CN114306751B

CN114306751B - 一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架及其制备方法

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Publication number: CN114306751B
Application number: CN202111645582.5A
Authority: CN
Inventors: 诸葛鑫
Original assignee: Zhixiang Biology Suzhou Co ltd
Current assignee: Zhixiang Biology Suzhou Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114306751A

Abstract

本发明公开了一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，包括聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架，依次沉积在纳米纤维支架表面的聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层、壳聚糖网络层。本发明还公开了该改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架的制备方法。本发明制得的支架不仅力学性能好，且可有效改善细胞的粘附和增殖。

Description

一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架及其制备方法。

背景技术

组织工程在人体组织修复领域正发挥着越来越重要的作用，组织工程支架能够支持细胞的生长、促进细胞的黏附和增殖并且有利于组织的形成，同时还能有效的防治感染和疾病传播，成本低来源广泛，在人体疾病的治疗中起着越来越重要的作用。组织工程学的产生使医学走进了组织和器官设计和组建的时代，大大促进了医学的发展，摆脱了医学上单纯的组织移植和器官移植，开创了人类医学发展史上的新的发展方向。目前，组织工程技术已经应用到了皮肤、骨骼、角膜、血管、肌肉、神经等组织器官的修复上，在修复和再生研究上取得了优异的成绩，其中在皮肤组织工程、骨骼修复的研究方向发展的最为广泛。

基于支架的组织工程为人体组织问题提供了可行的方法。理想的组织工程支架应具有生物相容性和可生物降解性，并具有一定的力学性能来适合手术操作。聚乳酸乙醇酸共聚物是一种可生物降解和生物相容性的生物聚合物，广泛应用与药物递送和组织工程应用。

申请号为201610366083.5的专利提供了一种具有径向取向孔结构的透明质酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物复合软骨修复材料及其制备方法，该透明质酸/聚乳酸-乙醇酸共聚物复合软骨修复材料在圆柱形复合支架中存在沿径向取向分布的管状孔结构，复合支架由透明质酸和聚乳酸-乙醇酸共聚物构成。申请号为201710928692.X的专利提供一种复合多孔骨组织工程支架，该复合多孔骨组织工程支架包含多孔PLGA支架和与该多孔PLGA支架复合的两性离子水凝胶。本发明还提供制备该复合多孔骨组织工程支架的方法，包括：配制包含两性离子单体、引发剂和交联剂的两性离子水凝胶预聚液，将经等离子体表面处理的多孔PLGA支架在预聚液中浸泡后取出，进行紫外光交联，冷冻干燥。本发明通过将两性离子与多孔PLGA支架复合。由上述现有技术可知，在制备PLGA支架时常常对其表面进行修饰来改善其表面生物活性，但是目前的PLGA支架在制备中常常使用到大量的有机溶剂，且制得的支架的力学性能需要进一步改善。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，该支架以聚乳酸乙醇酸纳米纤维为基体，在其表面依次沉积有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层、壳聚糖网络层，制得的支架不仅力学性能好，且可有效改善细胞的粘附和增殖。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，包括聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架，依次沉积在纳米纤维支架表面的聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层、壳聚糖网络层。

为更好的解决上述技术问题，本发明还提供了以下技术方案：

一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架的制备方法，包括以下步骤：

(1)将聚乳酸乙醇酸共聚物溶于二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的混合物中搅拌溶解制得聚合物溶液，将聚合物溶液置于注射器中进行静电纺丝，制得聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(2)将异佛尔酮二异氰酸酯、聚四亚甲基醚乙二醇在氮气保护下混合搅拌反应，制得预聚物，然后降温，并加入2,2-二羟基丙酸，搅拌反应，加入三乙胺搅拌混合，最后加入蒸馏水，制得聚氨酯乳液；

(3)将丙烯酰胺单体溶液和聚氨酯乳液混合搅拌反应，然后加入2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，搅拌处理，最后加入明胶，继续进行搅拌混合，制得三元混合物，将上述制得的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架置于上述三元混合物中浸泡处理，取出干燥，制得具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(4)将具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架置于多巴胺的pH为8.5Tris-HCl缓冲溶液中，室温下搅拌处理，取出采用去离子水洗涤，之后干燥，制得具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(5)将具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架浸泡在壳聚糖的乙酸溶液中搅拌处理，之后取出立即浸入液氮中冷冻处理，之后进行冷冻干燥，制得多功能纳米纤维支架。

