JP6220400B2 - 生物種を観察する方法 - Google Patents

Description

本発明は、ペトリ皿などの容器に収容されている培地上の生物種を観察し、必要に応じて検出する方法に関する。

バクテリアなどの微生物は一般に、ペトリ皿に収容されている培地（寒天）上で培養される。ペトリ皿は、ガラスまたはプラスチック（ポリスチレン）などの透明な材料で作られたベースおよび蓋から構成される、あまり深くない円筒形の皿である。微生物は一般に、均一な照明のもとで肉眼による観察によって検出される。すなわち、バクテリアコロニーが一般に、ペトリ皿の壁または底を通して見ることができる幾らか湾曲した物質のクラスターの形で現われる。蓋を通した観察は一般に、前記蓋の内面を覆う約１μｍから１ｍｍの間の直径を有する拡散小滴からできた薄い結露層によって、困難または不可能になる。したがって、培地が散乱性または吸収性（血液寒天培地である場合）であるとき、培養微生物を観察するにはペトリ皿を開ける必要があるが、これは汚染の危険につながる。

本発明は、この問題を解決することを目的とする。より具体的には、本発明は、容器内に収容されている培地上の生物種を、散乱物質の堆積、特に結露により半透明になる可能性がある、半透明の（したがって散乱性の）容器の面を通して観測できるようにする方法を提供することを目的とする。

本発明によれば、この目的は、少なくとも１つの半透明の面を有する容器に収容されている培地上の生物種を観察する方法によって解決され、この方法は、
ａ）前記半透明の面の１つの部分に光ビームを向けて、前記面の少なくとも１つの照明領域および少なくとも１つの非照明領域を画定するステップと、
ｂ）前記光ビームによって照明された前記培地の表面の一部分の画像を取得するステップとを含み、その取得は、前記半透明の面の前記非照明領域または少なくとも１つの前記非照明領域を通して、かつ前記光ビームの伝播方向に対して非ゼロの角度を形成する光取得軸に沿って行われる。

有利には、ステップａ）およびｂ）は、前記半透明の面の別の照明領域および非照明領域を画定しながら複数回行うことができ、この方法はまた、こうして取得された画像を結合して「結合」画像を形成するステップｃ）を含む。

特に、ステップａ）およびｂ）は、複数回行うことができ、ビームはこの場合、培地の表面をスキャンする。ビームのそれぞれ連続する位置において、画像が取得され、前記画像はこの場合、結合画像を形成するように処理される。そうして結合画像は、培地を表現したものを構成する。

例えば、前記結合画像は、培地の表面のそれぞれの点において、前記取得画像上で測定された、前記点に対応する最も弱い光強度を結合することによって得ることができる。

前記結合画像はまた、それぞれの取得画像上で対象領域を特定することによって得ることもでき、前記対象領域はこの場合、結合画像を形成するように結合される。

特に、対象領域は、培地上の光ビームの投影像を含むことができる。例えば、対象領域は、培地上の光ビームの投影像に一致し得る。好ましくは、前記対象領域は、半透明の面上の光ビームの投影像を含まない。

上記のステップａ）およびｂ）に続いて、培地上の光ビームの投影像を含む画像の対象区域を抽出することが可能である。好ましくは、この抽出された対象区域は、容器の半透明の面上の光ビームの投影像を含まない。

この方法はまた、前記画像または結合画像上で、明るい領域か暗い領域かの区別をすることによって前記生物種を検出するステップｄ）を含むこともできる。この検出は、操作員によって、あるいは画像処理ソフトウェアを実行するコンピュータによって自動的に、行うことができる。この検出には、コロニーを数えること、さらに、それを所与の基準（例えば、その表面積）に従って分類することが伴い得る。

有利には、前記光取得軸は、前記半透明の面に対して、かつ前記光ビームの伝播方向に対してある角度を形成する光取得軸に沿って、少なくとも１０°、好ましくは３０°から６０°の間の角度を形成することができる。

