾患の治療において有用な他のさらなる薬剤の例としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、例えば、シクロホスファミド、カルムスチン、ダウノルビシン、メクロレタミン、クロラムブシル、ニムスチン、メルファランなど；アントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシンなど；
タキサン化合物、例えば、パクリタキセル、ドセタキセルなど；トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、エトポシド、テニポシド、ツリポシド、イリノテカンなど；ヌクレオチド類似体、例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン、フトラフルなど；白金に基づく薬剤、例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンなど；抗新生物剤、例えば、ビンクリスチン、ロイコボリン、ロムスチン、プロカルバジンなど；ホルモン調節剤、例えば、タモキシフェン、フィナステリド、5-α-リダクターゼ阻害剤など；ビンカアルカロイド、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなどが挙げられる。好適な化学療法剤は、The Merck Index in CD-ROM、第13版などの文献にさらに詳細に記載されている。

本発明の医薬組成物は、いずれかの抗体を含有する製剤の投与に好適な経路、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内などにより投与することができる。

投与する医薬の投与剤形の説明上の例は、例えば、滅菌溶液、懸濁液もしくは凍結乾燥産物の剤形での非経口投与に好適なものであってよく、この場合、前記医薬組成物は好適な賦形剤、例えば、結合剤、試薬などを含むであろう。いずれの場合でも、賦形剤は選択した医薬剤形に従って選択することができる。

当業者であれば、LIFをコードする遺伝子のヌクレオチド配列中の突然変異であって、タンパク質の機能にとって重要でない位置にアミノ酸の保存的置換をもたらす前記突然変異は、その全体構造または機能に影響しない進化としては中立の突然変異であることを理解する。前記変異体は本発明の範囲に包含される。

本明細書で使用する「機能的に等価な」または「機能的に等価なその変異体」は、それが誘導された元の分子と機能的関係を有する分子（すなわち、元の分子の誘導体）を記載する。さらに典型的には、その分子はそれが誘導された元の分子と機能的および構造的関係の両方を有する。機能的／構造的関係は次の通り解釈すべきである。

A．機能的関係：本明細書で使用するLIFと機能的関係をもつ分子は、LIF活性に対するin vitroアッセイにおいて、LIFの効果と比較して50〜200％の範囲の、より好ましくはLIFの効果と比較して80〜120％の範囲の、そして最も好ましくはLIFの効果と比較して95〜105％の範囲の、例えば、本質的に100％のLIFの効果を有する。様々なLIF活性のin vitroアッセイが当業者に知られている。例えば、Hirobe, 2002, J. Cell. Phys., 192:315-326に示されたように、LIFまたはその機能的等価体を加えた時のメラノサイトの分化を測定してもよい。さらに特に、Hirobe, 2002, J. Cell. Phys., 192:315-326の図2Aに示したように、LIFを加えた時のメラノサイトのパーセントを測定してもよい。

B．構造的関係：LIFと構造的関係をもつ分子は、(1)標準トリス/グリシンSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で、当業者に公知のように、LIFと本質的に同じく泳動することができる、および／または、(2)異なる糖鎖パターンを有する分子である、および／または、(3)そのアミノ酸配列がヒトLIFから誘導された、すなわち、ヒトLIFの1以上（すなわち、1〜5、1〜10または1〜20）のアミノ酸が改変、置換、付加または欠失された分子である。LIFに対して１以上のアミノ酸の前記挿入、欠失または改変を有しかつさらになおLIFと同じ機能を保存する、これらのLIFの機能的等価体もそれ故に本発明の範囲内に含まれる。好ましい実施形態においては、「機能的に等価な」または「機能的に等価なその変異体」は、LIFと本質的に同じ機能を有することができる分子を記載する。それ故に、本明細書で使用する用語「機能的に等価な」または「機能的に等価なその変異体」はまた、LIFのいずれかの機能的に等価な断片を含むものである。LIFの機能的に等価な変異体についてここで記載した同じことはまた、他のタンパク質、例えば、CD44、Id1およびId3の機能的に等価な変異体に対しても適用される。

用語「断片」はタンパク質の一部分を含むペプチドに関する。この事例では、機能的に等価なLIFの断片はLIFの一部分を含みかつ本質的にLIFと同じ機能を有するペプチドまたはタンパク質である。エフェクター、例えば、LIFの本質的に同じ機能は、「A：機能的関係」のもとで先に記載したように決定することができる。

「抗体の断片」は、抗体の一部分を含む1つのペプチドまたは複数のペプチド、典型的には2、3、4つのペプチドである。これらのペプチドは、任意に、分子間または分子内ジスルフィド架橋を含む。従って、抗体の断片は、任意に、ジスルフィド架橋により連結された1つもしくは2つの軽鎖またはそれらの断片および／または1つもしくは2つの重鎖またはそれらの断片を含みうる。1つの重鎖と軽鎖もしくはそれらの断片または2つの重鎖と軽鎖もしくはそれらの断片による組み合わせが最も典型的である。関連する抗体の断片、または、さらに特に、軽鎖および重鎖の断片は、好ましくは、抗体／鎖の可変ドメイン（V_H）を含む、およびさらに特に抗体／鎖の抗原結合領域を含む断片であることが好ましい。

抗LIF抗体、好ましくは、本発明による抗LIF抗体はまた、腫瘍幹細胞が化学療法に耐性能力のあることが公知であれば、化学療法に耐性のある腫瘍の治療用にも潜在的に興味深い。さらに、本発明者らは、抗LIF抗体、好ましくは、本発明による抗LIF抗体の使用はまた、望ましくない細胞増殖に関連する疾患の再発を防止するためにも好適であることを示す（図7）。

