DE19827875A1

DE19827875A1 - Zellkulturflasche

Info

Publication number: DE19827875A1
Application number: DE1998127875
Authority: DE
Inventors: Toni Lindl
Original assignee: TONI LINDL INST fur ANGEWANDT
Current assignee: TONI LINDL INST fur ANGEWANDT
Priority date: 1998-06-23
Filing date: 1998-06-23
Publication date: 1999-12-30

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zellkulturflasche aus anorganischem Glas, umfassend eine großflächige, im wesentlichen ebene Bodenwand, eine mit Abstand parallel dazu verlaufende, großflächige, im wesentlichen ebene Deckwand, im wesentlichen orthogonal dazu verlaufende Umfangswände geringer Höhe sowie zumindest eine kopfseitige, verschließbare Zugangsöffnung. Die mehrfach verwendbare und kostengünstig herstellbare erfindungsgemäße Zellkulturflasche besteht aus Natron-Kalk-Silikatglas der hydrolytischen Klasse 2 oder 3, wobei zumindest die innere Oberfläche der Bodenwand eine dünne anorganische Schicht mit reduziertem Alkaligehalt aufweist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Zellkulturflasche aus anorganischem Glas, umfassend eine großflächige, im wesentlichen ebene Bodenwand, eine mit Abstand parallel dazu verlaufende großflächige, im wesentlichen ebene Deckwand, im wesentlichen orthogonal dazu verlaufende Umfangswände geringer Höhe sowie zumindest eine kopfseitige, verschließbare Zugangsöffnung.

Derartige Zellkulturflaschen werden seit vielen Jahren in großer Zahl in der zellbiologischen und medizinischen Forschung und Entwicklung, Diagnostik und Produktion eingesetzt, um tierische und menschliche Zellen unter kontrollierten Bedingungen zu züchten. T.Lindl u. J. Bauer: Zell- und Gewebekultur. 3. Auflage, G. Fischer Verl. Stuttgart 1994 und: R. I. Freshney: Culture of Animal Cells, Third Edition, J. Wiley & Sons. Ltd. 1994).

Die Bodenwand dieser Zellkulturflaschen dient dabei als Substrat, auf dessen zum Flascheninneren weisender Oberfläche die zu vermehrenden Zellen aufwachsen. Sie muß zu diesem Zwecke einen großen ebenen Flächenbereich aufweisen. Damit das Verhältnis von Nutzfläche zu Volumen der Zellkulturflasche möglichst hoch ist, verläuft die ebenfalls über einen möglichst großen Flächenbereich ebene, zur Bodenwand parallele Deckwand der Zellkulturflasche in einem möglichst geringen Abstand zu dieser, so daß aber das Pipettieren der Zellen durch die Zugangsöffnung hindurch noch problemlos möglich ist. Die Bodenwand und die Deckwand der Zellkulturflasche werden durch Umfangswände geringer Höhe verbunden, deren Verlauf so zu gestalten ist, daß möglichst alle Bereiche im Inneren der Zellkulturflasche problemlos mit einer Pipette erreichbar sind. Bekannte Zellkulturflaschen weisen daher in der Regel einen kopfseitigen Bereich mit sich von der Zugangsöffnung her zunächst stetig vergrößernder Breite auf, an den sich meist ein Bereich konstanter Breite anschließt. Die. Zugangsöffnung von Zellkulturflaschen befindet sich im Normalfall in einem mit einem Außengewinde versehenen Flaschenhals, der mit einem je nach Anwendung gasdurchlässigen oder gasdichten Verschluß verschließbar ist.

Zellkulturflaschen müssen aus einem mit den zu züchtenden Zellen verträglichen transparenten Material bestehen, das die Vermehrung der Zellen nicht störend beeinflußt und das die Betrachtung der Zellkultur unter dem Mikroskop ermöglicht. Gegenwärtig werden nahezu ausschließlich Zellkulturflaschen aus transparenten Kunststoffen wie Polystyrol oder Polycarbonat eingesetzt.

Vereinzelt werden außerdem Zellkulturflaschen aus Borosilikatglas verwendet.

