JP6030599B2 - ナノノズル装置アレイ：その作製および高分子分析における利用 - Google Patents

Description

本願明細書は、２００６年７月１９日に出願された米国仮出願第６０／８３１，７７２号；２００７年３月２８日に出願された米国仮出願第６０／９０８，５８２号；および２００７年３月２８日に出願された米国仮出願第６０／９０８，５８４号の利益を主張するものであり、それらの全ては参照によって本願明細書に組み込まれるものである。

本発明はナノスケールの装置の技術分野に関するものである。本発明はまた、高分子のシーケンシングの技術分野、特にＤＮＡのシーケンシングおよび特性解析の技術分野に関するものである。

本願明細書では、様々な科学技術的および特許の刊行物を参照している。それらそれぞれは、その全てが参照として組み込まれる。

ＤＮＡまたはＲＮＡといった生体分子はヌクレオチドからなる長鎖状分子であり、その配列は生体のゲノムおよびポストゲノミックな遺伝子発現情報と直接的に関連している。個体の一生の間に起こるヌクレオチド配列の変異または転位は、多くの場合、遺伝的異常または悪性腫瘍といった病状を引き起こす可能性がある。他の場合には、各個体間の配列の少しの相違が、集団の遺伝的構成の多様性を反映する。遺伝子配列のそのような相違によって、特定の個体は、薬物療法を含む環境からの刺激およびシグナルに対して異なる反応を示す。例えば、ある患者が特定の組成物に対して良好な反応を示す一方で、他の患者は反応がない、または不都合な副作用を示しさえする。

遺伝的多様性および医学的・薬理学的意味合いを研究する集団遺伝学、メディカルゲノミックス、および薬理ゲノム学の分野は、大規模な配列の解析および大量のサンプル数を必要とする。生成される配列情報は、ヘルスケアおよび医薬品業界にとって、特に有用なものであろう。癌ゲノミクスおよび診断は、腫瘍形成へ至るゲノム不安定性を研究する。これら全ての分野は、核酸などのバイオポリマー分子の直線的な配列、またはバイオポリマーのメチル化のパターンなどのエピジェネティックなバイオマーカーの、迅速な決定を可能にする技術の恩恵を受けるであろう。細胞１個よりもさらに少ないほどの極少量のサンプルの利用が長らく望まれている。それにより、細胞の状態をモニターする能力、および癌細胞の悪性のステージといった病気の発生および進行を理解する能力、が飛躍的に向上するであろう。

ほとんどのゲノムまたはエピゲノム解析技術は、大きな集団に対して広大なゲノム領域を解析するためには、高価すぎるままである。ゲノム解析のコストをいわゆる「＄１，０００ゲノム」のマイルストーンまで、少なくとも４桁低くするという目標を達成するためには、分子分析の新たな技術が必要である。２００６年７月１８日付のニューヨークタイムズ紙のＮｉｃｈｏｌａｓ Ｗａｄｅ氏による記事「＄１，０００のヒトゲノムの探求（"Ｔｈｅ Ｑｕｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ＄１，０００ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ"）」を参照されたい。

高速シーケンシングのために開発された一つの技術はＤＮＡを糸のように通すナノスケールの孔の利用を含む。歴史的には、「ナノ細孔（ｎａｎｏｐｏｒｅ）」の概念が、電圧を印加することによりＲＮＡおよびＤＮＡ鎖を孔に通す時にイオン電流の痕跡を作り出すために、生体分子装置を利用した。生体系はしかしながら、ｐＨ、温度、および電界に敏感である。さらに生体分子は、鋭敏なオンチップの電子機器に必要とされる半導体プロセスにすぐに組み込むことができない。

固体状態の物質に人工的なナノ細孔を設計および製造することに、長らく多くの努力が注がれてきた。しかしながら、膜に孔を形成するだけしかできないこれらの方法では、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの長鎖状生体ポリマーの真の１分子シーケンシングに必要な、より長いチャネルを形成することができない。

従って、本技術分野には、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの長鎖状生体ポリマーの配列および他の情報を生成することができる装置の必要性がある。

本発明の要約
記述した課題を解決するために、第１の態様では、本発明は、高分子の１若しくはそれ以上の特性を特徴付けるための方法であって、ナノチャネル内に少なくとも一部が存在する高分子を直線状にする工程であって、前記ナノチャネルの少なくとも一部が高分子の少なくとも一部を物理的に拘束することが可能であり、これにより前記高分子のその部分を直線形状に保持し、前記ナノチャネルが少なくとも１つの狭窄を含むものである、前記高分子を直線状にする工程と；前記ナノチャネルの少なくとも一部の中を前記高分子の少なくとも一部を輸送する工程であって、これにより前記高分子の少なくとも一部が前記狭窄を通過するものである、前記輸送する工程と；前記高分子による狭窄の通過に関連して発生する少なくとも１つのシグナルを測定する工程と；前記少なくとも１つのシグナルを、前記高分子の１若しくはそれ以上の特徴と関連付ける工程と、を有するものである、前記特性を特徴付けるための方法、を提供する。

第２の態様では、本発明は、２若しくはそれ以上の流体タンクを有し；ナノチャネルが狭窄を含み、前記ナノチャネルが前記少なくとも２つの流体タンクを互いに流体連通するよう設置するものである、線形高分子を解析する装置を提供する。

さらに提供されるところのものは、高分子を輸送する方法であって、少なくとも２つの流体タンクを提供する工程と；少なくとも部分的に線形の高分子を提供する工程であって、前記高分子の少なくとも一部がナノチャネル内に存在し、前記ナノチャネルが少なくとも２つのタンクを互いに流体連通するよう設置し、前記ナノチャネルが狭窄を含む、前記線形の高分子を提供する工程と；前記高分子に勾配を適用する工程であって、前記勾配が、前記線形高分子の少なくとも一部が前記ナノチャネルの少なくとも一部の中を輸送されるようにするものである、前記適用する工程と、を有する前記輸送する方法である。

追加的に提供するところのものは、狭窄ナノチャネルを製造する方法であって、ナノチャネルを提供する工程であって、前記ナノチャネルは約０．５ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の内径を有し、前記ナノチャネルは少なくとも約１０ｎｍの長さを有するものである、前記ナノチャネルを提供する工程と；前記ナノチャネルの内部の位置または前記ナノチャネルの端部に近接する位置のいずれか、または両方で前記ナノチャネルの内径を縮小させる工程であって、これにより前記ナノチャネルの内部または近接部に狭窄を生じさせ、この狭窄は前記ナノチャネルと流体連通する内径を有するものであり、前記ナノチャネルは線形高分子をその直線形状に保持することが可能であり、前記縮小内径は前記線形高分子の少なくとも一部の通過を許容することが可能なものである、前記ナノチャネルの内径を縮小させる工程と、を有する前記狭窄ナノチャネルを製造する方法である。

同様に開示されるところのものは、高分子を直線状にする方法であって、高分子をナノチャネル内に設置する工程であって、前記ナノチャネルの少なくとも一部分は、前記高分子の少なくとも一部分を物理的に拘束することが可能であり、これにより前記高分子のその部分を直線形状に保持するものである、前記設置する工程を有する、前記高分子を直線状にする方法である。

概略および以下の詳細な記述は一例としてのみ示すものであり、添付の請求項で定義するところの本発明を限定するものではない。本発明の他の観点は、本願明細書で提供するところの本発明の詳細な記述から、当業者にとって明らかであろう。