本発明の診断方法
本発明者らは、LIFがそのJAK/STATカスケードにおける関与により、腫瘍幹細胞（癌幹細胞）の細胞増殖プロセスおよび増加を誘導することを見出した。さらに特に、本発明者らはCD44およびId1がグリオーマの新規のマーカーであるという確証を提供する。さらに、本発明者らは、Id1が、CD44の高レベルの発現を特徴とするGICが濃縮された細胞亜集団において優先的に発現されること、およびID1およびID3は抗体が介在するLIF阻害のサインに含まれる遺伝子であることを示した。それ故に、LIF、CD44、Id1、Id3またはこれらのいずれかの組み合わせは、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を診断する診断方法に用いることができる。その診断方法は、LIFのもしくはその機能的に等価な変異体の、またはCD44のもしくはその機能的に等価な変異体の、またはId1のもしくはその機能的に等価な変異体の、またはId3のもしくはその機能的に等価な変異体のまたはこれらの分子のいずれかの組み合わせのレベルを決定することに基づく。好ましくは、診断方法はLIFのもしくはその機能的に等価な変異体のレベルを決定することに基づく。

従って他の態様において、本発明は、被験者における望ましくない細胞増殖に関連する疾患を診断するための、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者の素因を確認するための、または前記被験者の望ましくない細胞増殖に関連する疾患の段階もしくは重症度を決定するための、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患をもつ被験者に投与した治療法の効果をモニタリングするためのin vitro方法であって；前記被験者からの生体サンプル中のLIFのまたはその機能的に等価な変異体の、またはCD44のまたはその機能的に等価な変異体の、またはId1のまたはその機能的に等価な変異体の、またはId3のまたはその機能的に等価な変異体の、またはこれら分子のいずれかの組み合わせの発現レベルを定量するステップを含むものであり；ここで、対照サンプル中のLIFをコードする遺伝子のまたはその機能的に等価な変異体の、またはCD44のまたはその機能的に等価な変異体の、またはId1のまたはその機能的に等価な変異体の、またはId3のまたはその機能的に等価な変異体のまたはこれらの分子の組み合わせの発現レベルと比較した、前記LIFをコードする遺伝子のまたはその機能的に等価な変異体の、またはCD44のまたはその機能的に等価な変異体の、またはId1のまたはその機能的に等価な変異体の、またはId3のまたはその機能的に等価な変異体のまたはこれらの分子の組み合わせの発現の増加は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者のより大きい素因、または前記被験者に投与した治療法に対する非応答を示すものである前記in vitro方法に関する。好ましい実施形態において、前記in vitro方法はLIFまたはその機能的に等価な変異体をコードする遺伝子の発現レベルを、対照サンプルにおけるLIFまたはその機能的に等価な変異体をコードする遺伝子の発現レベルと比較して定量するステップを含むものである。

従って、本明細書で使用する用語「機能的に等価な変異体」はまた、前記マーカータンパク質の任意の機能的に等価な断片を含む。用語「断片」は、前記マーカータンパク質の一部を含むペプチドに関する。この場合、機能的に等価な断片は、前記マーカータンパク質の一部を含み、前記マーカータンパク質と本質的に同じ機能を有するペプチドまたはタンパク質である。「マーカータンパク質」は好ましくは、LIF、CD44、Id1およびId3を意味するが、これらに限定されるものでない。

本明細書で使用する診断の用語は、被験体が疾患を患う確率を評価するステップに関する。当業者であれば理解できるように、かかる評価は通常、診断しようとする被験体の100％について正しいとは限らないが、正しいことが好ましい。しかし、この用語は、被験体の統計的に有意な部分を疾患を患っているか、またはそれに対する素因を有すると特定できることは必要である。当業者であれば、いくつかのよく知られた統計的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、Mann-Whitney検定などを簡単に用いることにより、関係が統計的に有意であるかどうかを決定できるであろう。詳しくは、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に記載されている。好ましくは信頼区間は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％である。p値は、好ましくは0.2、0.1、0.05である。

本明細書で使用する用語「素因」は、被験体が依然として疾患、または上記の疾患の症候のいずれか、または他の診断基準を生じていないが、ある特定の確率で将来に疾患を生じうることを意味する。前記確率は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患の開始の統計的確率とは有意に異なるであろう。望ましくない細胞増殖に関連する疾患を生じる確率が、素因の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または100％であることを診断することが好ましい。前記確率は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患の発症の統計的確率と有意に異なりうる。望ましくない細胞増殖に関連する疾患を生じる確率は、素因の少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または100％であることを診断することが好ましい。素因の診断を、予後または被験者が疾患を生じる確率の予測と呼ぶこともある。

本発明の文脈において、「対照サンプル」は、本発明において用いられる遺伝子およびタンパク質の発現レベルの変動を決定するのに用いられる参照サンプルと解釈される。一実施形態において、参照値は、健康な個体から得た組織のサンプルを用いて提供されるシグナルから参考値を取得する。好ましくは、サンプル中のポリペプチドの量が集団中の前記分子の平均値を反映するように、サンプルをいくつかの健康な個体の同じ組織から取得して混合する。

こうして、本発明の特別な実施形態において、LIFのまたはCD44のまたはId1のまたはId3の発現レベルを定量することができる。

当業者は理解するように、タンパク質の発現レベルは、任意の従来の方法を用いて定量することができる。非限定の例として、タンパク質のレベルは、例えば、前記タンパク質(または抗原決定基を含むその断片)に結合する能力を有する抗体の使用および形成される複合体のその後の定量により定量することができる。これらのアッセイにおいて用いる抗体を標識していてもよいし、または標識していなくてもよい。用いることができるマーカーの説明のための例としては、放射性アイソトープ、酵素、フルオロフォア、化学発光試薬、酵素基質もしくはコファクター、酵素阻害剤、粒子、染料などが挙げられる。非標識抗体(一次抗体)および標識抗体(二次抗体)を用いる本発明において用いることができる様々な公知のアッセイが存在する；これらの技術には、ウェスタンブロット、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、RIA(ラジオイムノアッセイ)、競合的EIA(競合的酵素免疫アッセイ)、DAS-ELISA(二重抗体サンドイッチELISA)、免疫細胞化学技術および免疫組織化学技法、特異的抗体を含むタンパク質のバイオチップもしくはマイクロアレイの使用に基づく技法またはディップスティックなどの形式でのコロイド沈降に基づくアッセイが含まれる。他の特定の実施形態においては、タンパク質レベルの定量を、免疫分析法、例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学分析またはELISAを用いて実施する。さらになお特別な実施形態において、前記免疫分析法は本発明の意味における受託番号DSM ACC3054をもつハイブリドーマ細胞株により産生される抗体を含むものである。