Borosilikatglas zeichnet sich durch eine äußerst geringe Abgabe von Alkaliionen und Silikatverbindungen unter der Einwirkung von Wasser oder sauren Medien aus. Borosilikatglas gehört daher im Regelfall zur sogenannten 1. hydrolytischen Klasse gemäß DIN 12111. Gläser werden gemäß dieser Norm in verschiedene Klassen eingeteilt, die ein Maß für die Wasser- und Säurebeständigkeit dieser Gläser darstellen:

Tabelle 1

Zwar eignet sich Borosilikatglas der 1. hydrolytischen Klasse als chemisch äußerst stabiles und inertes Material grundsätzlich gut als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Zellkulturflaschen, doch Borosilikatglasflaschen sind relativ teuer in der Herstellung und nur schwer in ausreichend geringer Wandstärke zu produzieren. Ferner sind Borosilikatflaschen grundsätzlich nicht mit normalem Weichglas beim Recyclingprozess mischbar, da Borosilikatglas einen wesentlich höheren Schmelzpunkt, (ca. 1600°C) als z. B. Weichglas der hydrolytischen Klasse 3 (ca. 1200°C) aufweist. In der Praxis haben sich daher, wie oben erwähnt, Kunststoffflaschen durchgesetzt. Kunststoffflaschen können im Normalfall jedoch nur einmal zur Zellkultur eingesetzt werden, da die Oberfläche von den Zellen irreversibel verändert werden. So verursachen sie dadurch einen erhöhten Material- und Lageraufwand und sind unter ökologischen Gesichtspunkten negativ zu bewerten.

Der Erfindung liegt die Aufgabe, zugrunde, eine kostengünstig mit geringer Wandstärke herstellbare, mehrfach verwendbare Zellkultur flasche der eingangs genannten Art bereitzustellen, die auch nach mehrfacher Reinigung keine die Zellvermehrung beeinträchtigende Abgabe von Alkaliionen und Silikatverbindungen aufweist. Dabei soll die kostengünstig herstellbare Zellkulturflasche liegend stapelbar sein und eine mikroskopische Betrachtung der Zellkultur ermöglichen. Erfindungsgemäß besteht die Zellkulturflasche aus Natron-Kalk- Silikatglas der hydrolytischen Klasse 2 oder 3 (Weichglas), wobei zumindest die innere Oberfläche der Bodenwand eine dünne anorganische Schicht mit reduziertem Alkaligehalt aufweist. Bevorzugt weist dabei ihre gesamte innere Oberfläche eine anorganische Schicht mit reduziertem Alkaligehalt auf. Überraschenderweise gelingt es im Rahmen der Erfindung, an sich für Zellkulturzwecke nicht brauchbares Natron-Kalk-Silikatglas der 2. oder gar 3. hydrolytischen Klasse für die Herstellung von Zell kulturflaschen verwendbar zu machen, indem die innere Oberfläche der aus diesem Material hergestellten Flasche durch eine Behandlung, insbesondere eine Ionenaustauschbehandlung, oder eine Beschichtung so modifiziert wird, daß eine störende Abgabe von Alkaliionen und Silikatverbindungen über eine Anzahl von Reinigungsprozessen hinweg wirksam vermieden werden kann.

Um das Handling der bruchgefährdeten Zellkulturflasche aus Natron- Kalk-Silikatglas beim Stapeln von mehreren solcher Flaschen zu erleichtern, sind erfindungsgemäß ihre Bodenwand und Deckwand mit das Verrutschen der Zellkulturflaschen verhindernden formschlüssigen Querschnittskonturen versehen. Dabei weist die Bodenwand insbesondere von außen betrachtet eine konvexe (nach außen gewölbte) Querschnittskontur und die Deckwand ebenfalls von außen betrachtet eine entsprechend geformte konkave (nach innen gewölbte) Quer schnittskontur auf. Durch die walmenartige Gestaltung des Bodenbereichs der Zellkulturflasche wird die Zellkultur positiv beeinflußt, während die dazu passende Wölbung nach innen der nicht zum Aufwachsen von Zellen verwendeten Deckwand unproblematisch ist. Dabei ist zur Erreichung eines günstigen Verhältnisses von für die Zellkultur nutzbarer Bodenfläche und Flaschenvolumen darauf zu achten, daß die dem Formschluß von Boden- und Deckwand dienenden Abweichungen von der ebenen Form der Bodenwand örtlich beschränkt bleiben, so daß mindestens 85%, vorzugsweise mehr als 90%, der Fläche der Bodenwand eben verläuft.