以下の詳細な記述と同様に要約も、添付の図面と併せて読んだ場合にはさらに良く理解できるであろう。本発明を図示する目的で、図には本発明の一例となる実施例を示してある。しかしながら、本発明は、開示しているところの特定の方法、組成、および装置に限定されるものではない。さらに、図は必ずしも原寸に比例して描かれてはいない。

図１ａは、線形の２本鎖ＤＮＡがナノチャネルを通り、排出タンクで測定装置がＤＮＡの通過と関連して排出タンクまたはナノチャネル内の物理的、化学的、電気的、または他の変化を検出する、ＤＮＡシーケンサーの概略図である。図１ｂは、ＤＮＡ分子がナノチャネル端部のナノノズル狭窄を流れていくところを描いた図である。図１ｃは、ＤＮＡの狭窄ナノチャネルの通過に従って導き出されたデータを表した図である。 図２ａは、線形の１本鎖ＤＮＡがナノチャネルを通り、排出タンクで測定装置がＤＮＡの通過と関連して排出タンクまたはナノチャネル内のなにかしらの物理的、化学的、電気的、または他の変化を検出する、ＤＮＡシーケンサーの概略図である。図２ｂは、一本鎖ＤＮＡ分子がナノチャネル端部のナノノズル狭窄を流れていくところを描いた図である。 図２ｃは、１本鎖ＤＮＡの個々のヌクレオチドがナノチャネルの狭窄を通過するのに従って導き出されたデータを表した図である。 図３ａは、メチル化された線形の２本鎖ＤＮＡがナノチャネルを通り、排出タンクで測定装置がＤＮＡの通過と関連して排出タンクまたはナノチャネル内のなにかしらの物理的、化学的、電気的、または他の変化を検出する、ＤＮＡシーケンサーの概略図である。図３ｂは、メチル化された２本鎖ＤＮＡ分子がナノチャネル端部のナノノズル狭窄を流れていくところを描いた図である。図３ｃは、メチル化された２本鎖ＤＮＡの個々のヌクレオチドがナノチャネルの狭窄を通過するのに従って導き出されたデータを表わした図である。 図４は、断面積がナノチャネルの他の部分より小さい狭窄をナノチャネルが有し、高分子がナノチャネル内部で線形になり、分子の目的の特徴が狭窄を通過する際に検出される、タンクと結合して取り囲んだナノチャネルの、代表的な実施例を表したものである。 図５は、高分子がナノチャネル内部で直線状になり、分子の目的の特徴が狭窄を通過する際に検出される、断面積がどちらのナノチャネルよりも小さな狭窄を介して２つ目のナノチャネルと結合して取り囲んだナノチャネル、を表したものである。 図６ａは、添加材料の蒸着による、ナノチャネル端部への狭窄の作製を表わしたものであり、図６ｂは、ナノチャネル端部のそのような狭窄の実施形態の走査型電子顕微鏡写真である。 図７は、ナノチャネル端部への狭窄の代表的な製造手順を表わしたものであり、（図７ａ）チャネルを完全に閉塞するようにナノチャネル端部に物質を蒸着する工程；（図７ｂ）強塩基での中和によって反応終了する腐食液の酸を用いた、自動的に終了する狭窄の穴あけの工程；（図７ｃ）腐食液および中和液を除去した後の最終的なナノノズル装置、である。 図８は、犠牲材料を用いたナノチャネル端部への狭窄の代表的な製造を表わしており、（図８ａ）一部だけタンクへ出るようナノチャネル内へ設置した犠牲的な高分子；（図８ｂ）流体を除去して犠牲的な分子の周囲に材料を蒸着したところ；（図８ｃ）犠牲的な分子を除去してナノチャネル端部に狭窄が残されたところ、である。 図９は、材料の付加的な蒸着を用いたチャネル開口部のサイズの段階的な縮小を表わした一連の３枚の走査型電子顕微鏡写真を示しており、（図９ａ）最初の幅および高さが約１５０ｎｍである開口ナノチャネルへ、酸化ケイ素を付加的に蒸着することで、直径約５０ｎｍの取り囲まれたナノチャネルが生じるところ；（図９ｂ）パラメータである蒸着の変化がさらに小さな取り囲まれたチャネルを作り出すところ；（図９ｃ）さらにその延長線上で、１０ｎｍ以下の開口部も作り出すことが可能なところ、である。

用語
本願明細書で用いる場合、「実質的に直線状（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｌｉｎｅａｒ）」という用語は、これに限定するものではないが例えば２００残基の核酸が互いに結合したポリ核酸などの長鎖状分子の少なくとも一部のコンフォーメーションが、自身に対して折れ曲がることがないこと、またはいかなる鋭い屈曲、又は約３６０度より大きなカーブを含まないこと、を意味する。

本願明細書で用いる場合、「ナノチャネル」という用語は、導管、チャネル、パイプ、ダクト、または少なくとも１つのナノスケールの寸法を有する他の同様の構造、を意味する。

この開示内容の一部を構成する添付の図および実施例と関連させて、以下の詳細な説明を参照することで、本発明をより容易に理解することができるであろう。本発明は、本願明細書に記述するおよび／または示す特定の装置、方法、適用方法、条件、またはパラメータに限定されるものではないということ、および本願明細書で用いる用語は単なる実施例の形によって特定の実施形態を記述する目的のためのものであり、請求する発明を限定する意図はないこと、を理解されたい。また、添付の請求項を含めて本願明細書で用いる場合、文脈上で明確にことわりを述べていない限り、単数形の「ａ、」「ａｎ、」および「ｔｈｅ」は複数形を含み、特定の数値への言及は少なくともその数値を含むものである。本願明細書で用いる場合、「複数形」という用語は１よりも多いことを意味する。数値の範囲を記述する場合、もう１つの実施形態は１つの特定の数値から、および／または他の特定の数値までを含む。同様に、「約」という先行詞を用いて数値を概数で表現する場合、その特定の値がもう１つの実施形態を成立させるということを理解されたい。全ての範囲は包含的および結合可能である。

本願明細書に明確にするために別の実施形態の文脈で記述した本発明の特定の特徴は、１つの実施形態において組み合わせて提供することもできることも、高く評価されることである。反対に、簡単のために１つの実施形態の文脈において記述した本発明の様々な特徴は、別々にまたは他の組合せで提供することもまた、できる。さらに、範囲のかたちで記述した数値への言及は、その範囲内のそれぞれおよび全ての数値を含む。

一態様では、本発明は高分子の１若しくはそれ以上の特徴を明らかにする方法を提供する。それらの方法は、ナノチャネル内に少なくとも一部が存在する高分子を直線状にすること、ナノチャネルの少なくとも一部が高分子の少なくとも一部を物理的に拘束して、それによって高分子のその部分を直線形状に保持すること、を含む。

適切なナノチャネルは、伸張構造の高分子の旋回半径の約２倍より小さな直径を有する。そのような寸法のナノチャネルは、コイルを直線状にして引き伸ばすために、自由に延びて変動する高分子のコイルのエントロピーの制約を働かせ始めることで知られる。適切なナノチャネルは、２００４年１月２０日に出願され、本願明細書にその全てが参照として取り込まれるところの、米国特許出願第１０／４８４，２９３号「ナノチャネル・アレイおよびその作製および高分子のハイスループット解析における使用（Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ Ａｒｒａｙｓ Ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｕｓｅ Ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」に述べられている方法に従って作製することが可能である。

適切なナノチャネルは少なくとも１つの狭窄を有する。そうした狭窄はナノチャネルの有効内径を局所的に縮小させる働きをする。狭窄は線形高分子の通過を許容するようなサイズにすることが可能である。

