JP5968447B2

JP5968447B2 - 物性が強化されたキトサンおよび／またはキチン複合体およびその用途

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Publication number: JP5968447B2
Application number: JP2014533202A
Authority: JP
Inventors: ファン，ドン−ス; オ，ドン−ヨプ; キム，サン−シク; チャ，ヒョン−ジュン
Original assignee: ポステックアカデミー−インダストリーファンデーション
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2012-09-27
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2032-09-27
Also published as: EP2778179A2; WO2013048144A2; EP2778179A4; WO2013048144A3; KR101458059B1; JP2014528994A; US20140242870A1; KR20130033996A

Description

カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を含むキトサンおよび／またはキチン複合体、前記複合体を含む有機補強素材組成物、前記有機補強素材組成物で製造された製品、およびキトサンおよび／またはキチンに、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を添加する段階を含む、強度の増進したキトサンおよび／またはキチン複合体の製造方法に関するものである。

キチンおよびキトサンは、無味／無臭の天然高分子多糖体であって、キチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位体が無数に結合してなる多糖類高分子物質であり、キトサンは、キチンからアセチル基の脱離した単位体が無数に結合してなる多糖類高分子物質である。

キチンとキトサンは、天然成分であることから、生体に対する適合性に優れ、機能性食品として備えるべきすべての条件を完全に整えているだけでなく、人工皮膚、手術用縫合糸、人工透析膜、各種治療補助用品などの医薬分野、繊維、化粧品、生活用品、廃水処理、写真用フィルム、染料、製紙、生分解性プラスチックなどの工業分野、土壌改良剤、肥料、無公害農薬、飼料などの農業分野、放射能汚染除去、液晶、イオン交換膜などの多様な分野で利用価値の大きい多機能物質として評価される。

しかし、従来使用されているキチン／キトサンは湿った条件および水中でその強度が急激に減少するため、血液やリンパ液が流れる生体内のような湿った条件で、例えば、人工腱または人工靭帯などへの応用および商品化に困難があった。このような現象が現れる理由として最近発表された文献によれば、水分がキチンおよびキトサンに可塑剤（ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒ）の役割を果たすことにより、強度およびガラス転移温度を低下させることが報告されている［ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ８３（２０１１）９４７］。したがって、このような問題を解決し、キチンおよびキトサンの多機能の利用価値を維持しながら湿った条件で強度が増進し、人工腱、人工靭帯などのように湿った条件で作用する生体材料用オリジナル素材を実現するための技術の開発が要求される。

本発明者らは、キトサンおよび／またはキチンに、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を添加すると、湿った条件または水中で強度の増進した人工腱、人工靭帯などの生体材料用素材（有機補強素材）を実現できることを確認して、本発明を完成した。
そこで、本発明の一例は、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を含むキトサンおよび／またはキチン複合体を提供する。

他の例は、前記複合体を含む有機補強素材組成物および前記複合体の有機補強素材組成物製造のための用途を提供する。
さらに他の例は、前記有機補強素材組成物で製造された製品を提供する。
さらに他の例は、キトサンおよび／またはキチンに、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を添加する段階を含む、強度の増進したキトサンおよび／またはキチン複合体の製造方法を提供する。

上記のように、本発明は、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を含むキトサンおよび／またはキチン複合体、前記複合体を含む有機補強素材組成物、前記有機補強素材組成物で製造された製品、およびキトサンおよび／またはキチンに、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を添加する段階を含む、強度の増進したキトサンおよび／またはキチン複合体の製造方法を提供する。前記カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を含むキトサンおよび／またはキチン複合体は、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を含まない場合と比較して、水分による強度低下の問題が顕著に改善され、湿った条件でも高い強度を維持することができるという利点を有する。

特に、人工腱（ｔｅｎｄｏｎ）および人工靭帯（ｌｉｇａｍｅｎｔ）用素材としてキチンおよび／またはキトサン複合体が提供されるとよい。人工腱および人工靭帯は、腱と靭帯が破壊された時、これら組織の代わりに骨格と筋肉を連結する役割を果たせるように高い強度を有し、新たな組織が生じてそれ以上必要としない時には、生体に吸収可能となるように生体適合性が高いものが良い。
キチンおよびキトサンは、豊富で環境に優しい資源であって、生分解性、抗ウイルス性、傷治癒能など、多様な長所を有していて、人工腱および人工靭帯のような生体材料として適した素材である。しかし、人工腱および人工靭帯の応用が血液やリンパ液が流れる体内の湿った条件で行われるが、従来使用されているキチンおよびキトサンは、湿った条件および水中でその強度が急激に減少し、人工腱や人工靭帯のように湿った条件で強度が維持されなければならない生体材料としての商用化に困難があった。

先に説明したように、本発明者らの予備試験結果によれば、キチンおよびキトサンは、水と接触したり湿った条件でその強度（ｍｏｄｕｌｕｓ）が顕著に減少する問題を有することが明らかになった。キチン／キトサンの強度（ｍｏｄｕｌｕｓ）を、完全に乾燥した試料と０．１５ＭＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）水溶液で１日間浸水後試料を比較した時、キチンおよびキトサンフィルムの水和された試料のヤング率（Ｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓ）は、完全に乾燥した試料の引張強度の１０％と大きく減少することが明らかになった。これに関連し、水分がキチンおよびキトサンに可塑剤（ｐｌａｓｔｉｃｉｚｅｒ）の役割を果たすことにより、強度およびガラス転移温度を低下させることが報告されている［ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ８３（２０１１）］。

一方、メラニン色素は、ドーパ（ＤＯＰＡ）などのカテコール（Ｃａｔｅｃｈｏｌ）複合体が相互間の架橋（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）反応をしながら生じるとされている。ドーパの架橋密度が増加し、疎水性基のメラニンが増加しながら脱水化反応が進行する。これは、材料の物性を強化させると考えられている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．Ｏ．ｅｔａｌ，Ｎａｔｕｒｅ２５１，５０７（１９７４））。
そこで、本発明者らは、キトサンおよび／またはキチンに、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を添加すると、強度の増進した材料を実現できることを確認して、本発明を完成した。

まず、本発明は、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコール（例えば、３−メチルカテコール）からなる群より選択された１種以上の化合物とを含み、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物との間の共有または非共有結合により架橋されたキトサン、キチン、またはこれらの混合物の複合体を提供する。前記複合体は、キトサン、キチン、またはこれらの混合物のみが存在する場合より、水分に膨潤した状態で引張強度（ｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓ）などの機械的物性が顕著に増進することを特徴とする。このような機械的物性の増進により、濡れた環境（湿った条件下）で強い機械的性質と低い水吸湿性が要求される人工靭帯、人工腱、またはその他の用途に有利に適用可能である。