同様に、本発明の診断方法は、以上に定義した望ましくない細胞増殖に関連するいずれかの疾患に適用することができる。好ましい実施形態においては、望ましくない細胞増殖に関連する疾患は、癌、好ましくは、LIFの高いレベルまたはId1、Id3、CD44のいずれかの高いレベルを有する癌である。

本発明の方法の実施は、研究しようとする被験体から生物学的サンプルを取得するステップを含む。前記サンプルの非限定の説明例には、様々な型の生体液、例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、腹水、糞便、尿および唾液、ならびに組織のサンプルが含まれる。生体液のサンプルは、組織サンプルのようないずれかの従来法により取得することができる；説明として挙げれば、前記組織サンプルは、外科切除により得られる生検サンプルであってよい。

他の態様において、本発明は、LIFのもしくはその機能的に等価な変異体の、またはCD44のもしくはその機能的に等価な変異体の、またはId1のもしくはその機能的に等価な変異体の、またはId3のもしくはその機能的に等価な変異体の、またはこれら分子のいずれかの組み合わせの発現レベルを定量するための試薬を含むキットであって、被験者における癌を診断するための、または、前記癌を患う被験者の素因を確認するための、または前記被験者の癌の段階もしくは重症度を決定するための、または
前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患をもつ被験者に投与した治療法の効果をモニタリングするための前記キットに関するものであり、ここで、もし試薬が対照サンプルと比較して前記遺伝子または前記タンパク質もしくはその機能的に等価な変異体の発現の増加を検出すれば、前記被験者は望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う可能性があるか、または望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患うさらに大きい素因を提示するか、または前記疾患のさらに高い重症度を示すか、または投与した治療法は有効でないことを示す。その好ましい実施形態において、キットはLIFのもしくはその機能的に等価な変異体の発現レベルを定量するための試薬を含むことにより特徴付けられる。

本発明はまた、前記キットの使用に関する。

前記キットの使用の定義において使用した全ての用語と表現は、他の本発明の態様および本発明の特定の実施形態について上に記載されかつ説明されており、本明細書に記載のキットの使用にも適用可能である。

特注の療法を設計する、および抗LIF抗体に基づく治療法が好適な患者を選択する方法
他の態様において、本発明は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う患者に対する特注の治療法を設計するin vitro方法であって、
（a）前記患者におけるLIFの発現レベルを定量するステップ、および
（b）前記発現レベルを対照レベルと比較するステップを含み、
ここで、もし前記患者におけるLIFの発現レベルが対照値より大きいと、LIFに対する抗体を前記患者に投与する前記方法に関するものである。

他の態様において、本発明は、LIFに対する抗体を用いて治療する、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う患者を選択するin vitro方法であって、
a)前記患者におけるLIFの発現レベルを定量するステップ、および
b)前記発現レベルを対照レベルと比較するステップを含み、
ここで、もし前記患者におけるLIFの発現レベルが対照値より大きいと、前記患者はLIFに対する抗体を用いる治療を受けることが選択される前記方法に関する。

両方の態様において、好ましい実施形態は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患が望ましくない幹細胞増殖と関連している実施形態である。

望ましくない細胞増殖を示す疾患は、先に記載したものである。好ましい実施形態において、望ましくない細胞増殖を示す前記疾患は癌である。さらにより好ましくは、前記癌は、高い活性のJAK-STATシグナル伝達経路により引き起こされる。

好ましい実施形態において、前記癌は次のものである：グリオーマ、プレB細胞急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、結腸直腸癌、肺腺癌、前立腺癌、膀胱癌、乳管癌または乳癌のうちの1つである。さらにより好ましくは、前記グリオーマはグレードIVグリオーマである。

本発明の予後判定の方法
他の態様において、本発明は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う患者の平均余命を予測する予後判定のin vitro方法に関する。この方法は、例えば、グリオーマの場合、対照患者より高いLIF発現レベルを示す患者の平均余命は短いという観察に基づく。本発明者らはCD44およびId1はGICのマーカーであるという確証を提供する。これらのマーカーはGBM患者に芳しくない予後判定を与える。望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者における、LIFの高いレベルとId1およびCD44、それぞれの高いレベルとの間の上記の関係は、予後判定の信頼しうる新規マーカーを提供する。

この方法は、
a)前記患者におけるLIFまたはCD44またはId1またはId3の発現レベルを定量するステップ、および
b)前記発現レベルと対照レベルとを比較するステップ、に基づく方法であって、
もし前記患者におけるLIFまたはCD44またはId1またはId3の発現レベルが、同疾患の対照患者の値より高い場合、前記患者はおそらく対照群より短い平均余命を有するとする前記方法である。

さらに具体的な態様においては、LIFまたはCD44またはId1またはId3またはこれらのマーカーのいずれかの機能的に等価の変異体の濃度を、予後判定の目的で、すなわち、前記疾患を患う個体の平均余命を予測するために測定することができる。好ましくは、LIFまたはその機能的に等価な変異体の濃度を測定する。この目的のために、腫瘍患者からのLIFまたはその機能的に等価な変異体、またはCD44またはその機能的に等価な変異体、またはId1またはその機能的に等価な変異体、またはId3またはその機能的に等価な変異体またはこれらの分子のいずれかの組み合わせの濃度を同じマーカーの参照濃度と比較する。本明細書で使用するLIF、CD44、Id1およびId3またはLIF、CD44、Id1およびId3の機能的等価体は「マーカー」である。好ましくは、腫瘍患者からのLIFまたはその機能的に等価な変異体の濃度を、LIFまたはその機能的に等価な変異体の参照濃度と比較する、すなわち、マーカーはLIFまたはその機能的に等価な変異体である。参照サンプルは参照患者群から取得する。参照患者の群は典型的には、十分に立証された、同じ疾患を患う患者から成る。例えば、参照サンプルを、前記疾患を患う患者集団が統計的に有意であるように、少なくとも2、少なくとも10、少なくとも100から1000を超える個体群の同一量から取得することができる。参照群は、以下の１以上の項目からなってもよい：
a)前記疾患を患う全ての患者、
b)有意にアップレギュレーションされたLIFのレベルを示さない同じ疾患に罹患する全ての患者、
c)有意にダウンレギュレーションされたLIFのレベルを示す同じ疾患に罹患する全ての患者。

