CN112533652A - 用于3d生物打印的含纳米纤维素的生物墨水、其制造和使用方法、以及由此获得的3d生物结构 - Google Patents

Abstract

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或优选其组合的形式的纳米纤维素；在离子交联剂存在下可离子交联的海藻酸盐；以及水。纳米纤维素‑海藻酸盐生物墨水具有对于基于挤出的生物打印有利的流变、膨胀、和生物相容性特性。通过实验证明了具有人体鼻中隔软骨细胞的纳米纤维素‑海藻酸盐生物墨水使高分辨率的软骨生物打印成为可能。所披露的纳米纤维素已被证明是与细胞存活和增殖相容的；具有模拟促进分化和组织形成的天然细胞外环境的纳米尺度和微米尺度构造；并且具有理想的流变特性以允许挤出3D生物打印。具有晶体和原纤维纳米纤维素的独特共混物的生物墨水在培养中产生非常稳定的结构体积。

Description

用于3D生物打印的含纳米纤维素的生物墨水、其制造和使用 方法、以及由此获得的3D生物结构

优先权数据

本国际专利申请要求于2018年3月7日提交的美国临时专利申请号62/639,538的优先权，将所述专利申请特此通过援引并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及3D生物打印、用于3D生物打印的生物墨水组合物、生物墨水组合物的制造和使用方法、以及由3D生物打印生产的3D生物结构。

背景技术

三维(3D)打印，或增材制造是一种工艺，通过该工艺使用专用打印机将物体以其三维形式创建出来。在3D建模程序的帮助下，打印机接收来自计算机中创建的设计文件的指令。然后将待打印的物体的文件或数据蓝图切分成被送到打印机的二维(2D)表示。根据文件中含有的信息建立材料的多个层；这些层持续增加，直到打印出完整的物体。与2D打印相比，3D打印的工艺需要更长的时间，并且涉及大量的资本投资，但是提供了广泛的优势，如原则上打印出任何几何结构的能力。

现在在工业和学术界对使用3D打印技术构建组织和器官存在强烈的兴趣。使用3D打印技术打印活细胞、组织、器官和生物相容的支架的工艺被称作“3D生物打印”。生物打印人体组织和器官需要生物墨水，该生物墨水包括生物材料，如琼脂糖、海藻酸盐、壳聚糖、胶原蛋白、细胞外基质(ECM)、明胶、纤维蛋白、和透明质酸。

生物材料的3D打印提供了许多优势。这些应用主要是在药物检测、组织工程、和器官移植的领域，但其他生物应用可能会在未来出现。

因为3D生物打印涉及功能性活生物材料，所以3D生物打印比聚合物或金属的常规3D打印复杂得多。由于活细胞和组织的不同敏感性所形成的挑战，所使用的材料、细胞类型、以及生长和分化因子的适当选择通常决定生物打印的组织的结构完整性。

因为基于挤出和喷墨的技术改编自常规3D打印工艺，所以存在将这些体系与脆弱的生物材料一起使用有关的若干相容性和稳定性问题。使用上述技术开发的生物打印的产品在微观水平上缺少结构完整性。值得注意的是，在多个长度尺度上的细胞结构影响整个人造组织的功能性；这对于完全功能组织的产生是至关重要的。希望生物墨水同时复制天然组织微观构造和宏观构造，克服常规组织工程策略的可重复性和可缩放性问题。

关于3D生物打印的另一个常见观察结果是，构建的3D生物结构很大程度上是不稳定的，并且曾被报道随时间推移经历形状畸变。

在三种主要的3D生物打印技术：挤出、喷墨和激光辅助中，挤出是最通用、快速、可缩放且成本有效的，并且因此是现今的主要技术。挤出生物打印依赖于使用机械力(活塞或螺杆驱动)或气动力通过喷嘴挤出具有合适的机械特性(粘度、弹性、和剪切稀化)的生物墨水。基于挤出的生物打印(例如，生物绘制(bioplotting)或熔融沉积建模)涉及通过喷嘴或注射器分配粘性生物墨水。打印后，构建物可以逐层以物理方式或以化学方式固化(例如，凝胶化)。基于挤出的生物打印的主要缺点之一是其对于最佳材料粘度的依赖，当没有实现时，这可能导致泄漏并且影响最终的组织构建物的分辨率，这限制了生物结构(尤其具有突出部分的那些生物结构)的复杂性。合适的生物墨水必须还展现出在剪切和/或高温下的细胞活力、粘附、增殖和分化。而且，合适的生物墨水应该能够产生具有可接受的机械刚度的生物结构。

尽管更容易定制合成聚合物生物墨水如聚丙烯酰胺和聚乙二醇的生物力学特性以适合挤出技术，但是这些聚合物的生物相容性和组织再生潜力比不上模拟天然的细胞外基质环境的天然的非合成的生物墨水如明胶、琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸和胶原蛋白。

因此，挤出3D生物打印的主要挑战之一是确定具有合适的流变特性以及生物相容性的非合成生物墨水。许多聚合物提供合适的流变特性但不是生物相容的。在另一方面，许多生物材料是生物相容的，但不赋予生物墨水合适的流变特性，以使其可用于生物打印。

保证生物打印的构建物的高分辨率或保真度并找到最佳生物墨水仍是打印复杂生物结构的主要障碍。较高的分辨率不仅允许更好地复制天然构造，而且还可以控制孔径和相互连接性，当考虑到在400-500mm内的扩散距离可能限制氧气传输并且因此限制细胞活力时，这是重要的。目前，立体平板印刷和基于喷墨的技术提供了良好的分辨率，但是受到缺少适当的生物材料、降低的细胞活性和差机械强度的限制。激光辅助生物打印机可以以微尺度分辨率打印，但制备用于沉积的单独的带状物可能是耗时的且不是成本有效的。

对于附加的背景信息，参见Jessop等人，“3D bioprinting for reconstructivesurgery:Principles,applications and challenges[用于重建外科的3D生物打印：原理、应用和挑战]”,Journal of Plastic,Reconstructive&Aesthetic Surgery[整形、重建和美容外科期刊](2017)70,1155-1170，将该文献特此通过援引并入。

组织工程承诺创建将每年拯救成千上万生命并减轻长期健康负担的实体器官移植。此外，组织工程有潜力为天生具有先天性畸形的患者或后来在生活中由于创伤或恶性肿瘤而患有畸形的患者恢复形态和功能。

软骨是具有有限的自再生特性的含有软骨细胞的无血管组织。因为软骨不会自我修复，所以对于用可替代的途径如组织工程替换受损的软骨组织存在需求。来自创伤、烧伤、皮肤癌、或先天性疾病的面部软骨缺陷的重建目前依赖于使用自体移植，最常见从肋骨软骨部位进行自体移植，伴随显著的供体部位发病率。尤其当使用合成生物材料时，基于支架的非特异性细胞接种的组织工程的软骨构建物不能复制天然组织各向异性，并且因此在机械上不稳定且易于在体内降解、钙化、和发炎。

对软骨的3D生物打印进行的当代研究已确定了几种潜在的天然生物墨水材料，包括纤维蛋白、海藻酸盐、明胶、由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白质混合物、以及纳米纤维素，这些天然生物墨水材料已经被用作用于促进细胞从邻近的健康组织归巢或在加入细胞组分如软骨细胞或间充质干细胞后沉积细胞外基质的支架。然而，由于不最理想的可打印性，更通常使用的生物墨水的应用可能是个挑战。特别地，纯的海藻酸盐配制品以被确定为即使当增加粘度时也提供差的打印后形状保真度。

由平行的线性多糖分子构成并从植物或细菌的生物合成提取的纳米纤维素是新兴种类的先进的天然衍生的纳米材料。由于其有吸引力的物理化学特性、极其高的刚度(100-200GPa)和强度以及其充足性和可持续性，纳米纤维素是有前途的。由于其生物相容性、纳米结构、功能化潜能、持水能力、以及在形态上与胶原蛋白的相似性，细菌纳米纤维素已显示出用于组织工程应用的希望，由此提供细胞支持。由于细菌纤维素的高纵横比，独特的生物力学和流变特性还意味着它具有作为生物墨水用于3D生物打印的潜在效用。然而，用于生产细菌纳米纤维素的当前技术受到支持细菌生长的巨大基质成本、产品的低产率、可缩放性以及关于已被禁止广泛使用的剩余细菌毒素/表位的忧虑的限制。纳米纤维素还可以使用昂贵的酶促处理或使用具有差的化学回收的浓酸由生物质产生，这造成临床转化和扩大问题。

因为总体上水凝胶是生物相容的，显示出低细胞毒性，并且具有高水含量，与细胞外基质相似，所以已指出水凝胶作为有吸引力的材料用于生物墨水。被评估用于3D生物打印的常见的水凝胶是天然聚合物胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、和海藻酸盐。为了适合于3D生物打印，水凝胶必须是足够粘的，以便在打印过程中保持其形状，并且必须能够交联以便在生物打印后保持3D结构。交联可以通过温度改变、UV光聚合、和/或离子交联来发生。例如，从褐藻分离的海藻酸盐具有在加入二价阳离子下交联的能力。由于热敏粘度和不受控的可打印性，已证明纯海藻酸盐生物墨水是差的。尽管海藻酸盐的粘度可以通过改变浓度和分子量来增加，但它还是不足以在打印时实现形状保真度。

尽管对于3D生物打印研究有广泛的兴趣，但迄今为止不存在真正通用的生物墨水。通用的生物墨水将解决许多已知的问题，包括热敏性、打印后在培养基中膨胀或收缩、缺乏剪切稀化行为、凝胶化缓慢、分辨率差、印刷后形状保真度差、细胞粘附、生物活性和细胞存活、细胞分化为组织、以及为细胞粘附、迁移、增殖和分化提供最佳环境的一系列拓扑结构。希望的是一种生物墨水组合物，其是可打印的，能够保持复杂的宏观结构，并且提供活细胞可以在其中茁壮成长并分化的环境。还寻求制造并使用这种生物墨水的方法。

发明内容

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，该生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合形式的纳米纤维素；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，该生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素原纤维形式的纳米纤维素，其中该纳米纤维素的特征在于至少240℃的热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，该生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素晶体形式的纳米纤维素，其中该纳米纤维素的特征在于至少290℃的热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，该生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中这些纳米纤维素晶体(如果存在)的特征优选在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中这些纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征优选在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

在一些实施例中，该纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在。在某些实施例中，该纳米纤维素以从3％(w/v)至6％(w/v)的纳米纤维素浓度存在。

在一些实施例中，该海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在。

优选地，该纳米纤维素是含有很少木质素或不含木质素的亲水性纳米纤维素。

在本发明的一些实施例中，该生物墨水组合物是不含细胞的生物墨水。在其他实施例中，该生物墨水组合物是含有活的人体细胞(或其他动物细胞)的负载细胞的生物墨水。在某些实施例中，这些活的人体细胞是人体鼻中隔软骨细胞。这些活的人体细胞可以以每毫升该生物墨水组合物从10⁵至10⁷个细胞的细胞浓度存在于该生物墨水组合物中，例如像2×10⁶个细胞/mL。

在优选实施例中，该纳米纤维素呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合(共混物)形式。

在使用纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的共混物的实施例中，该纳米纤维素的特征可以在于至少250℃、260℃、270℃、280℃、290℃、或300℃的热分解起始温度。在使用纳米纤维素原纤维的实施例中，这些纳米纤维素原纤维的特征可以在于至少250℃、260℃、270℃、280℃、290℃、300℃或310℃的热分解起始温度。在使用纳米纤维素晶体的实施例中，这些纳米纤维素晶体的特征可以在于至少295℃、300℃、310℃、320℃、330℃、或340℃的热分解起始温度。

该纳米纤维素优选含有小于0.05wt％的硫，如约0.02wt％的硫或更少。优选地，该纳米纤维素不含有附着到纳米纤维素颗粒表面上的硫酸半酯基团。

在优选实施例中，该纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇(和水)存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将纤维素机械精制以产生纳米纤维素。

优选地，该纳米纤维素不是细菌纳米纤维素，不来源于被囊动物，并且不经由木质纤维素生物质或纤维素的酶促水解获得。

该纳米纤维素优选具有至少-10mV或更负、如至少-20mV或更负的ζ电位。

该纳米纤维素优选是剪切稀化的，使得生物墨水可以便利地经由挤出进行3D打印。

该生物墨水组合物可以进一步包含离子交联剂，典型地在稍后的时间在希望交联时加入该离子交联剂。在一些实施例中，该离子交联剂包括二价阳离子，如(但不限于)选自下组的二价金属阳离子，该组由以下各项组成：Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、及其组合。示例性离子交联剂是氯化钙CaCl₂。

在不同实施例中，该生物墨水组合物进一步包含选自下组的一种或多种生物墨水添加剂，该组由以下各项组成：生长促进剂、生长因子、维生素、矿物质、酶、蛋白质、糖、糖醇、酸、碱、盐、缓冲剂、稳定剂、溶解氧、以及抗生素。

所披露的生物墨水组合物是对选择用于生物打印的人体细胞非细胞毒性的。

本发明的其他变体提供一种制造用于3D生物打印的生物墨水组合物的方法，该方法包括：

(a)获得呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中这些纳米纤维素晶体(如果存在)的特征在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中这些纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)将该纳米纤维素与海藻酸盐在水溶液中组合，其中该海藻酸盐呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐的形式，并且其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的；

(c)将该水溶液灭菌；

(d)任选将多种活的人体细胞加入该水溶液；以及

(e)将该水溶液回收作为用于3D生物打印的生物墨水组合物。

在一些实施例中，该纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在于该生物墨水组合物中。在这些或其他实施例中，该海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在于该生物墨水组合物中。

优选地，在步骤(a)中，该纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇(和水)存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将纤维素机械精制以产生该纳米纤维素。

在一些优选实施例中，该纳米纤维素呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合(共混物)形式。

在一些实施例中，在步骤(c)中，灭菌使用选自下组的技术，该组由以下各项组成：蒸汽灭菌、UV灭菌、乙醇灭菌、及其组合。当使用蒸气灭菌时，步骤(c)在制备该水溶液之前分别将该纳米纤维素(或含有该纳米纤维素的液体溶液)和该海藻酸盐(或含有该海藻酸盐的液体溶液)灭菌，并且因为海藻酸盐是热敏的，优选不通过蒸汽灭菌将该海藻酸盐灭菌。海藻酸盐优选UV灭菌和/或乙醇灭菌，而不是蒸汽灭菌。

所产生的生物墨水组合物可以是不含细胞的生物墨水或负载细胞的生物墨水。在一些实施例中，该生物墨水组合物是含有活的人体细胞、如(但不限于)人体鼻中隔软骨细胞的负载细胞的生物墨水。活的人体细胞可以以例如每毫升该生物墨水组合物从10⁵至10⁷个细胞的细胞浓度存在于该生物墨水组合物中。

其他变体提供一种制造3D打印的生物结构的方法，该方法包括：

(a)获得呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中这些纳米纤维素晶体(如果存在)的特征在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中这些纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)将该纳米纤维素与海藻酸盐在水溶液中组合，其中该海藻酸盐呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐的形式，并且其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的；

(c)将该水溶液灭菌；

(d)将多种活的人体细胞加入该水溶液，以形成负载细胞的生物墨水；

(e)将多层的该负载细胞的生物墨水沉积到基材或表面上；

(f)在步骤(e)期间和/或在步骤(e)之后将该多层的该负载细胞的生物墨水暴露于离子交联剂，以离子交联该海藻酸盐；以及

(g)回收含有该多层的该负载细胞的生物墨水的3D打印的生物结构。

在一些实施例中，该纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在于该负载细胞的生物墨水中。在这些或其他实施例中，该海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在于该负载细胞的生物墨水中。

优选地，该纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇(和水)存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将纤维素机械精制以产生该纳米纤维素。

在一些优选实施例中，该纳米纤维素呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合(共混物)形式。

步骤(c)可以使用选自下组的灭菌技术，该组由以下各项组成：蒸汽灭菌、UV灭菌、乙醇灭菌、及其组合。当使用蒸气灭菌时，步骤(c)在制备该水溶液之前分别将该纳米纤维素(或含有该纳米纤维素的液体溶液)和该海藻酸盐(或含有该海藻酸盐的液体溶液)灭菌，并且因为海藻酸盐是热敏的，优选不通过蒸汽灭菌将该海藻酸盐灭菌。海藻酸盐优选UV灭菌和/或乙醇灭菌，而不是蒸汽灭菌。

在一些实施例中，这些活的人体细胞是人体鼻中隔软骨细胞，并且该3D打印的生物结构含有人体软骨。

在一些实施例中，步骤(e)中的沉积使用挤出(即，基于挤出的3D生物打印)。

在一些实施例中，在步骤(f)中，在形成该多层的该负载细胞的生物墨水的每个之间进行交联。在这些或其他实施例中，在步骤(f)中，在形成该多层的该负载细胞的生物墨水的全部之后进行交联。

该离子交联剂可以包括二价阳离子，如Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、或其组合。

在一些实施例中，步骤(f)使用该离子交联剂的气溶胶，其中将该气溶胶连续地或周期性地暴露于该多层的该负载细胞的生物墨水。

该3D打印的生物结构的特征可以在于紧密分散在离子交联的海藻酸盐内的相互连接的致密纳米纤维素颗粒的多孔3D网络。优选地，该3D打印的生物结构内的该纳米纤维素含有如从约50纳米至约10微米的孔径范围。在一些实施例中，该3D打印的生物结构内的该纳米纤维素含有小到55纳米并且大到12微米的孔径。

