JP5897774B2 - 生体試料の冷凍保存用基板装置、冷凍保存装置、および冷凍保存方法 - Google Patents

Description

本発明は、生体細胞を含む生体試料の冷凍保存を行い、生体試料を入れる培養面と、培養面および培養液を入れるチャンバとを特に備える基板装置に関する。また、本発明は、かかる基板装置を少なくとも１つ備える冷凍保存装置に関する。また、本発明は、上記基板装置または冷凍保存装置を用いて行われる、生体細胞を含む生体試料の冷凍保存方法に関する。本発明は、生体細胞の冷凍保存、特に、ヒトＥＳ細胞などの幹細胞、または卵母細胞などの胚細胞の冷凍保存に用いられる。

ヒトＥＳ細胞（ｈＥＳＣ）を長期間保存するために、冷凍保存（凍結状態での保存）を行うことが知られている。例えば、指定方法の１つに「緩慢凍結」があり、他の細胞型で用いられる十分に試行された冷凍保存方法がｈＥＳＣに適用される。細胞は培養面から分離され、試料容器内において凍結防止剤（例えば、１０％のＤＭＳＯ）を加えられ、ゆっくりとした冷却速度で浮遊状態で凍結される。試料は、例えば水槽に入れて解凍することで復元される（例えば「Biotechnol. Appl. Biochem.」ｖｏｌ．４１，２００５年，９７-１０４頁のＢ．Ｃ．Ｈｅｎｇ他を参照のこと）。「緩慢凍結」方法には、低有効性と低信頼性、培養面から細胞を分離する際の化学的および機械的ストレス、低細胞生存率、および解凍された細胞の機能性に限界がある点において問題がある。よって、解凍後、細胞は培養面の限られた範囲内でしか培養することができず、再培養には長時間かかる。

「緩慢凍結」に対する既知の代替方法としては、ガラス化による冷凍保存があり（ほぼ瞬間冷凍、または急速冷凍）、ガラス化を実現するために極めて高速な冷却速度で細胞が凍結される（例えば−１３０℃）。冷却速度は、例えば「Cryobiology」ｖｏｌ．６３（１），２０１１年，３２頁のＭ．Ｓａｎｓｉｎｅｎａ他（「Numerical simulation of cooling rates in vitrification systems used for oocyte cryopreservation」）により評価される。ガラス化の一般的な問題は、氷晶の形成を防ぐために高濃度の凍結防止剤が必要となることであるが、こうした凍結防止剤は、毒性作用を有して冷凍保存の成果を損なうことが多い。

冷却速度が極めて高速であるために、従来のガラス化では試料（細胞および低温培地）は少量に制限される。従来の場合、概ね、量が少ないほど試料の表面積対体積率が大きくなり、試料と冷却媒体との間の距離が短いほど良好なガラス化の確率が高まる。

従来のガラス化のもう１つの一般的な限界は、ライデンフロスト現象に由来する。この現象は、温かい面が液体窒素と接触するときの気泡の形成により見分けられる。冷却速度を下げ、よって良好なガラス化の可能性も低下する絶縁領域が形成される。

また、従来のガラス化では、大きくかつ急激な温度差に耐えることが期待される材料への要求が高い。ガラス化基板の場合、部品のクラッキングやずれが、細胞傷害を引き起こしたり試料の無菌状態を低くしたりすることがある。そのため、材料の損害を防ぎ摩耗を最小限とする適切な材料または方法を見つけることには関心がよせられている。

例えば、既知の方法の１つにストロー内ガラス化があり、細胞が培養面から分離され、低温培地でのインキュベーションの後で、開放または閉鎖ストロー、任意でプラスチックピンの先端、に運ばれる（「Mol. Reprod. Dev.」ｖｏｌ．５１，１９９８年，５３-５８頁のＧ．Ｖａｊｔａ他、「Stem Cells」ｖｏｌ．２２，２００４年，７７９-７８９頁のＭ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ他、「Theriogenology」ｖｏｌ．６７，２００７年，７３−８０頁のＭ．Ｋｕｗａｙａｍａ他、「Reprod. Biomed. Online」ｖｏｌ．１１，２００５年，６０８−６１４頁のＭ．Ｋｕｗａｙａｍａ他）。

ストロー内ガラス化では生存率に優れるが、多くの量の取り扱いには適していない。極めて少量の試料と、最大化された表面積対体積率と、により、一度にガラス化可能な細胞の量は大幅に減少する。ストローの厚みは、直径が大きすぎると表面積対体積率が良好なガラス化には好ましくないものとなるため、かなり制限される。ストローを長くすれば表面積対体積率を維持することができるが、取り扱いの関係で、試料インキュベーション時間が非常に長くなり細胞傷害につながることになる。

また、ストロー内ガラス化は、非常に高価であり、またその成果は操作者個人の専門技能に大きく依存する。この方法の問題は、特に試料の取扱いが難しいことによるものであり、高濃度の有毒な凍結防止剤でのインキュベーション時間の調整における間違いや、凍結および解凍の際の高細胞消失が起こる可能性がある。また、これらの方法によってガラス化可能な細胞の数は、極めて限定的である。

別の既知のガラス化方法では、いわゆる「クライオループ」が用いられる。クライオループを用いることで、細胞を含む試料の液滴がピンの端部のプラスチックリングに保持され、液体窒素に浸される（−１９６℃）（「Fertil. Steril.」ｖｏｌ．７２，１９９９，１０７３−１０７８頁のＭ．Ｌａｎｅ他）。この方法の問題は、試料と窒素との直接接触と、窒素中の不純物による細胞のコンタミネーションの危険性と、によるものである。

別の既知のガラス化として、接着状態の細胞が培養面でガラス化する接着ガラス化がある（「Cryobiology」ｖｏｌ．６３，２０１１，１７５-１８５頁のＡ．Ｆ．Ｂｅｉｅｒ他）。Ａ．Ｆ．Ｂｅｉｅｒにより提案されるこの方法を、図１１に模式的に示す（先端技術）。まず、生体細胞２’が基板プラットフォーム１０’に接着状態で培養される。基板プラットフォーム１０’は、培養液３’の入った容器２０’に配置される（図１１Ａ）。培養液３’は、例えば栄養媒体と少なくとも１種類の凍結防止剤とを含む。生体細胞２’をガラス化するために、冷却媒体４’としての液体窒素の入った別の容器３０’に基板プラットフォーム１０’が移される（図１１Ｂ）。容器３０’において細胞２’のガラス化が起こる。永久保存するためには、基板プラットフォーム１０’は窒素タンク６０’内の液体窒素４’の蒸気の中に置かれる（図１１Ｃ）。

この方法にも、やはり、試料と窒素との直接接触と、その結果としての窒素中の不純物による細胞のコンタミネーションの危険性と、による問題がある。特に、微生物によるコンタミネーションのリスクにより、臨床用途の可能性が大きく制限される（「Reprod. Biomed. Online」ｖｏｌ．２４，２０１２，１８０−１８５頁のＤ．Ｓｔｏｏｐ他）。液体窒素による殺菌方法も存在するが、時間もコストもかかる。

製造直後の液体窒素の純度は高く、市販時には実際には製剤品質を有しているが、運搬中や保管中に微生物やそのほかの不純物によるコンタミネーションが起こる可能性がある。コンタミネーションは、液体窒素の表面におけるエアロゾル形成により気相にも伝わることがあり、空気の質を損なう。ろ過による液体窒素の浄化方法は煩雑であり、実際には十分な信頼性がないことがわかっている。

容易に実施可能で、特に低温培地におけるインキュベーション時間の厳守に対する要求があまり厳格でないガラス化方法には関心が寄せられている。また、より費用対効果が優れ、労働集約性が低く、効率的な方法でｈＥＳＣを利用するための冷凍保存の自動化に関心が寄せられている。例えば、自動バイオバンクは、多数の患者または生命体からの幹細胞の保存と使用を可能にする。

また、良好に冷凍保存を行うために、例えばストロー内でのガラス化および解凍の後であって、例えば実験や治療の用途で利用される前に、細胞が培養面で再成長可能であることが望ましい。冷凍保存の効率を最大限にするよう解凍から使用までの時間を最小限にすることに、関心が寄せられている。

