CN113384756B - 一种原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料及其制备方法 - Google Patents

一种原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料及其制备方法，可用于骨缺损修复领域。该原位负载聚多巴胺的多孔复合支架以壳聚糖和盐酸多巴胺相互融合构成支架主体多级分层结构，可溶性钙盐和可溶性磷酸盐作为纳米羟基磷灰石的前驱体，以原位再生思想和自组装原理为指导，使材料表面原位均匀负载聚多巴胺和纳米羟基磷灰石，实现了微纳孔径内壁聚多巴胺的涂覆。有机材料与无机纳米颗粒之间相互掺杂，有效仿生天然骨组织结构，支架材料界面结合性强，具有较快的矿化能力和良好的生物相容性，有望成为一种新型骨修复材料。

Description

一种原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料及其制备方法
技术领域
本发明属于复合材料领域，具体涉及一种原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料及其制备方法。
背景技术
骨缺损分为先天性骨缺损和后天性骨缺损，先天性骨缺损受到遗传的影响，而后天性骨缺损是指由于疾病、车祸等其他外部原因造成的骨质短缺的情况。对于后天性骨缺损的修复是临床治疗中面临的一个重大难题，先后出现了同种同体移植、同种异体移植、异种异体移植治疗手法，而这些方法由于受到供体来源有限、免疫排斥、伦理道德等问题，限制其进一步发展。骨组织工程的诞生使得骨缺损的修复不再受限于传统治疗手段，通过在缺损部位植入支架材料，进而诱导羟基磷灰石、胶原蛋白、成骨细胞等活性物质在缺损部位增殖，再生出新的骨组织，进而实现骨缺损的修复，所使用的原材料来源广泛，价格便宜。
自然骨是一种有机无机相互杂化的多级分层结构，而羟基磷灰石（Ca10(OH)2(PO4)6）是自然骨中主要的无机成分，具有优异的生物相容性和骨传导性，对自然骨亲和力强，被广泛研究应用。纳米羟基磷灰石在骨修复中的应用被证实具有良好的效果，然而由于其脆性较大，难以加工成型，限制了它的应用场景，为提高纳米羟基磷灰石的应用，将纳米羟基磷灰石与人工合成或天然高分子聚合物相复合制备支架材料。文献[Hu Y, Gu X Y,Yang Y, et al. Facile fabrication of poly(L-lactic acid)-graftedhydroxyapatite/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffolds by pickering highinternal phase emulsion templates [J]. Acs Applied Materials & Interfaces,2014, 6(19): 17166-17175.]以疏水改性的纳米羟基磷灰石（g-HAp）结合乳液模板和溶剂蒸发法制备了多孔载药支架材料，通过改变g-HAp纳米颗粒的浓度或乳液模板的内相体积分数，可以调整支架的形貌、孔结构和力学性能，以及调控抗炎药物布洛芬的释放速率，细胞培养结果显示，支架材料可促进骨髓间充质干细胞的粘附、扩散和增殖，显示了复合支架良好的生物相容性。文献[Zhao Y, Fan T T, Chen J D, et al. Magnetic bioinspiredmicro/nanostructured composite scaffold for bone regeneration [J]. Colloidsand Surfaces B, 2019, 174: 70-79.]通过原位再生技术成功将羟基磷灰石和四氧化三铁纳米粒子引入到壳聚糖支架，制备了一种磁性骨修复材料，实现了无机纳米粒子的均匀分布，有效改善了壳聚糖支架的力学性能和矿化能力，该支架具备良好的生物相容性和较好的促进骨组织再生的能力。
