CN104755911B - 用于观察生物物种的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于观察在培养基(MC)上的生物物种(CB)的方法，该培养基(MC)被容纳在具有至少一个半透明面(CP，BU)的容器内，所述方法包括以下步骤：a)使光束(FL)射向所述半透明面的一部分上，以在所述半透明面上界定出至少一个被照亮的部位(M1)和至少一个未被照亮的部位(MO)；以及b)获取所述培养基的表面被所述光束照亮的部分(M2)的图像，所述获取透过所述半透明面的所述未被照亮的部位(MO)或至少一个所述未被照亮的部位(MO)并且沿光学获取轴进行，该光学获取轴与所述光束的传播方向形成非零角度(α)。

Description

用于观察生物物种的方法
技术领域
本发明涉及一种用于观察，并且适当情况下用于检测，在培养基上的生物物种的方法，该培养基被容纳在诸如皮氏培养皿的容器内。
背景技术
通常将诸如细菌的微生物培养在培养基(琼脂)上，其中培养基(琼脂)被容纳在皮氏培养皿内。皮氏培养皿为不是很深的圆柱状培养皿，由基底和盖子组成，由诸如玻璃或塑料(聚苯乙烯)的透明材料制成。通常在均匀照明下，通过肉眼观察来检测微生物；细菌菌落通常显现为或多或少的弧形材料簇，该材料簇可以透过皮氏培养皿的壁或底部看到。由于存在冷凝物薄层，通常难以或不能透过盖子进行观察，其中冷凝物薄层由直径大约在1μm至1mm之间的弥散的微滴构成，这些微滴覆盖了所述盖子的内表面。因此，当培养基为散射的或吸收性的(在血琼脂的情况下)时，需要打开皮氏培养皿以观察培养的微生物，但是这样存在污染的风险。
本发明的目标是要解决这一问题。更具体地，本发明的目标是提供一种方法，该方法使得能够透过容器的半透明面(并且因此为散射的面)，观察容纳在该容器内的培养基上的生物物种，该面可能由于散射材料(尤其是冷凝物)沉积在其上而是半透明的。
发明内容
根据本发明，该目标是利用如下方法实现的：一种用于观察在培养基上的生物物种的方法，该培养基被容纳在具有至少一个半透明面的容器内，该方法包括以下步骤：
a)使光束射向所述半透明面的一部分上，以界定出所述半透明面的至少一个被照亮的部位和至少一个未被照亮的部位；以及
b)获取所述培养基的表面被所述光束照亮的部分的图像，所述获取透过所述半透明面的所述未被照亮的部位或至少一个所述未被照亮的部位并且沿光学获取轴进行，该光学获取轴与所述光束的传播方向形成非零角度。
有利地，在界定出所述半透明面的不同的被照亮的部位和未被照亮的部位的同时，步骤a)和步骤b)可以进行多次，该方法还包括步骤c)：组合由此获取的图像，以形成“组合”图像。
具体地，步骤a)和步骤b)可以进行多次，然后光束扫描培养基的表面。在光束的每一连续位置处，获取图像，然后处理这些图像以形成组合图像。然后，组合图像构成培养基的描述。
例如，所述组合图像可以通过以下过程获得：在培养基的表面的每一点处，组合在所述获取的图像上测量的对应于该点的最弱的光强度。
所述组合图像还可以通过以下过程获得：鉴定出每一个获取的图像的感兴趣的部位，然后组合所述感兴趣的部位以形成组合图像。
具体地，感兴趣的部位可以包括光束在培养基上的投影。例如，感兴趣的部位可以对应于光束在培养基上的投影。优选地，所述感兴趣的部位不包括光束在半透明面上的投影。
在上述步骤a)和步骤b)之后，可以提取图像的感兴趣的区域，该图像的感兴趣的区域包括光束在培养基上的投影。优选地，该提取的感兴趣的区域不包括光束在容器的半透明面上的投影。
所述方法还可以包括步骤d)：通过辨别在所述图像或组合图像上的明亮部位或黑暗部位，检测所述生物物种。该检测能够通过操作者进行，或通过执行图像处理软件的计算机自动进行。该检测能够伴随对菌落进行计数，并且还能够伴随根据给定标准，例如它们的表面积，对其进行分类。
有利地，所述光学获取轴与所述半透明面能够形成至少10°的角度，并且优选形成在30°至60°之间的角度，并且沿光学获取轴与所述光束的传播方向形成角度。
具体地，所述光束可以在所述半透明面上界定出线条形式的被照亮的部位。
根据本发明的第一实施方式，所述光学获取轴与所述光束被所述培养基镜面反射的方向不一致，其结果是所述生物物种在所述图像上显现为明亮部位。
根据本发明的第二实施方式，所述光学获取轴与所述光束被所述培养基镜面反射的方向近似一致，其结果是所述生物物种在所述图像上显现为黑暗部位。
通过沉积散射材料，尤其通过沉积冷凝物微滴，能够使所述面为半透明的。更具体地，所述容器可以是培养皿，尤其是皮氏培养皿，并且所述半透明面是所述培养皿的盖子，该盖子的内表面覆盖有冷凝物。
更通常来讲，半透明面与生物物种相对放置。半透明面优选不与所述生物物种接触。
附图说明
本发明的其它特征、细节和优点将参考以实例方式给出的附图，通过阅读说明书显现出来，其中：