本発明の方法は、高分子の少なくとも一部が狭窄を通過するための、ナノチャネルの少なくとも一部の中での高分子の少なくとも一部の輸送の工程もまた、含む。このことは、例えば、ＤＮＡがナノチャネルの狭窄を通過するところを描いた図１ｂ、２ｂ、および３ｂに示してある。狭窄は例えば、ナノチャネル端部に材料を蒸着してナノチャネルを密封し、そしてナノチャネルよりかなり狭い孔が形成されるまで、蒸着させた物質をエッチング処理することで作ることが可能である。このことは、図６から９にさらに詳細に図示してある。

比較的に長い高分子を分析する場合は、高分子の端部をナノチャネルの一方の端部へ輸送する。これは例えば、ナノチャネルへのそうした輸送を助ける勾配構造によって達成できる；適切な勾配構造はｔｏ Ｃａｏ，ｅｔ ａｌ．による米国特許第７，２１７，５６２号明細書に記述されている。

本発明の方法は、高分子による狭窄の通過に関連して発生する少なくとも１つのシグナルの測定、および前記少なくとも１つのシグナルの分子の１若しくはそれ以上の特徴との関連付け、もまた含む。このことは、高分子によるナノチャネルの狭窄の通過に関連して発生するシグナルの測定の概略を描いた、図１ａ、２ａ、および３ａに表わしてある。適切なシグナルは、例えば、電荷のシグナル、光学的なシグナル、電磁気的なシグナル、磁器のシグナル、またはそれらのあらゆる組合せ、を含む。電気的なシグナルは例えば、市販の様々な電流計および増幅器を用いて測定することが可能である。例えば、適切なシグナル測定装置は、約１ナノボルト、または１マイクロボルト、または１ミリボルト、または１ボルトまたはそれ以上からの一定電圧を、タンクおよびナノチャネルの部分の流体に接した電極を通して印加することが可能である。適切な測定装置はまた、電極間の電流を毎秒複数回にわたって測定することも可能である。適切な装置は、少なくとも約１００ヘルツ（「Ｈｚ」、１秒あたりのサイクル）、または約１キロヘルツ（「ｋＨｚ」）、または１０ｋＨｚ、または１００ｋＨｚ、または約１メガヘルツ（「ＭＨｚ」）、または約１０メガヘルツ、の帯域幅を有する。従って、一旦測定がナノ秒、またはマイクロ秒、またはミリ秒のスケールの変形でできるようになったならば、電流を作り出すことは可能である。電流の増幅はピコ秒から可能である。ｓＤＮＡの輸送速度は、古典的な「パッチクランプ増幅器」を通してマイクロ秒あたり約４０塩基とすることが可能である。今日の最高の機械はマイクロ秒ごとに１回のサンプリングが可能である。１００ＫＨｚの帯域幅を有する、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ）社のＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂは、毎秒１００，０００回の電流測定が可能であり、または、これは２つの排液タンクに接続した電極間の電流変化の電流測定に１０マイクロ秒かかるのと同等である。

本発明の方法に適した高分子は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、天然および合成ポリマー、天然および合成共重合体、デンドリマー、界面活性剤、脂質、天然および合成炭水化物、天然および合成ポリペプチド、天然および合成タンパク質、またはそれらの組合せ、を含む。本願明細書の他の箇所で議論する通り、本発明の方法に従って分析可能なものとして、ＤＮＡは特に適切な高分子と考えられる。

本願明細書が提供する方法に従って分析する高分子は、典型的には流体中に存在する。適切な流体としては、水、緩衝液、細胞培養液、およびそれらに類するもの、である。適切な流体は、電解質液、酸性、または塩基性とすることもまた、可能である。

高分子の輸送は、適切なナノチャネルの流れの方向に沿って勾配を適切に適用し、高分子を勾配にさらすことで成し遂げられる。適切な勾配は、電気浸透の場、電気泳動の場、毛細管流動、磁場、電場、放射線場、機械力、電気浸透力、電気泳動力、動電学的な力、温度勾配、圧力勾配、表面性質の勾配、疎水性の勾配、毛細管流動、またはそれらの組合せ、を含む。電場が特に適切な勾配である。

勾配は時間的に一定、空間的に一定、またはそれらのあらゆる組合せとすることができる。勾配は必要に応じて空間および時間において変化させることもまた、できる。いくつかの実施形態では、勾配の変化によって、高分子を前進および後退の両方向へ輸送することが可能である。いくつかの実施形態では、勾配を変化させることで、高分子の同じ部分による狭窄の複数回の通過を許可することができる。

勾配を変化させることで、あたかもカセットテープを望みの部分まで早送りするのに似た方法で、高分子の特定の目的の領域に到達するまで、使用者が高分子を狭窄を通って素早く進ませることもまた可能である。一旦、目的の領域に到達したならば、目的の領域が狭窄をより遅い速度で通過するように、勾配を変化させることが可能である。高分子が狭窄を通って逆方向へ向かうよう、勾配を反転させることもまた、できる。これはあたかも、カセットテープを望みの箇所まで巻き戻しするのに似ているであろう。従って、「再生」、「早送り」、「巻き戻し」、「一時停止」、「停止」の機能を、タンクの間の勾配の大きさおよび極性を制御することで生じさせることが可能である。

検出できる適切なシグナルは、視覚的シグナル、赤外線シグナル、紫外線シグナル、放射線シグナル、磁気シグナル、電気的シグナル、電磁気的シグナル、またはそれらの組合せ、を含む。簡単に測定できるという理由から、電気的シグナルが好ましいと考えられるが、しかし、他のシグナルは効率的に測定できる。

高分子は１若しくはそれ以上の標識を含むことができる。適切な標識は、電子スピン共鳴分子、蛍光分子、化学発光する分子、同位体、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、電荷移動分子、半導体ナノ結晶、半導体ナノ粒子、コロイド金ナノ結晶、リガンド、マイクロビーズ、電磁ビーズ、常磁性体粒子、量子ドット、発色基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、脂質、ポリマー、荷電粒子、修飾ヌクレオチド、化学官能基、化学的部分、またはそれらのあらゆる組合せ、を含む。いくつかの実施形態では、標識はメチル基といった化学的部分である。このことは図３ｂに非限定的なかたちで示しており、そこでは、いくつかのメチル基で標識したＤＮＡ鎖および、それらのメチル基を標識ＤＮＡの１若しくはそれ以上の特徴の表れとして検出する工程、が描かれている。

いくつかの実施形態では、シグナルは高分子から内在的に発せられる。そうした内在的に発せられるシグナルは、高分子または高分子の一部が磁気または放射線を帯びている場合、磁気シグナルまたは放射性シグナルを含む。シグナルが高分子から内在的に発せられる場合、検出可能なシグナルを誘発するために高分子に照射する必要もまた、ないであろう。

他の実施形態では、分子に照射することによってシグナルを生成する。照射は高分子の少なくとも一部分の、可視光、紫外線ライト、赤外線ライト、Ｘ−線、ガンマ線、電磁放射、電波、放射性粒子、またはそれらの組合せ、への曝露を含む。適切な照射装置は、照射する、励起する、または高分子から散乱する、可干渉性および非干渉性の光源を有する。レーザーおよび他の光表面などの、ＵＶ，ＶＩＳ，ＩＲ光源を用いることが可能である。

開示した方法によって検出する高分子の特徴は、高分子の大きさ、高分子の分子組成、高分子の分子配列、高分子の１若しくはそれ以上の分子の化学的性質、高分子の１若しくはそれ以上の分子の放射性、高分子の１若しくはそれ以上の分子の磁気的性質、またはそれらのあらゆる組合せ、を含む。