聚多巴胺（PDA）是一种海洋贻贝类生物分泌的一种蛋白，具有良好的生物相容性和诱导细胞黏附性能，从 2007 年PDA作为涂层材料问世至今，以PDA为基础的材料制备和应用得到迅猛发展。PDA的形成过程比较复杂，其反应机理目前仍然存在争议，有学者认为PDA是通过纯粹的化学聚合所形成，但也有学者认为PDA是通过很强的非共价键力（电荷转移、π-π堆积和氢键）结合到一起，其反应机理存在争议是因为PDA反应的复杂性和检测手段的局限性。其中文献[Hong S, Na Y S, Choi S, et al. Non-covalent self-assemblyand covalent polymerization co-contribute to polydopamine formation [J].Advanced Functional Materials, 2012, 22(22): 4711-4717.] 所提出的PDA是通过物理和化学共同作用基质更为全面，首先盐酸多巴胺（DA）氧化生成5，6-二羟基吲哚（DHI），然后两个DA分子与一个DHI分子形成物理自组装三聚体，其次，两个DHI分子通过化学键结合成二聚体，再和一个DA分子化学键结合形成化学三聚体，最后两个化学三聚体和一个物理三聚体共同自组装形成PDA。
由于聚多巴胺其独特的结构，几乎可以沉积在任何类型的材料表面，提高复合材料的生物相容性以及稳定性，并且聚多巴胺表面含有丰富的官能团，例如氨基和羟基等，为材料的进一步改性提供了可能。文献[Ryu J, Ku S H, Lee H, et al. Mussel-inspiredpolydopamine coating as a universal route to hydroxyapatite crystallization[J]. Advanced Functional Materials, 2010, 20(13): 2132-2139.]报道显示，聚多巴胺涂层可以增强材料的矿化作用，促使羟基磷灰石的生成，作者将金属材料（钛、金、不锈钢）；非金属材料（硅、有机玻璃、多孔纤维素、聚酯纤维等）表面包裹聚多巴胺后，浸泡模拟体液进行仿生矿化，与表面未使用聚多巴胺处理过的材料相比，材料表面有大量的羟基磷灰石形成，聚多巴胺的存在可以显著增强材料的矿化能力。PDA促进矿化的机理是其对钙离子又较强的作用力，能在材料表面富集钙离子，促使钙离子浓度达到过饱和状态，同时为羟基磷灰石提供形核位点，诱导羟基磷灰石在材料表面矿化。
骨修复支架材料为多孔结构，孔径分布在微米尺度，采用浸泡含有DA分子的Tris溶液对其表面涂覆PDA，即便采用抽真空的方法迫使反应溶液渗入孔隙内部来保证PDA的生成，由于微孔结构的限制，材料外表面的PDA沉积效果要好于内部孔隙，难以实现PDA在微孔内壁的均匀沉积。为了提高支架材料的矿化能力，克服传统方法在多孔材料表面沉积PDA的不均一、步骤繁琐等问题，本发明依据自组装原理和原位再生思想，结合冷冻干燥技术，对天然骨组织进行结构仿生，以壳聚糖作为支架的主体原料，在其表面包裹PDA，该材料生物相容性良好，具有良好的矿化能力，有望成为一种治疗骨缺损的新型骨修复材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料及其制备方法，其依据自组装原理和原位再生思想，结合冷冻干燥技术，对天然骨组织进行结构仿生。