JP6228211B2 - 認知及び美容を目的とする組成物並びに作用薬を調製するための同組成物の使用 - Google Patents

Description

本発明はポリゴナム・ミナス（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｍｉｎｕｓ）の抽出物を含んでなる組成物に関する。

タデ科のポリゴナム・ミナスは、マレーシアの地元ではケサム（ｋｅｓｕｍ）又はラクサ（ｌａｋｓａ）の葉として知られている。ポリゴナム・ミナスは、予防的健康管理のためのウラム（ｕｌａｍ）として一般に摂取される現地の薬用植物である。この植物葉は芳香性であり、ラクサ（香辛料の効いた麺料理）、ケバブ（油で揚げたハーブ飯）、トムヤム（香辛料が入り酸味の効いたスープ）及びアサムペダス（香辛料の効いたタマリンドカレー）のようなマレーシアの珍味の成分として広く使用されている。この葉は、その強い芳香及び香味を得るために薄切りにされて振り掛けられることが多い。マレーシアの伝統的な医学体系では、ケサムの新鮮な葉の煎出物は、消化不良、便秘に対して、また胃病及び疼痛の治療法として摂取される（非特許文献１）。

皮膚は、数多くの外因性（環境）要因及び内因性要因による侵害を受けている。皮膚が老化するにつれて、酸化ストレスの増加、炎症の増加、コラーゲンレベルの減少、酵素ＭＭＰ（ペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ１）の過剰発現、タンパク質グリケーションの増加、並びにミトコンドリア崩壊の増加及びその結果の酸化障害が起きる。

そのような予防及び治療のうち少なくともいずれかの市場には現在多数の組成物が存在する。化粧品中には、抗酸化剤、酵素、フィトエストロゲン、皮膚軟化剤、湿潤剤などのような様々な成分の数多くの組み合わせが存在している。皮膚を保護する該組成物の能力は、該組成物及びその成分に応じて異なっており、その結果、酸化の影響及びその他の皮膚障害を治療するために処方箋なしで使用することが可能な、天然の再生可能な植物材料を利用した局所使用及び全身使用のうち少なくともいずれかに有効な調合物が依然として必要とされている。

さらに、単離された天然の再生可能な材料の他の特徴的な属性を調査することも当分野において望ましい、というのも、臨床的に十分に試験された結果ヒトの健康及び環境に重大な懸念を与えている合成分子と比べて、人類への副作用は最小限又は皆無であって容易に使用可能であるからである。

活性酸素をスカベンジする（ＲＯＳ）性質による抗酸化活性を、コラーゲンの分解を担う酵素を阻害する抗コラゲナーゼ活性と組み合わせていずれも有している有効なスキンケア剤を提供することが通常は非常に困難であると述べることは、適切である。関連分野における上記の既存の挑戦を背景として、意外にも、本発明により、ペルシカリア・マイナー（Ｐｅｒｓｉｃａｒｉａ ｍｉｎｏｒ）としても知られるポリゴナム・ミナスの抽出物が、抗酸化活性及びコラーゲンの分解を防ぐ潜在能力を備えた抗コラゲナーゼ活性の二重の活性による皮膚に有益な属性を有し、したがって皺発生防止／加齢防止並びに抗酸化という特徴による酸化障害に対する生細胞の保護に有利に働く、優れたスキンケア化粧品並びに薬剤及び該薬剤に由来する組成物のうち少なくともいずれかに強く望まれる基準を満たしている、ということが見出された。

ヴィマラ（Ｖｉｍａｌａ）Ｓ、イルハム（Ｉｌｈａｍ）Ｍ．Ａ．、ラシー（Ｒａｓｈｉｈ）Ａ．Ａ．及びロハナ（Ｒｏｈａｎａ）Ｓ．、「シリ・アラム・アンド・リンバ（Ｓｉｒｉ Ａｌａｍ ａｎｄ Ｒｉｍｂａ）（第７巻）健康のための自然の選択：抗酸化植物／ウラム（Ｎａｔｕｒｅ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ ｔｏ Ｗｅｌｌｎｅｓｓ：Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅｓ／Ｕｌａｍ．）」、マレーシア森林研究所（Ｆｏｒｅｓｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｍａｌａｙｓｉａ）（ＦＲＩＭ）、２００３年、ｐ．１３１

本発明は、認知及び美容を目的とするポリゴナム・ミナスからの抽出物を含有する組成物に関する。ポリゴナム・ミナスからの前記抽出物を得る方法も開示される。
別の好ましい実施形態では、組成物は、ケルセチン−３−グルクロニド及びケルシトリンから選択されたアクティブ（ａｃｔｉｖｅｓ）を含んでなるポリゴナム・ミナスの抽出物を含有する。

別の好ましい実施形態では、組成物は、ポリゴナム・ミナスの抽出物として供給された重量比で０．２〜１．０％の量のケルセチン−３−グルクロニドを、及びポリゴナム・ミナスの抽出物として供給された重量比で０．１〜０．５％の量のケルシトリンを、選択的に含有する。

別の好ましい実施形態では、ポリゴナム・ミナスの前記抽出物の量は、赤血球モデルにおける細胞系抗酸化保護（ＣＡＰ−ｅアッセイ）において没食子酸の５５倍に相当することが実証された、該抽出物が有している酸化障害の予防における有効性に基づいて選択される。