このような強度増進効果は、キトサン、キチン、またはこれらの混合物に、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物を添加することによって達成され、強度増進効果の程度は、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物の添加量に依存的に増加する。したがって、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物の添加量の範囲は特別な制限はないが、キトサン、キチン、またはこれらの混合物の本来の生体有用性を維持しながら所望の強度増進効果を得るために、キトサン、キチン、またはこれらの混合物の重量を基準（１００重量％）として、０．１〜３０重量％、または１〜３０重量％、または４〜３０重量％、または１５〜３０重量％程度とするのが良い。

本発明におけるキトサンまたはキチンの分子量は特別な制限はないが、５〜５００ｋＤａの範囲であるとよい。本発明の複合体には、キトサンとキチンがそれぞれ単独で含まれていてもよく、これらが混合された混合物形態で含まれていてもよい。
前記複合体は、完全に蒸留水に３時間浸漬させて湿潤膨潤した状態でも優れた物性を維持する（表２および表３参照）。
前記複合体は、キトサンおよび／またはキチンのほか、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコール（例えば、３−メチルカテコール）からなる群より選択された１種以上を追加的に含むことにより、これらカテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の酸化による架橋反応および脱水反応によって水分による機械的物性の低下を防止し、優れた物性を維持することができる。

また、前記複合体は、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の酸化によって疎水性のメラニンの生成が増加し、比較的多量のメラニンを含み、このようなメラニンは脱水化反応を進行させて、材料の物性の強化に役立つ。前記複合体内のメラニン含有量は、過酸化水素分解法（Ｍｏｓｅｓ，ＤａｎｄＪ．ＨＷａｉｔｅ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，Ｖｏｌ．２８１，Ｉｓｓｕｅ４６，３４８２６−３４８３２）によって測定されるものであって、約５０重量％以上、例えば、約５０重量％〜約９９重量％、または約７０重量％〜約９９重量％、具体的には約７５重量％〜約９８重量％、より具体的には８０重量％〜約９８重量％程度であるとよいが、これに制限されるわけではない。

このような内容は、後述する実施例で裏付けられる引張強度改善および吸湿性減少の結果から確認することができる。前記吸湿性は、通常の方法で測定可能であり、例えば、ＥＷＣ（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ）法により試験を行うことができる。試料を０．１５ＭＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）水溶液に１日間浸漬した後、吸湿性の試験を行い、０．０００１を最小単位とする精密秤で重量変化を測定した。ＥＷＣは次の式で計算することができる。１００Ｘ（Ｗ_ｔ−Ｗ_０）／Ｗ_ｔ（Ｗ_０：乾燥した試料の重量、Ｗ_ｔ：それ以上試料が水分を吸収しない時の重量）。

このように、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の酸化が複合体の物性の維持および強化に役立つので、前記複合体が酸化剤の役割を果たす化合物、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍｐｅｒｉｏｄａｔｅ）、過酸化水素、ヨウ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｉｏｄａｔｅ）、および／または水酸化ナトリウムを追加的に含有する場合、湿潤膨潤状態でも引張強度などの物性が顕著に増進することが明らかになった（表３参照）。したがって、本発明の複合体は、過ヨウ素酸ナトリウム、過酸化水素、ヨウ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｉｏｄａｔｅ）、および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）からなる群より選択された１種以上を追加的に含有するものであるとよい。前記追加的に含有される過ヨウ素酸ナトリウム、過酸化水素、および水酸化ナトリウムからなる群より選択された１種以上の量は、前記カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上を基準として、５〜１５重量％、具体的には８〜１２重量％であるとよい。

また、キトサンまたはキチン複合体は、熱処理（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）することにより、湿潤状態の強度をより増進させることができる（表３参照）。前記熱処理は、８０〜１２０℃、具体的には、９０〜１１０℃の真空下、６〜１２時間処理するものであるとよい。
キトサンまたはキチン複合体の場合、前記複合体は、相対湿度約４０〜５０％でのｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓが約５００Ｍｐａ以上、例えば、５００〜１００００Ｍｐａ、または５００〜５０００Ｍｐａ程度であり、相対湿度約９０〜１００％でのｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓが約１８０Ｍｐａ以上、具体的には約２８０Ｍｐａ以上、より具体的には３００Ｍｐａ以上、例えば、３００〜５０００Ｍｐａ、または３００〜３０００Ｍｐａ程度であるとよい。したがって、前記複合体は、体内の湿った条件で良い強度を要求する人工腱および人工靭帯などの生体材料用素材として応用可能である。

本発明にかかる複合体は、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上がキトサンまたはキチンのアミングループに共有結合されていたり（特に、過ヨウ素酸ナトリウムまたは過酸化水素を使用する場合）、非共有結合（例えば、ｃａｔｉｏｎ−π結合）して架橋されている構造であるとよい（図７参照）。図７は、過ヨウ素酸ナトリウム（ｏｘｉｄａｎｔと記載される）の添加時、キトサンのアミン基とドーパミンまたはカテコールとの間で起こり得る反応を模式的に示すものである。図４における１番から３番の反応は、過ヨウ素酸ナトリウムを入れた時加速化される反応であり、４番の反応は、温度を上げて、真空下で水が抜けながら起こり得る反応を示す（ＩＮＴＥＧＲ．ＣＯＭＰ．ＢＩＯＬ．，４２：１１７２−１１８０（２００２）ＡｄｈｅｓｉｏｎａｌａＭｏｕｌｅ１，Ｊ．Ｈ．Ｗａｉｔｅ）。

本発明の他の例は、前記物理的強度などの物性が増進した複合体を含む有機補強素材組成物を提供する。より具体的には、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコール（例えば、３−メチルカテコール）からなる群より選択された１種以上の化合物とを含み、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物との間の共有または非共有結合により架橋されたキトサン、キチン、またはこれらの混合物の複合体を含む有機補強素材組成物が提供される。さらに他の例において、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコール（例えば、３−メチルカテコール）からなる群より選択された１種以上の化合物とを含み、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物との間の共有または非共有結合により架橋されたキトサン、キチン、またはこれらの混合物の複合体の有機補強素材組成物製造のための用途が提供される。前記複合体に関する詳細な説明は先に説明した通りである。前記有機補強素材組成物は、フィルム、長繊維（ｆｉｌａｍｅｎｔ）、不織布などの形態であるとよいが、これらに制限されず、強度を必要とするすべての素材組成物であってもよい。