本願明細書の他の箇所で議論するように、いくつかの実施形態では、高分子を標識する。従って、そうした高分子の特徴は高分子の１若しくはそれ以上の標識の位置である。

分子の分子組成は、瞬間的な方法によってもまた、明らかになる。分子組成は、高分子の１若しくはそれ以上の分子の位置、ＤＮＡ多型、ＤＮＡコピー数の多型、ＤＮＡ中の重複、ＤＮＡ中の欠失、ＤＮＡ中の転位、ＤＮＡ中の特定の遺伝子座の反転、高分子中のメチル基の位置、またはそれらのあらゆる組合せ、を含む。いくつかの実施形態では、多型は、その多型に対してだけ相補的な標識プローブの存在の観察によって検出する。

薬剤と高分子間の結合部位、高分子−薬剤の複合体、ＤＮＡ修復部位、ＤＮＡ結合部位、ＤＮＡの切断部位、ＳｉＲＮＡ結合部位、アンチセンス結合部位、転写因子結合部位、調節因子結合部位、制限酵素結合部位、制限酵素切断部位、またはそれらのあらゆる組合せの検出は、本発明の範囲内に全て含まれる。

本願明細書の他の箇所で議論するとおり、それらの特徴は、目的の特徴と相補的な１若しくはそれ以上のプローブの存在に関して高分子を精査することによって決定する。本発明の方法は、図１ｃ２ｃ、および３ｃに概略が示してあり、それらはそれぞれ、ナノチャネルの狭窄の高分子による通過に関連して発生するシグナルの測定を表している。いくつかの実施形態では、所与の高分子の２若しくはそれ以上の特徴を決定するために、２若しくはそれ以上のプローブを用いる。

装置の特定の実施形態は、複数のナノチャネルを有する。そうしたナノチャネルのアレイは、１つの高分子の複数の特徴、または複数の高分子の複数の特徴を効率的に明らかにするにあたって、有用である。当業者にとっては、特定の特徴に相補的な標識を選ぶこと、および所与の高分子上にそうした特徴が存在するか否かを決定するために、分析する所与の高分子に適用すること、が可能であることは明白であろう。

さらに開示するのは、線形高分子を分析する装置である。適切な装置は、２若しくはそれ以上の流体タンク、および狭窄を有するナノチャネルを含み、前記ナノチャネルが少なくとも２つの流体タンクを互いに流体連通するように設置している。本願明細書の他の箇所に述べる通り、適切なナノチャネルは高分子の少なくとも一部分を物理的に拘束することが可能で、それによりその部分を直線形状に保持する。このことは、それらのそれぞれの全てが本願明細書に参照として取り込まれるところの特許出願である、２００６年７月１９日に出願された米国特許出願第６０／８３１，７７２号、２００７年３月２８日に出願された米国特許出願第６０／９０８，５８２号、２００７年３月２８日に出願された米国特許出願第６０／９０８，５８４号にさらなる詳細が説明されている。タンクを伴う適切な装置は、標準的なシリコンのフォトリソグラフィおよびエッチングの技術を用いて作ることが可能である。ナノチャネルの長さもまた、それらの技術を用いて制御することが可能である。タンクおよびそれに結合し、マイクロ流体インターフェイス領域を含むところのマイクロ流体領域は、熱接合、透明な蓋（例えば、水晶、ガラス、またはプラスチック）の接着、熱接合といったような、標準的なウエハー（シリコンウエハー−シリコンウエハー）接合技術を用いて密封することが可能である。

狭窄はナノチャネルの一方の端部に適切に設置する。しかしながら、いくつかの実施形態では、狭窄はナノチャネルの内部に設置する。狭窄の最終的な設置は、使用者の必要に応じたものとなる。ナノチャネル内部の狭窄は、以下のようにして作ることが可能である：本願明細書でさらに説明するように（例えば、以下でさらに述べるところの実施例７を参照のこと）、犠牲材料を充填剤として用いる。

適切なナノチャネルは少なくとも約１０ｎｍ、または少なくとも１５ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、さらにまたは少なくとも１００ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、または少なくとも１０００ｎｍ、の範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは、線形高分子のおおよその長さと少なくとも同じ長さを有する。

適切なナノチャネルはまた、約０．５ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の、または約１０ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の、または約１００ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲の、または約１５０ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲の、有効内径を有する。ナノチャネルの有効内径はまた、少なくとも１５ｎｍ、または少なくとも２０ｎｍ、または少なくとも３０ｎｍ、または少なくとも４０ｎｍ、または少なくとも５０ｎｍ、または少なくとも６０ｎｍ、または少なくとも７０ｎｍ、または少なくとも８０ｎｍ、または少なくとも９０ｎｍ、または少なくとも１００ｎｍ、とすることが可能である。述べてきたように、ナノチャネルは、高分子を直線形状に保持することが可能な有効内径を有する。

「有効内径（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎｎｅｒ ｄｉａｍｅｔｅｒ）」および「内径（ｉｎｎｅｒ ｄｉａｍｅｔｅｒ）」という用語は、他に示さない限り、同じ意味で用いる。「有効内径」という用語は、円形の断面を有するナノチャネルのみでなく、円形でない断面を有するナノチャネルについても言及するものである。例えば、「有効内径」は、ナノチャネルが円形の断面を有すると仮定して、有効内径を有する円形の領域という観点からナノチャネルの実際の断面を強いて効率的に演算することで、決定することが可能である：ナノチャネルの断面積 ＝ π × （有効内径／２）^２。従って、ナノチャネルの有効内径は以下のように決定できる：
有効内径 ＝ ２〔（ナノチャネルの断面積）／π〕^１／２
狭窄は適切には、約０．５ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲、または約１〜約８０ｎｍの範囲、または約５〜約５０ｎｍの範囲、または約８ｎｍ〜約３０ｎｍの範囲、または約１０ｎｍ〜約１５ｎｍの範囲の、分子の輸送を許可する有効内径または有効寸法を有する。適切な狭窄は、線形高分子が狭窄を通過する際に直線形状を保持することが可能な有効内径を有する。有効内径または寸法は、エッチングの条件の制御によって、または狭窄領域内の犠牲材料の大きさの制御によって、制御することが可能である。

開示する装置はまた、ナノチャネルの少なくとも一部に沿って適切に存在する勾配をも含むものである。適切な勾配は、電気浸透の場、電気泳動の場、毛細管流動、磁場、電場、放射線場、機械力、電気浸透力、電気泳動力、動電学的な力、温度勾配、圧力勾配、表面性質の勾配、毛細管流動、またはそれらの組合せ、を含む。

いくつかの実施形態では、勾配は、ナノチャネルの少なくとも一部の内部に存在する高分子の少なくとも一部を、直線状にすることが可能である。しかしながら、好ましい実施形態では、勾配は、ナノチャネルの少なくとも一部に沿ってナノチャネルの内部に位置する高分子の少なくとも一部を、輸送することが可能である。

装置は適切には、記述した勾配を供給することが可能な勾配発生器を含む。適切な発生装置は、電源、磁石、音源、圧力源、またはそれらの組合せ、を含む。

勾配発生器は適切には、一定の勾配を適用することが可能である。いくつかの実施形態では、勾配発生器はまた、変化する勾配を適用することも可能である。本願明細書の他の箇所で述べる実施例は、さらなる詳細を提供する。当業者にとっては、使用者の必要に従って、勾配の強度および変動性を選択することが明白であろう。