前記光ビームは特に、前記半透明の面上で、線の形に照明された領域を画定することができる。

本発明の第１の実施形態によれば、前記光取得軸は、前記培地による前記光ビームの鏡面反射の方向と一致せず、その結果、前記生物種は前記画像上に明るい領域として現われる。

本発明の第２の実施形態によれば、前記光取得軸は、前記培地による前記光ビームの鏡面反射の方向とほぼ一致し、その結果、前記生物種は前記画像上に暗い領域として現われる。

前記面は、散乱物質の堆積、特に結露の小滴の堆積によって半透明になり得る。より具体的には、前記容器は皿（特にペトリ皿）とすることができ、前記半透明の面は前記皿の蓋であり、その内面は結露によって覆われる。

より一般には、半透明の面は、生物種に対向して配置される。好ましくは、半透明の面は前記生物種と接触しない。

本発明の他の特徴、詳細および利点は、例として示した添付の図面に関して作成された本明細書を読めば明らかになろう。

蓋の内面に結露の層を呈示して本発明によって解決される問題を示すペトリ皿の図である。 本発明の一実施形態による方法の実施態様を表す図である。 バクテリアコロニーの検出に適用された本発明の技法の結果を示す図である。 ペトリ皿内の培地上のカビの検出に適用された本発明の技法の結果を示す図である。 本発明の一代替実施形態による方法の実施態様を示す図である。 鏡面反射条件下で得られた画像（６Ａ）と鏡面反射条件外で得られた画像（６Ｂ）とを比較可能にした図である。

図１は、蓋ＣＰが気密にかぶせられたペトリ皿ＢＰの断面図を示し、蓋の内面は、結露ＢＵの薄い層で覆われている。蓋ＣＰは、それ自体としては透明であるが、結露層を成す水の小滴により生じた散乱によって半透明になっている。ペトリ皿は、任意選択で不透明または散乱性である寒天タイプの培地ＭＣで部分的に満たされ、この培地上にバクテリアコロニーＣＢが培養される。上述のように、一方では結露ＢＵにより、蓋を通してコロニーＣＢを観察することが妨げられ、他方では蓋を取り除くと、培地の汚染、またはペトリ皿外部の環境汚染の危険が生じる。

この問題は、本発明によれば、図２Ａに示されるようにして解決することができる。光源ＳＬ（例えば、５３２ｎｍの波長のレーザ）が、光学系によって形成される光ビームＦＬを放出する。形成されたビームは、蓋ＣＰの方へ斜めに、前記蓋と交差することで線の形をした照明パターンＭ１を画定するように向けられ、この線は、約１ｍｍ以下のその幅の少なくとも１０倍の長さを有する。参照符号Ｍ２は、培地ＭＣの表面に画定されたパターンを表す。ＭＯは、照明されない部分（したがってＭ１の外側）を表す。蓋の面に対する垂線に沿って、したがって照明光ビームに対してある角度（α≠０°）を形成して、向けられたカメラＣＡが、蓋ＣＰの画像（図２Ｂ）を取得する。

ビームＦＬの伝播方向とカメラの観察方向（すなわち、その画像取得の光軸）が非ゼロの角度を形成するので、カメラは、蓋の非照明部分（ＭＯ）を通して培地の照明領域（パターンＭ２）を観察する。バクテリアコロニーＣＢは、その散乱性により、パターンＭ２上に重ね合わされた輝点として現われる。図２Ｃは、カメラＣＡによって取得された画像を示し、輝線の形をしたパターンＭ１と、ずっと暗い輝線の形をしたパターンＭ２と、バクテリアコロニーに対応するもっと明るい２つの点とに気付くことが可能である。実際に、
− 培地は入射光を本質的に鏡のように反射するが、この反射はカメラによって捕えられず、培地の表面の凹凸によって、または結露ＢＵによって散乱した光だけが検出される。