所得支架材料中原位再生的PDA分子与壳聚糖分子之间发生交联反应，提升支架的孔隙率、力学性能及亲水性，PDA在材料表面均匀分布，不仅可以有效调控磷酸钙转变为羟基磷灰石，而且还可以为后续羟基磷灰石的形成提供形核位点，加速矿化，其原料来源广泛，操作简便易行。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料，其利用天然高分子聚合物壳聚糖作为主体材料，盐酸多巴胺作为聚多巴胺生成的前驱体原料，将二者溶于含1 %（V/V）的乙酸水溶液混合均匀后，注模，经冷冻干燥和原位再生，一体化制备壳聚糖/聚多巴胺复合支架材料。
所述的原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料的制备方法具体包括以下步骤：
（1）称取1 g的壳聚糖溶于50 ml的乙酸溶液中，置于恒温水浴锅中搅拌使其溶解，配置2 %的壳聚糖溶液；
（2）称取一定量的盐酸多巴胺，加入步骤（1）所得的壳聚糖溶液，恒温水浴搅拌使其溶解，混合均匀；
（3）将浓度为2 mol/L可溶性钙盐溶液和1.2 mol/L可溶性磷酸盐溶液各2 ml依次加入步骤（2）所得的壳聚糖和盐酸多巴胺的混合溶液，恒温水浴充分搅拌，混合均匀，即得支架前驱体溶液；
（4）将步骤（3）所得的支架前驱体溶液加入模具中，将模具先放于4 ℃过夜，后放于-20 ℃冷冻24 h，随后真空冷冻干燥；
（5）取容积为500 ml的烧杯，在烧杯底部放入装有碳酸铵粉末的培养皿，后将冷冻干燥得到的支架材料放入烧杯中，用铝箔纸将支架材料与碳酸铵粉末分隔开，用封口膜将烧杯口密封，将烧杯放置于恒温培养箱中；
（6）将步骤（5）所得处理后支架材料，浸泡于250~500 ml的乙醇/Tris混合溶液中，并置于37 ℃恒温摇床中浸泡8~10 h后，用大量二次水冲洗，洗至中性，去除支架内残余的Tris成分，将支架材料放于-20 ℃冷冻，后冷冻干燥，即得原位负载聚多巴胺的多孔复合支架。
步骤（1）、（2）、（3）中所述的水浴锅的温度均为37 ℃，步骤（1）所用的乙酸溶液的乙酸体积分数为1 %，搅拌时间为2~3 h，使壳聚糖完全溶于乙酸溶液中。
步骤（2）中所述的盐酸多巴胺的加入量为壳聚糖质量的10%~30%，搅拌时间为1 h。
步骤（3）中所用可溶性钙盐为硝酸钙或氯化钙；所用可溶性磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠；其中Ca/P摩尔比为n(Ca2+):n(PO4 3-)=1.67:1，搅拌时间为3~4 h。
步骤（4）和（6）中冷冻干燥的温度为-80 ℃，冷冻干燥时间为48 h。
步骤（5）中所述的碳酸铵的用量为5 g，铝箔纸上扎有小孔，便于碳酸铵分解后产生的氨气与支架材料相接触，使支架材料处于碱性的气体氛围，促进聚多巴胺的生成，恒温烘箱的温度为37 ℃，放置时间48 h。
步骤（6）中所述的乙醇/Tris混合溶液是将无水乙醇和Tris溶液按照体积比1:1进行混合，无水乙醇的挥发性有利于支架材料与溶液充分接触，使晶体原位均匀转化，所用的Tris溶液的浓度为10 mmol/L，摇床转速为100 r/min。