最终的3D打印的生物结构可以选自下组，该组由以下各项组成：耳、鼻、软骨关节、气管环、喉、肋软骨条、或其一部分。该3D打印的生物结构可以是任意几何形状。

附图说明

图1总结了在实例中对在室温下溶解、流动、与纳米纤维素共混物(NCB)混合的容易度以及未交联的打印后构建物稳定性评估的不同海藻酸盐浓度的定性分析。

图2总结了在实例中使用雾化的CaCl₂用于交联的海藻酸盐交联时间(分钟)和交联强度的分析。

图3示出了在实例中网格厚度测定的结果，以测试含纳米纤维素的生物墨水的生物打印分辨率。

图4显示了在实例中用于复杂结构测试的形状的以图形格式的G代码；插图A是空心圆柱体，插图B是圆柱体，插图C是鼻软骨，插图D是立方体，插图E是右耳，并且插图F是4边棱锥体。

图5总结了在实例中具有不同CaCl₂浓度的海藻酸盐交联优化。

图6示出了在实例中在交联之前和之后的纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的TEM图像。

图7提供了在实例中使用用0.1M或0.5M的CalCl₂交联的三种不同生物墨水配制品(CNC-AG、NCB-AG、和CNF-AG)生物打印的圆柱体构建物体积的比较。

图8示出了在实例中相对于时间0在24和72小时的构建物(3D生物结构)体积变化。

图9揭示了在实例中用于复杂形状测试的使用NCB-AG生物墨水打印的几何结构。

图10示出了在实例中含有海藻酸盐但不含纳米纤维素的生物墨水的流变特性。

图11示出了在实例中作为剪切速率的函数的纯海藻酸盐生物墨水的粘度。

图12示出了在实例中纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水在1Hz下的流变特性。

图13示出了在实例中对于与1.25％海藻酸盐(w/v)组合的CNC、NCB和CNF生物墨水而言，作为剪切速率的函数的不同纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的粘度。x轴符号“-s”表示秒的倒数的单位，s^-1(Hz)。

图14示出了在实例中对于与2.5％海藻酸盐(w/v)组合的CNC、NCB和CNF生物墨水而言，作为剪切速率的函数的不同纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的粘度。x轴符号“-s”表示秒的倒数的单位，s^-1(Hz)。

图15示出了在实例中对于与5％海藻酸盐(w/v)组合的CNC、NCB和CNF生物墨水而言，作为剪切速率的函数的不同纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的粘度。x轴符号“-s”表示秒的倒数的单位，s^-1(Hz)。

图16显示了在实例中(A)纳米纤维素晶体(CNC-AG)、(B)纳米纤维素共混物(NCB-AG)、和(C)纳米纤维素原纤维(CNF-AG)生物墨水配制品的生物打印后人体鼻中隔软骨细胞的活力。

图17示出了在实例中在3D细胞培养与仅细胞(2D细胞培养)中的晶体/原纤维共混的纳米纤维素生物墨水中的人体鼻中隔软骨细胞活力。

图18总结了在实例中乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测定的结果，其中将2D培养中的人体鼻中隔软骨细胞的细胞毒性与用NCB-AG生物墨水生物打印后的人体鼻中隔软骨细胞的细胞毒性进行比较。

图19示出了在实例中在4、12和24小时NCB-AG生物墨水中的人体鼻中隔软骨细胞的代谢活性。

图20显示了在实例中在生物打印后的海藻酸盐生物墨水和含纳米纤维素的生物墨水构建物的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图21呈现了在实例中生物打印的构建物的应力-应变曲线。

图22示出了在实例中在仅海藻酸盐生物墨水与含纳米纤维素的生物墨水中培养的鼻中隔群体的相关基因表达的定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析。

图23示出了在实例中与鼻中隔软骨细胞混合24小时内(左分图)以及在与鼻中隔软骨细胞一起培养两周后(右分图)的含纳米纤维素的生物墨水的SEM图像(从底部到顶部10、20和50μm的比例尺)。

图24呈现了在实例中使用来源于鼻中隔软骨的细胞的3D生物打印的软骨构建物的组织学分析。

具体实施方式

本说明将使得本领域的技术人员能够制造和使用本发明，并且本说明描述了本发明的若干实施例、修改、变化、替代方案、和用途。在结合任何附图参考本发明的以下详细说明时，本发明的这些和其他实施例、特征和优势对于本领域的技术人员而言将变得更明显。

如本说明书和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“该”包括复数指代物。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非另外指示，否则基于百分比的所有组成数值和范围是重量百分比。数值或条件的所有范围均意味着涵盖包含于该范围内的任何特定值，四舍五入到任何适合的小数点。

除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中使用的表达参数、反应条件、组分浓度等的所有数值应该被理解为在所有情况中被术语“约”修饰。因此，除非有相反说明，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐明的数值参数是近似值，这些近似值至少可以根据具体的分析技术而变化。

与“包括(including)”、“含有(containing)”、或“特征在于”同义的术语“包含(comprising)”是包容性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。“包含”是权利要求语言中使用的专门术语，其意指所指定的权利要求要素是必需的，但可以加入其他权利要求要素并且仍构成在权利要求范围内的概念。

如本文所使用，短语“由……组成”不包括未在权利要求书中指定的任何要素、步骤或成分。当短语“由……组成”(或其变体)出现在权利要求主体的条款中，而不是紧跟在前言之后时，该短语仅限制该条款中阐明的要素；总体上没有将其他要素排除在该权利要求之外。如本文所使用，短语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制于所指定的要素或方法步骤，加上不实质地影响所要求保护的主题的基础以及一个或多个新颖特征的那些。

关于术语“包含”、“由……组成”以及“基本上由……组成”，当在本文中使用这三个术语之一时，目前披露的且要求保护的主题可以包括使用其他两个术语中的任何一个。因此，在未以其他方式明确列举的一些实施例中，“包含”的任何实例可以被“由……组成”替代，或者可替代地被“基本上由……组成”替代。

本发明的一些变体以具有对基于挤出的3D生物打印有益的流变特性的独特的生物墨水组合物为依据。所披露的生物墨水组合物含有具有变化很大的孔径范围和可调的形貌的纳米纤维素，其模拟在组织和器官中发现的天然细胞外基质。所披露的生物墨水组合物普遍适用于各种细胞类型。

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，该生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合形式的纳米纤维素；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，该生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素原纤维形式的纳米纤维素，其中该纳米纤维素的特征在于至少240℃的热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，该生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素晶体形式的纳米纤维素，其中该纳米纤维素的特征在于至少290℃的热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

本发明的一些变体提供一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，该生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中这些纳米纤维素晶体(如果存在)的特征优选在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中这些纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征优选在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

在一些实施例中，该纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在于该生物墨水组合物中，如1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、或9.5％(全部w/v)。在某些实施例中，该纳米纤维素以从3％(w/v)至6％(w/v)的纳米纤维素浓度存在。应注意，取决于如纳米纤维素分子量、纳米纤维素粒度、生物墨水中其他组分的浓度、预期的生物结构等的因素，可以使用包括低于1％(w/v)或高于10％(w/v)的其他纳米纤维素浓度。

海藻酸盐是β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的线性共聚物。在一些实施例中，该海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在于该生物墨水组合物中，如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、或4.5％(全部w/v)。应注意，取决于如海藻酸盐分子量、生物墨水中其他组分的浓度、预期的生物结构中的交联度等的因素，可以使用包括低于0.1％(w/v)或高于5％(w/v)的其他海藻酸盐浓度。

在一些实施例中，纳米纤维素和海藻酸盐以从1％(w/v)至15％(w/v)的浓度共同存在于该生物墨水组合物中，如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、或14.5％(全部w/v)。在一些实施例中，纳米纤维素和海藻酸盐至少以4％(w/v)、至少以5％(w/v)、或至少以6％(w/v)共同存在于该生物墨水组合物中。

该生物墨水组合物中纳米纤维素与海藻酸盐的重量比可以如从1至40变化，例如1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、或35。在一些优选实施例中，该生物墨水组合物中纳米纤维素与海藻酸盐的重量比是约4(即，从3.6至4.4)或约5(即，从4.6至5.4)。

除纳米纤维素和海藻酸盐之外，水还存在于该生物墨水组合物中。当不存在除纳米纤维素、海藻酸盐、和水之外的其他组分时，水是余量(例如，3％纳米纤维素、0.75％海藻酸盐、和100-3.75＝96.25％水，全部基于w/v)。当添加剂存在于该生物墨水组合物中时，那么水含量将小于100减去纳米纤维素和海藻酸盐浓度之和。应注意，尽管该生物墨水组合物可以最初以干燥粉末前体形式提供，但水对于生物打印是必需组分(因为细胞维持和发育需要水)。通常，该生物墨水组合物明确包括水。生物打印领域技术人员将理解，存在将水加入(纳米纤维素+海藻酸盐的)干燥粉末前体中以形成该生物墨水组合物的暗含的说明，这因此可以被认为首先包括水。

在本发明的一些实施例中，该生物墨水组合物是不含细胞的生物墨水。在其他实施例中，该生物墨水组合物是含有活的人体细胞(或其他动物细胞)的负载细胞的生物墨水。在某些实施例中，这些活的人体细胞是人体鼻中隔软骨细胞。这些活的人体细胞可以以每毫升该生物墨水组合物从10⁵至10⁷个细胞的细胞浓度存在于该生物墨水组合物中，作为一个示例性实施例，例如像2×10⁶个细胞/mL。

纳米纤维素可以呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合(共混物)形式。如将在以下更详细解释的，当纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的共混物在生物墨水中使用时存在益处(通过实验观察到的；参见实例)。

纳米纤维素晶体和原纤维的共混物可以分别含有从1％至99％的纳米纤维素晶体和从99％至1％的纳米纤维素原纤维。在不同实施例中，纳米纤维素晶体和原纤维的共混物含有2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或98％(全部是重量百分比)的纳米纤维素晶体，其中剩余的纳米纤维素是纳米纤维素原纤维。

因为纳米纤维素原纤维比纳米纤维素晶体大得多，所以纳米纤维素共混物的一个特征是存在宽范围的粒度。例如，纳米纤维素晶体宽度可以从约2纳米至约10纳米，或从约3微米至约6微米变化。例如，纳米纤维素晶体长度可以从约50纳米至约500纳米，或从约100纳米至约350纳米变化。例如，纳米纤维素原纤维宽度可以从约5纳米至约100纳米，或从约10微米至约50微米变化。例如，纳米纤维素原纤维长度可以从约200纳米至约10微米，或从约400微米至约3微米变化。共混物中平均纳米纤维素颗粒宽度可以从约3纳米至约50纳米变化，如从约5纳米至约30纳米。共混物中平均纳米纤维素颗粒长度可以从约50纳米至约5微米变化，如从约100纳米至约2微米。

优选地，该纳米纤维素是含有很少木质素或不含木质素的亲水性纳米纤维素。已知木质素涂覆的纳米纤维素是至少部分疏水的，通常不希望将其用于3D生物打印。因此，在优选实施例中，该纳米纤维素含有不大于0.5wt％的木质素、优选不大于0.1wt％、更优选不大于0.01wt％的木质素、并且最优选没有可检测到的木质素。这些低水平的木质素(如果有的话)使纳米纤维素亲水，并且产生更高的粘度和持水能力，这是优选的。

该纳米纤维素的“热分解起始温度”通过纳米纤维素的热重分析来定义。热重分析，又被称为热重量分析(TGA)，是一种技术，在该技术中，当使样品样本在受控的气氛中经过受控的温度程序时，作为温度或时间的函数监测物质的质量。热重分析可以使用PerkinElmer STA6000同步热分析仪(英国伦敦)。横坐标(x轴)是温度并且纵坐标(y轴)是重量百分比(％)。下降的TGA热曲线表明发生重量损失。从TGA热曲线中，可以计算外推的起始温度，其表示重量损失开始所处的温度。外推的起始温度是可再现的温度计算结果，并且ASTM和ISO指定将其用于TGA。外推的起始是峰的前缘上最大斜率的点处画的切线与外推的基线的交点。有用的另一种计算是重量损失曲线的一阶导数。一阶导数峰值温度表示重量损失曲线上的最大变化率的点。这也被称为拐点。

出于本说明书的目的，为了测定热分解起始温度，以10℃/min的加热速率在40mL/min流动速率的氮气氛下使用PerkinElmer STA6000同步热分析仪将纳米纤维素样品从50℃加热至600℃。参见Kyle等人,“Characterization of pulp derived nanocellulosehydrogels using

technology[使用

技术的纸浆来源的纳米纤维素水凝胶的表征]”,Carbohydrate Polymers[碳水化合物聚合物]198(2018)270-280，将该文献通过援引并入本文。作为温度的函数测量纳米纤维素质量。除水损失之外的纳米纤维素质量损失表明纳米纤维素热分解。由TGA图外推的起始温度(参见以上)是估算的热分解起始温度。

在使用纳米纤维素原纤维的一些实施例中，这些纳米纤维素原纤维的特征在于至少245℃、250℃、260℃、270℃、280℃、290℃、300℃或310℃中任一个的热分解起始温度。在使用纳米纤维素晶体的一些实施例中，这些纳米纤维素晶体的特征可以在于至少295℃、300℃、310℃、320℃、330℃、或340℃中任一个的热分解起始温度。在使用纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的共混物的一些实施例中，该纳米纤维素的特征在于至少250℃、260℃、265℃、270℃、280℃、290℃、或300℃中任一个的热分解起始温度。

在不受推测限制的情况下，据信纳米纤维素热分解起始温度取决于用来制造纳米纤维素的起始木质纤维素原料、以及制造纳米纤维素的生物精制工艺条件。当将本发明的纳米纤维素与用来制造纳米纤维素的其他方法(如用于纳米晶体的硫酸水解或用来制造纳米原纤维的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基(TEMPO)处理)进行比较时，应使用相同起始原料进行比较。在纳米晶体的情况下，与相同原料的硫酸水解相比，本文提供的纳米纤维素晶体优选具有更高的热分解起始温度，并且与相同原料的TEMPO处理相比，本文提供的纳米纤维素原纤维优选具有更高的热分解起始温度。

如上所指出，热重分析还提供“热分解最大速率温度”，其是测量到最高热分解速率时所处的温度，即，一阶导数峰值温度。

在使用纳米纤维素原纤维的一些实施例中，这些纳米纤维素原纤维的特征在于至少270℃、280℃、290℃、300℃、310℃、320℃、330℃、340℃或350℃中任一个的热分解最大速率温度。在使用纳米纤维素晶体的一些实施例中，这些纳米纤维素晶体的特征可以在于至少310℃、320℃、330℃、340℃、350℃、360℃、370℃、或380℃中任一个的热分解最大速率温度。在使用纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的共混物的一些实施例中，该纳米纤维素的特征在于至少290℃、300℃、310℃、320℃、330℃、340℃、350℃或360℃中任一个的热分解最大速率温度。

该纳米纤维素优选含有小于0.05wt％的硫，如约0.02wt％的硫或更少，包括没有可检测到的硫。优选地，该纳米纤维素不含附着到纳米纤维素颗粒表面上的硫酸半酯基团，因为这些基团除降低纳米纤维素的热稳定性之外还可能赋予人体细胞毒性。

在优选实施例中，该纳米纤维素来源于在二氧化硫、乙醇、和水存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将纤维素机械精制以产生纳米纤维素。

优选地，该纳米纤维素不是细菌纳米纤维素，不来源于被囊动物，并且不经由木质纤维素生物质或纤维素的酶促水解获得。

该纳米纤维素优选具有至少-10mV或更负、或至少-20mV或更负的ζ电位(例如，-15mV、-16mV、-17mV、-18mV、-19mV、-20mV、-21mV、-22mV、-23mV、-24mV、或-25mV)。ζ电位测量(以表面电荷估算的)可以例如使用ZetasizerNanoZS(英国马尔文仪器公司(MalvernInstruments,UK))进行。ζ电位测量跨过电场的带电颗粒的迁移率。至少-20mV或更负的ζ电位帮助纳米纤维素悬浮液形成稳定的胶体凝胶。

该纳米纤维素优选是剪切稀化的，使得生物墨水可以便利地经由挤出进行3D打印。在流变学中，剪切稀化是其粘度在剪切应变下降低的流体的非牛顿行为。

该生物墨水组合物可以进一步包含离子交联剂，典型地在稍后的时间在希望海藻酸盐交联时加入该离子交联剂。在一些实施例中，该离子交联剂包括二价阳离子，如(但不限于)选自下组的二价金属阳离子，该组由以下各项组成：Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、及其组合成。尽管不是必需的，阳离子典型地以中性盐存在；例如，Ca²⁺可以以氯化钙CaCl₂存在。其他二价金属阳离子在技术上起到交联海藻酸盐的作用，如Pb²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、和Mn²⁺，但由于毒性这些是较不优选的。离子交联剂还可以使用二价有机阳离子。

海藻酸盐的凝胶化和交联主要通过来自古洛糖醛酸的钠离子与二价阳离子交换来实现。二价阳离子与α-L-古洛糖醛酸嵌段以高度协作的方式结合，并且协作单元的大小典型地不超过20个单体。每个海藻酸盐链可以二聚化以形成与许多其他链的连接，从而形成凝胶网络而非不溶性沉淀物。