従来の培養方法では、多くの場合、冷凍保存前に接着状態にある細胞を分離または培養することができない。冷凍保存に対する要求を高める懸滴培養についても、ここで明確に述べておく。これらの培養技術とともに用いることができる新規な冷凍保存技術の可能性は、非常に有益であり、新たな利用方法の余地を作り出す。

ＵＳ５２５７１２８は、１００℃から−１００℃の範囲で制御可能な温度での液体培地における凍結および解凍の際に細胞を観察するクライオベンチを開示する。しかしながら、クライオベンチは、培養目的にも試料のガラス化にも適さない。ＤＥ６９６３３８５４Ｔ２は、皿部と、組織等価物を固定する膜による支持部と、蓋部とを備える容器を用いた、低温で培養された組織等価物の維持・保存の方法およびパッケージを開示する。この容器もまた、培養目的にも試料のガラス化にも適さない。培養容器は、ＵＳ５６５０３２５、ＷＯ９６４０８５８Ａ１、ＧＢ１５３９２６３Ａ、に開示されているが、冷凍保存を目的として設計されたものではない。

本発明の目的は、生体細胞を含む生体試料の冷凍保存ために改良された基板装置および方法を提供することであり、この装置および方法により、従来の生体試料の冷凍保存技術の問題および制限が排除または最小化される。本発明の別の目的は、生体試料の冷凍保存用の基板装置を少なくとも１つ備える、改良された冷凍保存装置を提供することである。特に、本発明により、一度により多くの試料を貯蔵することができ、貯蔵条件を再現可能に調整できるようにし、試料のコンタミネーションの可能性の排除と、生体試料のガラス化と、のうち少なくともいずれかを可能とする冷凍保存技術が提供される。

上記の目的は、独立請求項の特徴を有する基板装置、冷凍保存装置、および方法によって実現される。本発明の好適な実施形態および用途については、従属請求項に記載される。

本発明の第１の様態において、上記の目的は、特に生体細胞を含む生体試料の冷凍保存のための、培養面を有する基板プラットフォームと、基板プラットフォームの培養面を有し、培養液を入れるよう構成された第１チャンバと、を備える基板装置を提供する、一般的な技術的教示によって実現される。本発明によれば、基板装置は、温度制御媒体（冷却媒体または加熱媒体）を入れるよう構成された第２チャンバを備える。本発明によれば、第１チャンバおよび第２チャンバは、連結されている。両チャンバは、基板プラットフォームが第１チャンバの内部と第２チャンバの内部との間の分割壁となるよう、互いに隣接して接続される。第１チャンバ（または第１容器や培養区画）は、好ましくは平坦な広がりを有する培養面を含む。培養面は、接着細胞培養物または懸滴培養物を入れるのに適した生物学的適合性材料からなる面である。第２チャンバ（または第２容器、窒素区画）は、基板プラットフォームによって第１チャンバから区切られている。第１チャンバの生体試料は、周囲、特に第２チャンバの温度制御媒体から、分離されている。液状または気体状の物質間の交換は除外される。

好都合には、第１チャンバと第２チャンバとの間に設けられた本発明の基板プラットフォームは、同時に複数の機能を果たす。まず、基板プラットフォームの前面に培養面の広がりが配され、この培養面により、非常に高い表面積対体積率で生体試料を入れることができる。培養面のサイズの選択には制限がなく、例えばストロー内冷凍保存の場合に比べると、極めて多量の試料を冷凍保存することができる。

次に、基板プラットフォームは、培養面の層方向に延びる固体要素である。基板プラットフォームは、基本的には培養面に垂直、すなわち基板プラットフォームの厚み方向にはあまり伸びないため、温度制御媒体から生体試料への熱伝達の点では、試料と温度制御媒体との間の距離は無視できるほどのものである。基板プラットフォームは、第１チャンバに面した前面が培養面となり、反対側の第２チャンバに面した背面が第２チャンバの蓋となる、シート、フィルム、または層状の材料からなる。

第３に、基板プラットフォームは、生体試料と温度制御媒体との間、特に生体試料と液体窒素との間を確実に分離する。これにより、従来の技術と比較して、温度制御媒体を浄化するために特別な予防措置をとる必要がなく、信頼性の向上した基板装置を、新しい用途、特に医療や生物工学上の用途において利用できるようにする。

本発明の第２の様態において、上述の目的は、第１ステップにおいて特に培養された生体細胞が第１チャンバの培養液中で基板プラットフォームの培養面に配置され、第２ステップにおいて第１チャンバに隣接する第２チャンバに冷却媒体を充填することにより第１チャンバと第２チャンバとの間の分割壁となる基板プラットフォームの温度を低下させて生体試料を凍結状態に変換させる、生体試料の冷凍保存方法を提供する一般的な技術的教示によって実現される。好ましくは、この方法は、上述した本発明の第１の様態に係る基板装置を用いて行われる。好ましくは、第２チャンバに冷却媒体を充填することにより、生体試料のガラス化が実現するように、生体試料を保持する基板プラットフォームの温度が急速に低下する。

本発明の方法は、種類の異なる生体試料を用いて行われてもよい。「生体試料」という用語は、生体細胞および培養液の任意の組成を指す。培養液は、細胞の周囲の液膜または液滴となる。生体細胞は、分離された細胞、細胞群、または細胞コロニーであり、特に接着状態または浮遊状態にある。生体試料は、１種類の細胞（同一の細胞）を含むものであってもよく、例えば幹細胞および分化した細胞など、異なる種類の細胞を含むものであってもよい。本発明の好都合な変形例において、例えば、接着状態であって異なる種類の細胞を、冷却媒体の影響で凍結が起こるよりも前に培養面で共通に培養（共培養）することができる。一般に、培養液（低温培地）は、少なくとも１種類の栄養媒体と、例えばＤＭＳＯ、プロパンジオール、エチレン・グリコールのような少なくとも１種類の凍結防止剤と、を含む。凍結防止剤の組成は、特に、ＤＭＳＯ２０％、エチレン・グリコール２０％、トレハロース３００ｍＭであってもよい。単一の培養液を一度に、またはそれぞれ異なる栄養媒体および／または凍結防止剤を含む複数の培養液を連続して用いてもよい。

本発明の方法において特に好都合な点は、本発明の技術を用いることで、先に説明したライデンフロスト現象による問題が最小限に抑えられることにある。冷却媒体が第２チャンバに充填される際に徐々に形成される気泡は全て第２チャンバの上部に集まり、よって基板プラットフォームから取り除かれる。したがって、不必要な断熱領域の形成が防止される。

本発明の第３の様態において、上述の目的は、上述した本発明の第１の様態に記載の基板装置を少なくとも１つと、当該少なくとも１つの基板装置を入れて回転（旋回）するよう構成される回転装置と、を備える冷凍保存装置を提供する、一般的な技術的教示によって実現される。基板装置は、冷凍保存装置内に回転可能に配置される。本発明によれば、基板装置は、回転装置により、垂直方向すなわち重力方向における第１チャンバおよび第２チャンバの配置に関して異なる状態間で回転（旋回）することができる。回転装置により、基板装置は、第１チャンバが第２チャンバの垂直方向上方に配置されて基板プラットフォームが第１チャンバの床部となった状態である培養状態と、第２チャンバが第１チャンバの上方に配置されて基板プラットフォームが第２チャンバの床部となった状態である温度制御状態と、の間を旋回することができる。

本発明の好適な用途によれば、基板装置は、培養面の生体試料のガラス化を行うよう構成される。このため、基板プラットフォームの厚みおよび熱伝導率は、好ましくは第２チャンバ内に露出している基板プラットフォームの背面が、例えば−１３０℃以下など試料のガラス転移温度より低い温度の冷却媒体、特に液体窒素で濡れている場合、生体試料の温度が即座に冷却媒体の温度とされるように選択されることが好ましい。試料のガラス転移温度は例えば約−１３０℃であるが、濃度や例えば気圧などの条件によっては、これよりも高くても低くてもよい。基板プラットフォームの厚みおよび熱伝導率は、特に、マイナス５０００°／ｓ、特に好ましくはマイナス３７，５００°／ｓよりも早い冷却速度が実現されるように選択される。好都合に、これにより、現実的な利点のある冷却速度が実現される（上掲のＭ．Ｓａｎｓｉｎｅｎａ他を参照）。