步骤(1)中，所述二氯甲烷和和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为3：(1-2)。

步骤(1)中，静电纺丝时注射器的针尖与纤维收集器之间的距离为15cm，对针尖处施加的压力为20Kv，聚合物溶液的流速为2ml/L。

步骤(2)中，所述异佛尔酮二异氰酸酯、聚四亚甲基醚乙二醇、2,2-二羟基丙酸、三乙胺的质量比为25：(12-15)：(2-2.5)：2。

步骤(2)中，所述混合搅拌反应的温度为75-85℃，时间为1.5-2.5h，所述降温为降至60℃，搅拌反应的时间为0.5-1.5h。

步骤(2)中，所述聚氨酯乳液的固含量为45-55wt％。

步骤(3)中，所述丙烯酰胺单体溶液的质量浓度为63-64％，丙烯酰胺单体溶液、聚氨酯乳液、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、明胶的质量比为15:10：(0.5-0.8)：(0.5-0.8)：10。

步骤(3)中，所述混合搅拌反应的温度为35-40℃，时间为30-40min；所述搅拌处理的时间为30min；所述搅拌混合的时间为5-7h；所述浸泡处理的时间为6-7h。

步骤(4)中，所述多巴胺的pH为8.5Tris-HCl缓冲溶液中多巴胺的浓度为10mmol/L，搅拌处理的时间为6h。

步骤(5)中，所述壳聚糖的乙酸溶液中乙酸的浓度为1wt％，壳聚糖的浓度0.5-1mg/L，搅拌处理的时间为1h，冷冻处理的时间为30-90min。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明提供的多功能纳米纤维支架是以聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架为基体，在其表面依次沉积有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层、壳聚糖网络层，聚乳酸乙醇酸共聚物具有一定的生物降解性和生物相容性，可应用生物组织工程中，但是其缺少生物活性表面、且力学性能较差；本发明首先在其表面沉积聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层，该层具有规则的微通道结构，尺寸稳定性好，具有高度互连的多孔结构，有利于生物组织的生长；聚多巴胺层可以牢固的附着在无机/有机表面上，可有效促进不同类型的粘附和增殖，从而改善支架的生物学功能；壳聚糖是甲壳素的部分脱乙酰衍生物，含有氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖，其具有支持骨传导和提供抗菌作用的能力，本发明提供的壳聚糖网络层具有多孔结构，更利于细胞生长。

本发明首先将聚乳酸乙醇酸共聚物溶于溶剂中进行静电纺丝从而制得聚乳酸乙醇酸纤维支架，该过程有机溶剂用量少，更利于环境保护；本发明首先制备聚氨酯乳液，然后将其与丙烯酰胺类单体预聚合，最后加入明胶反应，制得具有三重互穿网络结合的三元混合物，将聚乳酸乙醇酸纤维支架浸泡其中，从而在支架基体表面形成具有微通道结构的聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层，然后将其置于多巴胺的缓冲溶液中，自组装形成聚多巴胺层，最后将其加入到壳聚糖的乙酸溶液中搅拌，取出迅速加入到液氮中进行冷冻处理，从而形成具有蜂窝网络的壳聚糖网络层，制得的多功能纳米纤维支架不仅力学性能好，且有利于细胞的粘附，生物学性能佳。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

(1)将10g聚乳酸乙醇酸共聚物溶于30ml二氯甲烷和20mlN,N-二甲基甲酰胺的混合物中搅拌溶解制得聚合物溶液，将聚合物溶液置于注射器中进行静电纺丝，静电纺丝时采用铝板作为纤维收集器，对针尖处施加的压力为20Kv，聚合物溶液的流速为2ml/L，注射器的针尖与纤维收集器之间的距离为15cm；制得聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(2)将25g异佛尔酮二异氰酸酯、12g聚四亚甲基醚乙二醇在氮气保护、75℃下混合搅拌反应1.5h，制得预聚物，然后降温至60℃，并加入2g2,2-二羟基丙酸，搅拌反应0.5h，加入2g三乙胺搅拌混合，最后加入蒸馏水，制得固含量为50wt％的聚氨酯乳液；