在不同实施例中，生物墨水组合物进一步包含选自下组的一种或多种生物墨水添加剂，该组由以下各项组成：生长促进剂、生长因子、维生素、矿物质、酶、蛋白质、糖(例如，葡萄糖)、糖醇(例如，甘露糖醇)、酸、碱、盐(例如，氯化钠)、缓冲剂、稳定剂、溶解氧、以及抗生素。添加剂(如果有的话)的量将总体上由在负载细胞的生物墨水中包括的细胞的类型和预期的3D生物结构来决定。可以包括酸、碱、和缓冲剂，以维持生物墨水的希望的pH，如从约6至约8、或从约6.5至约7.5的pH。

所披露的生物墨水组合物是对人体细胞、或至少待生物打印的所选择的人体细胞非细胞毒性的。本文参照实例进一步讨论细胞毒性。

可以以预包装、预灭菌的形式提供生物墨水组合物。在一些实施例中，将生物墨水组合物预包装，但没有灭菌，带有在生物打印前在稍后的时间灭菌(例如，在蒸汽高压釜中)的说明书。预包装可以在小容器、管、小瓶、广口瓶、袋中，并且预包装材料可以是玻璃、塑料、涂覆的纸、等。在某些实施例中，以干燥的形式或至少以降低的水含量提供生物墨水组合物，带有在生物打印前将水加入组合物中的说明书。在一些实施例中，生物墨水组合物是包括预包装的、预灭菌的生物墨水以及为特定细胞类型和/或特定生物结构定制的生物打印说明书的试剂盒的一部分。

所披露的生物墨水组合物具有对生物打印有益的流变特性并且产生具有相互连接的致密的高纵横比纳米颗粒和对细胞进入和维持有利的孔径的多孔原纤网络。孔和纤维网络是对组织工程应用有利的。可逆的应力软化行为使得能够在给予打印后形状保真度的同时，在生物打印期间剪切稀化(例如，通过喷嘴)。本文提供的生物墨水是可打印的，能够保持复杂的宏观结构，并且能够提供细胞可以在其中茁壮成长并分化的环境。

这些生物墨水组合物的流变特性特别对于挤出生物打印是理想的。剪切稀化(拟弹性)行为允许以低剪切速率流动穿过生物打印机喷嘴，降低施加到细胞上的机械应力。高的零剪切粘度维持生物打印后的形状保真度，并且防止复杂的3D生物打印的构建物的坍塌。

生物墨水组合物和3D生物结构的特征可以在于宽的形貌范围。特别地，可变的孔径(如从约10纳米至约100微米、或从约50纳米至约10微米)支持各种各样的细胞类型。广泛的形貌模拟细胞外基质中的天然胶原蛋白纤维大小，以增加对细胞的生物活性信号。而且，可调的形貌(作为纳米纤维素的类型和量的函数)提供为特定细胞类型定做生物墨水的能力。

生物墨水组合物的特征可以是有益的膨胀特性。优选地，生物墨水含有合适的纳米纤维素和离子交联剂浓度以允许在维持打印后形状保真度的同时，在标准培养条件下细胞营养足够膨胀。一旦生物打印为特定的3D生物结构，所得生物材料耐受培养中的膨胀或收缩，提供可再现的结果。

由于如以上所描述的包含耐热的纳米纤维素，所以生物墨水组合物是耐热的。这种特性允许在121℃高压釜灭菌，并且允许在室温(而不是更低的温度)生物打印，并且使得在如37℃的生物学上最佳温度下的细胞培养成为可能。当在标准培养条件下和在人体体温下时，纳米纤维素不瓦解。

应注意，所披露的生物墨水组合物可用作已用于特定细胞类型培养的当前水凝胶的流变改性剂—由此使先前不可打印的水凝胶可打印。一些实施例提供一种用于3D生物打印的生物墨水添加剂，该生物墨水添加剂包含：

(a)呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中这些纳米纤维素晶体(如果存在)的特征在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中这些纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)任选地水，

其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

可以将本发明的原理应用于除海藻酸盐之外的可交联聚合物。例如，代替海藻酸盐或除海藻酸盐之外，还可以在生物墨水组合物中包括可交联的天然聚合物，其选自明胶、结冷胶、透明质酸、纤维蛋白原、胶原蛋白、壳聚糖、或羟基磷灰石。而且，代替海藻酸盐或除海藻酸盐之外，还可以在生物墨水组合物中包括可交联的合成聚合物，其选自聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-共-乙醇酸、聚乙二醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、或聚氨酯。可以在生物墨水组合物中包括一种或多种可交联的天然聚合物和/或一种或多种可交联的合成聚合物的组合。应注意，交联可以是离子交联、共价交联、酶介导的交联、或其组合。在共价交联的情况下，交联可以典型地用UV或可见光完成(被称为光交联)。可交联的合成聚合物典型地经由光交联进行交联，但是可以改性可交联的天然聚合物以使得它们也是可光交联的。例如，可以在生物墨水组合物中包括改性的天然聚合物，其选自甲基丙烯酸酯化的海藻酸盐、明胶甲基丙烯酰(gelatin methacryloyl)、甲基丙烯酸酯化的结冷胶、甲基丙烯酸酯化的透明质酸、甲基丙烯酸酯化的硫酸软骨素、甲基丙烯胺(methacrylamine)壳聚糖、或甲基丙烯酸酯化的右旋糖酐。

本发明的其他变体提供一种制造用于3D生物打印的生物墨水组合物的方法，该方法包括：

(a)获得呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中这些纳米纤维素晶体(如果存在)的特征在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中这些纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)将该纳米纤维素与海藻酸盐在水溶液中组合，其中该海藻酸盐呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐的形式，并且其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的；

(c)将该水溶液灭菌；

(d)任选将多种活的人体细胞加入该水溶液；以及

(e)将该水溶液回收作为用于3D生物打印的生物墨水组合物。

在一些实施例中，该纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在于该生物墨水组合物中。在这些或其他实施例中，该海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在于该生物墨水组合物中。

优选地，在步骤(a)中，该纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇(和水)存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将纤维素机械精制以产生该纳米纤维素。

在一些优选实施例中，该纳米纤维素呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合(共混物)形式。

在一些实施例中，在步骤(c)中，灭菌使用选自下组的技术，该组由以下各项组成：蒸汽灭菌、UV灭菌、乙醇(或另一种醇)灭菌、及其组合。蒸汽灭菌可以例如在121℃温度和100kPa压力的高压釜中进行30分钟。UV灭菌可以使用暴露于254nm波长的UV-C杀菌光60分钟，该杀菌光由产生紫外(UV-C)光的杀菌灯发射。这种短波紫外光破坏DNA碱基配对，引发嘧啶二聚体形成，并且导致细菌和病毒灭活。乙醇灭菌可通过在70vol％乙醇中浸没30分钟来进行。

在步骤(c)中，优选在组合之前分别将纳米纤维素(或含有纳米纤维素的液体溶液)和海藻酸盐(或含有海藻酸盐的液体溶液)灭菌。应注意，因为海藻酸盐是热敏的，所以对于海藻酸盐不优选通过蒸汽灭菌进行灭菌。海藻酸盐优选UV灭菌和/或乙醇灭菌(或通常地，醇灭菌)，而不是蒸汽灭菌。在一些实施例中，将纳米纤维素蒸汽灭菌，而将海藻酸盐UV灭菌。可替代地，或此外，在步骤(c)中，可以如通过UV灭菌(具有纳米纤维素和海藻酸盐二者的)整个水溶液的薄层来将整个水溶液灭菌。

出于本披露的目的，因为预计在单个灭菌步骤与制造水溶液的时间之间没有污染，所以分别将纳米纤维素灭菌并且将海藻酸盐灭菌、然后组合到单一水溶液中提供了灭菌的水溶液。然而，因为灭菌会杀死活的细胞，所以灭菌步骤应该在步骤(d)之前进行。

所产生的生物墨水组合物可以是不含细胞的生物墨水或负载细胞的生物墨水。在一些实施例中，该生物墨水组合物是含有活的人体细胞、如(但不限于)人体鼻中隔软骨细胞的负载细胞的生物墨水。活的人体细胞可以以例如每毫升该生物墨水组合物从10⁵至10⁷个细胞的细胞浓度存在于该生物墨水组合物中。

应注意，步骤(a)、(b)、(c)、(d)、和(e)可以全部在相同或不同位置并且在相同或不同时间进行。例如，步骤(a)和(b)可形成储存一段时间的非灭菌溶液。步骤(c)可以稍后进行，或者可由购买纳米纤维素/海藻酸盐溶液的顾客进行。步骤(d)可以与步骤(c)在相同的时间和位置进行，或者可以稍后进行和/或由另一方进行。在一些实施例中，步骤(a)-(e)全部由一方进行，该方将用于3D生物打印的负载细胞的生物墨水组合物销售给随后进行3D生物打印的另一方。

其他变体提供一种制造3D打印的生物结构的方法，该方法包括：

(a)获得呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中这些纳米纤维素晶体(如果存在)的特征在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中这些纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)将该纳米纤维素与海藻酸盐在水溶液中组合，其中该海藻酸盐呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐的形式，并且其中该海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的；

(c)将该水溶液灭菌；

(d)将多种活的人体细胞加入该水溶液，以形成负载细胞的生物墨水；

(e)将多层的该负载细胞的生物墨水沉积到基材或表面上；

(f)在步骤(e)期间和/或在步骤(e)之后将该多层的该负载细胞的生物墨水暴露于离子交联剂，以离子交联该海藻酸盐；以及

(g)回收含有该多层的该负载细胞的生物墨水的3D打印的生物结构。

在一些实施例中，该纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在于该负载细胞的生物墨水中。在这些或其他实施例中，该海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在于该负载细胞的生物墨水中。

优选地，该纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇(和水)存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将纤维素机械精制以产生该纳米纤维素。

在一些优选实施例中，该纳米纤维素呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合(共混物)形式。

步骤(c)可以使用选自下组的灭菌技术，该组由以下各项组成：蒸汽灭菌、UV灭菌、乙醇灭菌、及其组合。

在一些实施例中，这些活的人体细胞是人体鼻中隔软骨细胞，并且该3D打印的生物结构含有人体软骨。

在一些实施例中，步骤(e)中的沉积使用挤出(即，基于挤出的3D生物打印)。

基材或表面可以是可以将第一层生物墨水生物打印到其上的材料的任何合适区域。基材或表面可以是生物纸、纤维素衍生的纸、惰性聚合物、玻璃、纳米纤维素层、或由生物墨水自身形成的材料层。在某些实施例中，不存在初始的基材；使用将第一层机械地保持在适当位置的装置将第一生物墨水层作为无支撑层沉积在溶液中、或空间中。然后该第一生物墨水层充当额外的层的基材。

在一些实施例中，在步骤(f)中，在形成该多层的该负载细胞的生物墨水的每个之间进行交联。在某些实施例中，在形成该负载细胞的生物墨水的层的一些但非全部之间进行交联。在这些或其他实施例中，在步骤(f)中，在形成该多层的该负载细胞的生物墨水的全部之后进行交联。应注意，交联的此最终步骤可以替代逐层交联，或者可以增大这种交联。

该离子交联剂可以包括二价阳离子，如Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、或其组合。

在一些实施例中，步骤(f)使用该离子交联剂的气溶胶，其中将该气溶胶连续地或周期性地暴露于该多层的该负载细胞的生物墨水。在相关实施例中，步骤(f)使用该离子交联剂的加热的蒸气，其中将该加热的蒸气连续地或周期性地暴露于该多层的该负载细胞的生物墨水。取决于离子交联剂的挥发性，可以优选的是使用气溶胶而非加热的蒸气，以保证离子交联剂与生物墨水层之间的良好接触。

步骤(f)可以使用从约1秒至约10分钟的交联时间，如约2、5、10、15、20、30、或45秒，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10分钟。在一些实施例中，存在与每个层的部分交联，并且然后在沉积全部的层之后存在完全交联。在那些实施例中，例如，每个层的交联时间可以是约1-30秒，而最终交联时间(已沉积全部的层之后)可以是约1-5分钟。

可替代地，或此外，步骤(f)可以使用将一个或多个生物墨水层浸没到含有离子交联剂的液体溶液中。用于交联的浸没时间可以是例如从约1分钟至约1小时。

该3D打印的生物结构的特征可以在于紧密分散在离子交联的海藻酸盐内的相互连接的致密纳米纤维素颗粒的多孔3D网络。

优选地，3D打印的生物结构含有如从约100纳米至约10微米的纳米纤维素孔径范围。在一些实施例中，纳米纤维素结构含有小到55纳米并且大到12微米的孔径。在不同实施例中，纳米纤维素结构含有选自以下各项的至少两个孔径：约50nm、75nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、或15。平均孔径可以是例如约300纳米至约3微米。

最终的3D打印的生物结构可以选自下组，该组由以下各项组成：耳、鼻、软骨关节、气管环、喉、肋软骨条、或其一部分。该3D打印的生物结构可以是任意几何形状。

制造3D打印的生物结构的方法的步骤可以连续、半连续、间歇、或半间歇进行。

在一些变体中，3D生物打印过程使用六种输入。

第一输入是计算机辅助设计(CAD)文件，其是组织或器官的蓝图，为具有待生物打印的活细胞的生物墨水的精确定位提供几何(空间)信息。此第一输入可以被称为预加工，并且可以使用核磁共振成像(MRI)、计算机断层摄影术(CT)扫描、或组织学研究、和/或其他计算技术。组织学研究可以单独进行或与生物成像集成。

第二输入是负载细胞的生物墨水，其是至少含有纳米纤维素和待打印的组织或器官的活的细胞的制备溶液。生物墨水可以包括例如可以分化成所需要的组织或器官的细胞的干细胞(例如，脂肪来源的干细胞、间充质干细胞、软骨干细胞/祖细胞等)、或特定细胞(如可以特定地产生皮肤组织的人体皮肤成纤维细胞)、或可以特定地产生软骨的软骨细胞。可以将各种其他生物相容的材料(如抗生素和细胞生长补充物)加入生物墨水中。

任选的第三输入是生物纸。生物纸是用于生物墨水的支撑材料，并且可以含有胶原蛋白、营养物、生长因子、和其他稳定剂。在混合上述组分之后，可以将混合物冷却到特定温度直到该混合物达到凝胶状稠度。生物纸提供支持细胞生长和发育的环境，而不妨碍自组装。应注意，生物墨水可以沉积到除生物纸之外的另一基材或表面(或支架)上。还应注意，在某些实施例中，生物纸自身含有纳米纤维素。

第四输入是生物打印机，其是用于将生物墨水以三维(3D)形式打印出来的设备。生物打印机可以使用选自立体平板印刷、基于挤出的打印、激光辅助打印、基于喷墨的打印、或纳米生物打印的3D生物打印技术。在优选实施例中，生物打印机是基于挤出的生物打印机。挤出可以例如经由注射器状喷嘴或小型挤出机进行。生物打印机遵循来自CAD文件的指令，并且分配典型地来自预填充的生物墨盒的生物墨水，以打印希望的组织或器官构建物。

任选的第五输入是一个或多个生物墨盒。生物墨盒是封闭待打印的生物墨水的容器。生物墨盒可以由任何合适的材料(如塑料)和任何合适的几何形状(如圆柱形小瓶或管)形成。生物墨盒可以含有预灭菌的生物墨水、或非灭菌的生物墨水(可以将其随后灭菌)。生物墨盒可以含有不含细胞的生物墨水或负载细胞的生物墨水。在一些实施例中，例如，将仅含有细胞溶液的生物墨盒与含有不含细胞的生物墨水的其他生物墨盒组合，以形成进料到生物打印机的负载细胞的生物墨水。

任选的第六输入是生物反应器。生物反应器是被配置成用于复制或实现相关生物环境(例如，温度、pH、生长因子、传热和传质等)以使在3D打印的生物结构中含有的细胞进一步发育和调节从而产生组织或器官的物理装置。化学和生物力学调节通常在生物反应器中同等重要。在生物反应器中，维持3D打印的生物结构直到它变得足够成熟以被移植到人体的目标区域上。可以操作生物反应器直到生物墨水形成细胞球体、细胞圆柱体、或细胞的另一种相关组织学形式。在某些实施例中，生物反应器是人体内的体内区域，即，在适合于将3D打印的生物结构直接置于细胞可能进一步生长并调节的目标区域中的时候。

在本发明的一些变体中，3D生物打印的过程包括从人体组织中分离细胞、并在培养中扩增以包括在负载细胞的生物墨水中的步骤。生物墨水可以微尺度(例如，1-100微米)或大尺度(例如，毫米或厘米)使用3D生物打印机以三维形式生物打印，以形成中等的3D生物结构。中等的3D生物结构可以在生物反应器中培养直到组织成熟，从而形成成熟的3D生物结构。

中等或成熟的3D生物结构可以用作用于化妆品测试的皮肤，作为动物测试的替代物。中等或成熟的3D生物结构可以用作生物打印的类器官(微小的、自组织的三维组织培养物)，如肾脏或肝脏类器官，作为动物测试的替代物。成熟的3D生物结构可以用于外科植入组织，如用于创伤、恶性肿瘤切除术、或先天性疾病后缺陷的外科重建的软骨或皮肤。成熟的3D生物结构可以用于外科植入器官，如肾脏、肝脏或心脏，以克服供体器官的短缺。