好都合に、基板プラットフォームの厚みは、当業者により、所望の冷却速度、水平方向の広がり、および要求される機械的安定性に応じて選択されてもよい。生体試料をガラス化するためには、本発明の好適な変形例における基板プラットフォームの厚みが、２００μｍ未満、特に好ましくは１２０μｍ未満、例えば１００μｍ以下であることが好都合であることがわかっている。また、基板プラットフォームが、ガラス、プラスチック、例えばシリコンなどの半導体材料、または例えば銅、金、銀などの金属からなる場合、生体試料のガラス化を好都合に促進することができる。一般に、熱伝導率が高い、例えば上記材料の熱伝導率を有する生体適合性材料が用いられる。ガラスまたはプラスチックの基板プラットフォームは、機械的安定性が高く生体適合性材料が入手しやすいという点で好都合である。また、半導体材料または金属からなる基板プラットフォームは、安定性が高く熱伝導率も高いという点で好都合である。さらに、基板プラットフォーム、特に好ましくは基板装置全体に金属を用いることは、金属の熱容量のおかげで好都合である。例えば、窒素タンクにおいて冷却できない場合でも、少なくとも一時的には試料に必要とされる保存温度を維持することができ、これにより試料の損失を最小限に抑える。

別の好都合な変形例によれば、基板プラットフォームは、透明材料からなってもよい。特に好ましくは、基板プラットフォームは、培養面の生体試料に対して光学的研究、特に顕微鏡による研究を行うことができるように形成されてもよい。好都合に、これにより、凍結中および冷凍保存中に試料を観察することができる。

本発明の別の好都合な実施形態によれば、基板装置は、基板プラットフォームと第１および／または第２チャンバとの間を液密かつ分離可能に接続するよう構成された基板保持部を備える。好都合には、基板保持部は、交換可能な基板プラットフォームを固定する手段を構成する。基板装置には、例えば保存対象の細胞型および／または本発明の用途に応じて選択される別の培養面が設けられていてもよい。

本発明の別の好都合な変形例によれば、基板装置の第１および／または第２チャンバには補償部が設けられる。補償部は、基板プラットフォームと、第１および／または第２チャンバの他の部分と、の間に配置されて、基板プラットフォームと第１チャンバとの間の温度依存性の機械的ストレスを吸収するよう構成される。基板プラットフォームと、第１または第２チャンバの他の部分と、が異なる材料からなる場合、基板装置が冷却または加熱されるときに生じる機械的ストレスが補償部により補償される。補償部は、例えば伸縮継ぎ手であり、基板プラットフォームと、第１および／または第２チャンバのホルダと、の間の柔軟性のある緩衝地帯となる。

代替的または付加的に、基板装置の第１チャンバには均圧弁が設けられてもよい。均圧弁は、第１チャンバとその周囲との間の過剰圧力を等しくするのに適している。過剰圧力は、例えば基板装置が加熱されて生体試料を復元するときに生じることがある。

本発明の別の変形例において、基板プラットフォームは第１チャンバまたは完成した基板装置と一体の要素であってもよい。例えば、基板装置は、第１および第２チャンバならびに基板プラットフォームの単一部品であってもよい。この場合、基板装置の機械的安定性、および基板装置が小型である点で、好都合である。基板装置は、例えば射出成形プロセスによりプラスチックで形成されてもよい。

本発明による基板装置によれば、好都合には、培養液および／または温度制御媒体の送達のための別の変形例が可能である。例えば、注入装置で各媒体を第１または第２チャンバに充填する手動送達を行ってもよい。また、基板装置は、培養液および／または温度制御媒体の１つを搬送するよう構成された搬送装置を備えてもよい。この変形例には、基板装置の使用を自動化し、媒体搬送および所与の保存手順遵守における再現性が向上するという利点がある。好都合には、搬送装置は、例えば第１チャンバまたは第２チャンバ壁部または蓋部に一体化されたマイクロ流体装置を備えてもよい。マイクロ流体ユニットは、例えばマイクロ流体システム技術からそれ自体が知られている、媒体搬送のための導通要素および計測要素を有する流体チップを備える。代替的または付加的に、搬送装置は、第１チャンバまたは第２チャンバの内部につながる媒体ラインを少なくとも１つ備えてもよい。マイクロ流体ユニットと同様に、媒体ラインは代替的に基板プラットフォームに一体化されてもよい。

本発明の別の好都合な変形例によれば、基板装置の第１チャンバおよび第２チャンバが互いに分離可能に接続されていれば、本発明の具体的な用途での要求に対する基板装置の適用、また例えば第１チャンバの洗浄や第１チャンバに生体試料をロードする際の基板装置の取り扱いにおいて、さらに有利である。第１の変形例において、第２チャンバが、第１チャンバを分離可能に入れるよう構成されたチャンバフレームにしっかりと接続されていてもよい。好都合には、この場合、チャンバフレームを有する第２チャンバが、まず第１チャンバ内の生体試料の温度制御、次に第１チャンバの保持という二重の機能を果たす。別の変形例では、第１チャンバおよび第２チャンバは、ねじ継ぎ手を介して互いに接続される。

本発明の実施においては、１つの単一の第１チャンバを１つの単一の第２チャンバへ連結することに限定されない。特に、異なる種類の細胞を保存するために、第１チャンバがそれぞれ別の試料を入れるよう配置されたいくつかのサブチャンバに細分化されると好都合である。サブチャンバは互いに隣り合わせに、第２チャンバに隣接して配置され、基板プラットフォームがサブチャンバと第２チャンバとの間の共通の分割壁となる。好都合には、全サブチャンバ内の全試料が、第２チャンバ内の温度制御媒体によって、同時に同じ温度、例えば凍結または解凍温度になる。

本発明の特に好ましい別の実施形態において、基板装置は、特に本発明の第３の様態に係る冷凍保存装置である支持体に旋回可能に基板装置を入れるよう構成されたチャンバ保持部を備える。チャンバ保持部は、例えば基板プラットフォームの広がりに平行な面に配置された２つの支持要素を有しており、これらの要素は例えば冷凍保存装置などの支持体に連結されてもよい。支持要素は、例えば、支持体の軸受に乗った差し込み部、または支持体の差し込み部を入れるピボット軸受である。好都合には、チャンバ保持部は、基板装置が、培養状態と保存状態との間で横軸を中心に再現可能な方法で急速旋回できるようにする。

好都合には、本発明に係る冷凍保存を、培養面への生体細胞の準備の点で異なる、異なる種類の細胞培養物において実行してもよい。本発明の方法の第１変形例は、接着生体細胞、すなわち培養面に接着（付着）して配置される生体細胞の冷凍保存を提供する。この場合、第１の部分的ステップにおいて、基板装置を、第１チャンバが第２チャンバの上に配置されて基板プラットフォームが第１チャンバの床部となった状態である培養状態とする。培養面の接着細胞培養物は、培養液で覆われる。生体細胞は、栄養媒体および／または培養液中の分化因子の作用により、培養面で培養、すなわち細胞増殖および任意で細胞増殖を施される。次の部分的ステップにおいて、基板装置は、第２チャンバが第１チャンバの上に配置されて基板プラットフォームが第２チャンバの床部となった状態である温度制御状態に旋回される。培養液は、好都合には、培養面に接着したままの細胞が残余培養液の表面張力によって薄い液膜にのみ覆われたままとなるように、第１チャンバから流れ出す。これにより、冷凍保存が施される生体試料の量が最小限となる。温度制御状態において、例えば液体窒素などの冷却媒体が、第２チャンバに充填される。冷却媒体は、上を向いている基板プラットフォームの背面を覆い、基板プラットフォームが培養面に配置された生体試料とともに即座に冷却されるようにする。

本発明の方法の第２変形例は、「懸滴」培養および懸滴状態の細胞のガラス化を提供する。この結果、非接着状態での生体細胞の冷凍保存となる。生体細胞は、懸滴状態で凍結される。このため、第１の部分的ステップにおいて、基板装置を、第２チャンバが第１チャンバの上に配置されて基板プラットフォームが第２チャンバの床部となった状態である温度制御状態とする。基板プラットフォームの培養面は水平方向にそろっており、培養面の法線は垂直方向に下向き、すなわち重力方向となっている。培養液の懸滴が培養面に塗布され、生体細胞が個別に、またはグループになってその中に置かれる。任意で、凍結前に、懸滴での生体細胞培養が行われる。第２の部分的ステップにおいて、本発明に係る方法の第１実施形態と同様に、基板プラットフォームと生体試料とが急速に凍結されるよう、冷却媒体が第２チャンバに充填される。