さらに他の例は、前記キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコール（例えば、３−メチルカテコール）からなる群より選択された１種以上の化合物とを含み、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物との間の共有または非共有結合により架橋されたキトサン、キチン、またはこれらの混合物の複合体を含む有機補強素材組成物で製造された製品を提供する。前記製品は、生体に適用される生体材料を含み、強度を要求するすべての補強材製品であるとよい。

さらに他の例は、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコール（例えば、３−メチルカテコール）からなる群より選択された１種以上の化合物とを含み、キトサン、キチン、またはこれらの混合物と、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の化合物との間の共有または非共有結合により架橋されたキトサン、キチン、またはこれらの混合物の複合体の補強材製品製造のための用途を提供する。

前記補強材製品は、例えば、人工靭帯、人工腱、人工歯科用材料（例えば、人工シャーピー繊維（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌＳｈａｒｐｅｙ’ｓｆｉｂｅｒ）、人工歯槽骨（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｐｅｒｉｏｄｅｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔ）など）、人工皮膚、手術用縫合糸、人工透析膜、各種治療補助用品、衣料用繊維、タイヤコード（ｔｉｒｅｃｏｒｄ、タイヤの耐久性と走行性、安定性を高めるために、ゴムの内部に入る繊維材質の補強材）などであるとよい。

さらに他の例は、キトサンおよび／またはキチンの強度を増進させるための方法、または強度の増進したキトサンおよび／またはキチンの製造方法が提供される。前記方法は、キトサン、キチン、またはこれらの混合物を、水、イオン性溶媒またはこれらの混合物に溶解する段階１）と、前記得られた溶液に、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上を添加する段階２）とを含むことができる。

前記イオン性溶媒は、キトサンおよび／またはキチンを溶解し得るすべてのイオン性液体（ｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ）を意味するもので、例えば、酢酸または酢酸水溶液、ＤＭＡｃ（ｄｉｍｅｔｙｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）／ＬｉＣｌ（ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）にＬｉＣｌを溶かした溶液、キトサンまたはキチンを質量比率で５〜１０％まで溶かすことができる）、エチルメチルイミダゾリウムアセテートなどであるとよく、具体的には０．１〜５Ｍの酢酸水溶液であるとよい。

前記カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上の添加量は、キトサン、キチン、またはこれらの混合物の重量を基準として、０．１〜３０重量％、または１〜３０重量％、または４〜３０重量％、または１５〜３０重量％程度であるとよい。

また、前記方法は、過ヨウ素酸ナトリウム、過酸化水素、ヨウ素酸ナトリウム、および水酸化ナトリウムからなる群より選択された１種以上を、例えば、前記カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上を基準として、５〜１５重量％、好ましくは８〜１２重量％の量で添加する段階２−１）を追加的に含むことができる。前記段階２−１）は、段階２）の前、後、または同時に実施可能である。

さらに、前記段階２）または２−１）の後に、熱処理段階（段階３）が追加的に含まれるとよい。例えば、前記熱処理段階３）は、前記段階２）または２−１）で得られた混合物（キトサンおよび／またはキチンと、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上との混合物；またはキトサンおよび／またはキチンと、カテコール、ドーパミン、ＤＯＰＡ、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上と、過ヨウ素酸ナトリウム、過酸化水素、および水酸化ナトリウムからなる群より選択された１種以上との混合物）を、８０〜１２０℃、好ましくは９０〜１１０℃の真空下、６〜１２時間処理して行われるとよい。このような熱処理段階を経ることにより、最終生産物の強度をより増進させることができる。

本発明で提供されるキトサン、キチン、またはこれらの混合物に、カテコール、ドーパミン、またはこれらの混合物が添加された複合体は、浸水後向上した強度を維持するため、人工腱、人工靭帯、人工歯科材料などの多様な生体材料として使用可能であり、用途をこれに制限せず、必要とする各種材料として有用に使用可能である。

引張強度の測定時に初期に得られるグラフと引張強度を計算する方法を示したものである。相対湿度９０〜１００％でのＣ１５ｖｓＣ１５＿ＳＰ＿ａｎｎｅａｌｉｎｇ７０％の引張強度テスト時に得られるグラフを示すものである。相対湿度９０〜１００％でのＤ１５ｖｓＤ１５＿ＳＰ＿ａｎｎｅａｌｉｎｇ７０％の引張強度テスト時に得られるグラフを示すものである。乾燥状態でのキトサンおよびＤＯＰＡが架橋結合されたキトサン複合体の引張強度を示すグラフである。乾燥状態でのキトサンおよびＤＯＰＡが架橋結合されたキトサン複合体の引張強度を示すグラフである。乾燥状態でのキトサンおよびＤＯＰＡが架橋結合されたキトサン複合体の引張強度を示すグラフである。乾燥状態でのキトサンおよびＤＯＰＡが架橋結合されたキトサン複合体のｓｔｉｆｆｎｅｓｓを示すグラフである。乾燥状態でのキトサンおよびＤＯＰＡが架橋結合されたキトサン複合体のｔｏｕｇｈｎｅｓｓを示すグラフである。湿潤膨潤した状態でのＤＯＰＡおよび酸化剤の含有量に応じた引張強度、ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ、およびｔｏｕｇｈｎｅｓｓを示すグラフである。ＤＯＰＡ含有量に応じたキトサン複合体のＥＷＣ（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ）を示すグラフである。キチンまたはキトサンとドーパミンまたはカテコールとの間の共有結合（過ヨウ素酸ナトリウムの添加や熱処理）を模式的に示すものである。キトサンとキトサン複合体の水接触角（Ｓｔａｔｉｃｗａｔｅｒｃｏｎｔａｃｔａｎｇｌｅ）を比較して示すものである。ＤＯＰＡ架橋結合されたキトサンの吸湿性の減少によって機械的物性が増進することを示すグラフである。純粋なキチンとドーパミンを含むキチン複合体の水接触角（上）とＥＷＣ（下）を示す。純粋キチンフィルムとキチン複合体フィルムの電子顕微鏡構造を示すＳＥＭイメージである。ドーパミンを１０重量％の量で含むキチン複合体の結晶構造を示すグラフで、黒色（グラフ中の一番下）はｎａｔｉｖｅキチン、赤色（グラフ中の中間）はキチンフィルム、青色（グラフ中の一番上）はドーパミンを含むキチン複合体フィルムを示す。完成したキチン繊維の骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−ｅ１）に対する細胞毒性を比較するグラフである。キトサンおよびキトサン複合体のＴＧＡ（ｔｈｅｒｍａｌｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓ）テスト結果を示すグラフである。実施例７によるキチン複合体またはキトサン複合体における、過酸化水素法で分解されたセピアメラニン溶液の３００ｎｍから７００ｎｍの間の紫外線−赤外線グラフを示す。図１５のセピアメラニン溶液の吸光係数から得られたメラニン標準化曲線である。

