JP5914578B2 - 凍結含水試料をマイクロプローブへ結合する方法 - Google Patents

Description

本発明は、マイクロプローブへ試料を結合する方法に関する。当該方法は、
− 前記試料を供する段階、
− 先端部を有するマイクロプローブを供する段階、
− 接触するまで前記先端部を前記試料へ向けて動かす段階、
− 前記試料の一部を固化した状態を維持しながら前記試料を局所的に融解する段階、及び、
− 前記の局所的に融解した試料を凍結させて前記先端部に取り付ける段階、
を有する。

本発明はさらに、当該方法を実行するように構成された装置に関する。

当該方法は特許文献1から既知である。

特許文献1に記載の方法は、極低温で鋭い先端部を有するマイクロプローブが凍結含水試料−たとえばガラス化した生体試料−と接触する方法について記載している。続いて先端部は、一時的に水の融点よりも高い温度に加熱される。加熱はたとえば、抵抗加熱又はレーザービームによる加熱により実現される。これに続いて、先端部は再度冷却される。その結果、含水試料は凍結して先端部に結合する。加熱と冷却は、試料の少なくとも一部が凍結状態−より具体的にはガラス化状態−を維持するのに十分な速さで行われる。

係るガラス化試料はたとえば、電子顕微鏡内で検査される生体細胞組織であって良い。係る試料は通常、集束イオンビーム装置を用いて切り出され、その後電子顕微鏡を用いたさらなる検査のために試料キャリアへ搬送される。

既知の方法の欠点は、先端部の加熱部分の熱容量に起因して、試料の一部が融解する、すなわちガラス化した状態でなくなってしまうことである。

欧州特許出願公開第2009422B1号明細書 欧州特許第2402477A1号明細書

試料のごく一部が融解するすなわちガラス化状態でなくなる結合方法が必要である。

上記目的のため、本発明による方法は、前記局所的に融解する段階が前記先端部の振動によって実現され、かつ、前記の局所的に融解した試料は、前記振動が止まったときに凍結して前記先端部に結合することを特徴とする。

前記先端部の振動によって、前記先端部と前記凍結試料は互いに摩擦される。このように摩擦を受ける結果、前記凍結試料は局所的に融解する。その後前記摩擦が止まると、前記試料の溶融部分は凍結して前記先端部に結合する。前記試料と前記先端部だけが前記摩擦によって加熱されるので、前記摩擦によって誘起される熱は迅速に取り去られる。前記の取り去られる熱の大半は前記先端部と境界をなす部分内に存在するので、前記部分は低温（前記試料材料の融点より低い温度）に保持される。

他の方法は特許文献2から既知であることに留意して欲しい。この既知の方法では、試料は、微細集束されたイオンビームを生成する集束イオンビーム鏡筒及び試料の融点よりも低い融点を有する気体の噴流を生成する気体注入系を備える装置の試料チャンバ内に設けられる。試料に結合する気体分子は、試料に結合する部分と試料チャンバから押し出される揮発部分とに分かれる。使用される気体の例は、試料と先端部との間に炭素結合を生成するプロパンである。

この方法の欠点は、イオンビーム鏡筒と試料を先端部に結合させる気体注入系を必要とすることである。

ある実施例では、固体試料は、凍結含水試料、ガラス化試料、又はポリマーである。

前記試料は、「生体試料」としても知られ、電子顕微鏡において非常に関心が持たれている。電子顕微鏡において、これらの試料は、細胞、細胞片、バクテリア、ウイルス、酵素、及びタンパク質を含む。

好適実施例では、前記試料はガラス化含水試料又はガラス化ポリマーで、前記試料は前記試料のガラス転移温度よりも低い温度で供され、かつ、前記試料の一部は当該方法を実施する間中前記試料材料のガラス転移温度より低い温度に保たれ、その結果前記試料の一部はガラス化したままである。