また、本発明に係る基板装置は、冷凍保存された細胞の復元に有利である。第２チャンバは、生体試料の解凍に用いてもよい。このため、基板装置が温度制御状態にある時に、例えば３７℃など所定の解凍温度の水などの加熱媒体を第２チャンバに充填する。生体試料を保持する基板プラットフォームは、加熱媒体により生体試料が解凍されるまで加熱される。その後、細胞は第１チャンバから取り除かれてもよく、またはそこでさらに培養されてもよい。

本発明の別の利点を以下にまとめる。本発明では、接着冷凍保存の利点と液体窒素によるガラス化の利点を組み合わせることができる。接着状態で冷凍保存されるため、ガラス化の前に細胞をトリプシンやコラゲナーゼなどの酵素で例えば細胞を基板から分離させるなどの処理をする必要がなく、解凍後さらに培養が可能となる前にコロニーが再成長する必要がない。また、細胞−細胞接触は元の状態のままで維持されるため、細胞に生じるストレスがさらに低減される。

また、冷凍保存後の細胞の生存率および機能性は、ストロー内ガラス化の場合よりも優れている、またはこれと同等である。しかながら、ストローよりも優れているのは、大量の細胞を一度に保存することができる点である。例えば、基板装置の培養面を拡大するという簡単な方法で、複数のコロニーを容易にガラス化することができる。また、各コロニーが個別に処理されるストローの場合のように別々の時間ではなく、各細胞コロニーが同時に各媒体と接触するため、凍結防止剤、任意で高濃度のものを導入するインキュベーション時間を正確に定義することができる。

本発明の方法の別の利点は、容易に自動化できる点である。煩雑な手動ピペット操作で１つの低温培地から次の低温培地へ試料を移動させてストローに吸い込ませる必要がない。かわりに、吸入または基板の自動回転により、簡単に媒体を変更することができる。システムの取扱いの容易さにより、個々の専門技能や操作者のスキルに依存することなく良好な保存を行うことができ、また同様に良好かつ普遍的に保存を行うことができる。

従来の接着ガラス化方法の持つコンタミネーションの危険性は、本発明に係る「２チャンバ・システム」によって最小限に抑えられる。培養区画と窒素区画との間には培養面という形で物的障壁が常に存在するため、細胞物質と非無菌の可能性がある窒素との間の接触は起こらない。また、培養区画（第１チャンバ）は周囲から分離することができ、特に蓋部によって外気から保護することができる。これにより、治療目的でのシステムの使用が簡易になり、ガラス化やタンクでの保存に無菌の窒素を用いる必要がなくなる。

可能な限り冷却速度を早くするための最小限の試料量や最大限の表面積対体積率など、良好なガラス化のための一般的な物理的条件は、本発明のいくつかの様態でも支持されている。まず、ぶら下がり状態（「オーバーヘッド」）での接着培養およびガラス化は、細胞に形成される膜を最小限とすることにつながる。余剰の媒体は下方向に流出し、よって試料量を不要に大きくすることにはつながらない。それ故、ガラス化の量が多くなりすぎる危険性を冒すことなく、インキュベーションに常に十分な低温培地を用いることが可能となる。液膜が最小限となることにより、有毒な低温培地も解凍後に少量の洗浄媒体で容易に希釈することができる。これにより、有毒な低温媒体による細胞傷害を最小限に抑えることができる。また、例えば細胞コロニーなど成長した試料の形状が平坦であることも、冷却速度に好ましい影響を与える。冷却媒体と細胞との間の距離は極小であり、二次元細胞コロニーの表面積対体積率は例えばストローの場合よりも大きい。加えて、細胞コロニーを他の細胞型との共培養物として冷凍保存することができる。これにより、多くの人手を要する解凍後の共培養物の準備を省くことができ、共培養物以外の細胞にかかる時間を最小限とすることができる。この利点は、ｈＥＳＣとマウスのフィーダー細胞との共培養物において特に顕著である。

異なる培養面の利用可能性により、本発明に係る基板装置を用途と細胞型に応じて操作できるようにすることができる。表面の熱伝導性を向上させることにより、ガラス化をさらに最大限に良好なものとすることができる。異なる培養面に特別な固定手段を用いることにより、用途に応じて表面を入れ替えることができる。熱的に誘導される使用材料の体積変化は、培養面とその保持部との間に設けられた柔軟性のある緩衝地帯により吸収することができる。これにより、熱膨張係数の異なる材料を基板に用いることができる。培養面と基板装置の残りの部分に同一の材料を用いる代替例も可能である。したがって、体積変化が同一であり、材料にストレスが生じることがない。

メニスカスの形成により基板の辺縁部で細胞上の媒体の量が増加すると、メニスカスがこれ以上形成されないよう辺縁部での角度と材料を適応させてもよい。これは、辺縁部まで細胞のガラス化を最適化するのに都合がよい。

本発明のさらなる詳細と利点を、添付の図面を参照して以下で説明する。

本発明に係る基板装置の第１実施形態の培養状態における模式断面図である。 本発明に係る冷凍保存装置の実施形態の模式断面図である。 本発明の好適な実施形態における冷凍保存方法の工程である。 図１の基板装置の基板プラットフォームの拡大断面図である。 冷凍保存後に生体試料を復元する工程である。 本発明に係る基板装置の別の実施形態であって、搬送装置を備える実施形態の模式断面図である。 本発明に係る基板装置の別の実施形態であって、チャンバフレームを備える実施形態の模式断面図である。 本発明に係る基板装置の別の実施形態であって、ねじ継ぎ手を備える実施形態の模式断面図である。 本発明に係る基板装置の別の実施形態であって、マイクロ流体ユニットを備える実施形態の模式断面図である。 本発明に係る基板装置の別の実施形態であって、多数のサブチャンバを備える実施形態の模式断面図である。 従来の接着生体細胞の冷凍保存の模式的な説明図である（先端技術）。

以下、本発明の実施形態を、基板装置および冷凍保存装置の特徴、ならびに冷凍保存方法の工程を参照して説明する。接着状態または懸滴における生体細胞の培養、培養媒体、凍結防止剤の使用、処理手順、保存状態の監視、媒体の冷却および加熱の取り扱いについては、従来技術から既知の場合には詳細を記載しない。基板装置および冷凍保存装置を、（水平方向に直交する）垂直切断面での模式断面図を用いて例として図示する。基板装置または冷凍保存装置の空間方向を含む、図とは異なる幾何学的形状は、本発明の所望の用途に応じて選択することができる。例えば、基板装置は、（図中の切断面に直交する）水平投影図において円形または矩形形状であってよい。また、第１および第２チャンバが形成する構造は、（缶のような）円筒形であってもよい。試料培養用の多数の第１チャンバが、温度制御媒体用の１つの共通チャンバと組み合わされる場合、第１チャンバの形状と配置は、同様に所望の用途の条件に応じて選択することができる。

図１に示す本発明に係る基板装置１００の実施形態は、基板プラットフォーム１０と、第１チャンバ２０と、第２チャンバ３０とを備える。基板プラットフォーム１０は、第１チャンバ２０の内部と第２チャンバ３０の内部との間の分割壁となる。

基板プラットフォーム１０は、基板保持部１２および補償部１３を介して第１チャンバ２０のチャンバ壁２１に接続される。第１チャンバ２０のチャンバ壁２１は、中空円筒形状をしており、その円柱軸は、基板装置１００の対称軸であり、培養状態および温度制御状態において垂直方向（ｚ方向）を向いている（以下を参照）。第１チャンバ２０の円筒チャンバ壁２１は、第２チャンバ３０に面する端部に補償部１３が接続される突出部２２を有する。第１チャンバ２０のチャンバ壁２１は、第２チャンバ３０とは反対側の端部に、蓋部２３用のシートを有する。蓋部２３は、第１チャンバ２０の内部と基板装置１００の周囲との間でのガス交換を除外するために、第１チャンバ２０のチャンバ壁２１に連結されていてもよい。