別の好ましい実施形態では、ポリゴナム・ミナス由来の活性抽出物の単離プロセスであって、ａ）茎及び葉のうち少なくともいずれかなど植物の地上部を含む前記ポリゴナム・ミナスを、好ましくは材料と溶媒の比率を１：１０〜２０とした、７０〜１０５℃の温度範囲好ましくは８０℃でのパーコレーションによる溶媒抽出に供して抽出物を得るステップと；ｂ）上記ステップ（ａ）から得られた抽出物を濾過した後、濃縮、及び凍結乾燥、噴霧乾燥又は真空ベルト乾燥を使う乾燥を行ってそこから乾燥抽出粉末を得るステップと、を含んでなるプロセスが提供される。

ポリゴナム・ミナスの抽出物の提供についてのフローチャートを例証する図。 ＨＰＬＣヒストグラム（ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）の結果を例証する図。 ケルセチン−３−グルクロニド及びケルシトリンのＵＶスペクトルの比較並びに抽出物中の対応するピークを例証する図。 抽出物のＩＣ_５０用量と既知の抗酸化剤である没食子酸のＩＣ_５０用量との比較を例証する図。 標準品の１，１０フェナントロリン一水和物（対照）によるコラゲナーゼの阻害（％）を例証する図。 ポリゴナム・ミナスの抽出物によるコラゲナーゼの阻害（％）を例証する図。 バーンズ迷路試験のプローブ試行の際のセグメントの概略図。 スコポラミン処理されてさらにイチョウ及びポリゴナム・ミナスでの処理も受けたマウスにおける速度を例証する図。 スコポラミン、スコポラミン及びドネペジル、並びにビヒクルで処理されたマウスにおける速度を例証する図。 スコポラミン及びイチョウ、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（１００ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びＰ．ミナス（５０ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びビヒクルを用いた初回経路長の研究を例証する図。 参照対照物を用いた初回経路長の研究を例証する図。 スコポラミン及びイチョウ、スコポラミン及びＰ．ミナス（１００ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（５０ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びビヒクルを用いた総経路長の研究を例証する図。 参照対照物を用いた総経路長の研究を例証する図。 スコポラミン及びイチョウ、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（１００ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（５０ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びビヒクルを用いた初回過誤の研究を例証する図。 参照対照物を用いた初回過誤の研究を例証する図。 スコポラミン及びイチョウ、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（１００ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（５０ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びビヒクルを用いた合計過誤の研究を例証する図。 参照対照物を用いた合計過誤の研究を例証する図。 スコポラミン及びイチョウ、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（１００ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（５０ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びビヒクルを用いた初回潜時の研究を例証する図。 参照対照物を用いた初回潜時の研究を例証する図。 スコポラミン及びイチョウ、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（１００ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びポリゴナム・ミナス（５０ｍｇ／ｋｇ）、スコポラミン及びビヒクルを用いた合計潜時の研究を例証する図。 参照対照物を用いた合計潜時の研究を例証する図。 スコポラミン処理群並びに５０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇのポリゴナム・ミナス処理群におけるセグメント内で費やされた時間を例証する図。

本発明は、認知及び美容を目的とするポリゴナム・ミナス由来の抽出物を含有する組成物に関する。ポリゴナム・ミナスから前記抽出物を得る方法も開示される。本発明の詳細、本発明の利点は、以降の非限定的な実施例及び添付の図面に関連して以下により詳細に説明される。以下、本明細書は本発明の好ましい実施形態に従って本発明について説明することになる。しかしながら、以降の実施例は、記載を本発明の好ましい実施形態に限定するのは単に本発明の議論を容易にするためにすぎず、かつ当業者が添付の特許請求の範囲から逸脱することなく様々な改変形態及び等価物を考案することができるものと想定されている、と了解されるものである。

茎葉を含む植物の地上部は水を使用して抽出され、オーブン乾燥によっておよそ１：１０の抽出比率で乾燥せしめられる。使用される原料は、大きさが２〜５ｃｍ、乾燥減量が１０％以下、灰分が１０％以下、異物が２％以下、好気性微生物の総数が１０^７個以下、酵母及び糸状菌の総数が１０^５個以下という性質を備えた乾燥葉である。乾燥葉はその後、精製水を使用するパーコレーションのステップに供され、７０〜１０５℃の範囲、好ましくは８０℃の温度で抽出されて抽出物が得られ、該抽出物はさらに濾過され、濃縮され、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥又は真空ベルト乾燥のような方法を使用して乾燥せしめられて乾燥抽出粉末が提供され、該粉末は包装及び保管された。乾燥ステップの後、乾燥抽出粉末は包装されて図１のフローシートの通りに室温で保管される。

該抽出物中のアクティブ（ａｃｔｉｖｅｓ）の同定及び定量並びにポリゴナム（Ｐｏｌｙｇｕｍ）・ミナスの含水量分析が研究され、その結果は以下に提供されている：
得られた抽出物は、以下のアッセイのようにアクティブ（ａｃｔｉｖｅｓ）のケルセチン−３−グルクロニド及びケルシトリンを含むことが分かる：
〔ＨＰＬＣアッセイ：ＨＰＬＣ分析用の試料溶液の調製〕
１．１００．０ｍｇの試料抽出物を５．０ｍＬのメスフラスコ中に正確に量り取り、ＤＭＳＯを容積まで添加する。