LIFの濃度は、細胞内で、間質性間隙中で、または抽出物（細胞内タンパク質内と間質性間隙中の両方のタンパク質が見出される）で定量することができる。

この態様において、好ましい実施形態は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患である。さらに特別な実施形態において、望ましくない細胞増殖に関連する疾患は癌である。さらにより好ましくは、癌の型は、前記癌の患者のサブセット(部分集合)におけるLIFの異常に高いレベルと関連する。さらに特別な実施形態において、前記癌は白血病、グリオーマ、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌のうちの1つである。さらに特別な実施形態において、白血病は、プレB細胞急性リンパ芽球性白血病または急性骨髄性白血病であり、乳癌は乳管癌または乳腺癌である。

統計学的方法により、前記タンパク質またはその機能的に等価な変異体のレベルに基づいて患者の平均余命を予測することができる。前記タンパク質は好ましくはLIFである。

本明細書で使用する用語「機能的に等価な変異体」はまた、前記マーカータンパク質LIFの機能的に等価な断片も含む。用語「断片」は前記マーカータンパク質の一部分を含むペプチドに関する。本事例において、機能的に等価な断片は前記マーカータンパク質の一部分を含みかつ前記タンパク質と本質的に同じ機能を有するペプチドまたはタンパク質である。

さらに特別な実施形態において、タンパク質のレベルの定量は免疫分析法、例えばウェスタンブロット、免疫組織化学またはELISAを用いて実施される。さらになお特別な実施形態において、前記免疫分析法は、受託番号DSM ACC3054のハイブリドーマ細胞株により産生される抗体を含むものである。

本発明を、以下の実施例を用いて説明するが、これは単に説明用のかつ非限定の例と考えなければならない。

材料および方法：
細胞株および一次細胞培養
PCTCおよびGBMニューロスフェアを先に記載の通り作製した（Bruna et al., Cancer Cell, 11:147-160, 2007; Gunther et al., Oncogene, 2007）。概要を述べると、腫瘍サンプルを外科切除後30分以内に処理した。細かく切り刻んだヒトGBMサンプルを、PBS中で2時間、37℃にて絶えず激しく撹拌しながら、200U/mlコラゲナーゼI（Sigma）および500U/ml DNase I（Sigma）を用いて消化した。単一細胞懸濁液を70μm細胞ストレーナー（BD Falcon(登録商標)）を通して濾過し、PBSを用いて洗浄した。最後に、細胞を、10％FBS（PCTC培養用）を含むDMEMにまたはニューロスフェア培地（GBMニューロスフェア用）に再懸濁し次いで培養した。ニューロスフェア培地は、B27（GIBCO）、Lグルタミン（GIBCO）、ペニシリン／ストレプトマイシン、および成長因子（20ng/ml EGFおよび20ng/ml FGF-2［PeproTech］）を補充した神経基礎培地（GIBCO）から成った。ヒトGBM標本はVall d’Hebron Hospitalから得たものである。

臨床プロトコルはthe Vall d’Hebron Institutional Review Board（CEIC）により認可され、全ての被験者からインフォームドコンセントを得たものである。

頭蓋内腫瘍アッセイ
全てのマウス実験は欧州連合および国家の指導に一致した、Vall d’Hebron Research Instituteの研究所動物愛護委員会（the Institutional Animal Care Committee）ガイドラインの認可を得てそれに従って実施した。細胞を、9週齢のNOD/SCIDマウス(Charles River Laboratories)の右脳半球の線条体(ブレグマに関して1mm前方、1.8mm側方、および2.5mm実質内)中に定位的に接種した。マウスが神経症候を示すか、または有意な体重減少を示した時にはマウスを安楽死させた。腹腔内にガドリニウムジエチレントリアミン五酢酸を0.25mmolガドリニウム/kg体重の用量で注射したマウスにおいて、磁気共鳴画像化（MRI）を実施した。AVANCE 400システム(Bruker)と接続した9.4Tの垂直ボア磁石において、先に記載されたスピン-エコー系列（Penuelas et al., Cancer Cell, 15:315-327, 2009）を用いて、全脳からのT1W磁気共鳴画像を得た。製造業者（Bruker）から与えられたソフトウエアを用いて各画像における腫瘍組織に対応するピクセル数を測定することにより、腫瘍体積を定量した。

統計解析
統計解析についてはスチューデントt検定を実施した。グラフ中のデータは平均±SDを表す。

プラスミドおよび試薬
TGFβ1（R&D）、TβRI阻害剤LY2109761（Eli Lilly）およびSB431542（Tocris）を示した濃度で用いた。p-Smad2、Smad2（細胞シグナル伝達）；α-チューブリン（Sigma）およびId1（C20、Santa Cruz Biotechnology）に対する特異的抗体を免疫ブロットに用いた。レンチウイルス構築物を作製し先に記載の通り充填した（Zufferey et al., Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997）。ニューロスフェアを増殖培地で解離し、ウイルスを混合し、そしてプレーティングした。ポリブレン（Sigma）を8μg/mlの濃度で加えた。細胞をウイルスと共に12時間インキュベートし、PBSで洗浄し、そして先に記載された新鮮培地（Zufferey et al., Nat. Biotechnol., 15:871-875, 1997）でインキュベートした。

CD44-ポジティブ集団のフローサイトメトリーによる分析
ニューロスフェアを解離し、個々の細胞を15分間、10μg/mlヒトIgGを含有する遮断溶液中でインキュベートし、次いで、両方共にFITCと結合した抗CD44抗体または対照IgG2bアイソタイプ（BD Pharmingen）とインキュベートした。細胞を20分間光から保護された氷上でインキュベートし、PBSで洗浄し、そしてヨウ化プロピジウム（Sigma）で染色して瀕死の細胞を識別した。細胞を次いでCD44-FITCで染色後、フローサイトメトリー（FACSCalibur; Beckton Dickinson）により分析するかまたはソートした（MoFlo； DAKO）。