本发明还提供了一种包含多个层的3D打印的生物结构，其中每个层含有(i)呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合形式的纳米纤维素、(ii)离子交联的海藻酸盐(例如，经由二价金属阳离子)、以及(iii)多种活的人体细胞，其中该3D打印的生物结构的特征在于密切分散在离子交联的海藻酸盐内的纳米纤维素的相互连接的致密纳米棒的多孔3D网络，并且其中活的人体细胞含有在多孔3D网络上和/或其内。

在该3D打印的生物结构中，存在与(生物墨水中的)纳米纤维素相关的多个长度尺度和孔径。该3D打印的生物结构中的纳米纤维素优选特征在于如以上所讨论的高热分解起始温度。人体细胞可以是人体鼻中隔软骨细胞。该3D打印的生物结构可以含有人体软骨。该3D打印的生物结构可以选自下组，该组由以下各项组成：耳、鼻、软骨关节、气管环、喉、肋软骨条、或其一部分。该3D打印的生物结构可以是任意几何形状。

该3D打印的生物结构转变成功能组织可以在体外作为基于生物反应器的培养通过使用各种生理条件和生长因子组合来进行，或者在体内通过植入该3D打印的生物结构来进行，允许接替退化的自然趋势的原位生长。在某些实施例中，该3D打印的生物结构已经是功能的，所以不必需使用生物反应器。

纳米纤维素被认为是生物相容的。在许多应用中，本发明是随时间推移(例如，数天、数周、数月、或可能数年)，纳米纤维素自然降解并且在某一时间点不再存在，被细胞基体(例如，软骨基体)替代。值得注意的是，将预期纳米纤维素体内水解仅产生对人体无毒的葡萄糖，因为纳米纤维素本质上是葡萄糖的长聚合物。

应用包括，但绝不限于，外科和医疗伤口敷料、乳房重建、面部重建、耳重建、以及与臀部或膝盖有关的软骨重建。细胞、组织、类器官、和器官可以使用本文的披露内容进行3D生物打印。3D生物结构可以用于研究信号通路和对毒素的天然细胞响应。作为动物测试的替代物，类器官和组织对于测试药物和化妆品是有用的。用于植入的组织和器官可以消除供体位点并发症并且克服器官供体的短缺。

纳米纤维素生产和表征

纳米纤维素和相关材料可以在包括与

生物炼制工艺(其在以下进一步详细讨论)相关的工艺条件和步骤的某些条件下生产。已发现，在不需要酶促处理或单独的酸处理步骤以水解无定形纤维素的情况下，可以在形成纳米纤维或纳米晶体的过程中产生并且维持非常高的纤维素结晶度。高结晶度可以解释为在机械上强的纤维或良好的物理增强特性，这对于生物墨水流变特性和生物结构机械特性是有利的。

产生纤维素纳米原纤维(CNF)的重要技术经济障碍是高能耗和高成本。使用二氧化硫(SO₂)和乙醇(或其他溶剂)，本文所披露的预处理不仅有效地将半纤维素和木质素从生物质中去除，而且去除纤维素的无定形区域，从而得到需要最小机械能来转化成CNF的独特、高度结晶的纤维素产物。低机械能需要由在去除纤维素的无定形区域后在化学预处理过程中形成的原纤化纤维素网络引起。

如本文所预期的，“纳米纤维素”被广泛地定义成包括一系列纤维素材料，包括但不限于微原纤化纤维素、纳米原纤化纤维素、微晶纤维素、纳米晶体纤维素、以及微粒化或原纤化的溶解浆。典型地，如本文所提供的纳米纤维素将包括在纳米尺度上具有至少一个长度尺寸(例如，直径)的颗粒。

“纳米原纤化纤维素”或等同地“纤维素纳米原纤维”(CNF)或“纳米纤维素原纤维”意指含有微米大小的颗粒或纤维、或微米大小和纳米大小的颗粒或纤维两者的纤维素纤维或区域。“纳米晶体纤维素”或等同地“纤维素纳米晶体”(CNC)或“纳米纤维素晶体”意指含有纳米大小的域的纤维素颗粒、区域、或晶体。“微米大小”包括从1μm至100μm并且“纳米大小”包括从0.1nm至1000nm(1μm)。

纳米纤维素的具体大小可以是无论在宽度和/或长度上在从纳米尺度直到微米尺度的范围。纤维素纳米原纤维典型地具有在宽度上约10-50nm以及在长度上约500-2000nm的尺寸，并且含有纤维素的无定形域和结晶域二者。纤维素纳米晶体典型地具有约3-8nm的宽度和约100-300nm的长度，并且主要是结晶的。虽然这些范围和尺寸是典型的，但是可以存在(包括长纤维的)其他粒度。粒度可以通过动态光散射、原子力显微镜、透射电子显微镜、小角X射线衍射、或其他技术来测量。

通常，以有效地将主级分(纤维素、半纤维素和木质素)彼此分离的方式加工生物质是有益的。可以使纤维素受到进一步加工以产生纳米纤维素。对木质纤维素的分级分离引起纤维素纤维的释放，并且通过将木质素和半纤维素溶解在纤维素微原纤维之间来打开细胞壁结构。纤维变得更容易转化成纳米原纤维或纳米晶体。半纤维素糖可以被发酵成各种产品(诸如乙醇)或转化成其他化学品。来自生物质的木质素具有作为固体燃料而且作为能源原料以生产液体燃料、合成气或氢气；以及作为中间体以制备各种聚合化合物的价值。另外，可以提取微量组分诸如蛋白质或稀有糖并且对其进行纯化以用于特种应用。

以下示例性实施例不旨在限制所要求保护的本发明的范围。步骤的顺序可以改变，可以省略一些步骤，和/或可以增加其他步骤。本文中参考第一步、第二步等是出于仅说明一些实施例的目的。

在一些实施例中，纳米纤维素来源于选自下组的生物质源，该组由以下各项组成：硬木、软木、农业残留物、未漂白的化学浆、漂白的化学浆、热机械浆、及其组合。

在一些实施例中，纳米纤维素由在酸、用于木质素的溶剂、和水存在下将生物质分级分离获得，以产生富含纤维素的固体和液相；并且然后机械精制富含纤维素的固体，以产生纳米纤维素。在某些实施例中，酸是二氧化硫并且溶剂是乙醇。在某些实施例中，使用

工艺来制造纳米纤维素。

在一些变体中，用于产生纳米纤维素材料的方法包括：

(a)提供木质纤维素生物质原料；

(b)在酸、用于木质素的溶剂以及水的存在下将原料分级分离，以产生富含纤维素的固体以及含有半纤维素和木质素的液体；

(c)机械处理富含纤维素的固体以形成纤维素原纤维和/或纤维素晶体，从而产生具有至少60％结晶度(即，纤维素结晶度)的纳米纤维素材料；以及

(d)回收纳米纤维素材料。

在一些实施例中，酸选自下组，该组由以下各项组成：二氧化硫、亚硫酸、三氧化硫、硫酸、木质素磺酸、及其组合。在具体实施例中，酸是二氧化硫。

生物质原料可以选自硬木、软木、森林残留物、桉树、工业废弃物、纸浆和纸张废弃物、消费废弃物或其组合。一些实施例使用农业残留物，这些农业残留物包含与食用作物、一年生牧草、能源作物或其他每年可再生原料相关联的木质纤维素生物质。示例性农业残留物包括但不限于玉米秸秆、玉米纤维、小麦秸秆、甘蔗渣、甘蔗秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆、大麦秸秆、芒草、能源甘蔗秸秆/残留物或其组合。本文披露的方法受益于原料灵活性；该方法对于各种各样的含纤维素原料是有效的。

如本文所使用，“木质纤维素生物质”意指含有纤维素和木质素的任何材料。木质纤维素生物质还可以含有半纤维素。可以使用一种或多种类型的生物质的混合物。在一些实施例中，生物质原料包含除了含蔗糖的组分(例如，甘蔗或能源甘蔗)和/或淀粉组分(例如，玉米、小麦、水稻等)以外的木质纤维素组分(诸如上述的一种)。不同湿度水平可以与起始生物质相关联。生物质原料不需要是，但可以是相对干燥的。通常，生物质呈微粒或碎片的形式，但粒度在本发明中不是关键的。

步骤(c)中的机械处理可以采用一种或多种已知技术，诸如但绝不限于碾磨、研磨、敲打、超声处理、高压冲击、高剪切或任何其他手段以在纤维素中形成或释放纳米原纤维和/或纳米晶体。本质上，可以使用任何类型的以物理方式分开纤维的碾磨机或设备。此类碾磨机是工业中熟知的，并且包括但不限于瓦利打浆机、单盘磨浆机、双盘磨浆机、锥形磨浆机(包括广角和窄角)、圆柱式磨浆机、均质机、微型流化器以及其他类似的碾磨或研磨装置。参见，例如，Smook,Handbook for Pulp&Paper Technologists[纸浆与造纸技术手册],Tappi出版社,1992；以及Hubbe等人,“Cellulose Nanocomposites:A Review[纤维素纳米复合物：综述]”BioResources[生物资源]3(3),929-980(2008)。

可以通过任何若干种手段在方法的过程中监测机械处理的程度。某些光学仪器可以提供关于纤维长度分布和细粒％的连续数据，该纤维长度分布和细粒％中的任一个可以被用于限定机械处理步骤的终点。时间、温度和压力可以在机械处理过程中变化。例如，在一些实施例中，可以使用在环境温度和压力下的超声处理持续从约5分钟至2小时的时间。

在一些实施例中，一部分富含纤维素的固体被转化成纳米原纤维，而剩余的富含纤维素的固体未被原纤化。在不同实施例中，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或基本上全部的富含纤维素的固体被原纤化为纳米原纤维。

在一些实施例中，一部分纳米原纤维被转化成纳米晶体，而剩余的纳米原纤维未被转化成纳米晶体。在不同实施例中，约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或基本上全部的纳米原纤维被转化成纳米晶体。在干燥过程中，少量的纳米晶体可能回到一起并且形成纳米原纤维。

在机械处理之后，可以通过粒度对纳米纤维素材料进行分类。可以使一部分材料受到单独的过程(诸如酶促水解)以产生葡萄糖。此种材料可以例如具有良好的结晶度，但可以不具有希望的粒度或聚合度。

步骤(c)可以进一步包括使用一种或多种酶或使用一种或多种酸对富含纤维素的固体进行处理。当采用酸时，这些酸可以选自下组，该组由以下各项组成：二氧化硫、亚硫酸、木质素磺酸、乙酸、甲酸、及其组合。与半纤维素相关联的酸(如乙酸或糖醛酸)可以单独地或结合其他酸采用。另外，步骤(c)可以包括使用热量对富含纤维素的固体进行处理。在一些实施例中，步骤(c)并未采用任何酶或酸。

在步骤(c)中，当采用酸时，酸可以是强酸，例如像硫酸、硝酸或磷酸。可以在更苛刻的温度和/或时间下采用更弱的酸。可以代替酸或可以在酸性水解之前或之后以顺序配置在步骤(c)中采用水解纤维素(即，纤维素酶)和可能地半纤维素(即，具有半纤维素酶活性)的酶。

在一些实施例中，方法包括酶促处理富含纤维素的固体以水解无定形纤维素。在其他实施例中，或顺序地在酶促处理之前或之后，方法可以包括酸处理富含纤维素的固体以水解无定形纤维素。

在一些实施例中，方法进一步包括酶促处理纳米晶体纤维素。在其他实施例中，或顺序地在酶促处理之前或之后，方法进一步包括酸处理纳米晶体纤维素。

如果希望，可以在机械处理之前或可能地与机械处理同时采用酶促处理。然而，在优选实施例中，不进行酶处理来水解无定形纤维素或在分离纳米纤维之前使纤维壁结构变弱。

在机械处理之后，可以回收纳米纤维素。可以使用能够瓦解细胞壁的超微结构同时保存纳米原纤维的完整性的装置来完成对纤维素纳米原纤维和/或纳米晶体的分离。例如，可以采用均质机。在一些实施例中，回收具有1-100nm范围内宽度的组分原纤维的纤维素聚集原纤维，其中原纤维尚未彼此完全分开。

方法可以进一步包括在步骤(c)之前和/或作为步骤(c)的部分对富含纤维素的固体进行漂白。可替代地，或此外，方法可以进一步包括在步骤(c)过程中和/或在步骤(c)之后对纳米纤维素材料进行漂白。可以采用任何已知的漂白技术或顺序，包括酶促漂白。

在一些实施例中，使用标准纸浆和纸D0EpD1漂白顺序(二氧化氯、氢氧化钠和过氧化氢、以及二氧化氯)将所筛选的纸浆漂白。每个步骤可以间歇或连续模式使用合适的工艺设备(贮存槽、化学混合器、等)进行。可以在漂白阶段之间通过用造纸厂水将纸浆稀释到如约4wt％固体并在离心机中浓缩回约15wt％固体进行水洗。优选在最终漂白阶段之后进行多次洗涤。

纳米纤维素材料可以包括纳米原纤化纤维素或基本上由其组成。纳米纤维素材料可以包括纳米晶体纤维素或基本上由其组成。在一些实施例中，纳米纤维素材料可以包括纳米原纤化纤维素和纳米晶体纤维素或基本上由其组成。

在一些实施例中，富含纤维素的固体(即，纳米纤维素前体材料)的结晶度是至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％或更高。在这些或其他实施例中，纳米纤维素材料的结晶度是至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％或更高。可以使用任何已知技术来测量结晶度。例如，可以使用X射线衍射和固态¹³C核磁共振。

在一些实施例中，纳米纤维素材料的特征在于从约100至约1500的平均聚合度，诸如约125、150、175、200、225、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300或1400。例如，纳米纤维素材料的特征可以在于从约300至约700、或从约150至约250的平均聚合度。当呈纳米晶体的形式时，纳米纤维素材料可以具有小于100的聚合度，诸如约75、50、25或10。部分材料可以具有高于1500的聚合度，诸如约2000、3000、4000或5000。

在一些实施例中，纳米纤维素材料的特征在于具有单峰的聚合度分布。在其他实施例中，纳米纤维素材料的特征在于具有双峰的聚合度分布，诸如一个峰集中在150-250的范围内并且另一个峰集中在300-700的范围内。

在一些实施例中，纳米纤维素材料的特征在于从约10至约1000的平均颗粒长度与宽度纵横比，诸如约15、20、25、35、50、55、60、75、100、150、200、250、300、400或500。与纳米晶体相比，纳米原纤维通常与更高的纵横比相关联。例如，纳米晶体可以具有约100nm至500nm的长度范围和约4nm的直径，这转化成25至125的纵横比。纳米原纤维可以具有约2000nm的长度和5至50nm的直径范围，这转化成40至400的纵横比。在某些示例性实施例中，纳米晶体的纵横比是约50，并且纳米原纤维的纵横比是约55。

任选地，方法进一步包括在步骤(b)和/或步骤(c)中将无定形纤维素水解为葡萄糖，回收葡萄糖，并且将葡萄糖发酵成发酵产物。任选地，方法进一步包括回收、发酵或进一步处理来源于半纤维素的半纤维素糖。任选地，方法进一步包括回收、燃烧或进一步处理木质素。

由无定形纤维素的水解产生的葡萄糖可以结合到整个方法中以产生乙醇或另一种发酵副产物。因此，在一些实施例中，方法进一步包括在步骤(b)和/或步骤(c)中将无定形纤维素水解为葡萄糖，并且回收葡萄糖。可以纯化葡萄糖并且将其出售。或者，葡萄糖可以被发酵成发酵产物，诸如但不限于乙醇。葡萄糖或发酵产物可以被再循环到前端，诸如如果希望，再循环到半纤维素糖加工。

当半纤维素糖被回收并且发酵时，它们可以被发酵以产生其单体或前体。单体可以被聚合以产生聚合物，该聚合物然后可以与纳米纤维素材料组合以形成聚合物-纳米纤维素复合物(例如，聚交酯-纳米纤维素复合物)。

在一些实施例中，纳米纤维素材料通过在步骤(b)过程中将至少一些木质素沉积到富含纤维素的固体表面上而为至少部分疏水性的。在这些或其他实施例中，纳米纤维素材料通过在步骤(c)或步骤(d)过程中将至少一些木质素沉积到纳米纤维素材料表面上而为至少部分疏水性的。在生物墨水的优选实施例中，纳米纤维素是亲水性的，并且不含有显著浓度的木质素。

某些变体提供一种用于产生纳米纤维素材料的方法，该方法包括：

(a)提供木质纤维素生物质原料；

(b)在二氧化硫、用于木质素的溶剂以及水的存在下将原料分级分离，以产生富含纤维素的固体以及含有半纤维素低聚物和木质素的液体，其中富含纤维素的固体的结晶度是至少70％，其中SO₂浓度是从约10wt％至约50wt％，分级分离温度是从约130℃至约200℃，并且分级分离时间是从约30分钟至约4小时；

(c)机械处理富含纤维素的固体以形成纤维素原纤维和/或纤维素晶体，从而产生具有至少70％结晶度的纳米纤维素材料；以及

(d)回收纳米纤维素材料。

在一些实施例中，SO₂浓度是从约12wt％至约30wt％。在一些实施例中，分级分离温度是从约140℃至约170℃。在一些实施例中，分级分离时间是从约1小时至约2小时。