２．その後該溶液を約６０℃で１０分間超音波処理し、０．２０ｍのＲＣメンブレンフィルタで濾過し、試験液としてＨＰＬＣ分析に使用する。
〔移動相の準備〕
１．チャネルＡ − １．０ｍＬのＦＡを１０００ｍＬの脱イオン水に加える。該溶液を濾過及び脱気する。

２．チャネルＢ − １．０ｍＬのＦＡを１０００ｍＬのアセトニトリルに加える。
〔クロマトグラフシステム（アジレント１２９０インフィニティ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ））〕
カラム：ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＫｉｎｅｔｅｘ（２．１×１５０ｍｍ、１．７ミクロン（１．７μｍ））
温度：６０．０℃
移動相：溶媒Ａ − ０．１％ＦＡ含有水
溶媒Ｂ − ０．１％ＦＡ含有ＣＡＮ
流速：０．４００ｍＬ／分（グラジエント）
グラジエントシステム
時間（分） 溶媒Ａ（％） 溶媒Ｂ（％）
０．００ ８９．０ １１．０
１８．００ ８９．０ １１．０
２０．００ ５．０ ９５．０
２３．００ ５．０ ９５．０
２５．００ ８９．０ ９５．０
波長：ＵＶ（３６０ｎｍ）、参照４５０ｎｍ
実行時間：２５分（実行後の５．０分を含む）
注入体積：２．０μＬ
データ収集：２５分
図２（ａ）を参照すると、強調された領域は左から、ＨＰＬＣヒストグラムにおけるケルセチン−３−グルクロニド及びケルシトリンそれぞれの存在を示している。さらに、ケルセチン−３−グルクロニド及びケルシチン（ｑｕｅｒｃｉｔｉｎ）は、以下の表１において、ポリゴナム（Ｐｏｌｙｇｕｍ）・ミナスから得られた前記最終抽出物の％アッセイによって定量される。

〔含水量分析〕
試料抽出物の含水量は湿度分析計の使用により決定されたが、該分析計では約０．５〜０．６ｇの粉末試料がアルミニウム皿の上に移されて１０５℃にて一定重量が得られるまで加熱される。乾燥減量（ＬＯＤ）は、当初重量に対する加熱の間の重量損失の比率（％）によって決定される。

表１：ケルセチン−３−グルクロニド及びケルシチン（Ｑｕｅｒｃｉｔｉｎ）のＨＰＬＣ定量（％）アッセイ並びに抽出物の含水量分析

図２（ｂ）を参照すると、ケルセチン−３−グルクロニド及びケルシトリンの保持時間及びＵＶスペクトルをポリゴナム・ミナスの試料抽出物のものと比較することにより、前記試料中における両化合物の存在が示された。したがって、ケルセチン−３−グルクロニド及びケルシトリンはいずれも、上記のＨＰＬＣ研究のようにポリゴナム・ミナスの試料抽出物中に明確に同定される。ポリゴナム・ミナス抽出物は、本明細書中以下の結果のように、美容を増強する特徴について明らかにするために研究された。

〔ポリゴナム・ミナス抽出物の抗酸化活性〕
ポリゴナム・ミナス抽出物の抽出物は、活性酸素吸収能力（Ｏｘｙｇｅｎ Ｒａｄｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ）を使用して抗酸化活性に関して試験され（ＯＲＡＣ法）、ＯＲＡＣ値が非常に高いことが示されている（以下の表を参照されたい）。実施された試験に基づくと、ポリゴナム・ミナスの抽出物は１１，０００マイクロモルＴＥ／グラム〜３６，０００マイクロモルＴＥ／グラムの好ましい活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）値を有しており、好ましいＯＲＡＣ値は少なくとも１６０００マイクロモルＴＥ／グラムである。ポリゴナム・ミナスにおいて生じた高いＯＲＡＣ値は、ｅ−ＣＡＰアッセイを使用して試験して、酸化障害から生細胞を保護する能力についてさらに試験された。

表２：試験的な凍結乾燥ポリゴナム・ミナスから得られた活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）。

表３：市販の凍結乾燥ポリゴナム・ミナスから得られた活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）

表４：試験的な噴霧乾燥ポリゴナム・ミナスから得られた活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）

表５：試験的な凍結乾燥ポリゴナム・ミナスから得られた活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）

表６：担体としてマルトデキストリンを備えた試験的な真空ベルト乾燥ポリゴナム・ミナスから得られた活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）

〔赤血球モデルでの細胞の抗酸化保護（ＣＡＰ−ｅアッセイ）〕
赤血球を使用する細胞の抗酸化保護アッセイとしてのＣＡＰ−ｅアッセイ（２１）は、複雑な天然物中の抗酸化剤は細胞質ゾルに侵入して細胞内の酸化障害の低減に寄与するかという疑問に取り組むために開発された。該アッセイは細胞質ゾル中での効果のみを測定する、というのも、本発明者らが試験で使用するレポーター色素は細胞内空間（すなわち細胞質ゾル）に入り込んだ後でのみ機能性であって、細胞内空間において該色素は化学修飾を受ける結果として細胞内に停留するからである。該アッセイは、生細胞に入り込むことができる抗酸化剤の特異的な半定量化を可能にする（ホンゼル（Ｈｏｎｚｅｌ）ら、「食品及び天然物の評価のための化学的及び細胞系の抗酸化方法の比較：赤血球及び多形核細胞を使用する並行試験による多面的データの生成。（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ ＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＭｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ：Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ Ｄａｔａ ｂｙ ＰａｒａｌｌｅｌＴｅｓｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒＣｅｌｌｓ．）」、ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２００８年）。