いくつかの実施形態では、装置の２若しくはそれ以上の流体タンクは同一の流体を有する。他の実施形態では、２若しくはそれ以上の流体タンクは異なる流体を有する。いくつかの実施形態では、ナノチャネル内で高分子を輸送するために用いる勾配を提供するために異なる流体を用いることができ、そうした勾配を提供するために、異なるイオン強度または他の性質の流体を選択することができる。適切な流体は、緩衝液、酸、塩基、電解液、細胞培養液、界面活性剤、およびそれらに類するもの、を含む。

装置はまた、直線状になった高分子の少なくとも一部が狭窄を通過することにより発生するシグナルを検出することが可能な検出器も有する。適切な検出器は、電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ：ＣＣＤ）検出システム、相補型金属酸化膜半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔａｌ−ｏｘｉｄｅ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ＣＭＯＳ）検出システム、光ダイオード検出システム、光電子増倍管検出システム、シンチレーション検出システム、光子計数検出システム、電子スピン共鳴検出システム、蛍光検出システム、光子検出システム、電子検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＡＦＭ）検出システム、走査型トンネル顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＴＭ）検出システム、走査型電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＥＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＮＭＲ）検出システム、近接場（ｎｅａｒ ｆｉｅｌｄ）検出システム、全反射（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ：ＴＩＲＦ）検出システム、パッチクランプ検出システム、電流検出システム、電気増幅検出システム、抵抗測定システム、容量検出システム、およびそれらに類するもの、を有する。

適切な検出器は、１若しくはそれ以上の流体タンク内の１若しくはそれ以上の場所を測定することが可能であり、または、他の実施形態では、ナノチャネル内部の位置、またはナノチャネル端部に近接する位置でも測定することが可能である。異なる位置の異なるシグナルを検出可能な１若しくはそれ以上の検出器の採用によって、所与の高分子の複数の特徴を明らかにすることが可能となることが、使用者にとっては明白であろう。

いくつかの実施形態では、装置は照射器を含む。照射器は適切には、レーザー、可視光の光源、放射性粒子の発生源、磁石、紫外線の発生源、赤外線の発生源、またはそれらの組合せ、を含む。いくつかの実施形態では、ナノチャネル内の高分子の一部を励起するために、照射器を用いる。非限定的な実施例としては、特定の波長の光源を用いることで、高分子の特定の特異的な位置に存在する蛍光標識を励起し、それにより、そのような標識の存在を顕在化させる。

装置はまた、適切にはデータ処理器も含む。いくつかの実施形態では、装置はデータ記録装置を含む。そうした処理装置は、大きなデータセットを操作および関連付けるために用いる。

開示する装置の一実施形態は図４に示してあり、そこにはタンクに近接する側の一端を狭窄させたナノチャネル、および高分子が直線的に輸送されるタンクから発生するシグナルを測定する検出器を描いてある。他の実施形態は図５に示してあり、そこでは狭窄が２つのナノチャネルを結合している。図５では、狭窄ナノチャネルの組立部を通って展開される１若しくはそれ以上のシグナルを検出器が測定する様子が見られる。

本願明細書の他の箇所で議論する通り、比較的に長い高分子を分析する場合、高分子の一端をまずナノチャネルの一端へと輸送する。述べた通り、このことは例えば、そうした輸送を助ける勾配構造によって成し遂げられる。適切な勾配構造は、その全てが本願明細書に参照として組み込まれるところのｔｏ Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．，による米国特許第７，２１７，５６２号明細書、に記述されている。

さらに開示するところのものは、高分子の輸送方法である。そうした方法は、少なくとも２つのタンクの提供、およびナノチャネルに存在する高分子の少なくとも一部少なくとも部分的に線形の高分子の提供、を含む。本願明細書の他の箇所で議論する通り、線形高分子の旋回半径の約２倍より小さな内径を有する適切な寸法のナノチャネルへ閉じ込めることによって、高分子を直線状にすることができる。

適切なナノチャネルは、互いに流体連通するようにタンクを設置する。本願明細書の他の箇所で述べる通り、適切なナノチャネルは狭窄もまた含む。適切な狭窄の寸法は、本願明細書の他の箇所に述べる。

本発明の方法は、高分子への勾配の適用もまた含む。勾配は、線形高分子の少なくとも一部の、ナノチャネルの少なくとも一部の中への輸送を適切に生じさせる。適切な勾配は、電気浸透の場、電気泳動の場、毛細管流動、磁場、電場、放射線場、機械力、電気浸透力、電気泳動力、動電学的な力、温度勾配、圧力勾配、表面性質の勾配、毛細管流動、またはそれらの組合せ、を含む。勾配は適切には、使用者の必要に応じて一定とする、または変動させることができる。

タンクは、ナノチャネルの部分と比較して容積が大きい。タンクはほとんどいかなる形および大きさとすることが可能である。例えば、タンクは、円形、球形、長方形、またはそれらのあらゆる組合せとすることができる。タンクの大きさは使用者の必要によって決定し、変化させることができる。

開示する方法のナノチャネルは、約１０ｎｍより長い、または約１２ｎｍより長い、または約１４ｎｍより長い、または約１６ｎｍより長い、または約１８ｎｎより長い、または約２０ｎｍより長い、または約２５ｎｍより長い、または約３０ｎｍより長い、または約３５ｎｍより長い、または約４０ｎｍより長い、または約４５ｎｍより長い、長さを有する。いくつかの実施形態では、ナノチャネルは約１００ｎｍより長い、または約５００ｎｍよりさらに長い、長さを有する。適切なナノチャネルは長さ約１ミクロンよりも長く、または約１０ミクロンよりも長く、または約１００ミクロンよりも長く、または約１ｍｍよりも長く、または長さ約１０ｍｍよりもさらに長く、することが可能である。いくつかの実施形態では、ナノチャネルの長さは、おおよそ線形高分子の長さを超えるように選択する。

さらに開示するところのものは、狭窄ナノチャネルの製造方法である。これらの方法はまず、ナノチャネルの提供を含む。適切なナノチャネルは、約０．５ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲、または約１ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲、または約５ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲、または約１０ｎｍ〜約１５ｎｍの範囲、の有効内径を有する。ナノチャネルの有効内径は、少なくとも約１５ｎｍ、または少なくとも約２０ｎｍ、少なくとも約３０ｎｍ、または少なくとも約４０ｎｍ、または少なくとも約５０ｎｍ、または少なくとも約６０ｎｍ、または少なくとも約７０ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ、または少なくとも約９０ｎｍ、または少なくとも約１００ｎｍ、とすることもまた可能である。

本発明の方法は、ナノチャネルの内部または近接部に狭窄が生じ、狭窄がナノチャネルと流体連通するような内径を有するように、ナノチャネルの内部またはナノチャネル端部に近接した位置のいずれか、または両方で、ナノチャネルの有効内径を縮小する工程もまた含む。狭窄のサンプルは、図１ｂ、図４、図５、および図６に示す。適切なナノチャネルは、線形高分子を直線形状に保持することが可能である；本発明の他の箇所で議論する通り、このことは、適切な寸法のナノチャネルの部分を用いて適切に成し遂げられ、それにより高分子を実質的に直線形状に保持するように高分子を物理的に拘束する。狭窄ナノチャネルの縮小した内径は、適切には、線形高分子の少なくとも一部の通過を許可することが可能である。