图1示出了在其盖子的内表面上显出冷凝物层的皮氏培养皿，例示了通过本发明解决的问题；
图2A～图2C示意性表现了根据本发明的一个实施方式的方法的实施；
图3A～图3D例示了本发明应用于检测细菌菌落的技术结果；
图4例示了本发明应用于检测在皮氏培养皿内的培养基上的霉菌的技术结果；
图5A～图5C例示了根据本发明的一个替代实施方式的方法的实施；以及
图6A～图6B使得能够对比在镜面反射条件下获得的图像(6A)和在镜面反射条件外侧获得的图像(6B)。
具体实施方式
图1示出了以气密方式被盖子CP封闭的皮氏培养皿BP的剖视图，盖子CP的内表面覆盖有冷凝物BU的薄层。尽管盖子CP自身是透明的，但是构成冷凝物层的水滴引起的散射使盖子CP成为半透明的。皮氏培养皿部分填充有琼脂型培养基MC，该琼脂型培养基MC任选地是不透明或散射的，在该琼脂型培养基MC上培养细菌菌落CB。如上所述，一方面，冷凝物BU妨碍了透过盖子观察菌落CB，并且另一方面，移除盖子会产生污染培养基或污染皮氏培养皿外的环境的风险。
根据本发明，能够以图2A例示的方式解决这一问题。光源SL(例如波长532nm的激光器)发射由光学系统形成的光束FL。使形成的光束偏斜地射向盖子CP，使得光束在与所述盖子的交接处界定出线条形状的照亮图案M1，该线条形状的照亮图案M1的长度为宽度的至少10倍，该线条形状的照亮图案M1的宽度为大约1mm或更小。符号M2表示在培养基MC的表面上界定出的图案。MO表示盖子未被照亮的部分(并且因此在M1之外)。相机CA获取盖子CP的图像(图2B)，其中相机CA的朝向沿与盖子表面正交的方向，并且因此与照亮光束形成角度α≠0°。
假定光束FL的传播方向和相机的观察方向(即其图像获取的光轴)形成非零角度，则相机透过盖子的未被照亮的部位(MO)观察培养基的被照亮的部位(图案M2)。由于细菌菌落CB的散射性质，它们显现为叠加在图案M2上的亮点。图2C示出了相机CA获取的图像：可以注意到亮线形式的图案M1，亮度低很多的线条形式的图案M2，以及对应于细菌菌落的两个更亮的斑点。实际上：
培养基以基本镜面的方式反射入射光，但是这种反射不被相机拦截；仅检测到由其表面的不规则部散射的光，或由冷凝物BU散射的光；
细菌菌落实际上构成了培养基表面的不规则部：由于这一原因，它们显得更加明亮；
冷凝物层是高度散射的，这解释了图案M1的亮度。
皮氏培养皿被有利地安置在平移台上，这使得能够扫描培养基的表面并且重构显示细菌菌落的完整图像。后者可以由操作者检测，或利用以适当方式编程并且与相机CA连接的计算机执行的自身已知的图像处理方法自动检测，例如使用阈值，高通滤波器或轮廓检测。
为了获得完整的图像，可以在每一个获取的图像上，提取对应于光束在培养基上投影的感兴趣的部位。感兴趣的部位的宽度优选等于在皮氏培养皿的两个连续位置之间的平移步幅。在两个连续获取的图像之间，使感兴趣的部位移动对应于平移台移动步幅的距离。然后组合在扫描过程中提取的感兴趣的部位，以形成完整的图像。
图3A至图3D例示了本发明的技术效果，图3A至图3D涉及大肠杆菌(Escherichiacoli)在血琼脂(哥伦比亚琼脂+5％绵羊血-生物梅里埃(Biomérieux)参考43041)上进行了24小时培养时的培养物的情况。角度α等于42°，照明利用激光器源进行，在培养基上投射出宽度为1mm的线条。透过被均匀照亮的盖子获取图3A：仅能看到被冷凝物散射回来的光，并且根本不能区分细菌菌落。另一方面，细菌菌落不仅在已经移除了盖子之后获取的图3B中清晰可见，而且在通过上述方法透过盖子获得的图3C中也清晰可见。图3D对应于图3B和图3C的叠加，由此能够证实它们具有非常好的相关性。
本发明不限制于细菌菌落的观察；举例来讲，图4示出了利用如上所述的方法观察接种有霉菌(Aspergilus fumigatus)的培养基所获得的图像。
本发明接受多种变体：
容器可能不是皮氏培养皿，并且观察可能不是透过具有覆盖着冷凝物的表面的盖子进行的；重要的是：透过容器的面观察容纳在该容器内的培养基，该容器的面由于例如冷凝物或油脂(指纹)的散射材料的沉积，而成为半透明的(散射的)，并且目的是检测生物物种。
照明可以以单色光或多色光，或甚至白光，空间相干或不相干的光进行。
可以使用几种光源：激光器、灯、发光二极管、光纤束等。
光束可以是平行的(准直的)、会聚的或发散的。
图案M1不一定必须为线条的形状。但是，光束在皮氏培养皿的盖子(更广泛来讲，容器的半透明面)上界定出至少一个被照亮的部位和至少一个未被照亮的部位是必不可少的。
光束倾斜地射向盖子(更广泛来讲，半透明面)并且观察的方向与所述盖子正交不是必需的；相反方式可能是正确的，或者照明的方向和观察的方向都可是倾斜的。重要的是，能够透过盖子的未被照亮的部位(MO)观察培养基的被照亮的部位(M2)。为此，由照明方向和观察方向形成的角度α不为零是必要的，并且优选大于或等于10°。