試験生成物については、０．５ｇが５ｍＬの生理的ｐＨの０．９％生理食塩水と混合される。試験生成物は転倒混和により混合され、次いで渦流混合される。固形物は２４００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により除去される。生成物の上清は取り出され、次いでＣＡＰ−ｅアッセイに使用するために濾過される。各々の濾過上清から生理的ｐＨの０．９％生理食塩水で系列希釈物が調製される。

赤血球は試験生成物の系列希釈物を用いて２連で処理される。未処理の赤血球の試料（陰性対照）、及び酸化剤で処理されるが抗酸化剤を含有する試験生成物では処理されない赤血球の試料（陽性対照）は、６連で調製される。細胞内に入ることができない抗酸化剤は、遠心分離及び細胞ペレット上の上清の吸引によって除去される。

細胞は、ペルオキシルフリーラジカル生成物質ＡＡＰＨの添加により酸化障害に晒される。酸化障害の結果として蛍光性となる指標色素ＤＣＦ−ＤＡを使用して、各試験試料の蛍光強度の測定により抗酸化障害の程度が記録される。酸化障害の阻害は、生成物で処理された細胞についての、酸化剤のみで処理された細胞と比較して減少した蛍光強度として計算される。ＣＡＰ−ｅ値は、試験生成物のＩＣ_５０用量すなわち酸化障害の５０％阻害を提供した用量を反映する。これは次に、既知の抗酸化剤である没食子酸のＩＣ_５０用量と比較される。

図３を参照すると、赤色のＩＣ_５０のラインが曲線と交差するグラフ上の点は、試験生成物のＩＣ_５０用量、すなわち酸化障害の５０％阻害を提供した用量を反映している。このＩＣ_５０用量は、既知の抗酸化剤である没食子酸（該アッセイ中で対照として使用されている）のＩＣ_５０用量と比較される結果、没食子酸換算ユニットで報告されるＣＡＰ−ｅ値が得られる。抽出物の抗酸化効果は赤血球におけるフリーラジカルからの保護について試験された。ポリゴナム・ミナス抽出物は、没食子酸の５５倍（又は恐らく５５倍超）に相当する細胞保護効果を示し、従ってその比較対象物（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）は活性酸素スカベンジング（ＲＯＳ）活性を有することが証明された。

〔ポリゴナム・ミナス抽出物の皺発生防止効果〕
抽出物は、抗コラゲナーゼ試験並びにＭＭＰ−１及びＭＭＰ−１３を使用して、皺発生防止効果に関してｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された。

〔ｉｎ ｖｉｔｒｏのコラゲナーゼ阻害バイオアッセイ〕
コラーゲンは脊椎動物において最も豊富なタンパク質であり、事実上すべての組織に存在する。コラーゲン細線維は、結合組織、硬骨軟骨、歯、並びに皮膚及び血管の細胞外マトリックスといった支持組織の主成分である。あらゆる年齢の男性において皮膚の厚さ及びコラーゲン含量の間には関係がある。同様の関係は６０歳を超える女性には存在するが、より若い女性ではそれほど明白ではない。成人の皮膚では、老化の特性は総コラーゲン含量と密接に関係しており、総コラーゲン含量は男女とも加齢に伴って減少する。コラーゲンはコラゲナーゼによって分解され、その結果として皮膚の低コラーゲン含量がもたらされる。よって、皮膚のコラゲナーゼ活性が高いと皮膚の皺発生に結びつく可能性がある。コラーゲンの阻害剤は皮膚における皺形成の制御において有用なはずである。特に興味深いのは、活発なコラゲナーゼと慢性関節リウマチの病理との関係である。関節構造体において通常は抑制されているコラゲナーゼが活性化され、それにより（ｔｈｅｒｅｖｙ）関節において特有の組織破壊がもたらされる可能性があることが示唆されている。

溶媒及び試薬：ＥｎｚＣｈｅｋ（商標）ゼラチナーゼ／コラゲナーゼアッセイキット（Ｅ１２０５５、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）、米国のインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、−２０℃で保管）であって：ブタ皮膚由来のＤＱゼラチンのフロウレセイン（Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ）コンジュゲート、１０×反応緩衝液、１，１０フェナントロリン一水和物、クロストリジウム・ヒストリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のコラゲナーゼ、を包含するもの。

２．５ｍｇの試料は、２００μｌのＤＭＳＯに溶解することで調製され、１×反応緩衝液で１０ｍｌとなされた。必要に応じてさらなる希釈物が作製された。ＤＱゼラチンのフロウレセイン（Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ）コンジュゲートの酵素切断によりフロウレセント（ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ）ペプチドが放出される。蛍光の増大はタンパク質分解活性に比例する。消化生成物フォーム（ｆｏｒｍ）のＤＱゼラチンフロウレセイン（Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ）コンジュゲートは４９０ｎｍの光で励起され、５２０ｎｍで放出された光は蛍光測定用プレートリーダで検出される。