一実施形態では、ナノチャネルの内径を縮小し、それにより、ナノチャネルの内部または外側への１若しくはそれ以上の材料の付加的な蒸着によって狭窄を形成する。このことは、スパッタリング、スプレー、物理蒸着、化学蒸着、またはそれらのあらゆる組合せ、によって適切に成し遂げられる。いくつかの実施形態では、ナノチャネルを完全に閉塞する前に、付加的な蒸着を停止する。このことは図６ａおよび６ｂに表しており、そこにはナノチャネルの一方の端部の近接部への追加的な材料の蒸着を示しており、ナノチャネルが完全に閉塞する前に蒸着が停止している。そうしたナノチャネルは図９にも示してあり、そこではナノチャネル端部（図９ａ）が付加的な材料の様々な蒸着（図９ｂおよび９ｃ）によって縮小する様子として、有効内径の縮小が示してある。

本発明の他の実施形態では、ナノチャネルを完全に閉塞した後に付加的な蒸着を停止する。それらの実施形態では、本発明の方法は、蒸着した添加材料の少なくとも一部の除去によって、密封したナノチャネルを再度開く工程を含む。このことは、エッチング処理によって適切に成し遂げられる。エッチング処理は、蒸着した添加材料の一方の面に、蒸着した添加材料を腐食させることが可能な第１の種類の物質を接触させる工程、および蒸着した添加材料の他方の面に、第１の種類の物質との接触によって腐食させる種類の物質の腐食作用を妨害することが可能な第２の種類の物質を接触させる工程、を必要とする。いくつかの実施形態では、第２の種類の物質は、第１の種類の物質との接触によって、腐食させる種類の物質の腐食作用を停止させることが可能である。このことは図７ａに示してあり、そこではシーリング材をナノチャネルの一方の端部へ塗布し、そして図７ｂでは、それを強塩基性溶液で腐食させ、エッチングが停止する図７ｃでは、塩基性溶液がシーリング材を腐食させながら進み、シーリング材の反対側に存在する強酸によって中和される。当業者にとっては明白なように、ナノチャネル内の条件、第１および第２の種類の物質の相対的な量、および他の施行上のパラメータは、所望の直径を得るために調節する。

さらに他の実施形態では、ナノチャネル内径の縮小はいくつかの工程を含む：（図８ａ）ナノチャネル内に犠牲材料を設置する工程、（図８ｂ）ナノチャネルを完全に閉塞するために、犠牲材料の近傍に添加材料を蒸着する工程、（図８ｃ）除去する犠牲材料の寸法となるナノチャネルの縮小内径を生じさせるために、近傍の添加材料をほぼ完全に残しつつ犠牲材料の少なくとも一部分を選択的に除去する工程、である。当業者にとっては明白なように、本発明のこの態様は、ナノスケールおよびより大きなチャネルの内部、または他の構造の内部に様々な寸法を有する空間を製造する際に有用である。適切な犠牲材料としては、ＤＮＡおよびカーボンナノチューブが共に考えられる。選択的に溶解または腐食できる他の材料は、当業者にとっては明白であろう。

本発明はまた、高分子の自由度を３次元から本質的に１次元へ制約するための、高分子を直線状とする方法、も提供する。それらの方法は、ナノチャネルの少なくとも一部が高分子の少なくとも一部を物理的に拘束することが可能であり、それにより高分子のその部分を直線形状に保持する、ナノチャネル内への高分子の設置の工程を含む。

ナノチャネルは適切には狭窄を含む。狭窄の適切な寸法は、本願明細書の他の箇所に記述する。

いくつかの実施形態では、本発明の方法はまた、高分子の少なくとも一部がナノチャネルの狭窄を直線的に通過するような、高分子への勾配の適用を含む。適切な勾配は、電気浸透の場、電気泳動の場、毛細管流動、磁場、電場、放射線場、機械力、電気浸透力、電気泳動力、動電学的な力、温度勾配、圧力勾配、表面性質の勾配、毛細管流動、またはそれらのあらゆる組合せ、を含む。

開示する方法のマイクロチャネルは、２若しくはそれ以上の流体タンクを互いに流体連通するように適切に設置する。

ナノチャネルは適切には、高分子の直線状コンフォーメーションの旋回半径の約２倍より小さな内径を含む。ナノチャネルは適切には、少なくとも約１０ｎｍ、少なくとも約５０ｎｍ、少なくとも約１００ｎｍ、少なくとも約５００ｎｍ、の長さを有する。ナノチャネルの適切な内径は、約０．５ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲、または約５ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲、または約５０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲、である。

実施例および説明のための他の実施形態
以下は非限定的な実施例および説明のための実施形態であり、必ずしも本発明の範囲を限定するものではない。

全般的な手順。充填剤の蒸着は、様々な角度に傾けたサンプルウエハーへの、スパッタリング、ＣＶＤ、電子ビーム蒸着法、によって提供する。この工程は、ナノチャネル開口部を縮小させる際、およびチャネル端部に先細のノズルを形成する際、の両方に用いる。

典型的には、取り囲まれたナノチャネルの製造には、１００〜３４０ｎｍの二酸化ケイ素をチャネル開口部へ蒸着する。効果的なシーリングは、テストした様々な蒸着の条件で達成できた。ガス圧３０ｍＴｏｒｒにおいて、ＲＦパワー〜９００Ｗ，ＤＣバイアス１４００Ｖ、蒸着速度〜９ｎｍ／ｍｉｎ、を達成できた。より低い５ｍＴｏｒｒの圧力においては、蒸着速度は概算１７ｎｍ／ｍｉｎに上昇した。充填剤は、５ｍＴｏｒｒにおけるスパッタリングによってナノチャネル開口部へ蒸着した。ナノチャネル・アレイおよび装置の製作に関するさらなる詳細は、それらの全てが本願明細書に参照として取り込まれるところの、米国公開特許第ＵＳ ２００４−００３３５１５ Ａ１、およびＵＳ ２００４−０１９７８４３ Ａ１に記されている。

実施例１：シリコン基板は、１５０ｎｍのトレンチ幅および１５０ｎｍのトレンチ高を有する複数の平行な直線状のチャネルを有するように、提供する。それらのチャネル開口部は、上述の全般的な手順に従って、５ｍＴｏｒｒのガス圧でスパッタリングした。部分的に密封した、または完全に密封したナノチャネル・アレイを提供するための、スパッタリングによる蒸着の時間は１０〜２５分間である。

実施例２：この実施例では、電子ビーム蒸着技術を用いた、取り囲まれたナノチャネル・アレイを提供する。基板は実施例１のようにして提供することが可能である。電子（熱）蒸着装置（Ｔｅｍｅｓｃａｌ ＢＪＤ−１８００）によって、二酸化ケイ素を基板上へ蒸着させることが可能である。二酸化ケイ素源ターゲットからの蒸着ビームの様々な入射角で、基板を設置することが可能である；蒸着速度は約３ｎｍ／分に設定することが可能であり、１５０ｎｍのシーリング材を約５０分で蒸着させることが可能である。チャネルの幅および高さをそれぞれ１５０ｎｍ以下および１５０ｎｍに縮小するために、および接線方向の浅い蒸着角度を提供することによってチャネルを実質的に密封するために、入射するシーリング材の蒸着ビームの角度を変化させることが可能である。

実施例３：この実施例では、ナノチャネル・アレイに表面修飾剤を接触させることが可能である。実施例１に従って作製したナノチャネル・アレイを、良く湿るように、および非特異的な結合を減少させるために、溶液中へ沈めることが可能である。溶液は、トルエン中に０．１〜１００ｍＭの範囲の濃度でポリエチレングリコール・シランを含有することが可能であり、約１〜約２４時間の間ナノチャネル・アレイと接触させておくことが可能である。それに続くエタノールおよび水中での洗浄は、結合しなかった材料の除去に用いられる。