(3)将15g质量浓度为63％的丙烯酰胺单体溶液和10g聚氨酯乳液混合在35℃下搅拌反应30min，然后加入0.5g 2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、0.5g N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，搅拌处理30min，最后加入10g明胶，继续进行搅拌混合5h，制得三元混合物，将上述制得的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架置于上述三元混合物中浸泡处理6h，取出干燥，制得具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(4)将具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架置于100ml浓度为10mmol/L的多巴胺的pH为8.5Tris-HCl缓冲溶液中，室温下搅拌处理6h，取出采用去离子水洗涤，之后干燥，制得具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(5)将具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架浸泡在浓度0.5mg/L的壳聚糖的乙酸溶液中搅拌处理1h，之后取出立即浸入液氮中冷冻处理30min，之后进行冷冻干燥，制得多功能纳米纤维支架。

实施例2

(2)将25g异佛尔酮二异氰酸酯、15g聚四亚甲基醚乙二醇在氮气保护、85℃下混合搅拌反应2.5h，制得预聚物，然后降温至60℃，并加入2.5g2,2-二羟基丙酸，搅拌反应1.5h，加入2g三乙胺搅拌混合，最后加入蒸馏水，制得固含量为55wt％的聚氨酯乳液；

(3)将15g质量浓度为64％的丙烯酰胺单体溶液和10g聚氨酯乳液混合在40℃下搅拌反应40min，然后加入0.8g 2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、0.8g N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，搅拌处理30min，最后加入10g明胶，继续进行搅拌混合7h，制得三元混合物，将上述制得的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架置于上述三元混合物中浸泡处理7h，取出干燥，制得具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(5)将具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架浸泡在浓度1mg/L的壳聚糖的乙酸溶液中搅拌处理1h，之后取出立即浸入液氮中冷冻处理90min，之后进行冷冻干燥，制得多功能纳米纤维支架。

实施例3

(2)将25g异佛尔酮二异氰酸酯、13g聚四亚甲基醚乙二醇在氮气保护、80℃下混合搅拌反应2h，制得预聚物，然后降温至60℃，并加入2g2,2-二羟基丙酸，搅拌反应1h，加入2g三乙胺搅拌混合，最后加入蒸馏水，制得固含量为50wt％的聚氨酯乳液；

(3)将15g质量浓度为63.5％的丙烯酰胺单体溶液和10g聚氨酯乳液混合在35℃下搅拌反应30min，然后加入0.6g 2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、0.6g N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，搅拌处理30min，最后加入10g明胶，继续进行搅拌混合5.5h，制得三元混合物，将上述制得的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架置于上述三元混合物中浸泡处理6.5h，取出干燥，制得具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(5)将具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架浸泡在浓度0.7mg/L的壳聚糖的乙酸溶液中搅拌处理1h，之后取出立即浸入液氮中冷冻处理50min，之后进行冷冻干燥，制得多功能纳米纤维支架。

实施例4

(2)将25g异佛尔酮二异氰酸酯、14g聚四亚甲基醚乙二醇在氮气保护、80℃下混合搅拌反应2h，制得预聚物，然后降温至60℃，并加入2g2,2-二羟基丙酸，搅拌反应1h，加入2g三乙胺搅拌混合，最后加入蒸馏水，制得固含量为48wt％的聚氨酯乳液；

(3)将15g质量浓度为63.7％的丙烯酰胺单体溶液和10g聚氨酯乳液混合在40℃下搅拌反应30min，然后加入0.6g 2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、0.6g N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，搅拌处理30min，最后加入10g明胶，继续进行搅拌混合6h，制得三元混合物，将上述制得的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架置于上述三元混合物中浸泡处理7h，取出干燥，制得具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(5)将具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架浸泡在浓度0.7mg/L的壳聚糖的乙酸溶液中搅拌处理1h，之后取出立即浸入液氮中冷冻处理60min，之后进行冷冻干燥，制得多功能纳米纤维支架。

实施例5

(2)将25g异佛尔酮二异氰酸酯、14g聚四亚甲基醚乙二醇在氮气保护、80℃下混合搅拌反应2.5h，制得预聚物，然后降温至60℃，并加入2.5g2,2-二羟基丙酸，搅拌反应1.5h，加入2g三乙胺搅拌混合，最后加入蒸馏水，制得固含量为50wt％的聚氨酯乳液；