本发明以壳聚糖为主体材料，借助壳聚糖在酸性条件下溶解，而盐酸多巴胺在酸性条件不利于聚合反应的特点，将二者混合，经冷冻干燥得到多孔支架。后采用碳酸铵扩散法，使材料处于碳酸铵分解后所产生的碱性氛围下，促使盐酸多巴胺原位自组装聚合生成PDA，从而实现PDA对支架表面的覆盖，钙磷离子的引入，在冻干后形成磷酸钙晶体，后经碱性的Tris/乙醇溶液处理后，原位转化生成纳米羟基磷灰石。
本发明中采用原位再生的方法使壳聚糖多孔支架表面均匀涂覆PDA，克服了在多孔材料内壁涂覆PDA的难题，采用碳酸铵气体扩散法，促使PDA的生成更加均匀，同时中和支架内部残余的乙酸。表面含有大量的羟基和氨基官能团，为材料提供二次反应（迈克尔加成反应或席夫碱反应）所需的活性基团，有利于蛋白、生长因子等活性物质的锚定，以及为后续材料的矿化提供形核位点，加速矿化。原位再生的无机纳米粒子与有机材料主体之间的相互掺杂，提升了支架整体的力学性能。
本发明所得原位负载聚多巴胺的多孔复合支架以原位再生思想和自组装原理为指导，以壳聚糖和盐酸多巴胺相互交融构建多孔结构支架材料，同时PDA和羟基磷灰石的原位再生赋予材料更好的生物活性，其多级分层结构以及相互连接的通孔，高度仿生自然骨结构，这有利于营养物质的运输及代谢废物的排出。
本发明原位负载聚多巴胺的多孔复合支架相对于其他骨修复材料具有如下优点：
（1）支架材料制备充分考虑不同分子的理化属性，酸性条件下有利于壳聚糖溶解，可抑制盐酸多巴胺的自聚合反应，将二者相互融合，使得后续PDA在微孔内壁生成的更加均匀；
（2）采用原位再生的方法，使PDA和羟基磷灰石在支架材料表面原位再生，PDA的存在可以有效调控磷酸钙向羟基磷灰石的转化，实现纳米尺度的均匀分散，有效提升材料的力学性能；
（3）采用碳酸铵扩散法使得PDA在微纳尺度的孔径内壁也可均匀生成 ，碳酸铵分解后产生的碱性气体氛围，同时去除了支架材料中残余的乙酸分子；
（4）无需使用其他交联剂，原位再生的PDA与壳聚糖分子之间发生原位交联，提升材料的孔隙率与亲水性以及机械强度；
（5）PDA表面含有大量的羟基和氨基等活性官能团，可以促进细胞粘附增殖及活性物质的锚定，还可为羟基磷灰石的生成提供形核位点，加速矿化，同时也可为材料二次接枝改性提供所需的活性基团；
（6）该复合支架制备简便易行，无需复杂设备操作。
附图说明
图1是实施例1、2、3、4所得复合支架的宏观形貌照片；
图2是实施例1、4所得复合支架的XRD图谱；
图3是实施例1、4所得复合支架的SEM图（A1、B1放大200 X，A2、B2、A3和B3放大10000 X）；
图4是实施例1、4所得复合支架的FTIR图谱；
图5是壳聚糖和聚多巴胺分子间交联反应示意图；
图6是实施例1、2、3、4所得复合支架的孔隙率；
图7是实施例1、4所得复合支架矿化一天后的SEM图（A1、B1放大3000 X，A2、B2、放大20000 X）；
图8是实施例1、4所得复合支架的接触角；
图9是实施例1、2、3、4所得复合支架的压缩强度。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1（不含聚多巴胺）
（1）称取1 g的壳聚糖加于50 ml的1%（V/V）的乙酸溶液中，置于37 ℃恒温水浴锅中搅拌3 h使其充分溶解，配置2 wt%的壳聚糖溶液；
（2）将2 mol/L硝酸钙溶液和1.2 mol/L磷酸氢二钾溶液各2 ml依次加入步骤（1）所得的壳聚糖溶液，37 ℃恒温水浴充分搅拌3 h，混合均匀，即得支架前驱体溶液；
（3）将步骤（2）所得的支架前驱体溶液加入模具中，将模具先放于4 ℃过夜，后放于-20 ℃冷冻24 h，后放置于-80 ℃真空冷冻干燥机，冷冻干燥48 h；