マウス脳中の同所性異種移植体からヒト細胞の単離
ニューロスフェアを接種したマウスからの脳を切除し、pan-MHCクラスI特異的mAbHP-1F7（Santa Cruz Biotechnology）で、次に二次PE結合したmAb（Dako Cytomation）で染色し、その後、ヒトMHC-Iポジティブ細胞（MoFlo-DAKO）の細胞ソーティングを行った。得た細胞を洗浄し、直接、その後の実験に用いた。

ニューロスフェア形成アッセイ
同じ数の細胞を低い細胞密度（4細胞/μl）にて96ウエルプレートのウエル中に播種した。細胞を示した化合物で処理し、新しく形成したニューロスフェアの培養中の総数を7日後に数えた（Lee, et al. Cancer Cell, 13:69-80, 2008；Reynolds and Weiss, Dev. Biol. 175:1-13, 1996）。

自己更新アッセイ
100細胞/μlでプレーティングした、示したGBMニューロスフェアからの細胞を、示した化合物で7日間処理した。ニューロスフェアを次いで解離し、処理を行わずに再プレーティングし、さらに7日間インキュベートした。新しく形成されたニューロスフェアの総数を数えた。

定量リアルタイムPCR
定量リアルタイムPCR（qRT-PCR）をApplied Biosystemから得たTaqmanプローブを用いて、製造業者の推奨に従って実施した。反応はABI 7900 系列検出器（Perkin Elmer）において行い、そして結果をΔΔCt方法により計算した対照サンプルに対する倍数変化として表した。GAPDHを内部規準化対照として用いた。

免疫組織化学、免疫細胞化学
組織マイクロアレイ作製については、3つの0.6mmコアを別々の領域から取得し、それぞれの1つを1mm間隔の格子の受給ブロック中に行列配置した。次の抗体をタンパク質検出のために用いた：抗Id1（BioCheck）、抗CD44（Ab-4、Neomarkers）、抗CD31（クローンJC70A、DAKO）。Id1の定量分析については、染色した腫瘍細胞のパーセントおよび染色の強度を、光学顕微鏡を用いて組織切片上の代表的な高パワーフィールド（x400）において評価した。その結果をH-スコアまたはポジティブ細胞のパーセントとして表した。

ニューロスフェアのId1（Santa Cruz Biotechnology）免疫組織化学を、先に記載された通り実施した（Geschwind et al., Neuron, 29:325-329, 2001）。核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて対抗染色した。

顕微解剖
壊死巣から離れた代表的な腫瘍の領域を、凍結サンプルの10μmヘマオキシリネオシン染色切片上で特定した。腫瘍細胞をMicrodisector Leica LMD6000を用いて顕微解剖し、RNAeasy Microキット（Qiagen）を用いて製造業者の推奨により処理してRNAを得た。

ルシフェラーゼアッセイ
GBMニューロスフェア細胞を、異なるID1プロモーターレポーター構築物とpRL-TKウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（Promega）により、規準化対照としてリポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて一過的に形質転換した。

実施例１ヒトLIFに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株
ヒトLIFに対する抗体を産生する目的でハイブリドーマ細胞株を当業者に周知の方法により作製した。これらのハイブリドーマ細胞株から1つの細胞株を選択し、2010年4月1日、Vall d’Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けられた。これは受託番号DSM ACC3054が割り当てられた。従ってまた、前記細胞株が産生する抗体の均一集団を選択した。ハイブリドーマ細胞株DSM ACC3054（2010年4月1日、Vall d’Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けられたもの）により産生される抗ヒトLIFモノクローナル抗体（α-LIF）の結合特異性を、その後、免疫沈降により決定した。この目的で、ヒトLIFタンパク質のC末端EGFPタグ付きバージョンを用いて形質転換しておいた293T細胞を溶解し、モノクローナル抗LIF抗体による免疫沈降で処理し、引き続いてプロテインA/Gを溶菌液に加えそして免疫沈降物を溶出した。LIF断片を、抗EGFP抗体を用いて免疫ブロットにより検出した。この分析は、アミノ酸160〜202から成るヒトLIFタンパク質のC末端ドメインが存在する限り、前記抗体がLIFとその変異体を認識することを示した。EGFPタグ付き全長LIFはモノクローナル抗体により認識されたが、アミノ酸1〜72、1〜127または1〜160に対応するEGFPタグ付きLIFは認識されなかった（図1B）。従って、アミノ酸160〜202から成るヒトLIFタンパク質のC末端ドメインが、抗LIF抗体による認識に必要である（図1C）。

実施例２モノクローナル抗LIF抗体は、細胞培養物中のおよび患者由来のグリア芽細胞腫ニューロスフェア中のLIFによるホスホ-Stat3の誘導を遮断する。
2010年4月1日、Vall d’Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けられたハイブリドーマ細胞株が産生するモノクローナル抗LIF抗体のLIF下流を遮断する効果を試験するために、U373細胞を、ヒト組換えLIFの存在または非存在のもとで、示したモノクローナル抗体の存在または非存在のもとでまたは対照とアイソタイプが整合したIgGの存在のもとで処理した。引き続いてのウェスタンブロットによるホスホ-Stat3レベルの定量は、LIF介在性誘導がモノクローナル抗LIF抗体の投与により効果的に遮断されることを示した（図2A）。

前記抗原の、患者由来の癌細胞に与える効果を試験するために、患者由来のGBMニューロスフェアを解離し、任意に、前記抗体またはアイソタイプ整合した対照IgGの存在のもとでインキュベートした。引き続いてのウェスタンブロットによるホスホ-Stat3レベルの定量は、患者由来の細胞において、ホスホ-Stat3のLIF介在性誘導がモノクローナル抗LIF抗体の投与により効果的に遮断できることを示した（図2B）。