特にガラス化した生体試料（含水試料又はポリマー）をマイクロプローブに取り付ける方法を用いることは有効であることがわかった。ガラス化生体試料は通常、極低温顕微鏡(cryo-EM)−より具体的には極低温透過型電子顕微鏡(cryo-TEM)−において用いられる。ガラス化した氷又はガラス化ポリマーは、生体構造−たとえばメンブレン−を損傷させる恐れのある結晶を有しないためである。

さらに他の実施例では、前記先端部は金属先端部である。

マイクロプローブは一般的には、金属先端部、たとえばタングステン又はタングステン/ニッケルのニードルを備える。

さらに他の実施例では、前記先端部は、接触している間に振動している。

この実施例は、前記接触がいつなされるのかを厳密に観測することを可能にする。なぜならそのときに前記振動の振幅が変化するからである。

さらに他の実施例では、前記振動の周波数は1乃至100kHzである。

これらは、たとえば圧電アクチュエータによって容易に実現される周波数である。エネルギーの移送が最大となるように、接触時に腹が存在する周波数が選ばれることが好ましい。

さらに他の実施例では、前記振動の振幅は10nm乃至200nmである。

さらに他の実施例では、前記先端部は、前記試料の表面に平行な面内で振動する。

この実施例は、前記先端部が前記試料を叩くのではなく、前記試料にわたって摩擦されることを記載している。叩く場合も摩擦する場合も、エネルギーが移送され、かつ、局所的な融解が実現される。しかし摩擦する方が、より制御できることがわかった。

さらに他の実施例では、前記結合は排気されたチャンバ内−より具体的には荷電粒子装置の試料チャンバ内−で行われる。

明らかに当該方法は非凝集環境内で行われなければならない。具体的には水のガラス転移温度より低い温度では、排気されたチャンバが好ましい。

他の実施例では、前記荷電粒子装置は、電子鏡筒及び/又は集束イオンビーム鏡筒を有する。

前記荷電粒子装置が集束イオンビーム鏡筒を備えることで、集束イオンビームによるミリング又はエッチングが可能となる。前記イオンビームは前記試料の撮像及びプロセスにも用いられ得るが、SEM鏡筒の方が好ましい。なぜならSEM鏡筒は、集束イオンビーム鏡筒よりも信号対雑音比が大きく、かつ、分解能も高いからである。

本発明のある態様では、荷電粒子装置と併用されるマイクロプローブであって、前記荷電粒子装置は試料保持するように構成された試料位置を有し、前記マイクロプローブは先端部を有し、前記マイクロプローブは、前記先端部を前記試料に接触させる位置設定手段を備え、前記先端部は振動するように構成され、前記先端部は、振動するときに前記試料を局所的に融解させ、前記の局所的に融解した試料は、前記振動が止まったときに凍結して前記先端部に結合することを特徴とする。

前記マイクロプローブの他の実施例では、前記先端部は-50℃−より具体的にはガラス化した氷のガラス転移温度よりも低い温度−よりも低い温度に冷却されるように構成される。

さらに他の実施例では、集束イオンビーム鏡筒及び/又は電子ビーム鏡筒を備える荷電粒子装置であって、試料位置が極低温でガラス化した生体試料を保持するように構成され、前記荷電粒子装置は先端部を有するマイクロプローブを備え、前記マイクロプローブは、前記先端部を前記試料に接触させる位置設定手段を備え、前記先端部は振動するように構成され、前記先端部は振動するときに前記試料を局所的に融解し、前記の局所的に融解した試料は、前記振動が止まったときに凍結して前記先端部に結合する。

他の実施例では、前記荷電粒子装置は、前記試料を-50℃よりも低い温度−より具体的にはガラス化した氷のガラス転移温度よりも低い温度−に保つように構成され、かつ、前記マイクロプローブの先端部は、前記試料を-50℃よりも低い温度−より具体的にはガラス化した氷のガラス転移温度よりも低い温度−まで冷却されるように構成される。