（4）取容积为500 ml的烧杯，在烧杯底部放入装有5 g碳酸铵粉末的培养皿，后将冷冻干燥得到的支架材料放进烧杯中，用带有小孔的铝箔纸将材料与碳酸铵粉末分隔开，用封口膜将烧杯口密封，将烧杯放置于37 ℃恒温培养箱中反应48 h；
（5）将步骤（4）所得处理后支架材料，浸泡于500 ml的乙醇/Tris（1:1，V/V）混合溶液，Tris浓度为10 mmol/L，并置于37 ℃恒温摇床，转速100 r/min，浸泡8h后，用大量二次水冲洗，洗至中性，去除支架内残余的Tris成分，将支架材料放于-20 ℃冷冻，后于-80 ℃冷冻干燥，即得多孔复合支架。
实施例2
（1）称取1 g的壳聚糖加于50 ml的1%（V/V）的乙酸溶液中，置于37 ℃恒温水浴锅中搅拌3 h使其充分溶解，配置2 wt%的壳聚糖溶液；
（2）称取100 mg的盐酸多巴胺，加入步骤（1）所得的壳聚糖溶液，37 ℃恒温水浴，搅拌1 h使其溶解，混合均匀；
（3）将2 mol/L硝酸钙溶液和1.2 mol/L磷酸氢二钾溶液各2 ml依次加入步骤（2）所得的壳聚糖、盐酸多巴胺混合溶液，37 ℃恒温水浴充分搅拌3 h，混合均匀，即得支架前驱体溶液；
（4）将步骤（3）所得的支架前驱体溶液加入模具中，将模具先放于4 ℃过夜，后放于-20 ℃冷冻24 h，后放置于-80 ℃真空冷冻干燥机，冷冻干燥48 h；
（5）取容积为500 ml的烧杯，在烧杯底部放入装有5g碳酸铵粉末的培养皿，后将冷冻干燥得到的支架材料放进烧杯中，用带有小孔的铝箔纸将材料与碳酸铵粉末分隔开，用封口膜将烧杯口密封，将烧杯放置于37 ℃恒温培养箱中反应48 h；
（6）将步骤（5）所得处理后支架材料，浸泡于500 ml的乙醇/Tris（1:1，V/V）混合溶液，Tris浓度为10 mmol/L，并置于37℃恒温摇床,转速100 r/min，浸泡8 h后，用大量二次水冲洗，洗至中性，去除支架内残余的Tris成分，将支架材料放于-20 ℃冷冻，后于-80 ℃冷冻干燥，即得原位负载聚多巴胺的多孔复合支架。
实施例3
（1）称取1 g的壳聚糖加于50 ml的1%（V/V）的乙酸溶液中，置于37 ℃恒温水浴锅中搅拌3 h使其充分溶解，配置2 wt %的壳聚糖溶液；
（2）称取200 mg的盐酸多巴胺，加入步骤（1）所得的壳聚糖溶液，37 ℃恒温水浴，搅拌1 h使其溶解，混合均匀；
（3）将2 mol/L硝酸钙溶液和1.2 mol/L磷酸氢二钾溶液各2 ml依次加入步骤（2）所得的壳聚糖、盐酸多巴胺混合溶液，37 ℃恒温水浴充分搅拌3 h，混合均匀，即得支架前驱体溶液；
（4）将步骤（3）所得的支架前驱体溶液加入模具中，将模具先放于4 ℃过夜，后放于-20 ℃冷冻24 h，后放置于-80 ℃真空冷冻干燥机，冷冻干燥48 h；
（5）取容积为500 ml的烧杯，在烧杯底部放入装有5 g碳酸铵粉末的培养皿，后将冷冻干燥得到的支架材料放进烧杯中，用带有小孔的铝箔纸将材料与碳酸铵粉末分隔开，用封口膜将烧杯口密封，将烧杯放置于37 ℃恒温培养箱中反应48 h；
（6）将步骤（5）所得处理后支架材料，浸泡于500 ml的乙醇/Tris（1:1，V/V）混合溶液，Tris浓度为10 mmol/L，并置于37 ℃恒温摇床,转速100 r/min，浸泡8 h后，用大量二次水冲洗，洗至中性，去除支架内残余的Tris成分，将支架材料放于-20 ℃冷冻，后于-80 ℃冷冻干燥，即得原位负载聚多巴胺的多孔复合支架。
实施例4
（1）称取1 g的壳聚糖加于50 ml的1%（V/V）的乙酸溶液中，置于37 ℃恒温水浴锅中搅拌3 h使其充分溶解，配置2 wt%的壳聚糖溶液；