以下、実施例、比較例および実験例を挙げて本発明の構成および効果をより具体的に説明する。しかし、下記の実施例、比較例および実験例は、本発明に対する理解のために例示の目的で提供されたに過ぎず、本発明の範疇および範囲がそれによって制限されるわけではない。

＜実施例１：カテコールまたはドーパミンが含まれているキトサン複合体の製造＞
０．３２５Ｍの酢酸水溶液を製造した後、キトサン（Ｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ、ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｈｉｔｏｓａｎ４１９４１９−（Ｃｏａｒｓｅｇｒｏｕｎｄｆｌａｋｅｓａｎｄｐｏｗｄｅｒ）８００−２０００ｃＰ、１ｗｔ％ｉｎ１％（ｗ／ｖ）ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（ｌｉｔ．）、ＤＤＡ：８０％以上）２０ｇを前記酢酸水溶液９８０ｇに溶かし、２４時間、４０℃、超音波下で溶かして、キトサン／酢酸水溶液を製造した。前記得られたキトサン／酢酸水溶液３０ｍｌに、カテコール（９９％（ｗ／ｗ）、ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）とドーパミン（９９％（ｗ／ｗ）ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）をそれぞれ次の表１のような混合比条件を満足させるように添加して溶解した。

試料Ｃ１５およびＤ１５に、ここに含まれているカテコールまたはドーパミンの１０％重量％に相当する過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍｐｅｒｉｏｄａｔｅ）を添加し、得られた混合物をそれぞれＣ１５ＳＰおよびＤ１５ＳＰと称した。
底全体がテフロン（登録商標）テープでコーティングされたペトリ皿に、前記用意された試料をそれぞれ３０ｍｌずつ（各試料ごとに別のペトリ皿を使用）を入れた。前記用意されたそれぞれのペトリ皿を、４０℃の対流式オーブン（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎｏｖｅｎ）で２日間乾燥させ、約０．１ｍｍのｆｒｅｅｓｔａｎｄｉｎｇフィルムを製作した。残っている酢酸と水を完全に除去するために、前記得られたフィルムを５０℃の真空オーブンに一晩置いた。

＜実施例２：キチンおよびキチン複合体の製造＞
キチン（ｃｈｉｔｉｎｆｒｏｍｓｈｒｉｍｐ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、イオン性液体（１−Ｅｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍａｃｅｔａｔｅ）に１０重量％となるように溶解して、キチン溶液を製造した。前記製造されたキチン溶液に、ドーパミン（９９ｗｔ％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を０重量％、５重量％、または１０重量％の量で添加した。溶質を完全に溶かすために、前記キチン溶液またはキチン／ドーパミン溶液を１００℃で６時間溶かした。完全に溶解した２種類の溶液を枠上に注いで、１５０℃で２時間処理し、ドーパミンの熱による酸化および架橋反応が起こるようにした。その後、前記２つの溶液を常温に一晩置き、温度を下げた。前記２つの溶液は常温でゲル化された。完成した２つのゲルを１００％（ｗ／ｖ）エタノール溶液に１時間程度浸漬し、蒸留水に入れて、拡散によってイオン性液体を除去した。水に膨潤したゲルを、幅１ｃｍ、長さ３ｃｍとなるように長方形状に切断した後、乾燥させた。

＜実施例３：キトサンとキトサン複合体の引張強度テスト＞
前記実施例１で製造された８種類（Ｎｅａｔ、Ｃ０１、Ｃ０４、Ｃ０７、Ｃ１５、Ｄ１５、Ｃ１５ＳＰ、Ｄ１５ＳＰ）のフィルムを、１ｃｍＸ３ｃｍの長方形状に切断し、厚さはｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒを用いて０．００１ｍｍの桁まで測定した。引張強度テスト装置（Ｉｎｓｔｒｏｎ３３４０モデル）を用いて、ｙｏｕｎｇ’ｓｃｏｎｓｔａｎｔｅｘｔｅｎｓｉｏｎｒａｔｅモードで変形速度を０．５ｍｍ／ｍｉｎとし、試験片クランプとクランプとの間の距離を１ｃｍとした。各試料の引張強度は、相対湿度が約５０％の場合と、試料を約０．１５ＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）に１日浸漬させて完全に試料が濡れた場合の２つの環境でそれぞれ測定した。

試料のうち、Ｃ１５ＳＰおよびＤ１５ＳＰを１００℃の真空オーブンで一晩（約１２時間）置いて、Ｃ１５ＳＰ＿ａｎｎｅａｌｉｎｇおよびＤ１５ＳＰ＿ａｎｎｅａｌｉｎｇ試料を製作した。前記引張強度テスト装置を用いて、前記試料の相対湿度が約５０％の場合と、試料を約０．１５ＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）に１日浸漬させて完全に試料が濡れた場合の２つの環境での引張強度を測定し、その結果を図２〜図３に示した。図２および図３において、黒色は共通に純粋キトサンフィルムの物性を示したものであり、図２の赤色はカテコール含有キトサン複合体を、図３の青色はドーパミン含有キトサン複合体を示したものである。また、このグラフから、平均ｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓ、ｙｉｅｌｄｓｔｒｅｓｓ、ｙｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｓｔｒｅｓｓａｔｂｒｅａｋ（Ｂｒｅａｋｉｎｇｓｔｒｅｓｓ）、およびｓｔｒａｉｎａｔｂｒｅａｋ（Ｂｒｅａｋｉｎｇｓｔｒａｉｎ）値を求めた。より具体的には、ｓｔｒｅｓｓはＦ（ｆｏｒｃｅ）／Ａ（ａｒｅａ、面積）で、引っ張る力を断面積で割った値であり、単位はＮ／ｍである。また、ｓｔｒａｉｎは伸びた比率を意味し、変化した長さ／最初の長さを意味する。このように、最初の長さおよび面積を前記引張強度テスト装置に代入して作動させると、前記値が得られる。まず、Ｘ軸はｓｔｒａｉｎ、Ｙ軸はｓｔｒｅｓｓのグラフが得られるが（図１参照）、ここで、変曲点が起こる前の初期傾きをｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓといい、変曲点が起こる点をｙｉｅｌｄｐｏｉｎｔといい、この時のｓｔｒａｉｎをｙｉｅｌｄｓｔｒａｉｎ、この時のストレスをｙｉｅｌｄｓｔｒｅｓｓという。最終的に破壊される地点をｂｒｅａｋｉｎｇｐｏｉｎｔといい、この時のｓｔｒａｉｎをＢｒｅａｋｉｎｇｓｔｒａｉｎ、この時のストレスをＢｒｅａｋｉｎｇｓｔｒｅｓｓという。破壊されるまでの傾きを引張強度というが、初期ｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓと概して比例し、本明細書では、ｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓが引張強度を代替する意味としても使用される。
前記のように得られた結果を、次の表２および表３に示した。