本発明による方法の典型的実施例を表すフローチャートを示している。 典型的なデュアルビームシステムを表している。

ここで図面を用いることによって本発明を明らかにする。図中、同一参照番号は対応する部位を表す。

段階1では、ガラス化した試料が、冷却された台を備えるデュアルビーム装置内に導入される。ガラス化した試料は、薄い試料を極低温流体−たとえばプロパン−中に沈めることにより、又は、高圧凍結法によって作成されて良い。いずれの方法も既知である。試料をガラス状態に保持するため、試料は水のガラス転移温度よりも低い温度−約-137℃−に保たれなければならない。このことは、台は低温に保たれなければならないこと、及び、試料が温まるのを防止するための極低温シールドが存在しなければならないことを意味する。通常台と極低温シールドは、液体窒素温度に保たれる冷却シンクとなる編組物によって冷却される。

段階2では、試料小片が切り出される。一般的にはこれは、イオンビームミリングによって行われる。通常試料小片は、ブリッジを介して一の位置で試料に取り付けられ、その後試料から取り外される。あるいはその代わりにブリッジはミリングによって除去される。ミリングは、エッチャントが試料へ向かう間に実行されて良い。エッチャントは、ミリング速度を向上させるか、又は、好適方向へのミリングを促進する。

段階3では、マイクロプローブが試料と接触する。マイクロプローブは、その時点で既に振動していて良い。既に振動しているマイクロプローブを試料に接触させることの利点は、先端部がいつ試料と接触するのかの観測が容易なことである。なぜなら接触は、振幅を変化させるからである。

段階4では、マイクロプローブは試料小片を摩擦する。先端部（ニードル）は、剛性部材として振る舞う必要はなく、かつ、節と腹が存在して良いことに留意して欲しい。よって接触時には、先端部は節と一致しないのが観測される。摩擦地点では（ほとんど）エネルギーが発生しないためである。

一般的には融解は観測できず、摩擦時間は実験データに基づくことにさらに留意して欲しい。本願発明者等が行った実験における試験用手段では、2〜5秒の摩擦時間が、20kHzの振動周波数及び50nmの振動振幅で満足行く時間であることがわかった。

段階5では、摩擦が止められ、かつ、試料小片はマイクロプローブの先端部周辺で凍結することが可能となる。

段階6では、試料小片が試料から取り外される。さらに検査するため、試料小片はたとえば、TEM用試料キャリアへ移動されて良い。又は試料は、薄くされて、その後試料キャリア上に設けられても良い。

図2は、本発明による方法を実行する典型的デュアルビームSEM/FIBシステム100を概略的に示している。適切なデュアルビームシステムは、本願出願人であるFEIカンパニーから市販されている。適切なハードウエアの例が以降で与えられるが、本発明は如何なる特別な型のハードウエアでの実施にも限定されない。

デュアルビームシステム100は、垂直に載置された電子ビーム鏡筒101、及び、排気可能な試料チャンバ103の垂直位置から約52°の角度をなして載置される集束イオンビーム(FIB)鏡筒102を有する。試料チャンバは、たとえばターボ分子ポンプ又は他の既知の排気手段（図示されていない）−油拡散ポンプ、イオンゲッターポンプ、スクロールポンプ等−によって排気されて良い。

電子ビーム鏡筒101は、電子ビーム112を生成する電子源110を有する。電子光学収束レンズ114a,114b及び対物レンズ116は、試料104上に電子ビームを微細集束させるのに用いられる。対物レンズ116は、静電浸漬レンズを有し、好適には磁気レンズをも有する。それにより電子ビーム112は、静電浸漬電場と磁場の両方によって集束される。電子ビームは、偏向コイル118aと118bによって試料表面上に位置設定され、かつ、試料（基板としても知られている）の表面にわたって走査されて良い。レンズ及び偏向ユニットは、電場を利用して電子ビームを操作することが可能で、かつ/又は、磁場が用いられ得ることに留意して欲しい。