実施例３患者由来のGBMニューロスフェアはCD44 ^high /Id1 ^high 細胞コンパートメントを含有する
CD44はある特定の腫瘍のCICにおいて高度に発現されることが記載されている（Visvader and Lindeman, Nat. Rev. Cancer, 8:755-768, 2008）。一致して、本発明者らはGBMニューロスフェアにおいて異なるレベルのCD44を発現する2つの別の集団が存在することを観察した（図3A）。しかし、CD44^highコンパートメントはいままでグリオーマにおいて徹底的に研究されていない。患者ニューロスフェア由来の細胞においてCD44の発現がID1の発現と相関があるかどうかを試験するために、4名の異なる患者からのニューロスフェアのCD44^high集団を、「材料と方法」の項で記載した細胞染色時のフローサイトメトリーによりソートした。次いで、ID1発現レベルをCD44^highおよびtheCD44^low集団においてそれぞれ測定した。興味深いことに、ID1タンパク質とRNAがCD44^highにおいてCD44^lowコンパートメントにおけるよりはるかに高いレベルで検出された（図3Bおよび3C）。興味深いことに、Id3もCD44^high集団において高レベルで存在した、しかし、これはId2（転写因子のIdファミリーの他のメンバー）についてはそうでなかった（図 3B）。従って、CD44の高レベルはID1およびId3の高レベルと相関がある。

実施例４ GBMニューロスフェア中のCD44 ^high /Id1 ^high 集団はグリオーマ開始細胞が濃縮されている
本発明者らは、血清による処理を介する患者由来のニューロスフェアの分化を誘導すると、CD44^highコンパートメントが消滅することを観察した（図4A）。次に、CD44^highとCD44^low細胞をソートし、低密度でプレーティングした。CD44^high細胞はCD44^lowコンパートメントより多いニューロスフェアを作製し（図4B）、CD44^high細胞がCD44^low細胞より高いニューロスフェア形成能力を有することを示した。次に、CD44^lowコンパートメントと比較したCD44^highの腫瘍発症能力を分析した。腫瘍細胞をCD44の発現に基づいてソートし、本発明者らは、減少する量の細胞のin vivo制限希釈移植をNOD-SCIDマウスの右線条体において実施した。腫瘍進行を磁気共鳴イメージング（MRI）によってモニターした。高いCD44のレベルを発現する細胞はCD44を低く発現する細胞よりはるかに腫瘍化した。100.000 CD44^low細胞を接種した7マウスのうちのわずか1マウスが腫瘍を発症したが、同じ数のCD44^high細胞を接種した9マウスのうち9マウスが腫瘍を生じた（図4Cおよび4D）。さらに、10.000または1.000 CD44^high細胞を接種したマウスは腫瘍を生じたが、同じ数のCD44^lowを接種したマウスは決して腫瘍を生じなかった。類似した結果は他の患者、GMB2からの細胞によって得られた（図4D）。CD44^highコンパートメントにより生じた腫瘍は、同じ細胞の不均一性を含む患者の腫瘍の組織病理学的特徴を再現した（図 4E）。例えば、マウスで生じた腫瘍は、患者の腫瘍と同じパーセント（ほぼ70％）のSox2ポジティブおよびネガティブ細胞を含有した（図4E）。全ての結果はCD44^highコンパートメントが、他の腫瘍型に示されたように、GICについて濃縮されていることを示した。

実施例５抗LIF抗体はGBMニューロスフェアにおけるCD44 ^high /Id1 ^high 集団のレベルを低下させる
GBMニューロスフェアを解離し、細胞株DSM ACC3054からの抗LIFモノクローナル抗体またはアイソタイプに整合した対照IgGの存在のもとで7日間、EGFおよびFGFの存在（A）または非存在（B）のもとで培養した。注目すべきは、抗LIF抗体で処理されたニューロスフェアはCD44^highコンパートメントが減少した。従ってTGFβはCD44^highコンパートメント（高レベルのId1を発現しかつGICの濃縮されているコンパートメント）を調節する。

実施例６抗LIF抗体は患者由来のGBMニューロスフェアにおけるCD44およびId1のレベルを減少させる
GBMニューロスフェアを解離しそして抗LIFモノクローナル抗体またはアイソタイプ対照IgGの存在のもとで7日間、EGFおよびFGFの非存在で培養し、そして示した遺伝子のmRNAレベルをqRT-PCRにより分析した。アイソタイプ整合した対照IgGと比較して、Id1 mRNAレベルならびにCD44 mRNAレベルは、患者由来のGBMニューロスフェアの抗LIF抗体を施用すると有意に低下した。

実施例７抗LIF抗体によるin vivo処理はCD44 ^high /Id1 ^high 細胞コンパートメントを減少させる
モノクローナル抗LIF抗体の施用に応答した腫瘍中のGIC集団の減少は腫瘍再発に影響を及ぼすかを試験するために、本発明者らは最初にGBM1ニューロスフェアの接種を介してマウスの腫瘍を生じさせた。細胞の接種1か月後に、マウスに腫瘍が生じていることをMRIにより検出した。その時点で、マウスをモノクローナル抗LIF抗体またはアイソタイプ整合したIgGで10日間処理しそして犠牲にした。ヒト腫瘍細胞を、マウス脳からヒトMHC-Iポジティブ細胞のソーティングを介して単離した（図7A）。

TβRI阻害剤で処理したマウスから取得した細胞は、qRT-PCRにより測定すると、低レベルのID1、ID3およびCD44転写物を示した（図7B）。

実施例８アップレギュレーションしたLIFレベルを示すグリオーマまたはグリア芽細胞腫の患者は短い全平均余命を有する
全グリオーマ患者の一サブセットにおいて、LIFレベルは2倍以上アップレギュレーションされている。ある設定期間にわたって、これらの患者は対照患者と比較して有意に低い生存の確率を有する。例えば、1000日後の生存確率は全グリオーマ患者と比較しておよそ50％に低下し、2倍以下しかアップレギュレーションしてないLIFレベルをもつグリオーマ患者と比較しておよそ35％に低下する（図8）。データは、REpository for Molecular BRAin Neoplasia DaTa (REMBRANDT) program form the National Cancer Instituteから得たものである。

全グリア芽細胞腫患者の一サブセットにおいて、LIFレベルは9倍以上アップレギュレーションされている。ある設定期間にわたって、これらの患者は対照患者と比較して有意に低い生存の確率を有する。例えば、500日後の生存確率は全グリア芽細胞腫患者と比較しておよそ50％に低下する（図9）。データは、REpository for Molecular BRAin Neoplasia DaTa (REMBRANDT) program form the National Cancer Instituteから得たものである。