在不同实施例中，纳米纤维素组合物不来源于被囊动物或细菌纤维素。在某些实施例中，纳米纤维素组合物不含酶或酶来源的片段。

在一些变体中，本发明还提供一种用于生产含纳米纤维素的产品的方法，该方法包括：

(a)提供木质纤维素生物质原料；

(b)在酸、用于木质素的溶剂以及水的存在下将原料分级分离，以产生富含纤维素的固体以及含有半纤维素和木质素的液体；

(c)机械处理富含纤维素的固体以形成纤维素原纤维和/或纤维素晶体，从而产生纳米纤维素材料；以及

(d)将至少一部分纳米纤维素材料并入到含纳米纤维素的产品(例如，含纳米纤维素的生物墨水组合物)中。

含纳米纤维素的产品包括纳米纤维素材料或其经过处理的形式。在一些实施例中，含纳米纤维素的产品基本上由纳米纤维素材料组成。

在一些实施例中，步骤(d)包括形成包含纳米纤维素材料或其衍生物的构造体(structural object)(例如，生物结构)。

因为对纳米纤维素不进行预处理后改性，有可能由于表面羟基和负表面电荷而功能化。不希望受理论限制，纳米纤维素可以适合于基于化学共轭和静电吸附的蛋白质固定化，以增强细胞附着、迁移、增殖和分化。

生物炼制工艺

现将在一些变体中进一步描述

生物炼制工艺。

在一些实施例中，第一方法步骤是“蒸煮”(等同地，“消化”)，该蒸煮将三种木质纤维素材料组分(纤维素、半纤维素和木质素)分级分离以允许容易的下游去除。特别地，溶解半纤维素并且超过50％完全水解；分离纤维素但保持耐水解；并且将部分木质素磺化为水溶性木质素磺酸盐。

在脂肪醇、水和二氧化硫的溶液(蒸煮液)中加工木质纤维素材料。蒸煮液优选地含有至少10wt％，诸如至少20wt％、30wt％、40wt％或50wt％的用于木质素的溶剂。例如，蒸煮液可以含有约30wt％-70wt％溶剂，诸如约50wt％溶剂。用于木质素的溶剂可以是脂肪醇，诸如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、1-戊醇、1-己醇或环己醇。用于木质素的溶剂可以是芳香醇，诸如苯酚或甲酚。其他木质素溶剂是可能的，诸如(但不限于)甘油、甲基乙基酮或二乙醚。可以采用多于一种溶剂的组合。

优选地，在提取剂混合物中包含足够的溶剂以溶解存在于起始材料中的木质素。用于木质素的溶剂可以是与水完全可混溶、部分可混溶或不可混溶的，使得可以存在多于一个液相。潜在的方法优点在溶剂与水可混溶时而且在溶剂与水不可混溶时出现。当溶剂是水可混溶时，形成单个液相，所以木质素和半纤维素提取的质量传递提高，并且下游操作仅需要处理一个液体流。当溶剂是在水中不可混溶时，提取剂混合物易于分离以形成多个液相，所以可以避免或简化单独分离步骤。如果一个液相含有大多数木质素而另一个液相含有大多数半纤维素糖，这可以是有利的，因为这有助于从半纤维素糖中回收木质素。

蒸煮液优选地含有二氧化硫和/或亚硫酸(H₂SO₃)。蒸煮液优选地含有呈溶解或反应形式的SO₂，其浓度是至少3wt％，优选地至少6wt％，更优选地至少8wt％，诸如约9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、20wt％、25wt％、30wt％或更高。蒸煮液还可以含有一种或多种分别来自SO₂的物质以调节pH。蒸煮液的pH典型地是约4或更小。

二氧化硫是优选的酸催化剂，因为在水解之后它可以容易地从溶液中回收。来自水解产物的大多数SO₂可以被汽提并且再循环回到反应器。回收和再循环可解释成与中和同等的硫酸相比所需要的石灰更少、处理的固体更少以及分离设备更少。由于二氧化硫的固有特性而产生的效率增加意味着可以需要更少的总酸或其他催化剂。这具有成本优势，因为硫酸可以是昂贵的。

另外地并且十分明显地，更少的酸用量还将解释为用于增加水解之后的pH的碱(例如，石灰)的成本更低、用于下游操作的成本更低。此外，更少的酸和更少的碱还将意味着可能需要另外处理的废弃物盐(例如，石膏)的产生大量减少。

在一些实施例中，可以包含约0.1wt％至10wt％或更多的量的添加剂以增加纤维素粘度。示例性添加剂包括氨、氢氧化氨、尿素、蒽醌、氧化镁、氢氧化镁、氢氧化钠以及它们的衍生物。

使用分批或连续消化器，以一个或多个阶段进行蒸煮。固体和液体可以同向地或反向地流动，或以实现所希望的分级分离的任何其他流动图案流动。如果希望，可以对蒸煮反应器进行内部搅动。

取决于待加工的木质纤维素材料，改变蒸煮条件，其中温度是从约65℃至190℃，例如75℃、85℃、95℃、105℃、115℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃、150℃、155℃、165℃或170℃，并且相应的压力是在液相或气相中从约1个大气压至约15个大气压。一个或多个阶段的蒸煮时间可以选自约15分钟至约720分钟，诸如约30、45、60、90、120、140、160、180、250、300、360、450、550、600或700分钟。通常，在消化步骤过程中所使用的温度与获得生物质良好分级分离为其组成部分所需要的时间之间存在反比关系。

蒸煮液与木质纤维素材料比率可以选自约1至约10，诸如约2、3、4、5或6。在一些实施例中，在具有低液体体积(低蒸煮液与木质纤维素材料比率)的压力容器中对生物质进行消化，使得蒸煮空间充满与水分平衡的乙醇和二氧化硫蒸气。用富含醇的溶液洗涤经过蒸煮的生物质以回收木质素和溶解的半纤维素，同时进一步加工剩余的纸浆。在一些实施例中，分级分离木质纤维素材料的方法包括使用脂肪醇(或其他用于木质素的溶剂)、水和二氧化硫对木质纤维素材料进行气相蒸煮。参见，例如美国专利号8,038,842和8,268,125，将这些专利通过援引并入本文。

一部分或全部的二氧化硫可以作为亚硫酸而存在于提取液中。在某些实施例中，通过引入亚硫酸、亚硫酸根离子、亚硫酸根盐离子、其组合、或任何前述物质的盐来原位产生二氧化硫。水解之后的过量二氧化硫可以被回收并且再使用。

在一些实施例中，在第一温度下使二氧化硫在水(或水溶液，任选地具有醇)中饱和，并且然后在第二(通常更高的)温度下进行水解。在一些实施例中，二氧化硫是欠饱和的。在一些实施例中，二氧化硫是过饱和的。在一些实施例中，二氧化硫浓度被选择成实现特定木质素磺化程度，诸如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％硫含量。SO₂与木质素进行化学反应以形成稳定的木质素磺酸，这些木质素磺酸可以存在于固相和液相两者中。

可以改变溶液中的二氧化硫、添加剂和脂肪醇(或其他溶剂)的浓度以及蒸煮时间以控制纸浆中的纤维素和半纤维素的产率。可以改变二氧化硫浓度和蒸煮时间以控制水解产物中的木质素与木质素磺酸盐的产率。在一些实施例中，可以改变二氧化硫浓度、温度和蒸煮时间以控制可发酵糖的产率。

一旦实现了从固相中对半纤维素和木质素两者的分级分离的所希望的量，分离液相和固相。用于分离的条件可以被选择成最小化或增加提取的木质素在固相上的再沉淀。在至少木质素的玻璃化转变温度(约120℃)的温度下进行分离或洗涤有利于最小化木质素再沉淀；相反地，在低于木质素的玻璃化转变温度的温度下进行分离或洗涤有利于增强木质素再沉淀。

可以通过将全部混合物转移到可以进行分离和洗涤的装置，或通过将多个相中的仅一个相从反应器中去除同时保持其他相在适当位置中来实现物理分离。可以通过液体能够穿过的适当大小的筛网来物理保留固相。固体被保留在筛网上并且可以被保持在那里持续连续的固体洗涤周期。可替代地，液体可以被保留并且使用可以有效地将固体转移到浆料外的离心力或其他力来将固相从反应区中压出来。在连续系统中，固体和液体的逆流可以实现物理分离。

回收的固体通常将含有大量木质素和糖，这些木质素和糖中的一些可以容易地通过洗涤来去除。洗涤液组合物可以与分级分离过程中所使用的液体组合物相同或不同。可以进行多次洗涤以增加有效性。优选地，使用包含用于木质素的溶剂的组合物来进行一次或多次洗涤以从固体中去除另外的木质素，接着使用水来进行一次或多次洗涤以从固体中置换残留溶剂和糖。可以使用再循环流(诸如来自溶剂回收操作)来洗涤固体。

在所述的分离和洗涤之后，获得固相和至少一个液相。固相基本上含有未消化的纤维素。当溶剂和水以所存在的相对比例是可混溶时，通常获得单个液相。在该情况下，液相含有呈溶解形式的最初在起始木质纤维素材料中的大多数木质素，以及在可能已存在的任何半纤维素水解中形成的可溶性单体糖和低聚物糖。在溶剂和水是完全或部分不可混溶时，倾向于形成多个液相。木质素倾向于被包含在含有大多数溶剂的液相中。半纤维素水解产物倾向于存在于含有大多数水的液相中。

在一些实施例中，使来自蒸煮步骤的水解产物受到减压。可以例如在分批消化器中蒸煮结束时，或在从连续消化器提取之后在外部闪蒸罐中进行减压。来自减压的闪急蒸气可以被收集到蒸煮液补给容器中。闪急蒸气含有基本上全部的未反应的二氧化硫，这些未反应的二氧化硫可以被直接溶解到新蒸煮液中。然后去除纤维素以便根据需要对其进行洗涤并且进一步处理。

方法洗涤步骤从纤维素中回收水解产物。经过洗涤的纤维素是可以用于不同目的(例如，纸张或纳米纤维素生产)的纸浆。来自洗涤器的弱水解产物继续到最终反应步骤；在连续消化器中，这种弱水解产物可以与来自外部闪蒸罐的提取的水解产物组合。在一些实施例中，水解产物和富含纤维素的固体的洗涤和/或分离在至少约100℃、110℃或120℃的温度下进行。经过洗涤的纤维素还可以通过使用酶或酸进行纤维素水解而用于葡萄糖生产。

在另一个反应步骤中，水解产物可以一个或多个步骤进行进一步处理以将低聚物水解为单体。这个步骤可以在去除溶剂和二氧化硫之前、过程中或之后进行。溶液可以含有或可以不含有残留溶剂(例如，醇)。在一些实施例中，加入二氧化硫或允许其穿过这个步骤以帮助水解。在这些或其他实施例中，引入酸诸如亚硫酸或硫酸以帮助水解。在一些实施例中，水解产物通过在压力下加热进行自水解。在一些实施例中，不引入另外的酸，而在初始蒸煮过程中产生的木质素磺酸有效于催化半纤维素低聚物水解成单体。在不同实施例中，这个步骤使用约0.01wt％至30wt％浓度的二氧化硫、亚硫酸、硫酸，诸如约0.05wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.5wt％、1wt％、2wt％、5wt％、10wt％或20wt％。这个步骤可以在从约100℃至220℃的温度下进行，诸如约110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃或210℃。加热可以直接或间接达到所选择的温度。

反应步骤产生可发酵糖，这些可发酵糖然后可以通过蒸发浓缩成发酵原料。通过蒸发而进行的浓缩可以在水解低聚物的处理之前、过程中或之后完成。最终反应步骤可以任选地接着是对所得到的水解产物进行汽提，以便去除并且回收二氧化硫和醇，并且用于去除潜在的抑制发酵的副产物。蒸发过程可以在真空或从约-0.1个大气压至约10个大气压的压力下，诸如约0.1atm、0.3atm、0.5atm、1.0atm、1.5atm、2atm、4atm、6atm或8atm。

回收和再循环二氧化硫可以使用分离，诸如但不限于气-液分离(例如闪蒸)、汽提、提取或其组合或多个阶段。可以实施不同再循环比，诸如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95或更大。在一些实施例中，约90％-99％的初始带电SO₂通过使用呈木质素磺酸盐形式的主要与溶解的木质素结合的剩余1％-10％(例如，约3％-5％)SO₂，从液相中蒸馏来容易地回收。

在优选实施例中，蒸发步骤使用一体化的醇汽提器和蒸发器。蒸发的蒸气流可以被分凝以便在不同的流中具有不同浓度的有机化合物。蒸发器冷凝物流可以被分凝以便在不同的流中具有不同浓度的有机化合物。醇可以通过冷凝排出的蒸气并且返回到蒸煮步骤中的蒸煮液补给容器中来从蒸发过程中回收。来自蒸发过程的干净冷凝物可以用于洗涤步骤中。

在一些实施例中，采用了一体化的醇汽提器和蒸发器系统，其中脂肪醇通过气提(vapor strip)来去除，所得到的汽提器产物流通过从该流中蒸发水来浓缩，并且蒸发的蒸气使用蒸气压缩来进行压缩并且被再使用以提供热能。

来自蒸发和最终反应步骤的水解产物主要含有可发酵糖，但取决于整个方法配置中的木质素分离的位置还可以含有木质素。水解产物可以被浓缩至约5wt％至约60wt％固体的浓度，诸如约10wt％、15wt％、20wt％、25wt％、30wt％、35wt％、40wt％、45wt％、50wt％或55wt％固体。水解产物含有可发酵糖。

可发酵糖被定义为纤维素、半乳葡甘露聚糖、葡甘露聚糖、阿拉伯葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯半乳聚糖以及葡糖醛酸木聚糖成为其对应的短链低聚物和单体产物的水解产物，即葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖以及阿拉伯糖。可发酵糖可以呈纯化形式回收，例如作为糖浆或干燥糖固体。可以采用任何已知技术来回收糖浆或干燥溶液以产生干燥糖固体。

在一些实施例中，可发酵糖被发酵以产生生物化学品或生物燃料，诸如(但绝不限于)乙醇、异丙醇、丙酮、1-丁醇、异丁醇、乳酸、琥珀酸或任何其他发酵产物。一定量的发酵产物可以是微生物或酶，如果需要，这些微生物或酶可以被回收。

当发酵采用细菌(诸如梭状芽胞杆菌细菌)时，优选进一步加工并且调理水解产物以提高pH并且去除残留SO₂和其他发酵抑制剂。残留SO₂(即，在通过汽提去除其大多数之后)可以被催化氧化以通过氧化将残留亚硫酸根离子转化成硫酸根离子。这种氧化可以通过加入将亚硫酸根离子氧化为硫酸根离子的氧化催化剂如FeSO4·7H₂O来完成。优选地，残留SO₂被减少到小于约100ppm、50ppm、25ppm、10ppm、5ppm或1ppm。

在一些实施例中，方法进一步包括回收木质素作为副产物。磺化木质素也可以被回收作为副产物。在某些实施例中，方法进一步包括燃烧或气化磺化木质素，用包含再生二氧化硫的气流回收包含在磺化木质素中的硫，并且然后对再生二氧化硫进行再循环以用于再使用。

方法木质素分离步骤是用于将木质素从水解产物中分离并且可以位于最终反应步骤和蒸发之前或之后。如果位于之后，则木质素将从水解产物中沉淀，因为在蒸发步骤中已去除醇。剩余的水溶性木质素磺酸盐可以通过例如使用碱土金属氧化物，优选地氧化钙(石灰)将水解产物转化成碱性条件(pH高于7)来沉淀。可以将组合的木质素和木质素磺酸盐沉淀物过滤。木质素和木质素磺酸盐滤饼可以被干燥作为副产物或燃烧或气化以用于能量产生。来自过滤的水解产物可以被回收并且作为浓缩的糖溶液产品出售或在随后的发酵或其他反应步骤中进一步加工。

天然(非磺化)木质素是疏水性的，而木质素磺酸盐是亲水性的。亲水性木质素磺酸盐可以具有较小的结块、聚结以及附着于表面的倾向。即使经历某种缩合和分子量增加的木质素磺酸盐将仍具有HSO₃基团，该基团将贡献一些溶解度(亲水性)。

在一些实施例中，在蒸发步骤中已去除溶剂之后，可溶性木质素从水解产物中沉淀。在一些实施例中，在脂肪醇存在下，使用过量石灰(或其他碱，诸如氨)从水解产物中选择性地沉淀反应性木质素磺酸盐。在一些实施例中，熟石灰被用于沉淀木质素磺酸盐。在一些实施例中，部分木质素以反应性形式沉淀，并且剩余的木质素以水溶性形式磺化。

方法发酵和蒸馏步骤旨在用于产生发酵产物，诸如醇或有机酸。在去除蒸煮化学品和木质素以及进一步处理(低聚物水解)之后，水解产物主要含有水溶液中的可发酵糖，优选地从其中已去除或中和任何发酵抑制剂。水解产物被发酵以产生从1wt％至20wt％浓度的稀醇或有机酸。如在本领域中已知的那样，稀产物被蒸馏或以另外的方式纯化。

当产生醇(诸如乙醇)时，该醇中的一些可以被用于方法蒸煮步骤中的蒸煮液补给。另外，在一些实施例中，具有或不具有蒸发器冷凝物的蒸馏柱流(诸如蒸馏残渣)可以被再使用以洗涤纤维素。在一些实施例中，石灰可以被用于使产物醇脱水。副产物可以被去除并且从水解产物中回收。这些副产物可以通过对来自最终反应步骤的排放物和/或来自蒸发步骤的冷凝物进行加工来分离。副产物包括例如糠醛、羟甲基糠醛(HMF)、甲醇、乙酸以及木质素来源的化合物。