デュアルビームシステム100はまた、イオンビームを生成するイオン源120を有する集束イオンビーム(FIB)鏡筒102をも有する。イオン光学収束レンズ124a,124b及び対物レンズ126は、イオンビームを試料104上で微細集束させるのに用いられる。イオンビームは、偏向器128aと128bによって、試料104の表面上で位置設定され、かつ、試料104の表面にわたって走査されて良い。イオンの特性（質量対電荷比）に起因して、レンズと偏向器は一般的には本質的には静電的である。

電子ビーム112とイオンビーム122は試料104上に集束されて良い。試料104は、真空チャンバ103内部において可動X-Y-Z台105の形態をとる試料マニピュレータの平坦面上に載置される。

鏡筒101と102は、イオンビーム122と電子ビーム112との間で交差位置106を生成するように位置合わせされる。試料はこの交差位置に設けられることが好ましい。

（引っ込め可能な）気体注入系(GIS)142が真空チャンバに載置される。GISは、前駆体材料を保持する容器（図示されていない）及び前駆体材料を基板表面へ案内するニードル144を有する。GISは、基板への前駆体材料の供給を制御する手段をさらに有する。この例では、制御手段は調節可能バルブ143として表されている。しかし制御手段はたとえば、前駆体材料の制御しながら加熱する形態をとっても良い。

引っ込め可能で位置設定可能なマイクロマニピュレータ145がさらに真空チャンバに載置される。マイクロマニピュレータ145は、真空チャンバ内に設けられる遠端備える先端部146を有する。先端部146の遠端はたとえば、試料の検査又はたとえば（イオンビーム、電子ビーム、又はレーザービームを用いた）ビーム誘起堆積を利用した試料（の一部）の接合に用いられる。

電子ビーム内の電子が試料104に衝突するとき、2次電子(SE)及び後方散乱電子(BSE)が放出される。SEは50eV未満のエネルギーで試料から放出される電子と定義される一方、BSEは50eV超のエネルギーで試料から放出される電子と定義される。SEとBSEの少なくとも一部は電子検出器140−たとえばEverhart-Thornley型検出器−又は鏡筒内に載置される−より好適には対物レンズ116内に載置される−鏡筒内検出器によって検出される。検出器は低エネルギー電子及び後方散乱電子の検出が可能である。係る検出器はシンチレータに基づいて良いし、又は、半導体デバイスとして形成されて良く、かつ、係る検出器は区分化されても良いしされなくても良いことに留意して欲しい。

SE及びBSEに加えて、他の種類の放射線−たとえばX線、可視光等−も放出されることに留意して欲しい。これらの種類の放射線もまた適切な検出器を用いて検出されうる。

検出器の信号はシステム制御装置130へ供給される。前記システム制御装置はまた、偏向器信号、レンズ、電子源、GIS、台、（複数の）ポンプ、及び他の部材−GIS及びマイクロマニピュレータ145を含む−をも制御する。よってシステム制御装置は、走査パターン又は定常状態の偏向のいずれかを利用することによってイオンビームと電子ビームの両方を試料上の特定の位置へ案内することができる。ビームの位置情報を利用し、かつ、検出器の情報を利用することによって、制御装置はモニタ上に試料の像を生成することができる。

システム制御装置はまた、たとえば利得を制御することによって検出器を制御することに留意して欲しい。

筐体内検出器141は、電子ビーム112を通過させる中心孔を有することに留意して欲しい。

検出器−たとえば検出器140−は、検出効率の最適化又はたとえば他の種類の検出器を必要とする観測中での他の部材のための空間を作るために真空チャンバ内で位置設定されて良いことに留意して欲しい。

台105は、試料及び/又は1つ以上のTEM試料ホルダを支持して良い。それにより試料のごく一部がその試料から取り出され、かつ、TEM試料ホルダへ移されうる。台105は、平行面（X軸とY軸）内及び垂直方向(Z軸)で移動可能であることが好ましい。台105の温度は、台105が備え得る冷却手段（図示されていない）によって降温されて良い。たとえば編組物が台105と液体窒素のデュワーとを熱的に接続して良い。台105はまた、約60以上の角度に傾斜することが可能で、かつ、Z軸の周りで回転することが可能である。一部の実施例では、別個のTEM試料台（図示されていない）が用いられて良い。