実施例４：この実施例は、ナノ流体チップのためのナノチャネル・アレイを伴うサンプルタンクを記述する。実施例１の全般的な手順に従って、幅１００ｎｍ、深さ１００ｎｍのナノチャネルを有するナノチャネル・アレイを作製した。ナノチャネル・アレイを、ＡＺ−５２１４Ｅなどのフォトレジストでスピンコートし、タンクの準備のためにチャネル・アレイの反対側の端の領域を提供するために、アライナー装置Ｋａｒｌ Ｓｕｓｓ ＭＡ６を用いてフォトマスクによるフォトリソグラフィによってパターンを作成する。ナノチャネル端部を露光し、基板の端のチャネルの反対側の端部に幅約１ミリメーターで深さ数ミクロンのタンクを提供するために、Ｐｌａｓｍａ−Ｔｈｅｒｍ ７２０ＳＬＲ中でＣＦ_４およびＯ_２の組合せを用い、圧力５ｍＴｏｒｒおよびＲＦパワー１００Ｗ、エッチング速度２０ｎｍ／ｍｉｎにて、露光した領域を、反応性イオンエッチングを用いてエッチングした。

実施例５：この実施例では、ＤＮＡを分析するための、ＤＮＡ分子を含有する流体によるナノ流体チップの充填の工程を記述する。直径２ｍｍの円筒形でプラスチック製のサンプル輸送チューブを、実施例３のナノチャネル・アレイのタンクの１つと流体連通するように設置した。輸送チューブは、さらに圧力／真空発生装置につなぐことが可能なところの、外部のサンプル輸送／収集装置と結合することが可能である。ナノチャネルは、緩衝液の毛細管現象を用いて湿らせる。染色した例えばラムダ・ファージの高分子（ラムダＤＮＡ）を含む緩衝液を、電場（１〜５０Ｖ／ｃｍ）によってナノチャネル・アレイへと導入する；溶液濃度は０．０５〜５マイクログラム／ｍＬ、ラムダＤＮＡはＴＯＴＯ−１染色液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を用いて１０：１塩基対／染色液の比率で染色する。０．１Ｍの抗酸化剤および付着防止剤として用いる０．１％直線状ポリアクリルアミドを含む０．５×ＴＢＥ（ｐＨ７．０のトリスホウ酸塩緩衝液）中で、染色したＤＮＡのこの溶液を０．０１〜０．０５マイクログラム／ｍＬに希釈する。

実施例６：この実施例では、酸によるエッチングを用いた、ナノチャネル端部へのナノノズルの製造工程を記述する。ナノノズル装置の製造は、実施例１で提供する取り囲まれたナノチャネルを有する完成したシリコンのナノチャネルをもって始める。チャネルの露光した端部に、クロムの薄層をスパッタコーティングすることにより、ナノ細孔の作成を進める。Ｔｅｍｅｓｃａｌシステムを用いたスパッタコーティングは、速度０．０１〜１ｎｍ／秒において蒸着量５〜２００ｎｍで、またはナノチャネル端部がクロムで完全に覆われるまで、ナノメーター以下の精度で制御可能である。クロム中に１０ｎｍ以下の細孔を開けるために、次にウェットエッチングの過程を利用することが可能である。Ｃｒ^−７のような希釈したクロムの腐食液を、毛細管力または他の揚水方法の形を用いて、チャネルへ流れ込ませることが可能である。希釈は１×〜１０，０００×の範囲とすることが可能である。Ｃｒ^−７は非常に選択的な酸腐食液であるため、シリコンのチャネル自体よりも、チャネル端部のクロムと選択的に反応する。エッチング処理を停止させるためには、細孔が一旦開くと、チャネルの外部領域が高濃度の塩基性溶液（水酸化ナトリウムのような）で満たされ、それが貫通とともに弱酸を急激に中和する。続く装置の洗浄の後には、結果としてナノチャネル端部にナノスケールのノズルが出来上がる。

実施例７：この実施例は、犠牲的な高分子を用いた、ナノノズル・チップの製造方法を記述するものである。２本鎖ＤＮＡを直線状にするために、ナノチャネルによって連結した入力／出力のタンクを有するナノ流体チップを利用する（図８ａ）。この実施例では、長さ約１〜１０ＭｂｐのＤＮＡの長い断片をＹＯＹＯ−１で均一に染色したものが好ましい。ＤＮＡ濃度は約０．５マイクログラム／ｍＬとするべきであり、染色液で１０：１塩基対／染色液の比率で染色する。緩衝液は、０．１Ｍの抗酸化剤および付着防止剤として用いる０．１％直線状ポリアクリルアミドを含む０．５×ＴＢＥ（ｐＨ７．０）から成る。ナノ流体チップおよび前述の方法（Ｃａｏ ２００２）を用いて、犠牲的なＤＮＡ分子の溶液をチップのナノチャネルへ流れ込ませると、それがナノチャネルから排液タンクへ出る。蛍光顕微鏡を用いて、ＤＮＡ分子が出る様子をリアルタイムで観察し、その動きをタンク中の電場（１〜５０Ｖ／ｃｍ）の適用により制御する。そうした方法によって、ＤＮＡ断片を、ナノチャネルを部分的にだけ出た望みの位置で留めることが可能である。そして、ナノチャネル・チップを真空状態の５０℃で乾燥させ、残った緩衝溶液を全て除去することで、目的のＤＮＡ断片をナノチャネル内部に部分的に残す。ナノチャネル表面とＤＮＡ断片間の相互作用、例えばファンデルワールス力による結合が、乾燥の間、チャネル内での断片の位置を保持する。

ナノチャネル・チップを乾燥した後、ナノチャネルへの入り口がブロックされ、ＤＮＡ断片が取り囲まれるように、チップ表面上に二酸化ケイ素などの材料を蒸着させる（図８ｂ）。材料の蒸着速度および蒸着温度は、この過程中にＤＮＡ断片が損傷しないように、慎重に選択すべきである。クーリングステージを用いて−１６０℃に保ったサンプルへ、０．２Ａ／ｓまたはそれ以下で材料を蒸着すると、小さな有機分子を損傷から保護できることが示されている（Ａｕｓｔｉｎ ２００３）。ナノノズルを適切に形成するために、ナノチャネル周辺の均一な被覆を得るために、蒸着の過程中、ステージを回転および傾斜させる。直径８０ｎｍのナノチャネルを完全に閉じるためには、約２００ｎｍの二酸化ケイ素材料を蒸着する必要がある。