葡萄糖可以被发酵成醇、有机酸或另一种发酵产物。葡萄糖可以被用作甜味剂或被异构化以提高其果糖含量。葡萄糖可以被用于生产面包酵母。葡萄糖可以被催化转化或热转化成不同有机酸和其他材料。

当半纤维素存在于起始生物质中时，全部或一部分液相含有半纤维素糖和可溶性低聚物。优选的是，如上所述从液体中去除大多数木质素以产生发酵液，该发酵液含有水、可能地一些用于木质素的溶剂、半纤维素糖以及来自消化过程的不同微量组分。此发酵液可以被直接使用、与一种或多种其他发酵流组合或进一步处理。进一步处理可以包括通过蒸发进行的糖浓缩；加入葡萄糖或其他糖(任选如从纤维素糖化获得的)；加入各种营养物如盐、维生素、或痕量元素；pH调节；以及去除发酵抑制剂，如乙酸和酚类化合物。调理步骤的选择应该特定于所采用的一种或多种目标产物和一种或多种微生物。

在一些实施例中，半纤维素糖并未被发酵，而是被回收并且纯化、储存、出售或转化成特种产品。例如木糖可以被转化为木糖醇。

可以使用若干方法中的一种或多种容易地从液相中获得木质素产物。一种简单的技术是蒸发掉所有液体，从而产生富含木质素的固体残留物。如果用于木质素的溶剂是水不可混溶的，此技术将是尤其有利的。另一种方法是致使木质素从溶液中沉淀出来。沉淀木质素的一些方法包括(1)从液相(但并非水)中去除用于木质素的溶剂，诸如通过从液相中选择性地蒸发溶剂直到木质素不再可溶；(2)用水对液相进行稀释直到木质素不再可溶；以及(3)调节液相的温度和/或pH。然后可以使用诸如离心的方法来捕获木质素。用于去除木质素的又另一种技术是连续液-液提取以从液相中选择性地去除木质素，接着去除提取溶剂以回收相对纯的木质素。

可以将木质素用作燃料。作为固体燃料，木质素在能量含量上与煤类似。木质素可以用作液体燃料中的含氧组分以提高辛烷值同时满足作为可再生燃料的标准。本文产生的木质素还可以被用作聚合材料并且用作用于产生木质素衍生物的化学前体。磺化木质素可以作为木质素磺酸盐产品被出售，或燃烧以获得燃料价值。

实例

纳米纤维素的结晶的、原纤化的、以及共混的配制品的可生物打印性通过评估分辨率(网格线分析)以及打印后形状保真度和流变学(弹性、粘度、和剪切稀化特性)并且将这些与纯海藻酸盐生物墨水进行比较来确定。用人体鼻中隔软骨细胞生物打印优化的纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水以确定细胞毒性、代谢活性和生物结构形貌。

如将在这些实例中示出的，所披露的纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水组合物展示了高剪切稀化度与可逆的应力-软化行为，这有助于打印后形状保真度。含有晶体和原纤维纳米纤维素共混物的生物墨水展现了对于细胞存活和分化的纳米尺度粗糙度以及微米尺度粗糙度，并且在培养中保持了最稳定的构建物体积。人体鼻中隔软骨细胞展示了打印后高代谢活性并且在延长培养后采用了圆形的软骨形成表型。

这些实例通过引用在此结合以下文献：Kyle等人,“Characterization of pulpderived nanocellulose hydrogels using

technology[使用

技术的纸浆来源的纳米纤维素水凝胶的表征]”,Carbohydrate Polymers[碳水化合物聚合物]198(2018)270-280和在https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab0631可获得的Jessop等人,“Printability of pulp derived crystal,fibril and blend nanocellulose-alginatebioinks for extrusion 3D bioprinting[用于挤出3D生物打印的纸浆来源的晶体、原纤维和共混物纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的可打印性]”,2019Biofabrication[生物制造](出版中)。

挤出3D生物打印设置

使用安装在以定制RepRap固件为特征的电机驱动的XYZ体系上的带有变速控制注射器驱动程序的定制的挤出生物打印机由纳米纤维素/海藻酸盐水凝胶生物墨水打印3D结构。将生物墨水装进5mL注射器(无菌BD Plastipak滑索接口(slip tip))并通过610μm精密度喷嘴(粘合剂分配有限公司(Adhesive Dispensing Ltd))挤出。Slic3r(开源软件)允许调节打印设置以适合单独的生物墨水；包括打印头移动速度、挤出速度、层高、填充物图案、和密度。将3D模型切片并以G代码输出以指挥生物打印机。打印机和软件的初始校准产生1.7mm的最小预制造层以允许连续均匀的打印。使用70％乙醇清洗所有外部生物打印机部件并进行UV处理60分钟后，在II类层流罩内实现无菌打印。

生物墨水制备和优化

纳米纤维素颗粒作为水性浆料由原木屑生物质使用专利

技术产生，该技术使用乙醇、二氧化硫、和水将生物质分级分离成纤维素、半纤维素、和木质素，这些纳米纤维素颗粒具有受分级分离的时间和温度控制的形态。最终纳米纤维素配制品是亲水性

纤维素纳米晶体凝胶(CNC，水中3wt％纳米纤维素)、亲水性

纤维素纳米原纤维凝胶(CNF，水中6wt％纳米纤维素)以及亲水性

共混物凝胶(NCB，水中3wt％纳米纤维素)。

将CNC、NCB和CNF以1500g离心5分钟以去除任何残余化学品和木质素片段，并且然后在高压釜内蒸汽灭菌(100kPa，121℃，30分钟)。将海藻酸钠盐(中等粘度，来自褐藻，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，普尔，英国)UV灭菌一小时，然后溶解于无菌培养基中以制成0.625％、1.25％、2.5％、5％、7.5％和10％海藻酸盐浓度(w/v)。将过量的水去除并用完全相同体积的含海藻酸盐的水凝胶替代。将一份海藻酸盐与四份纳米纤维素组合以产生CNC-AG、NCB-AG和CNF-AG生物墨水，这些生物墨水在生物打印后是与氯化钙(CaCl₂)可交联的。实验的纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的浓度是0.16％、0.31％、0.63％、1.25％、1.88％、2.5％(w/v)的海藻酸盐以及3％(w/v)的纤维素纳米晶体和纤维素纳米晶体/纳米原纤维共混物中任一者、6％(w/v)的纤维素纳米原纤维。

针对四个标准设置定性评估了从0.625％至10％(w/v)的海藻酸盐溶液以限定最佳生物墨水制备；溶解的容易度、在室温下流动的容易度、与纳米纤维素混合的容易度、以及在与纳米纤维素一起打印时的结构保持性。图1示出了定性分析的结果。

生物墨水交联优化

测量不同浓度(0.1M、0.5M、和1M)的雾化的CaCl₂溶液(无水CaCl₂粉末，西格玛-奥德里奇公司，普尔，英国，溶解在蒸馏水中)的从打印完成至在施加压入力时结构变化停止的交联时间。将全部溶液灭菌并通过0.22μm细胞过滤器(默克密理博公司(MerckMillipore)，沃特福德，英国)过滤，并在使用前储存在37℃培育箱内。使用如上所述的以1:4重量比与纳米纤维素混合的2.5％和5％(w/v)的海藻酸盐浓度打印测量出直径为27mm且高度为7个单层(11.9mm)的圆柱形构建物。通过将生物打印的生物墨水的每个层暴露于雾化的CaCl₂来进行交联。图2示出了交联时间(分钟)的定量分析和交联强度的定性分析。

可打印性测试：分辨率

使用纳米纤维素的三种不同配制品(CNC-AG、CNF-AG、和NCB-AG)的打印分辨率通过打印40×40mm正方形网格来进行测试，这些网格单层高(1.7mm)具有27％直线填充物，并且用0.5M CaCl₂交联(图3)，改编自Markstedt等人,“3D Bioprinting HumanChondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage TissueEngineering Applications[用于软骨组织工程应用的用纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水3D生物打印人体软骨细胞]”,Biomacromolecules[生物大分子]2015,16,1489-1496，将该文献特此通过援引并入。在填充物对角线的中间点处使用数显卡尺测量网格线厚度(图3的插图B)。使用三种配制品CNC-AG、CNF-AG、和NCB-AG生物打印并交联的结构的形状保真度通过生物打印具有7层高(11.9mm)的27mm直径圆柱体并且测量打印后即刻、在37℃在培养基中浸没后24小时和72小时的直径和高度来评估。

图3示出了网格厚度测定的结果，以测试含纳米纤维素的生物墨水的生物打印分辨率。图3的插图A示出了使用NCB-AG打印的交联的格子，显示了在用小铲搅动时的结构保持性。图3的插图B示出了使用NCB-AG打印的长丝的电子卡尺测量。图3的插图C是说明用于分辨率测试的构建物的测量点的示意图。图3的插图D示出了CNC-AG、CNF-AG、和NCB-AG配制品的长丝厚度。长丝厚度的数据以平均值表示，并且误差棒表示标准偏差。通过单向方差分析(ANOVA)计算统计学差异；p＝0.424，来自四个构建物的合并数据，每个n＝11。在本专利申请中，p是给出的统计模型的概率，当虚假设是真的时，统计摘要(如两个比较组之间的样本均值差异)将大于或等于实际观察到的结果，并且n是重复数。

可打印性测试：形状保真度

复杂结构测试使用从在线开源知识库

(生命科学数据库中心，在CC署名-相同方式共享2.1日本下许可的)(http://lifesciencedb.jp/bp3d/)获得的3D几何形状和耳软骨的解剖STL模型(参见图4)。圆柱体形状使用微软(Microsoft)3D Builder软件(微软公司(Microsoft Corporation)，新墨西哥州，美国)建立，并且以STL文件格式输出用于3D生物打印。通过测量3D打印的圆柱体构建物的直径(D)和高度(h)使用V＝πDh来计算体积，以评估在培养条件下24和48小时后的打印后形状保真度。图4示出了用于复杂结构测试的形状的以图形格式的G代码。在图4中，插图A是空心圆柱体，插图B是圆柱体，插图C是鼻软骨，插图D是立方体，插图E是右耳，并且插图F是4边棱锥体。

可打印性测试：流变学

使用配备有40mm直径平行板几何形状的AR-G2(TA仪器公司(TA instruments)，英国)控制应力流变仪测量生物墨水混合物(具有1.25％、2.5％和5％(w/v)海藻酸盐的1.25％/2.5％/5％(w/v)海藻酸盐和纳米纤维素混合物以产生分别具有0.25％、0.5％和1％(w/v)总海藻酸盐浓度的CNC-AG、NCB-AG和CNF-AG生物墨水)的流变特性。在装入样品前，在旋转摇臂上将溶液混合约15min。在每个实验前，在流变仪上设定零间隙，并且使用旋转测绘校准几何形状。

使用小铲将大致0.65mL的样品小心地装入流变仪的下板中心，并将上板逐渐降低至样品上直到间隙被完全填充(间隙范围从350-500μm)。使用小铲除去几何形状边缘周围的任何过量样品。将在下板处测量的法向力设定为最大0.1N，以确保最小化在设定间隙程序期间对样品的任何机械损伤。将流变仪下板控制在22℃的温度，并使用低粘度硅油(飞世尔科技：博勒飞公司(Fisher Scientific:Brookfield)，粘度标准物0.920比重硅油5mPa·s)包围样品的外边缘，以降低样品蒸发。

在2分钟的样品平衡阶段后，以0.5Pa的恒定应力进行频率扫描(0.1至10Hz)。每个测量是在如通过应力扫描确认的样品的线性粘弹性范围内(数据未示出)。在所使用的整个频率范围内记录储能模量(G′)和损耗模量(G″)的值。频率扫描完成后，使样品平衡10秒的一段时间，然后在从0.1-100s^-1的对数增加剪切速率内进行剪切流动斜升持续2分钟的一段时间。对每个样品重复频率扫描和剪切流动斜升实验二者至少三次。

用人体鼻中隔软骨细胞进行3D生物打印：细胞培养、封装、和生物打印

软骨细胞是在常规鼻中隔鼻成形术过程中知情同意(IRAS ID 99202)后获得的从人体鼻中隔软骨样品中分离的。将软骨组织切碎成1mm³的片，并通过0.4％链霉蛋白酶(罗氏公司(Roche)，西萨塞克斯，英国)在培养基中在37℃(5％CO₂)伴随温和搅拌消化1小时，随后用0.2％胶原酶I型消化18小时。溶液通过40μm细胞过滤网(VWR，莱斯特，英国)过滤，并且然后以500g离心5分钟，以用培养基替代酶混合物。在37℃在5％CO₂内生长细胞，并且每2-3天更换培养基。培养基由补充有10％胎牛血清(西格玛-奥德里奇公司，普尔，英国)、100μg/mL盘尼西林和100U/mL链霉素(西格玛-奥德里奇公司，普尔，英国)、1mM葡萄糖(西格玛-奥德里奇公司，普尔，英国)和0.1％非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，佩斯利，英国)的无葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基(西格玛-奥德里奇公司，普尔，英国)组成。当细胞达到80％-90％融合度时，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA(赛默飞世尔科技公司，佩斯利，英国)使细胞传代。总的且活的细胞的数量通过0.4％台盼蓝染色使用Invitrogen^TM Countess^TM II自动细胞计数器(赛默飞世尔科技公司，佩斯利，英国)来估算。

选择第5-7代用于随后的实验，因为它们产生足够数量的软骨细胞以用于使用每mL生物墨水2×10⁶个细胞的挤出3D生物打印。在生物打印负载细胞的生物墨水之前，立即将细胞悬浮液吸入注射器中，并使用双向旋塞在无菌条件下与一注射器的纳米纤维素/海藻酸盐不含细胞的生物墨水温和混合一分钟，以确保在负载细胞的生物墨水内均匀分布。在含有雾化的CaCl₂的气氛内以在每层之间约10秒的交联时间将负载细胞的生物墨水打印成多个层。在打印后(完成全部的层)，立即在培养基中洗涤细胞-生物墨水构建物，以便在培育箱中培养之前去除过量的CaCl₂。

用人体鼻中隔软骨细胞进行3D生物打印：生物相容性

根据制造商的说明书将

细胞活力试剂盒(赛默飞世尔科技公司，佩斯利，英国)用于在生物打印后24和48小时评估细胞活力。将样品用2μM钙黄绿素AM(绿色荧光染料)和1μM乙锭均二聚物-1(红色荧光染料)染色。使用共聚焦显微镜(Zeiss LSM 710反向共聚焦显微镜)检查标记，其中绿色标记表示活细胞并且红色标记表示死细胞。对于每个条件，为三个生物打印的构建物的至少六个不同区域拍照。使用NIH ImageJ软件对活细胞和死细胞的数目计数，并且细胞活力表示为活细胞与总细胞的数目百分比。

使用10％(v/v)

细胞活力试剂(赛默飞世尔科技公司，佩斯利，英国)在生物打印后4、12和24小时将细胞代谢活性量化。在530-560nm激发波长和590nm发射波长下用酶标仪(POLARstar Omega分光光度计，BMG LABTECH公司，奥芬堡，德国)测量荧光性。使用相配的培养基中细胞浓度作为对照物。还测试了培养基中阿尔玛蓝与纳米纤维素的交叉反应性。相对于t＝0的光密度(OD)值将光密度值标准化。细胞活力通过绘制荧光发射强度与细胞浓度来确定。

用人体鼻中隔软骨细胞进行3D生物打印：细胞毒性

NCB生物墨水的细胞毒性使用乳糖脱氢酶(LDH)细胞毒性测试进行评估。在37℃、5％CO₂下将含有具有NCB-AG的细胞(n＝6)以及仅细胞(n＝6)、仅培养基(n＝3)和NC对照物(n＝3)的板培育过夜。然后将50μL的每种样品培养基转移到96孔板上并且在室温下与50μL反应混合物混合30分钟，避光，在此时加入终止溶液。使用吸光度测量(在490nm和680nm)来确定LDH活性。

用人体鼻中隔软骨细胞进行3D生物打印：SEM分析

用50mM二甲胂酸钠-HCl缓冲溶液(pH 7.2-7.4，SPI Supplies公司)将培养生长3周的生物打印且交联的细胞构建物以10至20分钟的间隔洗涤三次，以去除过量的盐。将样品在2％戊二醛(西格玛-奥德里奇公司，英国)中固定过夜，并用一系列梯度浓度(30％至100％)的乙醇脱水。然后在通风橱内用在100％乙醇中的50％六甲基二硅氮烷溶液(HMDS)冲洗脱水的样品10分钟，并且然后在100％HMDS中冲洗三次，并且放置过夜以干燥。将样品使用溅射镀膜用金薄层(约15nm层厚度)涂覆，并且使用扫描电子显微镜(Hitachi 4800s)成像。

用人体鼻中隔软骨细胞进行3D生物打印：压缩测试

对用0.5M的CaCl₂交联5min并且在磷酸盐缓冲盐水(赛默飞世尔科技公司，佩斯利，英国)中在室温培育1小时以达到膨胀平衡的生物打印的NCB-AG圆柱盘(5mm直径和4mm高度)使用BOSE