前記表２から分かるように、相対湿度５０％程度において、カテコールを含むキトサン複合体では、カテコールの濃度に比例して、ｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓ（ｉｎｉｔｉａｌｍｏｄｕｌｕｓ）が８００Ｍｐａまで増加した。ドーパミンを含むキトサン複合体の試料Ｄ１５も、７２０Ｍｐａのｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓ値を示した。このようなカテコールまたはドーパミンを含むキトサン複合体試料のｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓ数値は、キトサンのみを含む試料ｎｅａｔｃｈｉｔｏｓａｎのｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓ（３２０Ｍｐａ）より顕著に高い数値である。

また、カテコールを含むキトサン複合体のｂｒｅａｋｉｎｇｓｔｒａｉｎとｓｔｒｅｓｓも、キトサンのみを含む試料ｎｅａｔｃｈｉｔｏｓａｎより高い数値を示し、カテコールの濃度に比例して大きく増加し、ドーパミンを含むキトサン複合体の試料Ｄ１５も、試料ｎｅａｔｃｈｉｔｏｓａｎに比べてｂｒｅａｋｉｎｇｓｔｒａｉｎとｓｔｒｅｓｓが増加した。これは、カテコールとドーパミンのドーパ（ｄｏｐａ）グループが一部架橋反応をして、キトサン分子鎖の動きを抑制したことに起因すると見られる。

表３から分かるように、試料を約０．１５ＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）に１日浸漬させて完全に濡れた試料ｎｅａｔｃｈｉｔｏｓａｎ、Ｃ０４、Ｃ０７、Ｃ１５、およびＤ１５のｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓ値が、相対湿度５０％の場合（表２）に比べて約５０％以上大きく減少することが明らかになった。これは、空気中の水分子が可塑剤の役割を果たし、材料を柔軟にしたためである。また、試料Ｃ１５ＳＰとＤ１５ＳＰがｓｏｄｉｕｍｐｅｒｉｏｄａｔｅの添加前になかった濃褐色に変化した理由は、カテコールグループに存在する２つの水酸基がケトン基に酸化されたためである。

試料Ｃ１５ＳＰとＤ１５ＳＰが、Ｃ１５とＤ１５に比べて、相対湿度が約５０％の場合と、試料を約０．１５ＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）に１日浸漬させて完全に試料が濡れるようにした場合の条件下で、ｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓおよびｂｒｅａｋｉｎｇｓｔｒｅｓｓ値で差がない理由は、ｓｏｄｉｕｍｐｅｒｉｏｄａｔｅが酸化反応は促進させたものの、次の反応である架橋反応は大きく増加させることができなかったためである。

Ｃ１５ＳＰとＤ１５ＳＰを、真空下、１００℃で１２時間程度加熱したＣ１５ＳＰ＿ａｎｎｅａｌｉｎｇとＤ１５ＳＰ＿ａｎｎｅａｌｉｎｇは、ｎｅａｔｃｈｉｔｏｓａｎに比べて、相対湿度が約５０％の場合と、試料を約０．１５ＭのＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）に１日浸漬させて完全に試料が濡れるようにした場合で、ｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓがそれぞれ約２４倍、１５倍程度増加した。このような結果は、加熱反応が架橋反応を加速化させたことを裏付ける。

＜実施例４：キトサンおよびキトサン複合体の引張強度テスト＞
４．１．ドーパを含むキトサン複合体の製造
０．３２５Ｍの酢酸水溶液を製造した後、キトサン（Ｈｉｇｈｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ、ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｈｉｔｏｓａｎ４１９４１９−（Ｃｏａｒｓｅｇｒｏｕｎｄｆｌａｋｅｓａｎｄｐｏｗｄｅｒ）８００−２０００ｃＰ、１％ｉｎ１％ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（ｌｉｔ．）、ＤＤＡ：８０％以上）２０ｇを酢酸水溶液９８０ｇに溶かし、２４時間、４０℃、超音波下で溶かして、キトサン／酢酸水溶液を製造した。前記得られたキトサン／酢酸水溶液３０ｍｌに、ドーパ（ＤＯＰＡ、９９％（ｗ／ｗ）ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）０−２０ｗｔ％、およびｓｏｄｉｕｍｐｅｒｉｏｄａｔｅ０−３ｗｔ％を混合比条件（図４および５参照）を満足させるように添加して溶解した。溶解した溶液を、底全体がテフロンテープでコーティングされたペトリ皿に、前記用意された試料をそれぞれ３０ｍｌずつ（各試料ごとに別のペトリ皿を使用）を入れた。前記用意されたそれぞれのペトリ皿を、４０℃の対流式オーブン（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎｏｖｅｎ）で２日間乾燥させ、約０．１ｍｍのｆｒｅｅｓｔａｎｄｉｎｇフィルムを製作した。残っている酢酸と水を完全に除去するために、前記得られたフィルムを５０℃の真空オーブンに一晩置いた。