コラゲナーゼ阻害アッセイは、ＥｎｚＣｈｅｋ（商標）ゼラチナーゼ／コラゲナーゼアッセイキット（Ｅ１２０５５、モレキュラー・プローブス、米国のインビトロジェン）のキット添付文書の通りに実施された。簡潔に述べると、８０μｌの１×反応緩衝液／ビヒクル緩衝液／試験溶液／様々な濃度の陽性対照、１００μｌの酵素溶液（０．１ユニット／ｍｌ）、２０μｌの基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）が添加されて１５秒間混合され、２５℃で２時間インキュベートされ、蛍光マイクロプレートリーダ［フルオスター・オプティマ（Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ）、ドイツ連邦共和国のＢＭＧラボテック（Ｌａｂｔｅｃｈ）］で次のパラメータを用いて読み取りが行われた、すなわち４９０ｎｍで励起され、５２０ｎｍの発光はＣｏｓｔａｒ（登録商標）９６蛍光プレートリーダによって記録された。

対照反応は試験試料なしで実行され、それぞれ試料ブランク、対照ブランク及びビヒクルブランクが行われた（酵素以外の試薬をすべて含んだもの）。阻害率（％）は以下すなわち：
阻害率（％）＝〔（ＡＦＵ（対照）−ＡＦＵ（試験））／（ＡＦＵ（対照））×１００〕×１００％
のように計算され、上記式中、ＡＦＵは任意の蛍光単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｕｎｉｔ）であり、ＩＣ_５０はログ−プロビット解析を使用して計算された。

上記の表７は、２１．１３μｇ／ｍｌのＰ．ミナス抽出物濃度がコラゲナーゼ活性の５０％阻害のための阻害濃度であることを示している。さらに図４及び図５は、標準物の１，１０フェナントロリン一水和物及びポリゴナム・ミナス抽出物による阻害率（％）を示す。

上記の表８は、ポリゴナム・ミナスの抽出物が５ｍｇ／ｍＬのレベルで有効であり、濃度が５０ｍｇ／ｍＬのレベルまで高められても阻害率（％）はあまり変化せず、従って５ｍｇ／ｍｌのレベルが最大の阻害のための最適レベルであると考えられたことを明らかにしている。

上記の表９は、ポリゴナム・ミナスの抽出物が５ｍｇ／ｍＬのレベルで有効であり、濃度が３０ｍｇ／ｍＬのレベルまで高められても阻害率（％）はあまり変化せず、従って５ｍｇ／ｍｌのレベルがＭＭＰ−１３の１００％の最大阻害のための最適レベルであると考えられたことを示している。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのＭＭＰタンパク質は正常な生理的プロセスにおいてコラーゲンの分解に関与するので、ポリゴナム・ミナスの抽出物によりコラーゲンの分解を防ぐことにより、コラーゲンの分解によって皺発生が引き起こされるような加齢効果を鈍化させる、ということに注目することが重要である。

それに加え、ポリゴナム・ミナス抽出物について、認知を増強する特徴を明らかにするための研究が行われた。
〔アセチルコリンエステラーゼ及びモノアミンオキシダーゼ−Ａに対するポリゴナム・ミナス抽出物のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害作用〕
アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は動物の神経系の重要な酵素であり、認知機能の調節に関与する最も重要な神経伝達物質であると考えられている。ＡＣｈＥ阻害剤は、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療処置についてＦＤＡに承認された重要な薬物の１つである。脳コリンエステラーゼ活性の減少と記憶の改善とを結びつける数多くの研究が存在する。抽出物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアセチルコリンエステラーゼ酵素の阻害に関して試験された。

モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）も神経伝達物質の不活性化において役割を果たし、ＭＡＯ機能不全（ＭＡＯ活性が高すぎる、又は低すぎる）は多くの精神障害及び神経障害の原因となっている。例えば、身体における異常に高レベル又は低レベルのＭＡＯは、うつ病、統合失調症、薬物濫用、注意力欠如障害、片頭痛、及び性成熟異常に関係している。モノアミンオキシダーゼ阻害剤は、食餌又は他の薬物と相互作用するリスクのため最後の治療として使用される場合が多いものの、うつ病の治療のために処方される主な種類の薬物のうちの１つであり、実際に、ＭＡＯ−Ａ阻害剤は抗うつ薬及び抗不安薬として作用する。

上記の表１０はこのように、アセチルコリンエステラーゼ及びＭＡＯ−Ａの阻害への抽出物ポリゴナム・ミナスの効果を明白に示し、前記の両酵素に対する阻害効果は同等であることが見出された一方、前記抽出物がモノアミンオキシダーゼＭＡＯ−Ｂ及びアデノシン

の阻害には顕著な役割を果たさないことは見出されなかった。

〔ポリゴナム・ミナス（ペルシカリア・マイナー）の抽出物を用いた、スコポラミン誘導性の学習及び記憶の障害の治療〕
動物は、高所の覆いのない円形のプラットフォーム上に置かれる。動物は、強烈な光に、又は大きな騒音に曝露される。この強烈な刺激に応答して動物は隠れ場を求め、プラットフォームの周りの穴のうちの１つに入る。該デバイスは元来はラットと共に使用されるように設計されたが、すぐにマウスと共に同様に使用されるように改変された。実際、該デバイスは、この生物が小さな穴を見つけてその穴を通って逃げる能力から、該生物に適切であると考えられてきた。

ムスカリン性コリン作動性受容体アンタゴニスト（ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）であるスコポラミンは、バーンズ迷路試験における機能障害を引き起こすことが知られている。これらの機能障害は、ドネペジルのようなコリンエステラーゼ阻害剤の投与によってコリン作動性の傾向を高めることにより覆される可能性がある。本研究では、バーンズ迷路の習得（学習）期の前半及びプローブ試行の間にスコポラミン処理による障害の誘導が行われた。