3200机械装料机(博世公司(Bose Corporation)，

Systems Group，明尼苏达州，美国)进行机械测试。在1Hz测试样品的抗压强度。记录压缩(mm)和载荷(N)并将杨氏模量确定为应力/应变曲线的线性区域的斜率：杨氏模量(N/m²或Pa)＝应力(Pa)/应变。

定量结果表示为平均值±标准偏差(SD)，并且使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad软件公司(GraphPad Software)，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)进行统计分析。使用用于非高斯分布的曼-惠特尼U检验以及用于高斯分布的t检验进行单一比较的统计分析。多重比较通过单向ANOVA、随后图基事后检验进行。生物重复数量在每个附图说明中指出。p<0.05的值被认为在统计上是显著的。

纳米纤维素生物墨水配制品和交联优化

0.625％(w/v)海藻酸盐溶液展现出在溶解和混合方面的优越特性，但在打印后在室温下快速坍塌。7.5％和10％(w/v)海藻酸盐溶液难以溶解，并且过于粘稠难以与纳米纤维素均匀混合。发现1.25％、2.5％和5％(w/v)的浓度具有合适的粘度和混合潜力，并且继续流变学测试。由于其平衡溶解和混合的容易度与打印后未交联的结构稳定性的能力(图1)，选择2.5％(w/v)的海藻酸盐浓度进行进一步实验。

用不同CaCl₂浓度的交联优化总结在图5中。1M CaCl₂在最短时间交联(立即，与对于0.5M的2分钟和对于0.1M的4分钟相比)，最终构建物能够耐受与0.5M和0.1M相比更大的机械力。然而，发现1M CaCl₂的立即交联时间导致层沉积过程中的长丝的交联，这引起拖拽并最终损坏最终打印的结构。图3(插图A)说明了使用0.5M CaCl₂的优选浓度的耐受使用小铲搅动的交联的格子结构。

使用透射电子显微镜(TEM)来评估交联、纤维缠结、和多孔性。将每个样品(2mg)分散在5mL去离子水中，并超声处理30分钟。超声处理后，立即取出50μL样品，并进一步分散在1mL去离子水中以防止聚结。将此溶液(10μL)加到涂覆有蕾丝碳膜的300目铜网上。使该网空气干燥，然后用1.5％乙酸双氧铀溶液染色。为了染色，将一滴乙酸双氧铀溶液置于

带(毕玛时公司(Bemis Company,Inc.)，尼纳，威斯康星州，美国)上，并使该网颠倒在该液滴上几秒钟。然后使样品空气干燥。在以200kV操作的Jeol 2100JEM上进行分析。

图6示出了交联之前和之后的纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的TEM图像。特别地，分图A和B分别示出了交联之前和之后的CNC-AG生物墨水；分图C和D分别示出了交联之前和之后的CNF-AG生物墨水；并且分图E和F分别示出了交联之前和之后的NCB-AG。在全部情况(即，图6的分图B、D和F)下，交联使用雾化的0.5M CaCl₂实现。

如在交联前由于团聚在TEM成像(图6，分图A、C和E)中看到的，全部三种配制品显示出不同程度的纳米纤维缠结和大量的多孔网络。NCB-AG显示出散布有纳米晶体的纳米原纤维的原纤缠结(图6，分图E)。在不受推测限制的情况下，据信在用CaCl₂交联时，海藻酸盐将纳米原纤维和纳米晶体拉在一起以减少材料内的空隙，由此产生可以被操控并且可以耐受细胞培养条件的牢固的结构(图6，分图B、D和F)。

使用含纳米纤维素的生物墨水3D生物打印宏观结构

图7和8示出了生物打印的构建物膨胀特性。图7提供了使用用0.1M或0.5M的CalCl₂交联的三种不同生物墨水配制品(CNC-AG、NCB-AG、和CNF-AG)生物打印的圆柱体构建物体积的比较。图8示出了相对于时间0在24和72小时的构建物体积变化。数据表示为平均值±SD(对于所有的组n＝3)。统计学差异通过单向ANOVA与图基多重比较事后检验计算。在图8中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，并且****表示p<0.001。

NCB-AG具有更好的分辨率，这通过分别与对于CNC-AG和CNF-AG的1.07mm和1.04mm比较的1.01mm的中值长丝厚度证明(图3，插图D)；然而，发现这在统计上是不显著的(p＝0.42，单向ANOVA)。交联的CNC-AG和NCB-AG圆柱体构建物尤其在低交联剂浓度下在培养条件下(在37℃在培养基内)在24小时内膨胀，但是这些变化在统计学上是不显著的(图7和图8)。72小时后，对于用0.1M与0.5M CalCl₂浓度交联的CNC-AG(697.6mm³，p＝0.003)和NCB-AG(523.9mm³，p＝0.021)构建物，存在体积的显著增加，而使用CNF-AG打印的构建物体积减小，其中0.5M CaCl₂交联的构建物的从其原始大小的体积减小(488.3mm³)比0.1M CaCl₂交联的构建物(186.8mm³)更大(图8)。用0.5M CalCl₂交联的NCB-AG构建物在培养条件下最稳定，具有从其原始大小的62.3mm³减少。

因为用0.5M CaCl₂交联的NCB-AG展示了在培养条件下最稳定的构建物体积，这是对于复杂形状测试所选择的配制品，包括空心圆柱体和解剖的耳软骨(图9)以及生物相容性实验(图16-19)。

图9示出了用于复杂形状测试的使用NCB-AG生物墨水打印的几何结构。在图9的分图A中，几何结构是空心圆柱体(左上方)、圆柱体(右上方)、棱柱体(左下方)、和立方体(右下方)。在图9的分图B中，几何结构是右耳。

纳米纤维素的流变特性使得能够生物打印

图10示出了含有海藻酸盐但没有纳米纤维素的生物墨水(为方便起见，被称为“纯海藻酸盐”，应注意余量主要是水)的流变特性。在图10中，在不同的海藻酸盐浓度下，G′是储能模量(深灰色)，并且G”是损耗模量(浅灰色)。数据表示为平均值±SD(对于所有的组n＝5)。

纯海藻酸盐生物墨水示出了随着频率增加G′和G″增加(图10)。对于所有的海藻酸盐浓度(1.25％、2.5％、5％和7％，w/v)，平均损耗模量(G″)始终高于平均储能模量(G′)，这展示了在纯海藻酸盐生物墨水中粘性超过弹性特性的主导地位。

进行剪切速率斜坡以便通过测量作为增加的剪切速率的函数的粘度来研究生物墨水的流动特性。图11示出了作为剪切速率的函数的纯海藻酸盐生物墨水的粘度。数据表示为平均值±SD(对于所有的组n＝5)。图11揭示了不含纳米纤维素的生物墨水在所研究的整个剪切速率下在5％和7.5％(w/v)海藻酸盐浓度下的受限的剪切稀化行为以及在1.25％和2.5％(w/v)海藻酸盐浓度下的近牛顿行为。

相比之下，在所研究的全部频率下，全部含纳米纤维素的生物墨水的平均G′大于G″，这表明弹性的主导地位(不同于海藻酸盐生物墨水)并且展示了在纳米结构之间强大的相互连接的网络(图12)。图12示出了纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水在1Hz下的流变特性。在图12中，在不同的海藻酸盐和纳米纤维素浓度下，对于含共混物(NCB)、晶体(CNC)、和原纤维(CNF)纳米纤维素的生物墨水，G′是储能模量(深灰色)，并且G”是损耗模量(浅灰色)。数据表示为平均值±SD(对于所有的组n＝3)。统计学差异通过单向ANOVA与图基多重比较事后检验计算(*表示p<0.05)。

进行剪切速率斜坡以便通过测量作为增加的剪切速率的函数的粘度来研究CNF-AG、CNC-AG和NCB-AG生物墨水的流动特性(图13-15)。图13至15分别示出了对于与1.25％、2.5％、和5％海藻酸盐(w/v)组合的CNC、NCB和CNF生物墨水而言，作为剪切速率的函数的不同纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的粘度。数据表示为平均值±SD(对于所有的组n＝3)。统计学差异使用t检验计算，并且*表示p<0.05。

与纯海藻酸盐生物墨水相比，所有的含纳米纤维素的生物墨水展现出更高程度的非牛顿、剪切稀化、拟弹性行为。与全部CNC配制品相比，CNF-AG和NCB-AG配制品展示了更大且统计学上不同的粘性。这种差异在剪切速率＝0.12s^-1下最好看出，但在更高的剪切速率下仍存在(图13-15，底部分图)。在不受推测限制的情况下，这种结果暗示了与CNC-AG生物墨水相比，NCB-AG和CNF-AG内的纳米结构与微米结构之间存在更强的颗粒-颗粒相互作用或增加的缠结，这提供更好的打印后形状保真度。

纳米纤维素与人体鼻中隔软骨细胞生物相容

图16示出了(A)纳米纤维素晶体(CNC-AG)、(B)纳米纤维素共混物(NCB-AG)、和(C)纳米纤维素原纤维(CNF-AG)生物墨水配制品的生物打印后人体鼻中隔软骨细胞的活力。数据表示为平均值±SD(对于所有的组n＝5)。统计学差异通过单向ANOVA与图基HSD多重比较事后检验计算(p＝0.1502，n＝5，其中3次生物重复)。

根据图16，紧跟生物打印后，NCB-AG的细胞活力最高(83.9％±16.7％活细胞)、接着是CNC-AG(80.1％±17.4％活细胞)，并且最后是CNF-AG(71.6％±17.4％活细胞)，但是差异在统计学上是不显著的(p＝0.15)。

图17示出了在3D细胞培养与2D细胞培养中的仅细胞中的晶体/原纤维共混的纳米纤维素生物墨水中的人体鼻中隔软骨细胞活力。白条表示在3D培养中24和48小时后用NCB-AG生物打印后的活力，而24和48小时后的黑条表示在2D培养中24和48小时后用NCB-AG生物打印后的活力。数据表示为平均值±SD(对于所有的组n＝4)。统计学差异通过曼-惠特尼检验计算。在图17中，*表示p<0.05，并且***表示p<0.001。

使用NCB-AG生物打印并用0.5M CaCl₂交联的构建物展示了最大体积稳定性和良好的细胞活力。因此将这种配制品用于进一步生物相容性实验。在培养24小时后的NCB-AG中的细胞活力(90.1％±13.8％)是与单独在组织培养塑料上的细胞(85.3％±3.4％)相当的。然而，出人意料地，经过48小时，与单独在塑料上培养的细胞相比(94.0％±6.4％，p＝0.0326)，在NCB-AG中培养的细胞的细胞活力(97.3％±4.5％)显著更高(图17)。

图18总结了乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性测试的结果。将2D培养中人体鼻中隔软骨细胞的细胞毒性与用NCB-AG生物墨水生物打印后的人体鼻中隔软骨细胞的细胞毒性进行比较。数据表示为平均值±SD。通过非配对t检验计算具有细胞和NCB-AG生物墨水的培养基之间的统计学差异(p＝0.322，n＝3-6)。没有发现在塑料上培养的细胞(LDH活性＝0.05)与在NCB-AG中3D生物打印并培养的细胞(LDH活性＝0.049)之间的中值LDH活性(细胞毒性指标)显著不同(p＝0.1138)。

图19示出了在4、12和24小时NCB-AG生物墨水中的人体鼻中隔软骨细胞的代谢活性。代谢活性通过随着细胞数增加孔中阿尔玛蓝还原所引起的荧光信号(减去培养基或培养基加上纳米纤维素值)来表示。数据表示为平均值±SD(对于所有的组n＝5)。统计学差异通过单向ANOVA与图基HSD多重比较事后检验计算。在图19中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，并且****表示p<0.0001。

在所测试的全部细胞密度和条件下，人体鼻中隔软骨细胞在培养4与12小时之间具有显著增加的代谢活性(p<0.0001)，但在12与24小时之间没有(图19)。如通过2×10⁵个细胞(分别为122.2±23.9与293.0±118.1；p＝0.0005)和5×10⁵个细胞(分别为257.8±21.0与403.0±120.5；p＝0.0068)的荧光强度测量的，软骨细胞展示了在四小时后与在塑料上2D培养(仅细胞)相比在NCB-AG生物墨水中显著增加的代谢活性(图19)。在12和24小时，这些条件之间的差异不再显著。

图20示出了在生物打印后的海藻酸盐生物墨水和含纳米纤维素的生物墨水构建物的扫描电子显微镜(SEM)图像。分图A和C示出了没有细胞的海藻酸盐生物墨水。分图B和D示出了与人体鼻中隔软骨细胞一起培养21天后的海藻酸盐生物墨水。分图E和G示出了没有细胞的NCB-AG生物墨水。分图F和H示出了与人体鼻中隔软骨细胞一起培养21天后的NCB-AG生物墨水。分图A、B、E和H中的SEM图像的比例尺是50μm，并且分图C、D、G和H中的SEM图像的比例尺是10μm。

SEM图像展示了，与来源于纳米纤维素共混物生物墨水的生物结构的高度多孔结构(分图E和G)相比，2.5％(w/v)海藻酸盐生物墨水(分图A和C)的相对同质的性质。含纳米纤维素的生物结构的不同的纳米构造和微米构造为细胞附着提供了更大的表面积。人体鼻中隔软骨细胞在培养3周后在纯海藻酸盐(分图B和D)和纳米纤维素共混物(分图F和H)二者内维持圆形的细胞形态。

图21是生物打印的构建物的应力-应变曲线。用0.5M CaCl₂交联的生物打印的NCB-AG构建物的无侧限抗压测试展示了52.6kPa的抗压/杨氏模量。

基于

纳米纤维素的生物墨水的软骨形成结果

图22示出了在海藻酸盐与含纳米纤维素的生物墨水中培养的鼻中隔群体的相关基因表达的定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析。使用纯海藻酸盐和纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水(使用纳米纤维素晶体/原纤维共混物)生物打印CDC，软骨来源的细胞；DNC，分化的软骨细胞；以及CSPC，软骨来源的干细胞/祖细胞。将球粒培养14和21天，并分析以下各项的表达：NCAM1，神经细胞附着分子1(分图A)；SOX9，SRY-Box 9(分图B)；ACAN，聚集蛋白聚糖(分图C)；和COL2A1，II型胶原蛋白(分图D)。在每个分图中并且对于4个条的每个分组，从左到右，这些条是在14天的海藻酸盐(中度浅灰色)、在14天的含纳米纤维素的生物墨水(浅灰色)、在21天的海藻酸盐(中度深灰色)、以及在21天的含纳米纤维素的生物墨水(深灰色)。

所示出的数据是目的基因与核糖体蛋白L3(RPL3)和TATA盒结合蛋白(TBP)管家基因的几何平均数的浓度比率。数据表示为平均值±SD(n＝5)，其中对于每种细胞类型使用在14天组的海藻酸盐作为校准组(标准化为表达水平1)。统计学差异通过单向ANOVA与图基HSD多重比较事后检验计算。在图22中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示P<0.001，并且****表示p<0.0001。

基因表达分析在培养14和21天后的使用具有CDC、DNC和CSPC群体的纯海藻酸盐和纳米纤维素生物墨水生物打印的构建物上进行(图22)。数据显示出，在培养14天后对于两种生物墨水中的全部三种细胞类型，NCAM1表达达到最高点，但与海藻酸盐构建物相比，其在纳米纤维素中显著增加(图22的分图A)。与海藻酸盐-CDC构建物相比，在培养14天后，早期软骨形成基因SOX9在纳米纤维素-CDC中具有显著更多的相对表达(1.0±0.09与2.3±0.89；p<0.0001)，并且这在21天减少2.3倍(p<0.0001)，达到与海藻酸盐-CDC构建物相似的水平(图22的分图B)。在14天的此SOX9表达峰值在DNC和CSPC群体中没有出现。在另一方面，ACAN展示了随培养时间增加而增加表达的一贯的模式，具有分别在14和21天在DNC-纳米纤维素构建物(3.0倍，p＝0.0355)、CDC-海藻酸盐(7.6倍，p<0.0001)、以及CDC-纳米纤维素构建物(4.6倍，p<0.0001)上的显著差异(分图C，图22)。

尽管与海藻酸盐构建物相比，纳米纤维素构建物看似具有增加的表达的模式，但这些差异在匹配的时间点并未显示为显著。在另一方面，COL2A1表达示出在21天后与CDC-海藻酸盐构建物相比在CDC-纳米纤维素中6.4倍更多的表达(p＝0.006)(图22的分图D)，这表示如果将这些mRNA水平翻译成细胞外基质分泌，存在软骨形成(chondrogenicity)的可能。尽管DNC-纳米纤维素构建物展示了与DNC-海藻酸盐构建物相比在14天COL2A1表达的极其显著的峰值(p<0.0001)，但这在21天没有持续(p＝0.54)。

此定量逆转录聚合酶链式反应数据表明，CDC-纳米纤维素构建物具有对于软骨形成最有前途的软骨形成基因表达谱。

使用纯海藻酸盐和纳米纤维素生物墨水生物打印人体鼻中隔软骨细胞。SEM分析在用纳米纤维素生物打印后立即在样品上进行，这些样品展示出具有细长的成纤维细胞状外观的鼻中隔软骨细胞。图23示出了与鼻中隔软骨细胞混合24小时内(左分图)以及在与鼻中隔软骨细胞一起培养两周后(右分图)的含纳米纤维素的生物墨水的SEM图像(从底部到顶部10、20和50μm的比例尺)。图23展示了从成纤维细胞到圆形的形态的细胞变化，这表示软骨形成表型。培养三周后，鼻中隔软骨细胞在纳米纤维素中呈现圆形、软骨形成表型。