実施例８．装置の操作−１本鎖核酸の配列の電気的な測定：ナノチャネルのそれぞれの端部にあり直径約５〜１００ミクロンおよび深さ１〜２ミクロンの寸法を有するタンクに接触した電極（銅、銀、チタン、金、またはアルミニウムとすることが可能である）を用いたシーケンシングに供する１本鎖核酸のために、ナノチャネルの一方の端部に位置して内径約１．５ｎｍの狭窄（ナノゲートまたはナノノズルのいづれでも）を有するナノチャネル装置で、前記ナノチャネルが長さ約２００ミクロンである、前記ナノチャネル装置に電圧バイアスを適用した。電極はタンク中へ設置し、リード線は電流計に接続するために流体領域の外部へ導く。１００ｍＶ〜１００Ｖの電圧範囲が利用可能である。それぞれのタンクに生理的緩衝液（ＴＥ、ＴＢＥ、ＴＡＥ）を入れて、適切な流体輸送のポンプまたはシリンジを用いて、毛細管現象および圧力差の助けによってナノ流体装置を湿らせる。緩衝液（１ナノリットル〜約１００マイクロリットル）中の核酸サンプル（例えば、１００塩基のｓＤＮＡおよび少なくとも１０００塩基、または１００００塩基、または１０００００塩基、または１百万、または１０百万、または１００百万以上、染色体の長さまで）を、１つまたは両方のタンクへ輸送した。１若しくはそれ以上のポリ核酸分子をナノチャネル内へ、狭窄へ輸送する助けとして、勾配を適用する。特にこの実施例では、場を適用し、１つのタンクからナノチャネルを通って狭窄を通り、ポリ核酸が狭窄に存在するように、および２つめのタンクへ行くように、制御した電圧の勾配を適用する。このシステムを通して流れる電流は、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）パッチクランプ増幅器を用いて、検出および増幅をする。典型的に測定した電流は、約１００ｆＡ〜約１ｕＡの範囲であり、ＤＮＡの狭窄通過の動きに応じて約１００ピコアンプの変動を伴う。１本鎖ＤＮＡへ付けた標識は、ＤＮＡ自体が作り出すよりも小さな追加的な変動を生じる可能性がある。１塩基の空間的解像度での測定の場合、典型的な移動速度は、測定システムが１塩基あたり最低１回の測定を記録できるような速度である。Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂで帯域幅１００ｋＨｚの場合、ナノチャネル内でのＤＮＡ分子の伸びが５０％と仮定すれば、輸送の最高速度は１００ｋＢ／秒である。このことは、ＤＮＡが構造を通過する輸送速度として約０．０１５ｎｍ／マイクロ秒を生じさせる。測定した電流の相違は、測定および較正基準のシートと関連づけられ、ＤＮＡサンプルの配列を生成する。

様々な対象分子の分析のための適切な断面寸法を表す表を、以下に示した。

Claims (15)

1. 高分子の１若しくはそれ以上の特徴を明らかにする方法であって、
   ナノチャネルの内部に少なくとも一部が存在する高分子を直線状にする工程であって、
   前記ナノチャネルが少なくとも１つの狭窄を有するものであり、前記ナノチャネルの有効内径が１０ｎｍから５００ｎｍであるとともに、線形高分子の長さと少なくとも等しい長さを有し、且つ前記狭窄は前記線形高分子が前記狭窄を通過する際に直線形状を保持することを可能にし、且つ前記狭窄は前記ナノチャネルの有効内径を０．５ｎｍから１００ｎｍになるように局所的に縮小して設定されるものである、前記直線状にする工程と、
   前記ナノチャネルの少なくとも一部の中に前記高分子の少なくとも一部を輸送する工程であって、これにより前記高分子の少なくとも一部が前記狭窄を通過するものである、前記輸送する工程と、
   前記高分子による狭窄の通過に関連して発生する少なくとも１つのシグナルを測定する工程と、
   前記少なくとも１つのシグナルを、前記高分子の１若しくはそれ以上の特徴と関連付ける工程と
   を有する方法。
2. 請求項１記載の方法において、前記ナノチャネルの長さは、少なくとも１０００ｎｍである、方法。
3. 請求項１記載の方法において、前記高分子は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、ポリマー、共重合体、デンドリマー、界面活性剤、脂質、炭水化物、ポリペプチド、タンパク質、またはそれらのあらゆる組合せ、を有するものである、方法。
4. 請求項１記載の方法において、前記輸送する工程は、前記高分子を勾配に曝露する工程を有するものである、方法。
5. 請求項４記載の方法において、前記勾配は、電気浸透の場、電気泳動の場、磁場、電場、電磁場、流動場、放射線場、機械力、電気浸透力、電気泳動力、動電学的な力、温度勾配、圧力勾配、表面性質の勾配、毛細管流動、またはそれらのあらゆる組合せ、を有するものである、方法。
6. 請求項１記載の方法において、前記シグナルは、視覚的シグナル、赤外線シグナル、紫外線シグナル、放射線シグナル、磁気シグナル、電気的シグナル、電磁気的シグナル、またはそれらのあらゆる組合せ、を有するものである、方法。
7. 請求項１記載の方法において、前記高分子は１若しくはそれ以上の標識を有するものであり、前記１若しくはそれ以上の標識は、選択的に電子スピン共鳴分子、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、および酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、荷電輸送分子、半導体ナノ結晶、半導体ナノ粒子、コロイド金ナノ結晶、リガンド、マイクロビーズ、電磁ビーズ、常磁性体粒子、量子ドット、発色基質、親和性分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗原、ハプテン、抗体、抗体断片、脂質、ポリマー、荷電粒子、修飾ヌクレオチド、またはそれらのあらゆる組合せ、を有するものである、方法。
8. 高分子を分析する装置であって、
   流体通路によって連結される２若しくはそれ以上の流体タンクと、
   狭窄を有するナノチャネルであって、
   前記ナノチャネル及び前記狭窄は前記タンク間の前記流体通路に位置し、前記ナノチャネルの有効内径が１０ｎｍから５００ｎｍであるとともに、線形高分子の長さと少なくとも等しい長さを有し、且つ前記狭窄は前記線形高分子が前記狭窄を通過する際に直線形状を保持することを可能にし、且つ前記狭窄は前記ナノチャネルの有効内径を０．５ｎｍから１００ｎｍになるように局所的に縮小して設定されるものである、前記ナノチャネルと、
   前記高分子が前記狭窄を通過するたびに、少なくとも前記高分子の少なくとも一部からの信号を検出するように設定された検出器と
   を有する装置。
9. 請求項８記載の装置において、前記狭窄は前記ナノチャネルの一方の端に存在するものである、装置。
10. 請求項８記載の装置において、前記狭窄は前記ナノチャネルの内部に存在するものである、装置。
11. 請求項８記載の装置において、前記狭窄は、１ｎｍから５０ｎｍの範囲の有効内径を有するものである、装置。
12. 請求項８記載の装置において、前記ナノチャネルの長さは、少なくとも１０００ｎｍで
    ある、装置。
13. 請求項８記載の装置において、前記装置は、さらに勾配を有するものであり、前記勾配は、選択的に電気浸透の場、電気泳動の場、毛細管流動、磁場、電場、放射線場、機械力、電気浸透力、電気泳動力、動電学的な力、温度勾配、圧力勾配、表面性質の勾配、毛細管流動、またはそれらのあらゆる組合せ、を有するものである、装置。
14. 請求項１３記載の装置において、前記勾配は、前記ナノチャネル内部に位置する高分子の少なくとも一部を、前記ナノチャネルの少なくとも一部に沿って輸送することが可能なものである、装置。
15. 請求項８記載の装置において、前記検出器は、電荷結合素子（ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ：ＣＣＤ）検出システム、相補型金属酸化膜半導体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｍｅｔａｌ−ｏｘｉｄｅ ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：ＣＭＯＳ）検出システム、光ダイオード検出システム、光電子増倍管検出システム、シンチレーション検出システム、光子計数検出システム、電子スピン共鳴検出システム、蛍光検出システム、光子検出システム、電気的検出システム、写真フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＡＦＭ）検出システム、走査型トンネル顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＴＭ）検出システム、走査型電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＳＥＭ）検出システム、光学検出システム、核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＮＭＲ）検出システム、近接場（ｎｅａｒ ｆｉｅｌｄ）検出システム、全反射（ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ：ＴＩＲＦ）検出システム、パッチクランプ検出システム、電流検出システム、電気増幅検出システム、抵抗測定システム、容量検出システム、またはそれらのあらゆる組合せ、を有するものである、装置。

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