スコポラミン誘導性の学習障害は、合計過誤及び初回過誤、合計潜時及び初回潜時、総経路長及び初回経路長すべてにおける増大によって証明された。バーンズ迷路試験は下に述べるようなパラメータを含む。

〔初回経路長（ｃｍ）〕：逃避穴と最初に接触する前に被験動物が移動した距離。最初の接触は鼻が逃避穴に触れる時点として定義される。
〔総経路長（ｃｍ）〕：課題を完了する前に被験動物が移動した距離。課題の完了は被験動物が逃避箱の中に入ることとして定義される。これで試行が終了する。

〔初回過誤〕：逃避穴との最初の接触の前に被験動物が犯した過誤の数の計数。非逃避穴への鼻先の接触はいずれも過誤と見なされる。この状況では同じ非逃避穴への複数回の接触は複数の過誤として計数される。

〔合計過誤〕：試行全体にわたって被験動物が犯した過誤の数の計数。非逃避穴への鼻先の接触はいずれも過誤と見なされる。この状況では同じ非逃避穴への複数回の接触は複数の過誤として計数される。

〔初回潜時（秒）〕：被験動物の鼻先が逃避穴と最初に接触するまでの潜時。
〔合計潜時（秒）〕：被験動物が課題を完了するまでの潜時。課題の完了は被験動物が逃避箱の中に入ることとして定義され、これで試行が終了する。

（ｉ）試験品目
試験品目、適当なポリゴナム・ミナス抽出物及び市販のイチョウ抽出物（比較対象（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）抽出物）が本研究において使用された。これらの抽出物は、供給者の仕様書に従ってプロジェクト用に調製及び保管された。研究用に選ばれた抽出物の用量は供給者によって同定された。３０×ストック懸濁物が各品目について毎週調製された。これは等分されてバッチとなり、該バッチはその後その週を通じて４℃で保管された。該ストック懸濁物は、毎日超純水で作業濃度に希釈されてから投薬され、投薬後には廃棄された。強制経口投与用のニードルは必要量の懸濁物で充填された。個々のシリンジ中に準備する前に懸濁物を渦流混合することにより、かつさらに希釈された試験品目をシリンジで混合することにより、粒子の均一な分布が確実になるよう注意が払われた。スコポラミン投与の用量及び時間は、げっ歯動物の空間ナビゲーション課題において障害を生じることが事前に示されている。該用量は当初報告された０．３ｍｇ／ｋｇから０．５ｍｇ／ｋｇに増量されたが、高用量のほうがより確実な障害を生じるであろうからである。

（ｉｉ）対照品目
ビヒクル対照は下記の表１１及び１２のプロトコールのようにして使用された。

（ｉｉｉ）動物
２〜６月齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（２０〜２５ｇ）（ｎ＝１２〜１４）は、バイオラスコ（ＢｉｏＬＡＳＣＯ）（台湾）により供給された。該マウスは１２／１２ｈの明／暗（２００〜３００ルクス）サイクル（０７：００時に点灯）のＩＶＣシステム（米国のアレンタウン（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ））に収容され、餌（ラボダイエット（Ｌａｂｄｉｅｔ）、調合飼料）及び水は自由摂食で湿度は５０％〜７０％に維持された。各処理に使用された合計動物数は、以下の表１３に示されている（実験の各アームに使用された被験動物）。

ｐ．ｏ．での長期処理は、上記の表１１及び表１２のような試験化合物（ＴＥＳＴ ＣＯＭＰＯＵＮＤ）（試験用量１及び２）、並びに対照品目（ビヒクル及びイチョウ）を用いて１９日間連続して実施された。投薬は毎日１８００時に（ａｔ １８００ ｈｒ）行われた。化合物は強制給餌ニードル（２０Ｇ）を使用して経口投与される。ｉ．ｐ．での長期処理は、バーンズ迷路試験の間５日間連続して対照品目（ビヒクル、スコポラミン及びドネペジル）を用いて実施された。処理は毎日試験前３０分に個々の被験動物に対して行われた。化合物は２７Ｇのニードルを使用してｉ．ｐ．投与された。

（ｉｖ）手順
バーンズ迷路での評価には各被験動物について５日間、すなわち１日４回の試行を４日間（習得期間）及び最後の習得試行の２４時間後に行われたプローブ試行、を要した。事前試行（適応期間）は、第１日及び第２日の試行の開始前に行われた。被験動物は２７Ｇのニードルで試験化合物をｉ．ｐ．で投与され、該動物の居たケージに３０分間戻された。バーンズ迷路試験は、３つの時期、すなわち適応期間、習得期間及びプローブ試行から構成されるものとした。詳細な手順は以下の節で説明される。

〔実験スケジュール〕
〔適応期間〕：チャンバが取り除かれて被験動物は迷路を３０秒間探検することを許され、次いで穏やかに逃避穴へ誘導された。その後、被験動物が逃避穴に入らなかった場合、その被験動物は中に入れられた。次いで穴にカバーがかけられ、被験動物はその場に３分間留められた。被験動物はその後該動物の居たケージに戻され、プラットフォームは７０％エタノールで清浄化された。

〔習得期間（第１〜４日）〕：この期間では、チャンバが取り除かれて被験動物は迷路を５分間探検することを許され、次いで穏やかに逃避穴へ誘導された。その後、被験動物が逃避穴に入らなかった場合、その被験動物は中に入れられた。次いで穴にカバーがかけられ、被験動物はその場に１分間留められた。被験動物はその後該動物の居たケージに戻され、プラットフォームは７０％エタノールで清浄化された。次の試行は続く２分間のインタートライバル（ｉｎｔｅｒｔｒｉｂａｌ）間隔の続いた後に実行された。