ポンプは、電子ビーム鏡筒101、イオンビーム鏡筒102、及び真空チャンバ103を排気するのに用いられる。真空ポンプは一般的には、チャンバ103内部で約3×10^-5mbarの真空度を供する。適切な前駆体気体が試料表面上に導入されるとき、チャンバの背圧は典型的には5×10^-5mbarまで上昇しうる。しかし湿気を含む試料の観測及び「加工」を可能にする1〜10mbar程度の高さの圧力を用いることが知られている。

マイクロマニピュレータ145−たとえばオムニプローブ社製のAutoProbe200（商標）−は真空チャンバ内で対象物を厳密に移動させることができる。マイクロマニピュレータは、真空チャンバ内に設けられた遠端のX,Y,Z及びθ制御を供するように真空チャンバ外部に設けられる精密電気モータを有して良い。マイクロマニピュレータは、小さな対象物を操作するため、様々なエンドエフェクタに適合して良い。本願で述べる実施例では、エンドエフェクタは細いプローブである。当技術分野において既知であるように、マイクロマニピュレータ（又はマイクロプローブ）は、分析のため、（一般的にはイオンビームによって基板から解放された）TEM試料をTEM試料ホルダへ搬送するのに用いられて良い。

マイクロマニピュレータ145又はマイクロプローブは、冷却手段（液体窒素温度で冷却シンクに接続する編組物）と圧電アクチュエータを備える。圧電アクチュエータは、先端部（エンドエフェクタ）を要求される周波数と振幅で振動させることを可能にする。ここで標準的に利用可能なマイクロマニピュレータは、本発明によるマイクロマニピュレータに変化する。

たとえばポリマーを観察するとき、液体窒素温度にまで冷却するのではなく、ペルチェ素子によってたとえば-50℃に冷却すれば十分であることに留意して欲しい。当該方法はまた、かなり高い温度（室温以上）で用いられて良い。しかしここではIBIDは、既に十分であることがわかっているし、十分許容されうる技術である。

よって好適実施例では、本発明は約-137℃のガラス転移温度より低い温度のガラス状生体試料を、前記ガラス転移温度よりも低い温度に保たれているマイクロマニピュレータへ結合する方法に関する。従来技術に係る方法が、たとえばプロパン又は加熱されたニードル（抵抗加熱又はレーザーにより加熱された）と共にIBIDを用いた場合、本発明は、振動するニードルを用いて前記試料を局所的に融解する。前記振動を止めることによって、前記試料は凍結して前記マイクロマニピュレータへ結合する。前記の加熱された部分の熱容量は小さいので、ガラス状態にとどまる材料の量は多い。

100 デュアルビームSEM/FIBシステム
101 電子ビーム鏡筒
102 イオンビーム鏡筒
103 試料チャンバ
104 試料
105 台
106 交差位置
110 電子源
112 電子ビーム
114 電子光学収束レンズ
116 対物レンズ
118 偏向コイル
120 イオン源
122 イオンビーム
124 イオン光学収束レンズ
126 対物レンズ
128 偏向器
130 システム制御装置
134 電源
140 電子検出器
141 筐体内検出器
142 気体注入系(GIS)
143 調節可能バルブ
144 ニードル
145 マイクロマニピュレータ
146 先端部

Claims (19)