前記製作されたキトサンおよびキトサン複合体のフィルムを１ｃｍＸ３ｃｍの長方形状に切断し、厚さはｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒを用いて０．００１ｍｍの桁まで測定した。生産されたフィルムの電子顕微鏡構造は図１１に示した。
引張強度テスト装置（Ｉｎｓｔｒｏｎ３３４０モデル）を用いて、ｙｏｕｎｇ’ｓｃｏｎｓｔａｎｔｅｘｔｅｎｓｉｏｎｒａｔｅモードで変形速度を５ｍｍ／ｍｉｎとし、試験片クランプとクランプとの間の距離を１ｃｍとした。各乾燥状態で測定される試料は、真空オーブンで１２０℃で６時間保管して完全に乾燥させ、湿潤状態で測定される試料は、０．１５ＭＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）に１日浸漬させた後、直ちに取り出して引張強度を測定した。

図４Ａ〜図４Ｅは乾燥状態（水分含有量約１％以下）、図５は０．１５ＭＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）中で膨潤した状態のキトサンおよびキトサン複合体の引張強度の結果である。試料のＹｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓは、実施例３に記載された方法で計算した。
図４Ａは、酸化剤（過ヨウ素酸ナトリウム；以下、同様）を含まない場合の、ＤＯＰＡ含有量に応じた引張強度、図４Ｂは、１重量％の酸化剤を含む場合の、ＤＯＰＡ含有量に応じた引張強度、図４Ｃは、５重量％のＤＯＰＡを含む場合の、酸化剤含有量に応じた引張強度を示し、図４Ｄは、ＤＯＰＡおよび酸化剤の含有量に応じたｓｔｉｆｆｎｅｓｓ、図４Ｅは、ＤＯＰＡおよび酸化剤の含有量に応じたｔｏｕｇｈｎｅｓｓを示す（各数値とエラーバーはそれぞれ５回の平均値および標準偏差を示す）。図４Ａ〜図４Ｅに示されるように、乾燥した状態でのＹｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓは、純粋キトサンの場合に約０．５ＧＰａ程度であり、添加するドーパの量に比例して増加し、最大４倍（約２ＧＰａ）まで増加した。

図５のＡ、Ｂ、およびＣは、湿潤膨潤した状態でのＤＯＰＡおよび酸化剤の含有量に応じた引張強度、ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ、およびｔｏｕｇｈｎｅｓｓをそれぞれ示す（各数値とエラーバーはそれぞれ５回の平均値および標準偏差を示す）。図５のＡに示されるように、湿潤膨潤した状態でのＹｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓは、純粋キトサンの場合に０．０５ＧＰａであり、添加するドーパミンの量に比例して増加し、最大７．１倍（０．３５ＧＰａ）まで増加した。ヒトの腱および靭帯のＹｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓは、それぞれ０．５ＧＰａと０．２ＧＰａであることを考える時、製造されたキトサン複合体は、人工腱および人工靭帯用素材として使用可能であることを確認することができる。

＜実施例５：キチンとキチン複合体の引張強度テスト＞
前記実施例２で製造された３種類（ドーパミン含有量：０重量％、５重量％、１０重量％）のキチンとキチン複合体のフィルムを１ｃｍＸ３ｃｍの長方形状に切断し、厚さはｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒを用いて０．００１ｍｍの桁まで測定した。引張強度テスト装置（Ｉｎｓｔｒｏｎ３３４０モデル）を用いて、ｙｏｕｎｇ’ｓｃｏｎｓｔａｎｔｅｘｔｅｎｓｉｏｎｒａｔｅモードで変形速度を５ｍｍ／ｍｉｎとし、試験片クランプとクランプとの間の距離を１ｃｍとして測定した。
乾燥状態の試料は、前記得られたそれぞれの試料を、真空オーブンで１２０℃で６時間保管して完全に乾燥させて用意し、湿潤状態の試料は、蒸留水で３時間程度浸漬して用意し、これを直ちに取り出して引張強度を測定した。

図９は、乾燥状態（上）と、０．１５ＭＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）中で膨潤した状態（下）のキチンおよびキチン複合体の引張強度の結果である。試料のＹｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓは、実施例３に記載された方法で計算した。乾燥した純粋キチンのＹｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓは約１．５ＧＰａ程度であり、キチン複合体の場合には、添加されたドーパミンの量に比例して増加し、最大２．１倍まで増加した。湿潤膨潤した状態において、純粋キチンのＹｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓは０．２１ＧＰａであり、キチン複合体の場合には、添加されたドーパミン量に比例して増加し、最大２．２倍まで増加した。ヒトの腱および靭帯のＹｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓはそれぞれ０．５ＧＰａと０．２ＧＰａであることを考える時、キチン複合体が人工腱および人工靭帯用素材として使用可能であることを確認することができる。

＜実施例６：キチン／キトサンとキチン／キトサン複合体の吸湿率および接触角テスト＞
前記実施例１、２、および４．１で作られたキチン／キトサンおよびキチン／キトサン複合体の吸湿率（ＥＷＣ、ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｗａｔｅｒｃｏｎｔｅｎｔ）を測定した。
試料の吸湿率は次のように測定された。完全に乾燥した前記３種類の試料の重量（Ｗ_０）を測った後、０．１５ＭＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）に３時間浸漬した後、取り出してその重量（Ｗ_ｔ）を測った。前記重量は、０．０００１を最小単位とする精密秤で測定した。吸湿率を１００Ｘ（Ｗ_ｔ−Ｗ_０）／Ｗ_ｔとして定義した。

前記得られた結果、純粋キトサンの約６６％であり、キチンの吸湿率は約６５％であった。キトサン複合体の場合、添加されたドーパの量に比例して約５５％まで減少した（図６参照）。これは、キトサン複合体のｗａｔｅｒ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅが顕著に改善されたことを示すもので、湿潤条件での疎水性メラニンの生成を意味するものである。また、キチン複合体の場合、添加されたドーパミンの量に比例して吸湿率が減少し、実験した領域で最大４３％に減少した（図１０の下を参照）。
このような吸湿率の減少は、先に説明したドーパ／ドーパミンの酸化による架橋反応と脱水化反応に起因するものである。

キチン／キトサンおよびキチン／キトサン誘導体フィルムの接触角実験を行った。最大限に平らにした試料フィルム上に、１０マイクロリットル未満の蒸留水滴を落とし、フィルムと水滴との間の角を測定することにより、試料の接触角を得た（Ｒｕｔｎａｋｏｒｎｐｉｔｕ，ｅｔａｌ．２００６．Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｐｏｌｙｍ．，６３（２）、２２９−２３７）。前記得られた結果を図８および図１０（上）に示した。図８に示されるように、純粋なキトサンの接触角は約６０度であり、ドーパが添加されるにつれ、約８０度まで増加した（ｕｎｏｘｉｄｉｚｅｄ：１０ｗｔ％ＤＯＰＡを含む；ｏｘｉｄｉｚｅｄ；１０ｗｔ％ＤＯＰＡ＋１ｗｔ％過ヨウ素酸ナトリウム）。図１０（上）に示されるように、純粋なキチンの接触角は約３５度であるのに対し、ドーパミンが添加されるにつれ、約５０度に増加した。このような結果は、ドーパおよびドーパミンの酸化反応で生じたメラニン層が素材の疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）を増加させたことを示す。