（2）称取300 mg的盐酸多巴胺，加入步骤（1）所得的壳聚糖溶液，37 ℃恒温水浴，搅拌1 h使其溶解，混合均匀；
（3）将2 mol/L硝酸钙溶液和1.2 mol/L磷酸氢二钾溶液各2 ml依次加入步骤（2）所得的壳聚糖、盐酸多巴胺混合溶液，37 ℃恒温水浴充分搅拌3 h，混合均匀，即得支架前驱体溶液；
（4）将步骤（3）所得的支架前驱体溶液加入模具中，将模具先放于4 ℃过夜，后放于-20 ℃冷冻24 h，后放置于-80 ℃真空冷冻干燥机，冷冻干燥48 h；
（5）取容积为500 ml的烧杯，在烧杯底部放入装有5 g碳酸铵粉末的培养皿，后将冷冻干燥得到的支架材料放进烧杯中，用带有小孔的铝箔纸将材料与碳酸铵粉末分隔开，用封口膜将烧杯口密封，将烧杯放置于37 ℃恒温培养箱中反应48 h；
（6）将步骤（5）所得处理后支架材料，浸泡于500 ml的乙醇/Tris（1:1，V/V）混合溶液，Tris浓度为10 mmol/L，并置于37 ℃恒温摇床,转速100 r/min，浸泡8h后，用大量二次水冲洗，洗至中性，去除支架内残余的Tris成分，将支架材料放于-20 ℃冷冻，后于-80 ℃冷冻干燥，即得原位负载聚多巴胺的多孔复合支架。
由图1可知，冻干后的支架材料为白色，经碳酸铵处理后，含有盐酸多巴胺的复合支架颜色发生转变，颜色加深，且颜色随着盐酸多巴胺的含量增加而加深，此外，（每组图片中右边的圆形材料为支架的剖面）支架切开后内部的颜色与支架外表面颜色没有差别，说明聚多巴胺在材料表面均匀的生成。由图2可知实施例1和实施例4材料在Tris溶液处理前，材料中的无机晶体为磷酸钙，经Tris溶液处理后，磷酸钙晶体转变为羟基磷灰石。
由图3可知，在放大200 X时，可以看到，实施例4中由于聚多巴胺的生成与壳聚糖分子之间发生交联反应，使材料的孔径尺寸从300 μm减小到200 μm，在放大10000 X时可以看到材料表面附着许多圆球状的磷酸钙晶体，经Tris溶液处理后，材料表面的磷酸钙晶体转变为羟基磷灰石，实施例1材料表面还残留着许多片状的磷酸钙，而实施例4材料表面已经全部转变为羟基磷灰石，说明聚多巴胺分子的引入可以加速磷酸钙向羟基磷灰石的转变。
由图4和图5可知，2921和2872 cm-1是壳聚糖分子中亚甲基C-H的伸缩振动峰，实施例4中由于聚多巴胺分子内氢键作用导致吸收峰发生红移，在2852 cm-1出现C-H吸收峰；此外，原本聚多巴胺中1615和1512 cm-1处吲哚结构的吸收峰和壳聚糖中1599 cm-1的吸收峰被1624和1560 cm-1的两个新吸收峰取代，峰强度有所减弱，并且在1763 cm-1出现了C=O的吸收峰，证实分子中醌基形成，聚多巴胺和壳聚糖之间发生交联反应。由图6可知，含有聚多巴胺的复合支架孔隙率较高，主要是因为聚多巴胺与壳聚糖分子发生交联反应，从而提升了孔隙率。
由图7可知，矿化1天后，材料表面均有羟基磷灰石生成，其中实施例1支架表面的羟基磷灰石沉积在片状的磷酸钙表面，而实施例4支架表面已经有了均匀的矿化层出现，说明聚多巴胺的引入提升了材料的矿化能力。
由图8可知，未经表面改性的实施例1材料接触角是126.2°，而实施例4材料的接触角为78.4°，表面聚多巴胺涂层显著改善了材料的亲水性，因为聚多巴胺分子表面含有丰富的羟基和酰胺类亲水性基团，增加了材料的亲水性。