第２チャンバ３０は、その形状とサイズが第１チャンバ２０の形状とサイズに適合するチャンバ壁３１を備える。図に示す例では、第２チャンバ３０のチャンバ壁３１も、第１チャンバ２０に面する端部に内側に向けて半径方向に突出する突出部３２を有する中空円筒形状をしている。基板プラットフォーム１０の補償部１３は、第１チャンバの突出部２２にのみ接続されてもよく、図に示すように突出部２２，３２の両方に接続されていてもよく、または第２チャンバ３０の突出部３２にのみ接続されてもよい。第２チャンバ３０は、基板プラットフォーム１０と反対側が開放されている。ただし、変形例においては、第２チャンバ３０にも蓋部を設けることができる。

第１および第２チャンバ２０，３０のチャンバ壁２１，３１は、例えばプラスチックおよび／または金属など異なる材料からなってもよく、突出部２２，３２で互いに接続されてもよい。また、チャンバ壁２１，３１は、一体の要素として例えばプラスチックまたは金属からなる１つの部品からなってもよい。

基板プラットフォーム１０は、円板形状のガラス平板、プラスチック、または金属を含む。第１チャンバ２０面したガラス板の上面は、例えば露出したガラス面または生体適合性のある表面層を有するガラス面から構成される培養面１１となる。培養面１１は、生体細胞を少なくとも１つ含む保存する試料を入れるのに適しており（図３参照）、特に細胞培養物（例えば、ｈＥＳＣｓ、ＭＥＦｓ、ｉＰＳ細胞、またはその他の接着成長する細胞型）が配された表面および／または親水性表面を含んでもよい。

基板保持部１２は、中に基板プラットフォーム１０が分離可能に配置される環状のフレームである。フレームは、基板プラットフォーム１０に液密に連結するよう構成され、例えば基板プラットフォーム用の台と、取り付けられた基板プラットフォーム１０をしっかりと固定するための環状の封止舌とを備える。基板プラットフォーム１０は、封止舌を持ち上げて基板プラットフォーム１０を外すことにより、例えば特定の培養タスクに適合するように交換することができてもよい。好ましくは、基板保持部１２は、特にシリコーンゴムである軟質プラスチック、または金属からなる。

補償部１３は、温度に応じて基板装置１００の部品の寸法の変化を保証する伸縮継ぎ手である。補償部１３は、例えば円環板形状をしており、一方が基板プラットフォーム１０および／または基板保持部１２、他方が突出部２２，３２および／またはチャンバ壁２１，３１の隣接する材料に適合する材料からなる。材料は、温度による熱膨張または熱収縮が互いに補完または相殺されるように選択される。例えば、チャンバ壁２１，３１の材料が基板プラットフォーム１０の材料よりも収縮すれば（すなわち、本例では、チャンバ壁２１，３１よりも冷気で収縮する）、補償部１３がこれを補償する。図からはなれると、基板保持部１２および補償部１３は、一体の要素として１つの部品からなってもよい。この場合、この要素は基板保持部および補償部の両方として機能する。

実施例においては、基板装置１００は、例えば以下のような寸法をとる。基板プラットフォームの直径：２０ｍｍ、基板プラットフォームの厚み：１８０μｍ（例えば、ドイツのメーカーｉｂｉｄｉ社のμディッシュタイプ）、基板装置１００のｘ−ｙ面における外径：３５ｍｍ、第１および第２チャンバ壁２１，３１の厚み：３ｍｍ、第１および第２チャンバ壁２１，３１のｚ方向の高さ：いずれも１０ｍｍ、蓋部２３のｚ方向の高さ：４ｍｍ。上記の寸法は例に過ぎず、当業者は、具体的な用途での要求に応じて寸法を選択することができる。

図に示すように、第１および第２チャンバ２０，３０の外側、例えば基板プラットフォーム１０と同一面内に、例えば図２に示す冷凍保存装置の基板装置１００を入れるよう構成されたチャンバ保持部５０が配置される。チャンバ保持部５０は、例えば、基板装置１００の円筒形状の外側に半径方向外向きに突出する、共通の参照線に沿って互いに反対側に配置された２個の差し込み部５１，５２を備える。

本発明の変形例において、基板装置１００に、図１に模式的に示す均圧弁２５を設けてもよい。均圧弁２５は、チャンバ壁２１または蓋部２３に挿入されており、第１チャンバの過剰圧力を周囲と等しくするよう設計されている。

図２に、本発明に係る冷凍保存装置２００の実施形態を模式的に示す。この冷凍保存装置は、例えば図１に示す基板装置１００を入れるのに適し、また本発明に係る冷凍保存方法の実施に適している（以下を参照）。冷凍保存装置２００は、基板装置１００を保持および回転させることができる回転装置２１０と、例えば台上などの作業面（不図示）上で回転装置２１０と基板装置１００とを安定して位置合わせするよう構成された支持フレーム２２０とを備える。支持フレーム２２０は、例えばプラスチックおよび／または金属からなる要素であり、その下側に流出培養液または流出温度制御媒体を入れる溝部２２１を設けてもよい。

回転装置２１０は、支持フレーム２２０の向かい合った延長アームに互いに距離をおいて配置されるピボット軸受２１１，２１２を備える。ピボット軸受２１１，２１２は、チャンバ保持部５０の差し込み部５１，５２を受ける（図１参照）。このため、基板装置１００がピボット軸受２１１，２１２に挿入されると両者の間の距離が大きくなるよう、例えば一方のピボット軸受２１１を軸方向に弾性的に移動可能とすることができる（二重矢印参照）。また、回転装置２１０を、模式的に示す任意の装置ユニット２１３とともに示す。駆動ユニット２１３は、例えば電気モータを備え、この電気モータは基板装置１００を回転するよう設計され、例えば歯車などの動力伝達要素を介して基板装置１００に接続される。

図３に、本発明の実施形態における生体細胞２を含む生体試料１の冷凍保存方法であって、生体細胞２が基板プラットフォーム１０の培養面の接着細胞培養物となる方法の工程を模式的に示す。図３Ａは、基板装置１００の第１チャンバ２０の基板プラットフォーム１０の培養面に生体試料１を用意する様子を示し（図１参照）、生体細胞２は培養液３に囲まれている。本発明の実施形態において、接着細胞の培養は、図示のように第１チャンバ２０が第２チャンバ３０の上にある培養状態で行われる。したがって、第２チャンバ３０の底部が開放された空の状態で、第１チャンバ２０に培養液３を充填することができる。培養液３は、細胞および本発明の具体的な用途に応じて選択された組成を有し、栄養媒体と、少なくとも１種類の凍結防止剤とを含む。組成の例としては、ＤＭＳＯ２０％、エチレン・グリコール２０％、トレハロース３００ｍＭである。

生体細胞２の培養は、細胞型に特有の所定の培養手順に従って行われる。ここで、基板装置１００の蓋部２３は、密封または開放することができる。第１チャンバ２０を蓋部２３で閉鎖可能なことは、第１チャンバ２０を運搬する際に特に有利である。例えば、培養は、冷凍保存とは別の場所、例えばインキュベーション装置において行われてもよい。その後の冷凍保存のために、蓋部２３を閉めた状態で基板装置１００を例えば図２に示す冷凍保存装置に運搬することができる。

具体的な実験的に試験された例において、細胞２は、マウス線維芽細胞の単分子層で囲まれたヒトＥＳ細胞コロニー（ｈＥＳＣコロニー）から構成され、培養液３は、ＤＭＳＯ２０％、エチレン・グリコール２０％、トレハロース３００ｍＭの標準的なｈＥＳＣ培地からなる。図３Ａに示す培養は、基板装置１００において数時間または数日にもわたって行われる。また、基板プラットフォーム１０の生体細胞２の培養は、まず、別のインキュベーション装置で行われる。基板プラットフォーム１０は、所望の培養結果が得られた後に、基板装置１００に挿入することができる。

図３Ｂに示す別の部分的ステップにおいて、基板装置１００は水平回転軸を中心に１８０°回転される。そして、基板装置１００は、第２チャンバ３０が第１チャンバ２０の上に来る温度制御状態となる。試料１は、基板プラットフォーム１０の下向きの培養面から接着状態で浮遊する。培養液３の表面張力により、液膜４も図３Ｂに示す温度制御状態で維持されて、細胞を覆う。したがって、好都合には、細胞２は液膜４としての培養液と接触し続け、培養液の量は膜形成により最小限に抑えられる。これにより、その後冷却媒体５が第２チャンバ３０に導入されたときの試料１の急速冷凍に役立つ（図３Ｃ参照）。