− 実際はバクテリアコロニーが培地の表面の凹凸を構成し、この理由のために、バクテリアコロニーがより明るく現われる。

− 結露層は非常に散乱性であり、このことがパターンＭ１の明るさを説明する。

ペトリ皿は有利には、培地の表面をスキャンすること、およびバクテリアコロニーを示す完全な画像を再構成することを可能にする並進移動台に取り付けられる。そうして、バクテリアコロニーは、操作員によって、あるいはそれ自体は知られている画像処理法（例えば、適切にプログラムされカメラＣＡに接続されたコンピュータによって実行される、閾値処理、高域通過フィルタまたは輪郭検出を使用する）によって自動的に検出され得る。

完全な画像を得るために、培地上のビーム投射に対応する対象領域は、それぞれの取得画像で抽出することができる。対象領域の幅は、好ましくはペトリ皿の２つ続きの位置間の並進移動ステップに等しい。２つ続きで取得された画像間で、対象領域は、台移動ステップに相当する距離だけシフトされる。次に、スキャン中に抽出された対象領域が結合されて、完全な画像を形成する。

本発明の技法の効果は、血液寒天（Ｃｏｌｕｍｂｉａ寒天＋５％ヒツジ血液、Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ参照番号４３０４１）上の２４時間の培養における大腸菌の培養の場合と関連がある、図３Ａ〜３Ｄで示されている。角度αは４２°に等しく、照明はレーザ光源によって行われて、１ｍｍの幅を有する線が培地上に投射される。図３Ａは、不均一に照明された蓋を通して取得されており、結露によって後方散乱された光しか見ることができず、バクテリアコロニーは全く識別されない。後者は、一方で、蓋を取り除いた後で取得された図３Ｂだけでなく、上述の方法によって蓋を通して取得された図３Ｃでも鮮明に見える。図３Ｄは、図３Ｂと図３Ｃを重ね合わせたものに相当し、それによって、これらの非常に良好な相関関係を検証することを可能にしている。

本発明は、バクテリアコロニーの観察に限定されない。例として図４は、上述の、カビ（アスペルギルス フミガーツス（Aspergilus fumigatus））を播種した培地の観察に適用された方法によって得られた画像を示す。

本発明は、多くの変形物を受容する。

− 容器はペトリ皿でなくても可能であり、観察は、表面が結露で覆われた蓋を通して行われなくても可能であり、重要なのは、生物種の検出を目的として、容器に収容されている培地が、例えば結露または油脂（指跡）である散乱物質の堆積によって半透明（散乱性）になった、前記容器の面を通して観察されることである。

− 照明は、空間的にコヒーレントまたは非コヒーレントである単色光、多色光、または白色光でも行うことができる。

− いくつかの光源を使用することができる。すなわちレーザ、電球、発光ダイオード、光ファイバのビームなどである。

− 光ビームは、平行（平行化）でも、収束しても、発散してもよい。

− パターンＭ１は、必ずしも線の形でなくてよい。しかし、光ビームは、ペトリ皿の蓋（より一般的には、容器の半透明の面）の少なくとも１つの照明領域、および１つの非照明領域を画定することが絶対必要である。

− ビームが蓋（より一般的には、半透明の面）に対し斜めに向けられること、および観察の方向が前記蓋に対して垂直であることは絶対必要ではなく、反対が正しいこともあり、あるいは照明の方向および観察の方向の両方が斜めであることもある。重要なのは、培地の照明領域（Ｍ２）を蓋の非照明領域（ＭＯ）を通して観察できることである。このためには、照明方向と観察方向により形成される角度αがゼロではないこと、好ましくはそれが１０°以上であることが必要である。

− １つの特別な事例が注目に値する。照明方向および観察方向が培地の表面に対して同じ角度を形成する場合、すなわちこれらの方向が鏡面反射条件下にある場合、パターンＭ２は明るく現われ、生物種は暗いスポットを成す。この状態は図６Ａに示されており、３つのコロニーが照明の線の中断として現われている。図６Ｂは、培地が鏡面反射条件外で観察されたときに明るいスポットとして現われている、これらの同じコロニーを示す。