1. マイクロプローブへ試料を結合する方法であって：
   前記試料を供する段階；
   先端部を有するマイクロプローブを供する段階；
   接触するまで前記先端部を前記試料へ向けて動かす段階；
   前記試料の一部を固化した状態を維持しながら前記試料を局所的に融解する段階；及び、
   前記の局所的に融解した試料を凍結させて前記先端部に取り付ける段階、
   を有し、
   前記局所的に融解する段階が前記先端部の振動によって実現され、かつ、前記の局所的に融解した試料は、前記振動が止まったときに凍結して前記先端部に結合する、
   ことを特徴とする方法。
2. 前記試料が、凍結含水試料、ガラス化試料、又はポリマーである、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料はガラス化含水試料又はガラス化ポリマーで、
   前記試料は前記試料のガラス転移温度よりも低い温度で供され、かつ、
   前記試料の一部は当該方法を実施する間中前記試料材料のガラス転移温度より低い温度に保たれ、その結果前記試料の一部はガラス化したままである、
   請求項１に記載の方法。
4. 前記先端部が金属先端部である、請求項１に記載の方法。
5. 前記先端部が、接触している間に振動している、請求項１に記載の方法。
6. 前記振動の周波数は１乃至１００ｋＨｚである、請求項１に記載の方法。
7. 前記振動の振幅は１０ｎｍ乃至２００ｎｍである、請求項１に記載の方法。
8. 前記先端部が、前記試料の表面に平行な面内で振動する、請求項１に記載の方法。
9. 前記結合は排気されたチャンバ内、より具体的には荷電粒子装置の試料チャンバ内で行われる、請求項１に記載の方法。
10. 前記荷電粒子装置が電子鏡筒及び／又は集束イオンビーム鏡筒を有する、請求項１に記載の方法。
11. 荷電粒子装置と併用されるマイクロプローブであって、
    前記荷電粒子装置は試料保持するように構成された試料位置を有し、
    前記マイクロプローブは先端部を有し、
    前記マイクロプローブは、前記先端部を前記試料に接触させる位置設定手段を備え、
    前記先端部は振動するように構成され、
    前記先端部は、振動するときに前記試料を局所的に融解させ、
    前記の局所的に融解した試料は、前記振動が止まったときに凍結して前記先端部に結合し、
    前記先端部が−５０℃よりも低い温度に冷却されるように構成される、
    ことを特徴とするマイクロプローブ。
12. 集束イオンビーム鏡筒及び／又は電子ビーム鏡筒を備える荷電粒子装置であって、
    試料位置が極低温でガラス化した生体試料を保持するように構成され、
    先端部を有するマイクロプローブを備え、
    前記マイクロプローブは、前記先端部と前記試料とを接触させる位置設定手段を備え、
    前記先端部は、振動時に前記試料を局所的に融解するように振動する、
    荷電粒子装置。
13. 前記試料を−５０℃よりも低い温度に保つように構成される請求項１２に記載の荷電粒子装置であって、
    前記マイクロプローブが請求項１１に記載のマイクロプローブである、
    荷電粒子装置。
14. システム制御装置をさらに有する請求項１２に記載の荷電粒子装置であって、
    前記システム制御装置は：
    前記試料を供する命令；
    先端部を有するマイクロプローブを供する命令；
    接触するまで前記先端部を前記試料へ向けて動かす命令；
    前記試料の一部を固化した状態を維持しながら前記試料を局所的に融解する命令；及び、
    前記の局所的に融解した試料を凍結させて前記先端部に取り付ける命令、
    を有し、
    前記局所的に融解する段階が前記先端部の振動によって実現され、かつ、前記の局所的に融解した試料は、前記振動が止まったときに凍結して前記先端部に結合する、
    荷電粒子装置。
15. 前記試料はガラス化含水試料又はガラス化ポリマーで、
    前記試料は前記試料のガラス転移温度よりも低い温度で供され、かつ、
    前記試料の一部は当該方法を実施する間中前記試料材料のガラス転移温度より低い温度に保たれ、その結果前記試料の一部はガラス化したままである、
    請求項１４に記載の荷電粒子装置。
16. 前記先端部が金属先端部である、請求項１２に記載の荷電粒子装置。
17. 前記先端部が、接続されている間に振動する、請求項１４に記載の荷電粒子装置。
18. 前記先端部が、前記試料の表面に対して平行な面内で振動する、請求項１４に記載の荷電粒子装置。
19. 請求項１４に記載の荷電粒子装置であって、
    結合が当該荷電粒子装置の真空チャンバ内で行われる、
    荷電粒子装置。

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