この期間の間、該実験の被験動物の行動はビデオカメラで録画され、デスクトップＰＣのハードドライブに記録された。これらの記録の分析は、動物の動きの自動的な追跡及び分析のためのＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ（登録商標）ＸＴトラッキング・システムを使用して実施された。上記に議論されたパラメータは試験の間測定されて処理された。

各パラメータについては、平均された各日の試行（本研究では各被験動物につき４回の試行）及び特定の日についてのすべての被験動物の平均パフォーマンス値が得られた。１匹の被験動物により任意の日に取り組まれた４回の試行の平均が１つの測定量とされ、したがってデータポイントのｎは被験動物の数のみに基づいている。データは、日数（Ｄａｙｓ）を被験動物における反復測定要因とし、群（Ｇｒｏｕｐ）を被験動物間の要因として、該データが正規分布の検定を受けた後で二元配置反復測定分散分析を使用してさらに分析された。要因の相互作用も同様に検査された。有意な効果が見出された場合はテューキーのＨＳＤ検定を使用する群間の事後対比較が行なわれた。グラフはすべて平均値±ＳＥとしてプロットされ、α水準は特に指定のないかぎり０．０５に設定された。データ分析はＳｉｇｍａＰｌｏｔ統計ソフトウェアを使用して実施された。

〔プローブ試行（第５日）〕：プローブ試行は習得試行と同じ環境条件の下で実施された。
〔セグメント内の滞在時間（秒）〕：穴は、プローブ試行の間は迷路上に同一の白色ディスクを置くことにより閉鎖される。被験動物には迷路を探検するために９０秒が与えられる。実験の場は（図６に示されるように）８個の完全に等しいセグメントに分割され、各セグメント中の被験動物の滞在時間がプローブ試験の間Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎビデオ・トラッキング・ソフトウェアを使用して測定された。該バーンズ試験においてパラメータが示されて以下に議論されている。

習得期間（第１日〜第４日）
〔速度〕：図７（ａ）及び図７（ｂ）を参照すると、二元配置反復測定分散分析から、処理による速度に対する有意な効果は明らかにならず、したがって、学習及び記憶の測定値の解釈は試験化合物の覚醒効果又は鎮静効果によって混乱せしめられることはない。

〔初回経路長及び総経路長〕：図８（ａ）、図８（ｂ）、図８（ｃ）及び図８（ｄ）を参照すると、これらの図面は、スコポラミン処理が第２日（初回経路長について）並びに第１、２及び３日（総経路長について）にのみ、ビヒクル対照処理群と比較してパフォーマンスを低下させたことを示している。総経路長についてのパフォーマンスのこの低下は、バーンズ迷路での学習におけるスコポラミン誘導性の障害を実証している。スコポラミン誘導性の障害は、５０ｍｇ／ｋｇのポリゴナム・ミナスで処理されたマウスにおいて見られ；該マウスは、第２日及び第３日にビヒクル＋ビヒクルで処理されたマウスと比較してパフォーマンスの有意な低下を示した。これは、この用量ではポリゴナム・ミナス処理はバーンズ迷路におけるスコポラミン誘導性の障害を覆さないことを示唆している。しかしながら、ドネペジル、イチョウ及び１００ｍｇ／ｋｇのポリゴナム・ミナスで処理されたマウスは、スコポラミン誘導性の障害を示さなかった。該マウスのパフォーマンスは、ビヒクル＋ビヒクルで処理されたマウスとの有意な差はなかった。

〔初回過誤および合計過誤〕：結果は、スコポラミンが、ビヒクル処理された対照マウスと比較して、第２日（初回過誤について）並びに合計過誤については第１日及び第２日に学習障害を誘導したことを示している。合計過誤に関する障害は、スコポラミン誘導性の障害が存在した第１日及び第２日に１００ｍｇ／ｋｇのポリゴナム・ミナス、イチョウ又はドネペジルで処理された後では見られなかった。これらのデータは、合計過誤によって評価されるように、高用量のポリゴナム・ミナスがスコポラミン誘導性の学習障害を覆すことが可能であることを示唆している。低用量のポリゴナム・ミナスは、図９（ａ）、図９（ｂ）、図９（ｃ）及び図９（ｄ）の初回過誤によって評価されるように、第２日にスコポラミン障害を覆すように見えた。

〔初回潜時及び合計潜時〕：これらのデータは、ビヒクル対照と比較した場合、スコポラミンが学習障害を誘導することを示している。すなわち、スコポラミンで処理されたマウスは穴を見つけて迷路から逃避するのにより長い時間を要している。高用量のポリゴナム・ミナスで処理されたマウスは、ビヒクルで処理されたマウスと同じように行動し、スコポラミンの学習障害を示さない。同様の結果は、図１０（ａ）、図１０（ｂ）、図１０（ｃ）及び図１０（ｄ）に示されるように、ドネペジル処理及びイチョウ処理でも得られる。