＜実施例７：キチン／キトサン複合体内に存在するメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）の定量試験＞
ＤＯＰＡを多様な含有量（１０ｗｔ％および２０ｗｔ％）で含むキトサン複合体（実施例４．１参照）とキチン複合体（実施例２参照）内に存在するメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）を定量化する実験を行った。
まず、メラニン以外のすべての物質を除去するために、前記４種類のＤＯＰＡ含有複合体（１０ｗｔ％ＤＯＰＡ含有キチン複合体、２０ｗｔ％ＤＯＰＡ含有キチン複合体、１０ｗｔ％ＤＯＰＡ含有キトサン複合体、および２０ｗｔ％ＤＯＰＡ含有キトサン複合体）を加水分解させた。７０ｍｇのＤＯＰＡ含有キチン／キトサン複合体を、３．６ｍｌの６Ｍ塩酸と０．１２ｍｌのフェノールと共にガラスアンプル（ａｍｐｏｕｌｅ）に入れて、真空状態で完全に封印（ｓｅａｌｉｎｇ）した。それぞれのサンプルが入っているアンプル瓶を、１１０℃で４８時間熱を加えた。以降、各サンプルをアンプルから取り出し、ｒｏｔａｒｙｅｖａｐｏｒａｔｏｒを用いて塩酸とフェノールを乾燥させ、サンプルをパウダー状態にした。このパウダーサンプルを蒸留水とエタノールで洗浄して親水性の加水分解産物を除去し、加水分解されたサンプルを用意した。

過酸化水素分解法（Ｍｏｓｅｓ，ＤａｎｄＪ．ＨＷａｉｔｅ，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，Ｖｏｌ．２８１，Ｉｓｓｕｅ４６，３４８２６−３４８３２）を利用したサンプルのメラニン濃度の定量化を行った。セピアメラニン（Ｓｅｐｉａｍｅｌａｎｉｎ）、前記用意された加水分解されたサンプル、および加水分解されていないサンプルを塩基性過酸化水素水溶液上で分解させた後、５６０ｎｍの吸光係数を観察した。セピアメラニンは、イカ墨にあるもので、メラニン純度が高く、標準物質として実験的に多様に使用される物質で、Ｓｉｇｍａ−ａｄｒｉｃｈから購入して使用した。

まず、過酸化水素法で分解された０、０．１、０．２、０．５、および１ｍｇｌ／ｍｌのセピアメラニンの吸光係数を得て、その結果を、最小二乗法により標準メラニン吸光係数グラフを描き、１ｍｇ／ｍｌのサンプル溶液の吸光係数を比較して、サンプル内の存在するメラニン濃度を計算した。サンプルとセピアメラニンは次のように過酸化水素分解させた。１体積倍の１０Ｎ水酸化ナトリウムと２体積倍の３０％（ｗ／ｖ）過酸化水素を、３７体積倍の水とサンプル（サンプルの濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるように）によく混合して、封印後、７０℃で１日程度保管した。前記水溶液を１４，０００ｒｐｍで遠心分離して、残っている固体状態の不純物を除去し、上澄液の吸光係数を測定した。セピアメラニンから得られた５６０ｎｍの吸光係数標準曲線は、Ｒ^２＝０．８７６７の最小二乗法係数を示し、加水分解されたサンプルと加水分解を行っていないサンプルの吸光係数をこの標準曲線に代入した。

前記得られた結果を図１５および図１６に示した。これらの結果から、加水分解が行われていない１０％および２０％ＤＯＰＡ含有キチン／キトサン複合体は、それぞれ８．６、１２．２ｗｔ％のメラニンを含んでおり、加水分解された１０％および２０％ＤＯＰＡ含有複合体は、それぞれ９４．６ｗｔ％、９５．２ｗｔ％のメラニンを含んでいることが確認された。言い換えれば、加水分解されていないサンプルで、それぞれＤＯＰＡの９０％および８４ｗｔ％が酸化反応途中にメラニン化されたことが分かる。塩酸加水分解法はキチンおよびキトサンを含む大部分のバイオ材料を溶解することができるが、メラニンは分解させることができないと知られている。その理由は、メラニン分子間の架橋反応と強いｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ結合がメラニンを安定化させるためであると知られている。このような理由から、加水分解されたサンプルで高いメラニン含有量を示すと見られる。

＜実施例８：キチンとキチン複合体の骨芽細胞実験＞
前記実施例２で作られたキチンとキチン複合体の細胞活性を次のように測定した。
具体的には、ネズミ骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１；Ｒｉｋｅｎｃｅｌｌｂａｎｋ）を、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）が含まれている動物細胞培養液（ａｌｐｈａ−ＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）を用いて、３７℃のインキュベータで培養した。前記細胞を、細胞培養皿から引き離して、１０％ＦＢＳが入っていない前記培養液に２ｘ１０^５個／ｍｌの濃度に希釈し、１２ウェルの細胞培養皿（Ｆａｌｃｏｎ、ＵＳＡ）にキチンとキチン複合体のフィルムを培養皿の形状および大きさに合わせて切断して入れた後、前記細胞をウェルあたり１ｘ１０^５個の量で入れて、１時間インキュベータで培養した。

前記培養後、生きている細胞を定量化するために、ＣＣＫ−８（ｃｅｌｌｃｏｕｎｔｉｎｇｋｉｔ−８；Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）分析を実施した。まず、前記培養後に付いていない細胞を除去するために、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）で洗浄した後、ＣＣＫ−８溶液５０μｌをウェルに注入した。生きている細胞は、ミトコンドリアで２−（２−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−３−（４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（２，４−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＷＳＴ−８）を水に溶けるホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に還元させたため、ＣＣＫ−８試薬を入れて３時間追加培養した後、分光器（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）により４５０ｎｍでの吸光度を測定し、培地中に溶けているホルマザンを測定した。