图24呈现了使用来源于鼻中隔软骨的细胞的3D生物打印的软骨构建物的组织学分析。将使用纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水生物打印的CDC，软骨来源的细胞(分图C、H和M)；DNC，分化的软骨细胞(分图D、I和N)；CSPC，软骨来源的干细胞/祖细胞(分图E、J和O)与用纯海藻酸盐生物墨水生物打印的CDC(分图B、G和L)进行比较。在培养21天后将切片用阿辛蓝(分图A、B、C、D和E)、番红-O(分图F、G、H、I和J)以及甲苯胺蓝(分图K、L、M、N和O)染色。天然人体鼻中隔软骨切片使用匹配的方案染色(分图A、F和K)。对于图24中所有的分图，比例尺是20μL。

组织学证实了CDC-纳米纤维素构建物展示了最多的软骨细胞外基质。将用纯海藻酸盐与纳米纤维素生物墨水生物打印的构建物中的糖胺聚糖与使用匹配方案染色的天然人体鼻中隔软骨切片进行比较(图24)。在来自CDC-海藻酸盐(分图B、G和L)和DNC-纳米纤维素构建物(分图D、I和N)的切片上，可见的细胞外基质形态不明显。阿辛蓝(分图A-E)和甲苯胺蓝(分图K-O)展示了遍及人体鼻中隔软骨的硫酸化的蛋白聚糖(分图A)以及在CDC-纳米纤维素构建物中、特别是在围绕可辨认陷窝的细胞外周基质区域中硫酸化的蛋白聚糖的簇(分图C和M)。番红-O染色还示出了在CDC-纳米纤维素构建物中的结节强烈深红色阳性，这表示在新的细胞外软骨形成区域中增加的糖胺聚糖含量(分图H)。还存在具有较低强度番红-O(分图J)染色但没有阿辛蓝或甲苯胺蓝阳性(分别为分图E和O)的在CSPC-纳米纤维素构建物中含有糖胺聚糖的较小结节的证据。

考虑到II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖是人体鼻中隔透明软骨的细胞外基质的主要成分，这些基因通过在纳米纤维素中培养的软骨细胞的持续表达暗示了这种材料为软骨形成提供恰当的环境因素。转录数据得到增加的糖胺聚糖组织学染色的支持，提供了在纳米纤维素的情况下细胞外基质分泌以及软骨结节与陷窝形成的形态组织的证据。尽管在三周后在SEM上看到圆形的表型，但这些发现在海藻酸盐构建物中不存在—这表示尽管3D细胞培养维持圆形的表型，但只有这(在海藻酸盐构建物中)对于软骨细胞分化和细胞外基质分泌是不足够的。

这些实例的结果展示了优化的晶体、原纤维和共混物纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水配制品具有相当的分辨率、合适的流变学、和与人体鼻中隔软骨细胞的生物相容性以使用于软骨生物打印的效用成为可能。

具有纳米纤维素原纤维和晶体二者的纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水提供了展现用于细胞功能性的纳米尺度粗糙度以及微米尺度粗糙度、以及维持稳定的构建物体积的优势，以可靠地维持在培养条件下患者特定的软骨构建物的形状。

TEM和SEM数据示出了即使加入海藻酸盐，全部测试的含纳米纤维素的配制品仍继续在纳米尺度和微米尺度二者上是高度多孔的，这不同于典型地仅纳米多孔的纯海藻酸盐生物墨水(在约5nm的长度尺度)。NCB水凝胶展现了原纤网络和相互连接的致密纳米棒的组合，并且具有与仅来自CNC的那些相比更广泛的孔径变化(55nm至超过12μm，中值934nm)，这将允许软骨细胞迁移(大概的软骨细胞直径是10μm)并为更多种类的生物活性信号提供可调的纳米形貌。

加入海藻酸盐以允许交联能力没有不利地影响纳米纤维素生物墨水的弹性或剪切稀化行为，据信这主要取决于生物墨水的干含量而非这两种组分之间的比率。在所研究的全部频率内，对于纳米纤维素-海藻酸盐生物墨水的全部组合，储能模量大于损耗模量，这展现了与纯纳米纤维素材料相似的弹性的主导地位。这与主要是粘性的纯海藻酸盐生物墨水形成对照。大的纵横比以及通过氢键形成相互连接的网络结构的能力使得纳米纤维素既由于纳米颗粒的有序(结晶)区域而是刚性，又由于无序(无定形)区域而是柔性的。当置于悬浮液中时，这些纳米纤维素网络结构可以解开并且与流动方向平行排列，这也解释了所观察到的高剪切稀化度。剪切稀化使得能够通过细小的沉积喷嘴在低剪切速率下以施加到细胞上的减少的机械力进行生物打印。这与更常用的纯海藻酸盐生物墨水形成对照，这些纯海藻酸盐生物墨水即使在高剪切速率下仅展现出受限的剪切稀化，需要更高的力(剪切应力)用于挤出，这可能降低打印后细胞活力。纳米纤维素的可逆的应力-软化行为意味着打印后，储能模量(G′)在静态条件下恢复并且高于纯海藻酸盐生物墨水(在1.25％至7.5％w/v范围)的储能模量，这有助于形状保真度并且防止复杂3D生物打印的构建物的坍塌。NCB的刚性显著高于CNC，但与CNF类似，这表示之前报道的NCB的双网络水凝胶结构(Kyle等人,“Characterization of pulp derived nanocellulose hydrogels using

technology[使用

技术的纸浆来源的纳米纤维素水凝胶的表征]”,Carbohydrate Polymers[碳水化合物聚合物]198(2018)270-280，将该文献特此通过援引并入)没有因加入海藻酸盐而被破坏。

使用细菌纳米纤维素(BNC)的体内动物研究，表明没有异物反应或炎症，纳米纤维素广泛地被认为是生物相容的。尽管众所周知由于缺乏纤维素酶，纤维素不易被人体降解，对于可以通过氧化来增强的缓慢降解建议考虑纤维素链的自发非酶促水解。纳米纤维素的水解产生无毒的葡萄糖。即使没有完全降解，纤维素是生物惰性的并且在理论上不应干扰稳态过程如基质重塑。关于纳米纤维素的纳米毒理学的大部分报道使用BNC，并且没有示出在基因、细胞和体内动物水平的损害的证据，但很少研究使用人体细胞并且迄今为止均没有直接比较基于纸浆的晶体、原纤维、和共混物配制品。

我们发现，

基于纸浆的纳米纤维素是对鼻中隔软骨细胞非细胞毒性的，在用CNC、NCB和CNF打印后的细胞活力没有显著差异。NCB不仅显著增加了培养两天后活的鼻中隔软骨细胞的比例，它还促进这些细胞在打印后前四个小时后更具代谢活性，同时在培养三周后保持圆形的软骨形成表型—这暗示用于软骨基质形成的合适的3D环境、纳米形貌以及多孔性。这些发现与先前的研究相一致，表明圆形的细胞形态的维持是明显的软骨形成分化的先决条件。纳米细胞原纤结构可以模拟细胞外基质组分的特性，其还是由糖胺聚糖和纤维蛋白(如胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、和纤连蛋白)构成的纳米原纤网络，由此促进细胞分化。

基于纳米纤维素的生物墨水的软骨形成结果是阳性的。纳米纤维素的存在促进从成纤维细胞到圆形的形态的细胞变化，这表示软骨形成表型。已经通过实验展示了所披露的含纳米纤维素的生物墨水促进软骨形成。

在此详细描述中，已参考本发明的多个实施例和关于如何可以理解并实践本发明的非限制性实例。可以使用没有提供本文列举的全部特征和优势的其他实施例，而不背离本发明的精神和范围。本发明结合了常规实验以及本文描述的方法和体系的优化。这样的修改和变化被视为在由权利要求限定的本发明范围内。

本说明书中所引用的所有出版物、专利和专利申请通过援引以其全文并入本文，就如同每个披露物已在本文中明确且单独地提出。

当以上描述的方法和步骤表明某些事件以某种顺序发生时，本领域普通技术人员将认识到某些步骤的顺序可以修改，并且这种修改是根据本发明的变体。此外，某些步骤在可能时可以并行过程同时进行，以及顺序进行。

因此，在某种程度上，存在本发明的多个变体，这些变体是在本披露的精神内或等同于在所附权利要求书中获知的发明，意图是本专利还将覆盖那些变体。本发明应仅受限于权利要求书。

Claims (50)

1.一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素晶体和纳米纤维素原纤维的组合形式的纳米纤维素；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

2.一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素原纤维形式的纳米纤维素，其中所述纳米纤维素的特征在于至少240℃的热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

3.一种用于3D生物打印的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物包含：

(a)呈纳米纤维素晶体形式的纳米纤维素，其中所述纳米纤维素的特征在于至少290℃的热分解起始温度；

(b)呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐形式的海藻酸盐；以及

(c)水，

其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的。

4.如权利要求1至3中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在。

5.如权利要求4所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素以从3％(w/v)至6％(w/v)的纳米纤维素浓度存在。

6.如权利要求1至5中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在。

7.如权利要求1至6中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述生物墨水组合物是不含细胞的生物墨水。

8.如权利要求1至6中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述生物墨水组合物是含有活的人体细胞的负载细胞的生物墨水，并且其中所述活的人体细胞任选是人体鼻中隔软骨细胞。

9.如权利要求8所述的生物墨水组合物，其中，所述活的人体细胞以每毫升所述生物墨水组合物从10⁵至10⁷个细胞的细胞浓度存在于所述生物墨水组合物中。

10.如权利要求1至9中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素是亲水性纳米纤维素。

11.如权利要求1所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素的特征在于至少250℃的热分解起始温度。

12.如权利要求11所述的生物墨水组合物，其中，所述热分解起始温度是至少290℃。

13.如权利要求2所述的生物墨水组合物，其中，所述热分解起始温度是至少270℃。

14.如权利要求3所述的生物墨水组合物，其中，所述热分解起始温度是至少310℃。

15.如权利要求1至14中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素含有小于0.05wt％的硫。

16.如权利要求1至15中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素不含硫酸半酯基团。

17.如权利要求1至16中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素具有至少-20mV或更负的ζ电位。

18.如权利要求1至17中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素是剪切稀化的。

19.如权利要求1至18中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将所述纤维素机械精制以产生所述纳米纤维素。

20.如权利要求1至19中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述纳米纤维素不是细菌纳米纤维素，其中所述纳米纤维素不来源于被囊动物，并且其中所述纳米纤维素不经由木质纤维素生物质或纤维素的酶促水解获得。

21.如权利要求1至20中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述生物墨水组合物进一步包含离子交联剂。

22.如权利要求21所述的生物墨水组合物，其中，所述离子交联剂包括二价阳离子。

23.如权利要求22所述的生物墨水组合物，其中，所述二价阳离子选自下组，该组由以下各项组成：Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、及其组合。

24.如权利要求1至23中任一项所述的生物墨水组合物，所述生物墨水组合物进一步包含选自下组的一种或多种生物墨水添加剂，该组由以下各项组成：生长促进剂、生长因子、维生素、矿物质、酶、蛋白质、糖、糖醇、酸、碱、盐、缓冲剂、稳定剂、溶解氧、以及抗生素。

25.如权利要求1至24中任一项所述的生物墨水组合物，其中，所述生物墨水组合物对人体细胞是非细胞毒性的。

26.一种制造用于3D生物打印的生物墨水组合物的方法，所述方法包括：

(a)获得呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中所述纳米纤维素晶体(如果存在)的特征在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中所述纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)将所述纳米纤维素与海藻酸盐在水溶液中组合，其中所述海藻酸盐呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐的形式，并且其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的；

(c)将所述水溶液灭菌，或者在制备所述水溶液之前分别将所述纳米纤维素和所述海藻酸盐灭菌；

(d)任选将多种活的人体细胞加入所述水溶液；以及

(e)将所述水溶液回收作为用于3D生物打印的生物墨水组合物。

27.如权利要求26所述的方法，其中，所述纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在于所述生物墨水组合物中。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中，所述海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在于所述生物墨水组合物中。

29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中，所述纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将所述纤维素机械精制以产生所述纳米纤维素。

30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中，所述纳米纤维素呈所述纳米纤维素晶体和所述纳米纤维素原纤维的组合的形式。

31.如权利要求26至30中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，所述灭菌使用选自下组的技术，该组由以下各项组成：蒸汽灭菌、UV灭菌、乙醇灭菌、及其组合，并且其中当所述灭菌使用所述蒸汽灭菌时，步骤(c)在制备所述水溶液之前分别将所述纳米纤维素和所述海藻酸盐灭菌，并且其中所述海藻酸盐是UV灭菌和/或乙醇灭菌的。。

32.如权利要求26至31中任一项所述的方法，所述生物墨水组合物是不含细胞的生物墨水。

33.如权利要求26至31中任一项所述的方法，其中，所述生物墨水组合物是含有活的人体细胞的负载细胞的生物墨水。

34.如权利要求33所述的方法，其中，所述活的人体细胞是人体鼻中隔软骨细胞。

35.如权利要求33所述的方法，其中，所述活的人体细胞以每毫升所述生物墨水组合物从10⁵至10⁷个细胞的细胞浓度存在于所述生物墨水组合物中。

36.一种制造3D打印的生物结构的方法，所述方法包括：

(a)获得呈纳米纤维素晶体、纳米纤维素原纤维、或其组合的形式的纳米纤维素，其中所述纳米纤维素晶体(如果存在)的特征在于至少290℃的纳米晶体热分解起始温度，并且其中所述纳米纤维素原纤维(如果存在)的特征在于至少240℃的纳米原纤维热分解起始温度；

(b)将所述纳米纤维素与海藻酸盐在水溶液中组合，其中所述海藻酸盐呈海藻酸和/或海藻酸盐的盐的形式，并且其中所述海藻酸盐在离子交联剂存在下是可离子交联的；

(c)将所述水溶液灭菌，或者在制备所述水溶液之前分别将所述纳米纤维素和所述海藻酸盐灭菌；

(d)将多种活的人体细胞加入所述水溶液，以形成负载细胞的生物墨水；

(e)将多层的所述负载细胞的生物墨水沉积到基材或表面上；

(f)在步骤(e)期间和/或在步骤(e)之后将所述多层的所述负载细胞的生物墨水暴露于离子交联剂，以离子交联所述海藻酸盐；以及

(g)回收含有所述多层的所述负载细胞的生物墨水的3D打印的生物结构。

37.如权利要求36所述的方法，其中，所述纳米纤维素以从1％(w/v)至10％(w/v)的纳米纤维素浓度存在于所述负载细胞的生物墨水中。

38.如权利要求36或37所述的方法，其中，所述海藻酸盐以从0.1％(w/v)至5％(w/v)的海藻酸盐浓度存在于所述生物墨水组合物中。

39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中，所述纳米纤维素来源于在二氧化硫和乙醇存在下将木质纤维素生物质分级分离以产生纤维素、半纤维素和木质素，随后将所述纤维素机械精制以产生所述纳米纤维素。

40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其中，所述纳米纤维素呈所述纳米纤维素晶体和所述纳米纤维素原纤维的组合的形式。

41.如权利要求36至40中任一项所述的方法，其中，在步骤(c)中，所述灭菌使用选自下组的技术，该组由以下各项组成：蒸汽灭菌、UV灭菌、乙醇灭菌、及其组合，并且其中当所述灭菌使用所述蒸汽灭菌时，步骤(c)在制备所述水溶液之前分别将所述纳米纤维素和所述海藻酸盐灭菌，并且其中所述海藻酸盐是UV灭菌和/或乙醇灭菌的。

42.如权利要求36至41中任一项所述的方法，其中，所述活的人体细胞是人体鼻中隔软骨细胞，并且其中所述3D打印的生物结构含有人体软骨。

43.如权利要求36至42中任一项所述的方法，其中，步骤(e)中的所述沉积使用挤出。

44.如权利要求36至43中任一项所述的方法，其中，在步骤(f)中，在形成所述多层的所述负载细胞的生物墨水的每个之间进行交联。

45.如权利要求36至43中任一项所述的方法，其中，在步骤(f)中，在形成所述多层的所述负载细胞的生物墨水的全部之后进行交联。

46.如权利要求36至45中任一项所述的方法，其中，所述离子交联剂包括二价阳离子，并且其中所述二价阳离子任选选自下组，该组由以下各项组成：Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、及其组合。

47.如权利要求36至46中任一项所述的方法，其中，步骤(f)使用所述离子交联剂的气溶胶，其中将所述气溶胶连续地或周期性地暴露于所述多层的所述负载细胞的生物墨水。

48.如权利要求36至47中任一项所述的方法，其中，所述3D打印的生物结构的特征在于紧密分散在离子交联的所述海藻酸盐内的所述纳米纤维素的相互连接的致密颗粒的多孔3D网络。

49.如权利要求36至48中任一项所述的方法，其中，所述3D打印的生物结构含有在从50纳米至100微米的孔径范围内的纳米纤维素孔。

50.如权利要求36至49中任一项所述的方法，其中，所述3D打印的生物结构选自下组，该组由以下各项组成：耳、鼻、软骨关节、气管环、喉、肋软骨条、或其一部分。

Images