プローブ試行（第５日）では、スコポラミン処理群及び５０ｍｇ／ｋｇポリゴナム・ミナス処理群において、セグメント内で費やされた時間に有意差は見られない。図１０（図１１）は、プローブ試行中にマウスは課題を実施するが逃避穴は存在しないことを示している。マウスは迷路を探検することを許され、該マウスが迷路上の様々なエリアにとどまる時間が記録される。この「プローブ（探査）」試行は記憶を評価するために使用される。スコポラミンで処理されたマウスは、迷路の「標的」セグメント（事前の試行において逃避穴が位置した場所である）を好むことはなかった。これは、スコポラミンが記憶障害を誘導したことを示唆している。この記憶障害は、低用量のポリゴナム・ミナスによっては覆されなかった、というのもこれらのマウスも標的セグメントを好むことはなかったからである。イチョウ及びドネペジル処理はいずれもスコポラミン障害を覆したが、これは様々な研究室によって報告されている効果である。１００ｍｇ／ｋｇのポリゴナム・ミナス抽出物で処理されたマウスが標的セグメント内でかなりの時間を費やしたように、高用量のポリゴナム・ミナスもスコポラミン誘導性の記憶障害を覆した。

本研究ではスコポラミン処理によりバーンズ迷路の習得（学習）期の前半において障害が誘導された。スコポラミン誘導性の学習障害は、合計過誤及び初回過誤、合計潜時及び初回潜時、並びに総経路長及び初回経路長のいずれも増大したことによって証拠づけられた。学習曲線を考えれば、スコポラミン処理動物の機能障害は訓練初期において最も顕著であり、その後は処理群間である程度一定に達するが、これは、スコポラミン処理マウスで第１日、２日及び３日に総経路長が増大するが第４日には増大しないことにより最もよく例証される。これらの障害は陽性対照（ドネペジル及びイチョウ抽出物）によって軽減された。加えて、１００ｍｇ／ｋｇのポリゴナム・ミナスは、バーンズ迷路の習得期におけるスコポラミン誘導性の障害を軽減した。試験化合物は、課題の記憶保持（プローブ試行）の局面におけるスコポラミン誘導性の障害を覆した。プローブ試行では、５０ｍｇ／ｋｇの低用量のポリゴナム・ミナス以外のすべての処理によりスコポラミン誘導性の障害が軽減された。これらの障害は、マウスが標的セグメントにおいてほとんど時間を費やさないことにより説明された。低用量の効果の不足及び高用量の有意な効果は、抽出物の用量依存的な作用があったことを示唆するものであろう。

スコポラミンの学習障害は実験の早期に存在しており、その結果から、ポリゴナム・ミナスの抽出物は、マウスにおけるこれらのスコポラミン誘導性の学習障害及び記憶障害を軽減することができることを示唆している。本研究は、空間記憶の評価を行うバーンズ迷路を使用した。

よって本発明の技術の進歩により、ペルシカリア・マイナーとしても知られるポリゴナム・ミナスの抽出物であって、前記抽出物の少なくとも１６０００マイクロモルＴＥ／グラムという高いＯＲＡＣ値を有して細胞を酸化障害から防ぎ、ＭＭＰ−１（ペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１）及びＭＭＰ−１３（ペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１３）への強力な阻害作用を有する結果としてコラーゲンの分解を防ぐことによる皺発生及び加齢に対する保護効果を示す、潜在力；並びに、該抽出物の抗コリンエステラーゼ効果を介した潜在的な記憶及び学習の改善による認知への有益性、を備えた抽出物を提供することが可能になっている。

よって、マーカーであるケルセチン−３−グルクロニド及びケルシトリンの存在を特徴とするポリゴナム・ミナスの水抽出物は、驚くべきことに認知増強剤として有効であることが見出され、かつアセチルコリンエステラーゼ及びモノアミンオキシダーゼ−Ａ酵素それぞれの潜在的阻害剤であることによりうつ病及び不安の治療について有効である可能性がある。

Claims (9)

1. 有効な量のポリゴナム・ミナス（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍ ｍｉｎｕｓ）の抽出物を、他の作用薬と組み合わせて又は他の作用薬と組み合わせることなく、含んでなる組成物であって、前記他の作用薬は薬剤または化粧品であり、かつ前記抽出物はケルセチン−３−グルクロニド及びケルシトリンを含んでなり、治療目的の作用薬を調製するために、前記ケルセチン−３−グルクロニドは重量比で０．２〜１．０％の量でポリゴナム・ミナスの抽出物として供給され、かつ前記ケルシトリンは重量比で０．１〜０．５％の量でポリゴナム・ミナスの抽出物として供給される組成物。
2. ポリゴナム・ミナスの抽出物は１１，０００マイクロモルＴＥ／グラム〜３６，０００マイクロモルＴＥ／グラムの活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）値を有している、請求項１に記載の組成物。
3. ポリゴナム・ミナスの抽出物は少なくとも１６０００マイクロモルＴＥ／グラムの活性酸素吸収能力（ＯＲＡＣ）値を有している、請求項２に記載の組成物。
4. ケルセチン−３−グルクロニドの好ましい量は重量比で０．５％にてポリゴナム・ミナスの抽出物として供給される、請求項１に記載の組成物。
5. ケルシトリンの好ましい量は重量比で０．２％にてポリゴナム・ミナスの抽出物として供給される、請求項１に記載の組成物。
6. 認知増強のための作用薬を調製するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
7. スキンケアの目的のための作用薬を調製するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
8. 前記組成物は皺発生防止の目的のための作用薬を調製するためのものである、請求項７に記載の組成物の使用。
9. 酸化的細胞障害からの保護のための作用薬を調製するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。