例として、図５Ａ〜５Ｃは、本発明の代替実施形態を示す。照明は白色光で行われ、パターンＭ１（図５Ａ）は４つの明るい帯の形をしている。３つの画像は、図５Ｂに示されるように、このパターンに対してペトリ皿を移動しながら取得され（図２Ａの場合のように皿を動かすことによって、あるいはパターンを動かすことによって得ることができる）、次に、これらの画像の暗い部分が互いに結合されて、図５Ｃに再生された最終画像が与えられる。言い換えると、各画像において、培地上の光ビームの痕跡を含む対象領域が抽出され、それぞれ異なる対象区域が結合されて最終画像が形成される。

画像５Ｃは、以下のようにして画素ごとに構成することができる。すなわち、蓋のそれぞれの点について、それぞれ異なる取得画像上で測定された、前記点に対応する最も弱い光強度が取り込まれる。

言い換えると、Ｉ_ｎ（ｘ，ｙ）が、位置（ｘ、ｙ）の関数としての画像番号ｎ（図５Ａ〜５Ｃの例では、ｎ＝１〜３）の光強度であるとする。そうすると、結合画像ＩＣは、それぞれの点（ｘ，ｙ）において、ＩＣ（ｘ，ｙ）＝ｍｉｎ_ｎ（Ｉ_ｎ（ｘ，ｙ））の関係を適用することによって形成される。これは結局、半透明の容器の面上の、高強度の区域の形をしている光ビームＦＬの痕跡をマスキングするということになる。

Claims (11)

1. 少なくとも１つの半透明の面（ＣＰ、ＢＵ）を有する容器に収容されている培地（ＭＣ）上の生物種（ＣＢ）を観察する方法であって、
   ａ）前記面の少なくとも１つの照明領域（Ｍ１）および少なくとも１つの非照明領域（ＭＯ）を画定するように前記半透明の面の１つの部分に光ビーム（ＦＬ）を向けるステップと、
   ｂ）前記光ビームによって照明された前記培地の表面の一部分（Ｍ２）の画像を取得するステップとを含み、その取得が、前記半透明の面の前記非照明領域（ＭＯ）または少なくとも１つの前記非照明領域（ＭＯ）を通して、かつ前記光ビームの伝播方向に対して非ゼロの角度（α）を形成する光取得軸に沿って行われる、方法。
2. ステップａ）およびｂ）が、前記半透明の面の別の照明領域および非照明領域を画定することによって複数回行われ、方法がさらに、こうして取得された画像を結合して「結合」画像を形成するステップｃ）を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記結合画像が、培地の表面のそれぞれの点において、前記取得画像上で測定された、前記点に対応する最も弱い光強度を結合することによって得られる、請求項２に記載の方法。
4. 前記結合画像が、それぞれの取得画像の対象領域を画定することによって得られ、前記対象領域はこの場合、結合画像を形成するように結合される、請求項２に記載の方法。
5. 前記画像または結合画像上で、明るい領域か暗い領域かの区別をすることによって前記生物種を検出するステップｄ）もまた含む、請求項１から４の一項に記載の方法。
6. 前記光取得軸が、前記半透明の面に対して、かつ前記光ビームの伝播方向に対してある角度を形成する光取得軸に沿って、少なくとも１０°、好ましくは３０°から６０°の間の角度（α）を形成する、請求項１から５の一項に記載の方法。
7. 前記光ビームが、前記半透明の面上で、線の形をした照明領域（Ｍ１）を画定する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記光取得軸が、前記培地による前記光ビームの鏡面反射の方向と一致せず、その結果、前記生物種が前記画像上に明るい領域として現われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記光取得軸が、前記培地による前記光ビームの鏡面反射の方向とほぼ一致し、その結果、前記生物種が前記画像上に暗い領域として現われる、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記面が、散乱物質の堆積、特に結露（ＢＵ）の小滴の堆積によって半透明になる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記容器がペトリ皿（ＢＰ）であり、前記半透明の面が前記皿の蓋（ＣＰ）であり、その内面が結露（ＢＵ）によって覆われる、請求項１０に記載の方法。

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