試料１の冷凍保存、特にガラス化は、例えば液体窒素などの冷却媒体５を第２チャンバ３０に充填することにより実現される（図３Ｃの矢印参照）。熱交換は、同時に第１チャンバ２０の内部の分割壁となる基板プラットフォーム１０を介して起こるため、試料１は−１９６℃まで急速に冷却される。試料１は、−１３０℃未満の温度で維持される場合、ガラス化して安定する。試料の安定性は、特に冷却媒体５が第２チャンバ内に維持される場合、保証される。特に、これにより、冷却媒体５が再充填される場合には冷凍保存された試料１を現実的に無制限に運搬することができる。基板装置１００が液体窒素蒸気、例えば窒素タンク内に気相で保存される場合、試料１も約−１７０℃の気相で安定してガラス化するが、第２チャンバ３０の冷却媒体５は徐々に蒸発する。

図３Ｂおよび図３Ｃに、第１チャンバ２０が閉じた基板装置１００の温度制御状態を示す。したがって、基板装置１００が培養状態から温度制御状態に回転すると、残余培養液３は蓋部２３によって第１チャンバ２０内に保持される。図から離れて、温度制御状態では、液膜４を除く培養液３が全て流出するよう、蓋部２３を取り外してもよい。

一方、図３は、例として接着細胞の培養および冷凍保存を示しており、培養および冷凍保存は、代替的に、懸滴の生体細胞とともに行うこともできる（「懸滴」培養）。この場合、基板装置はすでに培養用の温度制御状態となっており、第２チャンバ３０は第１チャンバ２０の上に配置されて、基板プラットフォームの培養面は下向き、すなわち重力方向を向いている。浮遊細胞を含む培養液の液滴は、培養面からぶら下がる。凍結防止剤を含む培養液の導入および／または交換は、従来の懸滴培養より既知の方法で実現される。試料のガラス化のために、細胞を含む液滴が急速に凍結するよう、冷却媒体が第２チャンバに導入される。

図４に、温度制御状態における基板装置１００のさらに詳細を示す。図４Ａは、図３Ｃと同様に、第１チャンバ２０と、第２チャンバ３０と、その間の分割壁となる基板プラットフォーム１０とを有する基板装置１００を示す。生体細胞２は、基板プラットフォーム１０の下向きの培養面に接着状態で配置され、液膜４で覆われる。第２チャンバ３０には、生体細胞２が急速に冷却されてガラス化するよう、上から冷却媒体５が充填される（矢印参照）。

図４Ｂは、基板プラットフォーム１０の部分拡大図であり、その下向きで第１チャンバ２０に面する培養面１１に、異なる種類の生体細胞、特に細胞群２．１および個々の細胞２．２を含む試料１が配置される。例えば、大きい細胞群２．１（細胞コロニー）はヒトＥＳ細胞コロニーであり、細胞２．２は細胞質の単分子層を形成するマウス胎児線維芽細胞からなる。細胞群２．１および細胞２．２は、培養面１１に接着固定される。

冷却媒体５が第２チャンバ３０に充填されると（図４Ｂの矢印参照）、基板プラットフォーム１０は急速に冷却される。冷却媒体５が上から第２チャンバ３０に充填されると、ライデンフロスト現象を最小限に抑えることができる。気泡６は、冷却媒体５が基板プラットフォーム１０に作用するにつれて形成されるものであるが（図４Ｃの変形図参照）、重力方向とは反対方向、すなわち上向きに移動し、これに対応する体積が流入する冷却媒体に置き換えられる。したがって、従来の冷凍保存方法に見られる気泡の絶縁効果を、最小限に抑えることができる。

また、図４Ｃは、冷却媒体５と細胞２との間の距離が基板プラットフォーム１０の厚みを薄くすることにより最小限に抑えられることを示す。細胞２および液膜４を含む試料１の熱は、急速に冷却媒体５に向って流れる（図４Ｃの矢印７参照）。

図４Ｄおよび図４Ｅに、基板プラットフォーム１０の第１および第２チャンバ２０，３０の壁部への固定の変形例を模式的に示す。基板プラットフォーム１０は、例えば基板保持部１２および補償部１３（一体的な要素として示す）で第２チャンバ３０の壁部の突出部３２に固定される（図４Ｄ）。補償部１３は、特に基板プラットフォーム１０と第１および第２チャンバ２０，３０の他方の壁部の熱膨張係数が異なる場合、基板プラットフォーム１０および基板保持部１２の機械的ストレスを防止することができる。

図４Ｅに、第１チャンバ２０の壁部の突出部２２がチャンバ２０の内側に面した環状の突出部となり、部分的に基板プラットフォーム１０、基板保持部１２および／または補償部１３を超えて突出する様子を模式的に示す。この突出部に沿った基板プラットフォーム１０の面と突出部２２の端部との間の角度αは、９０°未満である。好都合には、これにより、試料１と突出部２２との間にメニスカスが形成されず、試料１の厚みが突出部２２まで変化しないままであることが保証される。好都合には、これにより、さらに、試料１の辺縁部における冷凍保存条件が基板プラットフォーム１０の中央部の条件と同じとなり、細胞２のガラス化を最適なものとする。

図５に、冷凍保存の後の試料１の復元を模式的に示す。例えば液体窒素などの液体の冷却媒体は、保存中に窒素タンクの気相に蒸発し、通常、第２チャンバ３０は、冷凍保存中は空になっている（図５Ａ）。この状況で、試料１を解凍するために窒素タンクから基板装置１００を取り外すことができる。これは、例えば３７℃の水などの加熱媒体８を上から第２チャンバ３０に充填することにより行われる（図５Ｂの矢印参照）。試料の解凍は、冷凍保存同様、急速に行われ、これにより解凍中に試料１に氷晶が形成されることを防止することができる。

そして、図５Ｃに示すように、基板装置１００が回転して、第１チャンバ２０が第２チャンバ３０の上に配置される培養状態（二重矢印参照）に戻る。第２チャンバ３０が空にされ、第１チャンバ２０にはさらに培養液３が充填される。培養液３により、例えば試料１が洗浄され、さらに培養される。続いて、例えば移動やさらにガラス化するなどの追加的な処理工程を行うことができる。

図５に示す工程の代わりに、解凍時、基板装置１００が培養状態であるときに加熱媒体を第１チャンバ２０充填してもよい。この場合、加熱媒体は、３７℃まで加熱された培養液であってもよい。

本発明の別の実施形態において、基板装置１００には、例として図６に示すような搬送装置４０が設けられてもよい。図に示す例において、搬送装置４０は、それぞれが第１チャンバ２０または第２チャンバ３０に接続された多数の媒体ライン４１，４２を備える。媒体ライン４１，４２は、例えば、液体貯蔵庫およびポンプに接続されたチューブまたはパイプ（一部のみ図示）であり、特に培養液を自動的に第１チャンバ２０に搬送し、冷却または加熱媒体を自動的に第２チャンバ３０に搬送することが可能である。媒体ライン４１，４２（または少なくとも図に示す媒体ラインの端部または接続部）は、第１および第２チャンバ２０，３０の壁部２１，３１に一体化されている。また、媒体ラインは、第１または第２チャンバの蓋部に接続されてもよい。

図６Ｂによれば、少なくとも１種類の培養液３が第１チャンバ２０の媒体ライン４１を介して培養状態で導入される。例えば、所定の培養手順に従って、栄養媒体ならびに／または所定の組成および／もしくは濃度の凍結防止剤を連続して第１チャンバ２０に導入することができる。

試料１を凍結させるために、基板装置は、回転して第２チャンバ３０が第１チャンバ２０の上に来る温度制御状態になる（図６Ｃ）。この状況で、冷却媒体が、第２チャンバ３０の媒体ライン４２を介して第２チャンバ３０の内部に充填される。第２チャンバ３０への冷却媒体５充填のレベルは、冷却媒体の流入と流出を適切に制御することで調整することができる。同時に、第１チャンバ２０の媒体ライン４１を介して、第１チャンバ２０が空にされる。図６Ｄによれば、試料１を解凍するために、例えば水などの加熱媒体８が媒体ライン４２を介して第２チャンバ３０に充填できるようにする。