应当指出一种特殊的情况。当照明方向和观察方向与培养基的表面形成相同角度时，即在镜面反射的条件下，图案M2呈现为亮的，而生物物种构成黑点。这种情形例示在图6A中，其中三个菌落呈现为明亮线条的中断。图6B示出了相同的菌落，当在镜面反射条件之外观察培养基时，这些菌落呈现为明亮的斑点。
举例来讲，图5A至图5C例示了本发明的替代实施方式。照明以白光进行，并且图案M1(图5A)是四个亮带的形式。如图5B中例示的，三个图像是在相对于该图案(如在图2A的情况中，能够通过移动培养皿或图案获得)移动皮氏培养皿时获取的；然后这些图像的黑暗部分彼此互相组合得到最终图像，该最终图像重现在图5C中。换句话说，在每一个图像上，提取感兴趣的部位，组合多个感兴趣的区域以形成最终图像，该感兴趣的部位包括光束在培养基上的痕迹。
图像5C可以通过以下方式像素接像素地构建：对于盖子的每一点，采集在多个获取的图像上测量的对应于所述点的最弱的光强度。
换句话说，使In(x,y)为图像数量n(在图5A～图5C的实施例中n＝1～3)，作为位置(x,y)的函数的光强度。然后，通过在每一点(x,y)应用关系式IC(x,y)＝minn(In(x,y))形成组合图像IC。这相当于遮蔽光束FL在容器的半透明面上的痕迹，其为高强度的区域的形式。

Claims (13)

1.一种用于观察在培养基(MC)上的生物物种(CB)的方法，该培养基(MC)被容纳在具有至少一个半透明面(CP，BU)的容器内，所述方法包括以下步骤：
a)使光束(FL)射向所述半透明面的一部分上，以在所述半透明面上界定出至少一个被照亮的部位(M1)和至少一个未被照亮的部位(MO)；以及
b)获取所述培养基的表面被所述光束照亮的部分(M2)的图像，所述获取透过所述半透明面的所述未被照亮的部位(MO)或至少一个所述未被照亮的部位(MO)并且沿光学获取轴进行，该光学获取轴与所述光束的传播方向形成非零角度(α)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过界定出所述半透明面的不同的被照亮的部位和未被照亮的部位，多次进行步骤a)和步骤b)，
所述方法还包括步骤c)：组合由此获取的图像，以形成“组合”图像。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述组合图像通过以下过程获得：在所述培养基的表面的每一点处，组合在所述获取的图像上测量的对应于该点的最弱的光强度。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述组合图像通过以下过程获得：界定出每一个获取的图像的感兴趣的部位，然后组合所述感兴趣的部位以形成所述组合图像。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，还包括步骤d)：通过辨别在所述图像或所述组合图像上的明亮部位或黑暗部位，检测所述生物物种。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述光学获取轴与所述半透明面形成至少10°的角度(α)，并且沿光学获取轴与所述光束的传播方向形成角度。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述光学获取轴与所述半透明面形成形成30°至60°之间的角度(α)。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述光束在所述半透明面上界定出线条形状的被照亮的部位(M1)。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述光学获取轴与所述光束被所述培养基镜面反射的方向不一致，由此所述生物物种在所述图像上显现为明亮部位。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述光学获取轴与所述光束被所述培养基镜面反射的方向近似一致，由此所述生物物种在所述图像上显现为黑暗部位。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，通过沉积散射材料，使得所述面为半透明的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，通过沉积冷凝物(BU)的微滴，使得所述面为半透明的。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述容器为皮氏培养皿(BP)，并且所述半透明面是所述培养皿的盖子(CP)，所述培养皿的内表面被覆盖有冷凝物(BU)。
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