本発明の好ましい実施形態
以下は本発明の好ましい実施形態である。しかしながら、本発明がこれらの好ましい実施形態に限定されると理解すべきではない。
１．全長ヒトLIFを認識するが、アミノ酸1〜72に対応するLIF断片を認識しない、そして、より好ましくは、アミノ酸1〜127に対応するLIF断片を認識しない、そしてさらにより好ましくはアミノ酸1〜160に対応するLIF断片を認識しないモノクローナル抗体またはその断片。
２．前記抗体がヒトLIFのアミノ酸160〜202に対応する領域に含まれるヒトLIFのエピトープを認識する、上記実施形態１のモノクローナル抗体。
３．前記抗体が次の領域：ヒトLIFのアミノ酸160〜180に対応する領域、アミノ酸170〜190に対応する領域、アミノ酸180〜200に対応する領域、アミノ酸182〜202に対応する領域から選択される領域に含まれるエピトープを認識する、上記実施形態１のモノクローナル抗体。
４．前記抗体はヒトLIFとのその結合が2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けられたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体により競合阻害される、上記実施形態１〜３のいずれかのモノクローナル抗体。
５． IgG1アイソタイプの、上記実施形態１〜４のいずれかのモノクローナル抗体。
６． 2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けられたハイブリドーマ細胞株DSM ACC3054により産生される、上記実施形態１〜５のいずれかのモノクローナル抗体。
７． 2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに預けられたハイブリドーマ細胞株。
８．上記実施形態１〜６のいずれかのモノクローナル抗体またはその断片を含む、ヒトLIFの測定に用いられる免疫分析試薬。
９．腫瘍幹細胞の自己再生の阻害を介して作用する、上記実施形態１〜６のいずれかのモノクローナル抗体または断片。
１０．望ましくない細胞増殖に関連する疾患を治療するための、ヒトLIFに対する抗体またはその断片。
１１．望ましくない細胞増殖に関連する疾患を治療するための、上記実施形態１〜６または上記実施形態９のいずれかの抗体または断片。
１２．上記実施形態１〜６または上記実施形態９〜１１のいずれかの抗体またはその断片の治療上有効量と製薬上許容しうる担体を一緒に含む医薬組成物。
１３．被験者における望ましくない細胞増殖に関連する疾患を診断する、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者の素因を確認する、または前記被験者の望ましくない細胞増殖に関連する疾患の段階もしくは重症度を決定する、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者に投与した治療法の効果をモニタリングするin vitro方法であって、前記被験者からの生体サンプル中の、LIFのまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、CD44のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id1のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id3のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいはこれら分子のいずれかの組み合わせの、発現レベルを定量するステップを含み、ここで、対照サンプル中のLIFをコードする遺伝子のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、CD44のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id1のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id3のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいはこれら分子のいずれかの組み合わせの、発現と比較した、前記LIFをコードする遺伝子のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、CD44のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id1のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id3のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいはこれら分子のいずれかの組み合わせの、発現の増加は、望ましくない細胞増殖に関連する疾患の、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者のより大きい素因の、または前記被験者に投与した治療法に対する非応答を示すものである前記in vitro方法。
１４． LIFのもしくはその機能的に等価な変異体の、あるいは、CD44のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id1のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id3のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいはこれら分子のいずれかの組み合わせの、発現レベルを定量するための試薬を含むキットの使用であって、被験者における望ましくない細胞増殖に関連する疾患を診断するための、または、前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者の素因を確認するための、または前記被験者の望ましくない細胞増殖に関連する疾患の段階もしくは重症度を決定するための、または前記望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者に投与した治療法の効果をモニタリングするための前記キットの使用であり、ここで、もし試薬が対照サンプルと比較して前記遺伝子または前記タンパク質もしくはその機能的に等価な変異体の発現の増加を検出すれば、前記被験者は望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う可能性があるか、または望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患うさらに大きい素因を提示するか、または前記疾患のさらに高い重症度を示すか、または投与した治療法は有効でないことを示す前記キットの使用。
１５． LIFレベルの増加に関連する疾患を患う患者に対する特注の治療法を設計するためのin vitro方法であって、
（a）前記患者におけるLIFの発現レベルを定量するステップ、および
（b）前記発現レベルを対照レベルと比較するステップを含み、
ここで、前記患者におけるLIFの発現レベルが対照値より大きい場合、LIFに対する抗体を前記患者に投与する前記方法。
１６． LIFに対する抗体を用いて治療する、望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う患者を選択するin vitro方法であって、
a)前記患者におけるLIFの発現レベルを定量するステップ、および
b)前記発現レベルを対照レベルと比較するステップを含み、
ここで、前記患者におけるLIFの発現レベルが対照値より大きい場合、前記患者を上記実施形態１〜６または上記実施形態９〜１２の抗体またはその断片を用いる治療を受けるものとして選択する前記方法。
１７．望ましくない細胞増殖に関連する疾患を患う被験者の平均余命のまたは生存確率の予後判定をするin vitro方法であって、前記被験者由来の生体サンプル中のLIFまたはその機能的等価体の発現レベルを定量するステップを含み、ここで、対照サンプル中のLIFまたはその機能的等価体の発現の増加と比較して、LIFまたはその機能的等価体の発現の増加は平均余命が短いことを示す前記in vitro方法。
１８．望ましくない細胞増殖を示す疾患が高レベルのLIFを提示することにより特徴付けられる、上記実施形態１０〜１４のいずれかの抗体もしくはその断片または医薬組成物または方法またはキット。
１９．望ましくない細胞増殖を示す疾患が高レベルのCD44およびId1を発現する細胞集団により特徴付けられる、上記実施形態１０〜１７のいずれか一項に記載の抗体もしくはその断片または医薬組成物または方法またはキット。
２０．望ましくない細胞増殖を示す疾患が癌である、上記実施形態１０〜１９のいずれかの抗体もしくはその断片または医薬組成物または方法またはキット。
２１．癌が次の癌：グリオーマ、プレB細胞急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、肺腺癌、前立腺腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、乳管癌または乳癌の一つである、上記実施形態１８〜２１のいずれかの抗体もしくはその断片または医薬組成物または方法またはキット。
２２．前記グリオーマがグレードIVグリオーマである、上記実施形態２１の抗体もしくはその断片または医薬組成物または方法またはキット。
２３． LIFのレベルの定量をウェスタンブロット、免疫組織化学またはELISAを用いて実施する、上記実施形態１３〜２２のいずれかの方法またはキット。
２４． LIFの発現レベルを測定する方法またはキットが上記実施形態１〜６または上記実施形態９のモノクローナル抗体またはその断片を含む、上記実施形態１３〜２３のいずれかの方法またはキット。
２５．前記抗体またはその断片が高レベルのCD44およびId1により特徴付けられる細胞集団を減少させることができる、上記実施形態１〜６または上記実施形態９〜１２または上記実施形態２０〜２２のいずれかの抗体もしくはその断片または医薬組成物。
２６．前記抗体が腫瘍幹細胞の自己再生の阻害を介して作用する、上記実施形態１〜６、上記実施形態９〜１２または上記実施形態２０〜２２のいずれかの抗体もしくはその断片または医薬組成物。
２７． “LIFのまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、CD44のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id1のまたはその機能的に等価な変異体の、あるいは、Id3のまたはその機能的に等価な変異体の”なる用語が、“LIFのまたはその機能的に等価な変異体の”に限定される、上記実施形態の抗体もしくはその断片または医薬組成物またはキットまたは方法。