図１の実施形態から離れると、本発明に係る基板装置１００の第１および第２チャンバ２０，３０は、例えば図７に示すように、互いに分離可能に接続することができる。第１チャンバ２０（図７Ａ）は、その内部が基板プラットフォーム１０、チャンバ壁２１、および蓋部２３に囲まれた容器である。基板プラットフォーム１０の培養面１１は試料１を接着状態または懸滴で入れる第１チャンバ２０に面しており、基板プラットフォーム１０の培養面１１とは逆の面は外部に露出している。第２チャンバ３０（図７Ｂ）は、半径方向に内側に突出する突出部３２を有するチャンバ壁３１と、第１チャンバ２０を分離可能に入れるよう構成されたチャンバフレーム３３とを備える構成を有する。チャンバフレーム３３は、その内径が第１チャンバ２０の外径に等しい円筒形のシートである。第２チャンバ３０とは反対の側に、第１チャンバ２０をチャンバフレーム３３に固定することができるフレームカバー３４が設けられる。チャンバフレーム３３の第２チャンバ３０に面する側には、基板プラットフォーム１０が第２チャンバ３０の内部に露出する開口部がある。

図７Ａおよび７Ｂの基板装置１００の二重構造は、第２チャンバ３０（ガラス化チャンバ）を第１チャンバ２０（培養チャンバ）として何度も使用することができるという点で有利である。第１チャンバ２０の形状は、例えばインキュベーション装置での最適な培養に適したものとすることができる。第２チャンバ３０は、所望の冷凍保存が行われるようになるまで第１チャンバ２０に連結されない。また、チャンバフレーム３３を有する第２チャンバ３０が市販の培養基板の形状に適している場合には、その培養基板を第１チャンバに用いてもよい。

図７Ａおよび図７Ｂに示す基板装置１００の実施形態は、試料１の培養および例えば顕微鏡による研究などの観察を、第２チャンバ３０やチャンバフレーム３３なしで行うことができるという点で有利である。これにより、所定の培養ステージにおける冷凍保存のための試料１の準備および／または生体細胞を含む適切な試料の選択の自由度が、さらに上がる。

図７Ｃ〜図７Ｆに、図７Ａおよび図７Ｂに示す基板装置１００を用いた、本発明に係る冷凍保存の工程を示す。図７Ｃによれば、基板プラットフォーム１０と、試料１と、培養液３とともに、第１チャンバ２０が、チャンバフレーム３３に挿入されて固定される。必要であれば、冷却媒体が第２チャンバ３０から第１チャンバ２０の周り、特に蓋部２３に浸透しないよう、第１チャンバ２０の接触面２６とチャンバフレーム３３とに封止（不図示）を設けてもよい。

ガラス化が開始される前に、基板装置が基板プラットフォーム１０の面に対して１８０°回転して、細胞２を含む試料１および液膜４が下向きにぶら下がる。余分な培養液は、下向きになった第１チャンバの蓋部２３に溜まる、または媒体ライン（不図示）を介して排出される（図７Ｄ）。

この後、例えば液体窒素などの低温培地５が、第２チャンバ３０に導入される（図７Ｅ）。結果として、基板プラットフォーム１０と試料１から急速に熱が取り除かれ、生体細胞２を含む試料１がガラス化する。さらに、液体の冷却媒体が第２チャンバ３０から蒸発可能な窒素タンクの液体窒素上で、気相で保管することができる（図７Ｆ）。

複数の要素からなる基板装置１００の別の変形例を、図８に示す。第１チャンバ２０は、基板プラットフォーム１０、チャンバ壁２１、および蓋部２３とともに、閉鎖可能な容器として構成される。第１チャンバ２０の外側、特にチャンバ壁２１の外側には、雄ねじ２４が設けられ、これが第２チャンバ３０のチャンバ壁３１の雌ねじ３４と連携して、ねじ継ぎ手３５となる（図８Ｂ）。図１を参照して上述したように、冷凍保存装置２００（図２）に入れるために、第２チャンバ３０は外側にチャンバ保持部を有してもよい。第１チャンバ２０と第２チャンバ３０とを組み合わせた状態において（図８Ｃ）、基板プラットフォーム１０は第２チャンバ３０の内部に露出し、基板プラットフォーム１０の内側は、上述のように、第１チャンバ２０の内部で試料１の培養面となる。このように組み合わせた状態において、上述のように、基板装置１００を試料１のガラス化に用いることができる。

図９に、本発明に係る基板装置１００の別の実施形態を示す。この実施形態では、少なくとも１種類の培養液を搬送する搬送装置４０が、マイクロ流体ユニット４３（または媒体搬送チップ）から構成される。マイクロ流体ユニット４３は、例えば、媒体ライン、バルブ、液体貯蔵庫、および／またはポンプなどのマイクロ流体要素４４を含む。マイクロ流体ユニット４３により、培養媒体、凍結防止剤、または水を、第１チャンバ２０および／または第２チャンバ３０の内部に特に自動的に、導入することができる。

本発明によれば、マイクロ流体ユニット４３は、基板装置１００にしっかりと接続されていなければならないわけではない。むしろ、図９に示すように、マイクロ流体ユニット４３を第１および第２チャンバ２０，３０から分離可能としてもよい。この場合、マイクロ流体ユニット４３は、具体的には培養液の搬送と冷却媒体の搬送という、二重の機能を果たすことが好ましい。マイクロ流体ユニット４３は、培養状態または温度制御状態において基板装置１００の上面に位置する第１または第２チャンバ２０，３０に液体を導入するために、例えば基板装置１００上など固定位置に例えば図２の培養装置２００の一部として設けてもよい。図９に示す本発明の実施形態は、少なくとも１種類の培養液３．１，３．２、冷却媒体、および加熱媒体を搬送する工程を完全に自動化することができるという点で特に有利である。

また、少なくとも１つのマイクロ流体ユニットを第１ならびに／または第２チャンバの蓋部および／もしくは壁部に組み込んでもよい。例えば液体窒素などの冷却媒体を第２チャンバに導入するために、例えば、別のマイクロ流体ユニットを設けてもよい。

図９Ｂ〜図９Ｆに、基板装置１００およびマイクロ流体ユニット４３を用いた冷凍保存の経過を模式的に示す。図９Ｂによれば、基板装置が培養状態にあるとき、マイクロ流体ユニット４３によって第１培養液３．１を第１チャンバ２０に導く。その後、基板装置は、第１チャンバ２０が下向きになるようチャンバ保持部５０上で１８０°回転して、第１培養液３．１が第１チャンバ２０から流出する（図９Ｃ）。さらに１８０°回転して、第１チャンバ２０が基板装置の上面に戻ると、マイクロ流体ユニット４３によって別の培養液３．２が第１チャンバ２０に充填される（図９Ｄ）。最終ステップでは、図９Ｅに示すように試料１ガラス化する。これは、第２チャンバ３０が基板装置の上面に来るよう、基板装置１００が再度１８０°回転してすることにより行われる。例えば液体窒素などの冷却媒体５が、マイクロ流体ユニット４３によって第２チャンバ３０に充填される。

最後に、図９Ｆに、試料１の復元、ならびに例えば加熱した水などの加熱媒体８および凍結防止剤を洗い流す洗浄物質がマイクロ流体ユニット４３によって第１チャンバ２０に加えられる様子を模式的に示す。

図１０に、本発明に係る基板装置１００の別の実施形態を示す。この実施形態では、第１チャンバが、それぞれ基板プラットフォーム１０．１，１０．２，１０．３，・・・を有し、第２チャンバ３０に隣接して配置される多数のサブチャンバ２０．１，２０．２，２０．３，・・・を備える。第１媒体ライン４１は、培養液３をサブチャンバ２０．１，２０．２，２０．３，・・・（図１０Ａ）に導くようまたはこれらのサブチャンバ（図１０Ｂ）から導出するよう設けられる。上記の実施形態を参照して説明したように、基板装置１００は、少なくとも１種類の培養液を導入および導出するために毎回１８０°回転してもよい。試料１．１，１．２，１．３，・・・をガラス化するために、基板装置１００が温度制御状態にあるとき、例えば液体窒素などの冷却媒体５を第２媒体ラインを介して第２チャンバ３０に導く（図１０Ｃ）。図１０Ｅは、対応して試料の復元を示す図であり、培養状態の基板装置１００の第１媒体ライン４１を介して加熱媒体８がサブチャンバ２０．１，２０．２，２０．３，・・・に導かれる。