また、これを継続して培養するためにＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳが含まれている前記培養液１ｍｌを入れて、３７℃のインキュベータで培養した。前記細胞の成長は、接着時と同様の方法を用いて測定した。

前記得られた相対的な生存細胞数を図１３に示した。ＣＣＫ培地の４５０ｎｍにおいて、相対的吸光係数は、特定表面上の相対的な生存細胞数を意味する。図１３のように、純粋キチンフィルム、キチン複合体フィルム、および空のウェル表面上で３日間培養しながら、培養時間に応じた相対的な吸光係数を比較した。純粋キチンフィルム、キチン複合体フィルム、および空のウェルにおいて、ＣＣＫ培地の吸光係数は、初日にそれぞれ約２．３、２．２、および約２．１で誤差範囲内に似た値を示し、最後の３日目には約５．０、５．１、および５．７を示した。キチン細胞は、空のウェルより生存細胞数が少なかったが、その差は約１０％程度と小さかった。また、キチンおよびキチン複合体上に存在する生存細胞数は、２％未満とその差が非常に小さかった。そのため、ドーパミンおよびカテコール化合物の添加は、細胞毒性を増加させない。

＜実施例９：キトサンとキトサン複合体のＴＧＡ（ｔｈｅｒｍａｌｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓ）＞
実施例１で用意された試料ｎｅａｔｃｈｉｔｏｓａｎ、Ｃ１５ＳＰ、およびＤ１５ＳＰをそれぞれ約５ｍｇ程度取って、ＴＧＡテストを行った。ＴＧＡテストは、ＴＧＡ（Ｑ６００、ＴＡｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、窒素雰囲気で１０℃／ｍｉｎの速度で昇温させながらテストを行った（Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，２１，６０４０−６０４５；Ｆａｃｉｌｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｏｒｇａｎｏ−ｓｏｌｕｂｌｅｓｕｒｆａｃｅ−ｇｒａｆｔｅｄａｌｌｓｉｎｇｌｅ−ｌａｙｅｒｇｒａｐｈｅｎｅｏｘｉｄｅａｓｈｏｌｅ−ｉｎｊｅｃｔｉｎｇｂｕｆｆｅｒｍａｔｅｒｉａｌｉｎｏｒｇａｎｉｃｌｉｇｈｔ−ｅｍｉｔｔｉｎｇｄｉｏｄｅｓ参照）。前記得られた結果を図１４に示した。

図１４において、Ｘ軸は温度、Ｙ軸は最初に入れた試料に対する重量比率を示す。最初に５ｍｇを入れて稼動させた場合、当該温度で０．５ｍｇが分解されてなくなったとすれば、９０％を意味する。図１４のＴＧＡテストの結果得られたデータにおいて、３種類の試料すべてのグラフが、２００℃未満で７パーセント程度ｗｅｉｇｈｔｌｏｓｓが発生したことが明らかになったが、これは、文献によれば、キトサンが吸収していた水が蒸発したためであると判断される。５ｗｔ％のｌｏｓｓ温度で試料Ｃ１５ＳＰとＤ１５ＳＰの温度がそれぞれ約２７、１３度程度高い２つの複合体が、純粋キトサンに比べて含水量が少ないことを意味する。３５０℃以上で２つの複合体の残っている相対質量が純粋キトサンに比べて約７％程度高いことは、複合体内に架橋構造が存在することを意味する。特異に２００℃から３２０℃の間で２つの複合体の残っている相対質量が純粋キトサンに比べて少ない理由は、架橋反応が促進されて生じる脱水反応のためと考えられる。

＜実施例１０：キチンおよびキチン複合体の結晶構造＞
キチンおよびキチン複合体の結晶構造を観察するために、Ｘ線大角散乱（ｗｉｄｅ−ａｎｇｌｅＸ−ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ、ＷＡＸＤ）試験を行った。試験は、Ｘ線散乱器（Ｘ−Ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ）の１つであるＤ／ＭＡＸ−２５００／ＰＣ（Ｒｉｇａｋｕ、Ｊａｐａｎ）を用いて行い、実験条件として、４０キロボルト（４０ｋＶ）１００ミリアンペアで（１００ｍＡ）ニッケル−銅誘導光（Ｎｉ−ｆｉｌｔｅｒｅｄＣｕＫα ｒａｄｉａｔｉｏｎ）を利用した。Ｘ線大角散乱データは、５°から４０°まで、１分あたり４°ずつ増加させながら測定した。前記結果を図１２に示した。図１２において、黒色はｎａｔｉｖｅキチン、赤色はキチンフィルム、青色はドーパミンを含むキチン複合体フィルムを示す。

Claims

キトサン、キチン、またはこれらの混合物を、水、イオン性溶媒またはこれらの混合物に溶解する段階（１）、
前記得られた溶液に、カテコール、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上のカテコール系化合物が、キトサン、キチン、またはこれらの混合物の重量を基準として、０．１〜３０重量％で添加する段階（２）と、
前記得られた混合物を、８０〜１２０℃の真空下、６〜１２時間処理する段階（３）を含み、
前記段階（２）の前、後、または同時に過ヨウ素酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍｐｅｒｉｏｄａｔｅ）、過酸化水素、ヨウ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｉｏｄａｔｅ）、および水酸化ナトリウムからなる群より選択された１種以上の酸化剤を前記カテコール系化合物を基準として、５〜１５重量％で添加する段階（２−１）を追加的に含み、
前記カテコール、およびメチルカテコールからなる群より選択された１種以上が、キトサン、キチン、またはこれらの混合物のアミングループに共有結合または非共有結合により架橋された構造を有し、
相対湿度４０〜５０％でのｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓが５００〜１００００Ｍｐａ以上、相対湿度９０〜１００％でのｙｏｕｎｇ’ｓｍｏｄｕｌｕｓが１８０〜５０００Ｍｐａである複合体を製造することを特徴とする、複合体の製造方法。
請求項１に記載の複合体を含むことを特徴とする、有機補強素材組成物の製造方法。
フィルム、フィラメントまたは不織布形態であることを特徴とする、請求項２に記載の有機補強素材組成物の製造方法。
請求項１に記載の複合体を含むことを特徴とする、有機補強素材組成物で製造された製品の製造方法。
前記製品は、人工靭帯、人工腱、人工歯科用材料、人工皮膚、手術用縫合糸、人工透析膜、人工治療補助用品、衣料用繊維、およびタイヤコードからなる群より選択された１種以上であることを特徴とする、請求項４に記載の製品の製造方法。