DSM ACC3054

Claims

全長ヒトLIFを認識するが、アミノ酸1〜160に対応するLIF断片を認識しないモノクローナル抗体であって、2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたハイブリドーマ細胞株DSM ACC3054により産生されるモノクローナル抗体。
2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたハイブリドーマ細胞株DSM ACC3054。
癌を治療するためのモノクローナル抗体であって、該癌が(a)高レベルのLIF、または(b)高レベルのCD44およびId1を発現する細胞集団、によって特徴付けられる、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
腫瘍幹細胞の自己再生の阻害を介して作用する、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
高レベルのCD44およびId1によって特徴付けられる細胞集団を減少させることができる、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
癌が高レベルのLIFを提示することにより特徴付けられる、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
癌が高レベルのCD44およびId1を発現する細胞集団により特徴付けられる、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片の治療上有効量と製薬上許容しうる担体を一緒に含む医薬組成物。
グリオーマの治療方法において使用するための医薬組成物であって、該グリオーマが(a)高レベルのLIF、または(b)高レベルのCD44およびId1を発現する細胞集団、によって特徴付けられる、請求項８に記載の医薬組成物。
前記グリオーマがグレードIVグリオーマである、請求項９に記載の医薬組成物。
被験者における癌を診断する、または癌を患う被験者の素因を確認する、または被験者の癌の段階もしくは重症度を決定する、または癌を患う被験者に投与した治療法の効果をモニタリングするためのキットであって、LIFの発現レベルを定量する試薬として全長ヒトLIFを認識するが、アミノ酸1〜160に対応するLIF断片を認識しないモノクローナル抗体であって、2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたハイブリドーマ細胞株DSM ACC3054により産生されるモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を含み、ここで、もし試薬が対照サンプルと比較してLIFをコードする遺伝子またはLIFの発現の増加を検出すれば、前記被験者は癌を患う可能性があるか、または癌を患うさらに大きい素因を提示するか、または癌のさらに高い重症度を示すか、または投与した治療法は有効でないことを示す、前記キット。
LIFのレベルの定量をウェスタンブロット、免疫組織化学またはELISAを用いて実施する、請求項１１に記載のキット。
癌が高レベルのCD44およびId1を発現する細胞集団により特徴付けられる、請求項１１に記載のキット。
前記癌がグリオーマである、請求項１１に記載のキット。
グリオーマを患う患者に対する特注の治療法を設計するのを補助するin vitro方法であって、
（a）前記患者におけるLIFの発現レベルを定量するステップ、および
（b）前記発現レベルを対照レベルと比較するステップを含み、
ここで、前記患者におけるLIFの発現レベルが対照値より大きい場合、該患者を請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片を投与する患者として選択する、前記方法。
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片を用いて治療する、グリオーマを患う患者を選択するのを補助するin vitro方法であって、
a)前記患者におけるLIFの発現レベルを定量するステップ、および
b)前記発現レベルを対照レベルと比較するステップを含み、
ここで、前記患者におけるLIFの発現レベルが対照値より大きい場合、前記患者を前記抗体またはその抗原結合性断片を用いる治療を受けるものとして選択する、前記方法。
グリオーマを患う被験者の平均余命のまたは生存確率の予後判定をするのを補助するin vitro方法であって、前記被験者由来の生体サンプル中のLIFの発現レベルを定量するステップを含み、ここで、対照サンプル中のLIFの発現と比較して、LIFの発現の増加は平均余命が短いことを示し、かつ、LIFの定量が、全長ヒトLIFを認識するが、アミノ酸1〜160に対応するLIF断片を認識しないモノクローナル抗体であって、2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたハイブリドーマ細胞株DSM ACC3054により産生されるモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を用いて行われる、前記in vitro方法。
被験者におけるグリオーマを診断する、またはグリオーマを患う被験者の素因を確認する、または被験者のグリオーマの段階もしくは重症度を決定する、またはグリオーマを患う被験者に投与した治療法の効果をモニタリングするのを補助するin vitro方法であって、被験者からの生体サンプル中のLIFの発現レベルを定量するステップを含み、ここで、対照サンプル中のLIFをコードする遺伝子の発現と比較して、LIFをコードする遺伝子の発現が増加している場合、グリオーマを患うこと、被験者がグリオーマを患う大きい素因があること、または被験者のグリオーマがより高い重篤度であること、または被験者に投与した治療法に対して無応答であることを示し、かつ、LIFの定量が、全長ヒトLIFを認識するが、アミノ酸1〜160に対応するLIF断片を認識しないモノクローナル抗体であって、2010年4月1日にVall d'Hebron Institute of Oncologyによってthe Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託されたハイブリドーマ細胞株DSM ACC3054により産生されるモノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を用いて行われる、上記in vitro方法。
LIFのレベルの定量をウェスタンブロット、免疫組織化学またはELISAを用いて実施する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
グリオーマが高レベルのCD44およびId1を発現する細胞集団により特徴付けられる、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
グリオーマがグレードIVグリオーマである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む、ヒトLIFの測定に用いられる免疫分析試薬。