(3)将15g质量浓度为63％的丙烯酰胺单体溶液和10g聚氨酯乳液混合在40℃下搅拌反应30min，然后加入0.7g 2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、0.7g N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，搅拌处理30min，最后加入10g明胶，继续进行搅拌混合7h，制得三元混合物，将上述制得的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架置于上述三元混合物中浸泡处理6h，取出干燥，制得具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架；

(5)将具有聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层的聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架浸泡在浓度1mg/L的壳聚糖的乙酸溶液中搅拌处理1h，之后取出立即浸入液氮中冷冻处理30-90min，之后进行冷冻干燥，制得多功能纳米纤维支架。

对比例1

纳米纤维支架表面不沉积聚多巴胺层，其他条件和实施例5相同。

对比例2

纳米纤维支架表面不沉积聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层，其他条件和实施例5相同。

将上述实施例和对比例中的支架切成10mm×5mm×5mm的小块，浸泡于含有体积分数为0.1％的胎牛血清的DMEM、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L L-抗坏血酸，2mmol/L L-谷氨酰胺、10^-8mmol/L地米塞松的培养液中，预湿24h，取出，滤纸吸干液体后，置于24孔培养板内备用。无菌条件下，在兔一侧股骨大转子处抽取骨髓约3mL，按每毫升培养液3×10⁶个有核细胞接种，4～6d半量换液，然后1周换液两次，等细胞汇合后首次传代。细胞传代3代后，取出培养皿，消化后调整细胞浓度为1×10¹⁰L^-1。用移液器吸取细胞悬液，小心滴加至各组材料上，直至饱和。将培养板置于CO₂培养箱内孵育4h后，按上述方法补种一次，8h后再补种一次，每块材料接种细胞约1×10⁶个，然后加入诱导培养液浸没材料，置于CO2培养箱内培养。隔天换液，操作过程中尽量避免材料移动。

细胞接种4h后，取出样品，用PBS溶液轻轻冲洗两次，然后用2.5g/L胰蛋白酶消化贴壁细胞，并用细胞计数板进行计数，计算贴壁细胞数，公式如下：细胞黏附率(％)＝贴壁细胞数/接种细胞数×100％。

上述实施例以及对比例制得的支架的性能如表1所示。

表1

从上述测试结果可以看出，本发明制得的支架不仅具有良好的细胞黏附性，且力学性能佳。

此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，包括聚乳酸乙醇酸纳米纤维支架，依次沉积在纳米纤维支架表面的聚氨酯/聚丙烯酰胺/明胶水凝胶层、聚多巴胺层、壳聚糖网络层；

其制备方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，步骤(1)中，所述二氯甲烷和和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为3：(1-2)。

3.根据权利要求1所述的一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，步骤(1)中，静电纺丝时注射器的针尖与纤维收集器之间的距离为15cm，对针尖处施加的压力为20Kv，聚合物溶液的流速为2ml/L。

4.根据权利要求1所述的一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，步骤(2)中，所述异佛尔酮二异氰酸酯、聚四亚甲基醚乙二醇、2,2-二羟基丙酸、三乙胺的质量比为25：(12-15)：(2-2.5)：2。

5.根据权利要求1所述的一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，步骤(2)中，所述混合搅拌反应的温度为75-85℃，时间为1.5-2.5h，所述降温为降至60℃，搅拌反应的时间为0.5-1.5h。

6.根据权利要求1所述的一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，步骤(3)中，所述聚氨酯乳液的固含量为45-55wt％；所述丙烯酰胺单体溶液的质量浓度为63-64％，丙烯酰胺单体溶液、聚氨酯乳液、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺、明胶的质量比为15:10：(0.5-0.8)：(0.5-0.8)：10。

7.根据权利要求1所述的一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，步骤(3)中，所述混合搅拌反应的温度为35-40℃，时间为30-40min；所述搅拌处理的时间为30min；所述搅拌混合的时间为5-7h；所述浸泡处理的时间为6-7h。

8.根据权利要求1所述的一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，步骤(4)中，所述多巴胺的pH为8.5Tris-HCl缓冲溶液中多巴胺的浓度为10mmol/L，搅拌处理的时间为6h。

9.根据权利要求1所述的一种改善细胞黏附的多功能纳米纤维支架，其特征在于，步骤(5)中，所述壳聚糖的乙酸溶液中乙酸的浓度为1wt％，壳聚糖的浓度0.5-1mg/L，搅拌处理的时间为1h，冷冻处理的时间为30-90min。