図１０に示す基板装置１００の実施形態は、好都合には、搬送および導出ラインが全て装置内に含まれて基板プラットフォームの特性に適合した小型の構造を形成する。好都合には、媒体変化、媒体追加、インキュベーション、ガラス化、および解凍は、完全に自動化することができ、複数の試料を用いて同時に行うことができる。これにより、開放して媒体または凍結防止剤を手動で導出または追加する必要性が取り除かれる。

上述の説明、図面、および請求項において開示された本発明の特徴は、単独または組み合わせによって、本発明の各種構成の実現に大きな影響を与えるものである。

Claims (18)

1. 生体細胞（２，２．１，２．２）を含む生体試料（１）の冷凍保存のための基板装置（１００）であって、
   前面および背面を有する基板プラットフォーム（１０）であって、前記基板プラットフォーム（１０）の前面が前記生体試料（１）を入れる培養面（１１）となる基板プラットフォームと、
   前記基板プラットフォーム（１０）の前記培養面（１１）を有する第１チャンバ（２０）であって、前記第１チャンバ（２０）は培養液（３）を入れるのに適した第１チャンバと、
   温度制御媒体（５）を入れるのに適した第２チャンバ（３０）と、
   前記基板装置（１００）を冷凍保存装置に旋回可能に入れるのに適したチャンバ保持部（５０）と、を備え、
   前記第１チャンバ（２０）および前記第２チャンバ（３０）は、互いに隣接して接続され、
   前記基板プラットフォーム（１０）は前記第１チャンバ（２０）と前記第２チャンバ（３０）との間の分割壁となり、前記基板プラットフォーム（１０）の背面は前記第２チャンバ（３０）に面している基板装置。
2. 請求項１の基板装置であって、
   前記基板プラットフォーム（１０）の背面は、前記第２チャンバ（３０）内に露出しており、
   前記基板プラットフォーム（１０）は、前記基板プラットフォーム（１０）の背面が−１２０℃を下回る温度の第１温度制御媒体（５）で濡れている場合に、前記培養面（１１）において前記生体試料（１）がガラス化可能な厚みおよび熱伝導率を有する基板装置。
3. 請求項１または２の基板装置であって、
   前記基板プラットフォーム（１０）は、
   前記基板プラットフォーム（１０）の厚みが、２００μｍ未満であることと、
   前記基板プラットフォーム（１０）が、ガラス、プラスチック、半導体材料、または金属からなることと、
   前記基板プラットフォーム（１０）が、透明材料からなることと、
   のうち少なくとも１つの特徴を有する基板装置。
4. 請求項１から３のいずれか１つの基板装置であって、
   前記基板プラットフォーム（１０）は、液密の基板保持部（１２）を介して、前記第１または第２チャンバ（２０，３０）に分離可能に接続されている基板装置。
5. 請求項１から４のいずれか１つの基板装置であって、
   前記基板プラットフォーム（１０）が、補償部（１３）を介して、前記第１または第２チャンバ（２０，３０）に接続され、前記補償部（１３）が、前記基板プラットフォーム（１０）と前記第１または第２チャンバ（２０，３０）との間の温度依存性のストレスを吸収するよう構成されていることと、
   前記第１チャンバ（２０）が、前記第１チャンバ（２０）とその周囲との間の気圧を等しくするのに適した均圧弁（２５）を有することと、
   のうち少なくとも１つの特徴を備える基板装置。
6. 請求項１から４のいずれか１つの基板装置であって、
   前記基板プラットフォーム（１０）は、前記第１または第２チャンバ（２０，３０）と一体の要素である基板装置。
7. 請求項１から６のいずれか１つの基板装置であって、
   前記培養液（３）および／または前記温度制御媒体（５）を搬送するのに適した搬送装置（４０）を備える基板装置。
8. 請求項７の基板装置であって、
   前記搬送装置（４０）は、少なくとも１つの媒体ライン（４１，４２）およびマイクロ流体ユニット（４３）のうち、少なくとも一方を備える基板装置。
9. 請求項１から８のいずれか１つの基板装置であって、
   前記第１および第２チャンバ（２０，３０）は、互いに分離可能に接続される基板装置。
10. 請求項９の基板装置であって、
    前記第２チャンバ（３０）は、前記第１チャンバ（２０）を分離可能に入れるよう構成されたチャンバフレーム（３３）にしっかりと接続されている基板装置。
11. 請求項９または１０の基板装置であって、
    前記第１チャンバ（２０）は、ねじ継ぎ手（３５）を介して、前記第２チャンバ（３０）に接続されている基板装置。
12. 請求項１から１１のいずれか１つの基板装置であって、
    前記第１チャンバ（２０）は、前記第２チャンバ（３０）に隣接して配置される複数のサブチャンバ（２０．１，２０．２，２０．３，・・・）を備え、前記基板プラットフォーム（１０）は、前記サブチャンバ（２０．１，２０．２，２０．３，・・・）と前記第２チャンバ（３０）との間の分割壁となる基板装置。
13. 冷凍保存装置（２００）であって、
    請求項１から１２のいずれか１つの基板装置（１００）を少なくとも１つと、
    前記少なくとも１つの基板装置（１００）を入れるのに適した旋回ユニット（２１０）と、を備え、
    前記基板装置（１００）は、前記旋回ユニット（２１０）により、前記基板プラットフォーム（１０）が前記第１チャンバ（２０）の床部となる培養状態と、前記基板プラットフォーム（１０）が前記第２チャンバ（３０）の床部となる温度制御状態と、の間で旋回可能である基板装置。
14. 生体細胞（２，２．１，２．２）を含む生体試料（１）の冷凍保存方法であって、
    第１チャンバ（２０）内の基板プラットフォーム（１０）の培養面（１１）に前記生体試料（１）を配置し、前記生体細胞（２，２．１，２．２）を培養液（３）で囲むステップと、
    前記基板プラットフォーム（１０）が前記第１チャンバ（２０）と第２チャンバ（３０）との間の分割壁となるように前記第１チャンバ（２０）に隣接して接続される第２チャンバ（３０）に冷却媒体（５）を入れ、前記基板プラットフォーム（１０）の温度を低下させて前記生体試料（１）を凍結状態に変換させるステップと、を備え、
    前記生体細胞（２，２．１，２．２）の培養は、
    前記第１チャンバ（２０）と前記第２チャンバ（３０）とを、前記基板プラットフォーム（１０）が前記第１チャンバ（２０）の床部となり前記培養液（３）が前記第１チャンバ（２０）に充填される培養状態にするステップと、
    前記生体細胞（２，２．１，２．２）を、前記基板プラットフォーム（１０）の前記培養面（１１）に接着状態にするステップと、を含み、
    前記第１チャンバ（２０）および前記第２チャンバ（３０）は、旋回して前記基板プラットフォーム（１０）が前記第２チャンバ（３０）の床部となる温度制御状態となり、前記冷却媒体（５）が前記第２チャンバに入るよりも前に前記培養液（３）が前記第１チャンバから流出する方法。
15. 請求項１４の方法であって、
    前記生体細胞（２，２．１，２．２）の培養は、
    前記第１チャンバ（２０）と前記第２チャンバ（３０）とを、前記基板プラットフォーム（１０）が前記第２チャンバ（３０）の床部となる温度制御状態にするステップと、
    前記基板プラットフォーム（１０）の前記培養面（１１）から浮遊する前記生体細胞（２）を、前記培養液（３）の液滴に入れるステップと、を含む方法。
16. 請求項１４または１５の方法であって、
    前記基板プラットフォーム（１０）の温度は、前記生体試料（１）がガラス化する冷却速度で低下する方法。
17. 請求項１４から１６のいずれか１つの方法であって、
    前記生体試料（１）は、前記培養面（１１）で共通に培養されて種類の異なる生体細胞（２．１，２．２）を含む方法。
18. 請求項１４から１７のいずれか１つの方法であって、
    加熱媒体（８）を前記第２チャンバ（３０）に入れ、前記基板プラットフォーム（１０）の温度を上昇させて前記生体試料（１）を解凍状態に変化させるステップを含む方法。

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