由图9可知，壳聚糖和聚多巴胺分子间交联提升了材料的力学强度。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料的制备方法，其特征在于：由壳聚糖和盐酸多巴胺相互融合构成支架主体多级分层结构，可溶性钙盐与可溶性磷酸盐作为无机相纳米羟基磷灰石的前驱体，采用碳酸铵扩散法诱导盐酸多巴胺自聚合，使材料表面原位负载聚多巴胺，后经Tris溶液处理，原位仿生构建纳米羟基磷灰石掺杂的骨修复支架材料；
包括以下步骤：
（1）称取1 g的壳聚糖溶于50 ml的乙酸溶液中，置于恒温水浴锅中搅拌使其溶解，配置2 wt%的壳聚糖溶液；
（2）称取一定量的盐酸多巴胺，加入步骤（1）所得的壳聚糖溶液，恒温水浴搅拌使其溶解，混合均匀；
（3）将浓度为2 mol/L可溶性钙盐溶液和1.2 mol/L可溶性磷酸盐溶液各2 ml依次加入步骤（2）所得的壳聚糖和盐酸多巴胺的混合溶液，恒温水浴充分搅拌，混合均匀，即得支架前驱体溶液；
（4）将步骤（3）所得的支架前驱体溶液加入模具中，将模具先放于4 ℃过夜，后放于-20℃冷冻24 h，随后真空冷冻干燥；
（5）取容积为500 ml的烧杯，在烧杯底部放入装有碳酸铵粉末的培养皿，后将冷冻干燥得到的支架材料放入烧杯中，用铝箔纸将支架材料与碳酸铵粉末分隔开，用封口膜将烧杯口密封，将烧杯放置于恒温培养箱中；
（6）将步骤（5）所得处理后支架材料，浸泡于250~500 ml的乙醇/Tris混合溶液中，并置于37 ℃恒温摇床中浸泡8~10 h后，用大量二次水冲洗，洗至中性，去除支架内残余的Tris成分，将支架材料放于-20 ℃冷冻，后冷冻干燥，即得原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架；
步骤（5）中所述的碳酸铵的用量为5 g，铝箔纸上扎有小孔，便于碳酸铵分解后产生的氨气与支架材料相接触，使支架材料处于碱性的气体氛围，促进聚多巴胺的生成，恒温烘箱的温度为37 ℃，放置时间48 h。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）、（2）、（3）中所述的水浴的温度均为37 ℃，步骤（1）所用的乙酸溶液的乙酸体积分数为1 %，搅拌时间为2~3 h，使壳聚糖完全溶于乙酸溶液中。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的盐酸多巴胺的加入量为壳聚糖质量的10%~30%，搅拌时间为1 h。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所用可溶性钙盐为硝酸钙或氯化钙；所用可溶性磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或磷酸二氢钠；其中Ca/P摩尔比为n(Ca2+):n(PO4 3-)=1.67:1，搅拌时间为3~4 h。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）和（6）中冷冻干燥的温度为-80 ℃，冷冻干燥时间为48 h。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（6）中所述的乙醇/Tris混合溶液是将无水乙醇和Tris溶液按照体积比1:1进行混合，无水乙醇的挥发性有利于支架材料与溶液充分接触，使晶体原位均匀转化，所用的Tris溶液的浓度为10 mmol/L，摇床转速为100 r/min。
7.如权利要求1-6任一所述的制备方法制得的原位负载聚多巴胺的壳聚糖复合支架材料。
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