Ganz besonders bevorzugt ist es im Rahmen der Erfindung, wenn die Schicht mit reduziertem Alkaligehalt eine durch oberflächlichen Ionenaustausch im Natron-Kalk-Silikatglas erzeugte Ionenaustausch schicht ist, deren Dicke mind. 50 nm beträgt. Es hat sich insbesondere bewährt, wenn die Ionenaustauschschicht einen gegen über dem Glas-Basismaterial erhöhten Natriumsulfatgehalt aufweist.

Alternativ dazu wird erfindungsgemäß die Schicht mit reduziertem Alkaligehalt durch eine zusätzlich aufgebrachte dünne Beschichtung der inneren Glasoberfläche der Zellkulturflasche gebildet. Als Beschichtungsmaterialien sind vor allem die Metalloxide SnO₂ geeignet. Die Beschichtung weist bevorzugt eine Dicke von mindestens 50 nm auf. Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn die Beschichtung eine Akali-Diffusionssperrschicht, ist. Als Beschicht ungsverfahren kommen vor allem die Verfahren der Entalkalisierung der Oberfläche bis zu einer Tiefe von mindestens 50 nm durch aggressive Gase, insbesondere SO₄ in Frage.

Es liegt im Rahmen der Erfindung, zusätzliche anorganische oder organische Schichten auf die innere Oberfläche der Zellkulturflasche aufzubringen, um die Aufwachsbedingungen für Zellen gezielt zu beeinflussen. Beispielsweise eine Beschichtung mit biologischen Adhäsionsmolekülen, wie Fibronectin, V-CAM, Laminin oder Collagenen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand einer Zeichnung und mit Hilfe von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1 die Draufsicht auf ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Zellkulturflasche,

Fig. 2 die Seitenansicht einer Zellkulturflasche entsprechend Fig. 1,

Fig. 3 einen Querschnitt der Zellkulturflasche im Bereich der Linie A-A gemäß Fig. 1,

Fig. 4 einen Schnitt durch die Bodenwand der Zellkulturflasche in schematischer, nicht maßstabsgerechter Darstellung,

Fig. 5 die Seitenansicht zweier aufeinander gestapelter Zellkultur flaschen nach dem ersten Ausführungsbeispiel,

Fig. 6 die Draufsicht auf ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Zellkulturflasche,

Fig. 7 die Seitenansicht einer Zellkulturflasche entsprechend Fig. 6,

Fig. 8 einen Schnitt durch die Bodenwand der Zellkulturflasche nach dem zweiten Ausführungsbeispiel in schematischer, nicht maßstabsgerechter Darstellung.

Ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Zellkultur fläsche ist in den Fig. 1 bis 4 dargestellt. Die Zellkultur flasche 1 weist eine annähernd trapezförmige Außenkontur auf. Ihre Bodenwand 2 und ihre Deckwand 3 verbreitern sich stetig vom kopf seitigen Flaschenhals 5 her bis hin zu ihrem gegenüberliegenden Ende, das die Stelle mit der größten Breite der Zellkulturflasche 1 bildet. Entlang der Außenkontur der Zellkulturflasche 1 verläuft ihre Umfangswand 4, die die Bodenwand 2 mit der Deckwand 3 verbindet und sich im wesentlichen orthogonal zu diesen erstreckt. Die Zugangsöffnung 7 der Zellkulturflasche 1 wird durch eine auf das nicht dargestellte Außengewinde des Flaschenhalses 5 aufschraubbare Verschlußkappe 6 verschlossen.

Wie besonders gut in den Fig. 2 und 3 erkennbar ist, verlaufen die Bodenwand 2 und die Deckwand 3 über den größten Teil ihrer Fläche eben. Hierdurch wird eine Betrachtung der auf der inneren Oberfläche der Bodenwand 2 angesiedelten (nicht dargestellten) Zellkultur durch ein Mikroskop ermöglicht. Im Randbereich hingegen ist die Bodenwand 2 nach außen gewölbt, so daß ihre Querschnittskontur insgesamt von außen betrachtet einen konvexen Verlauf hat. Die im wesentlichen parallel zur Bodenwand 2 angeordnete Deckwand 3 ist im Randbereich nach innen gewölbt, so daß ihre Querschnittskontur von außen betrachtet einen konkaven Verlauf hat. Die Querschnittskonturen der Bodenwand 2 und der Deckenwand 3 sind so aufeinander abgestimmt, daß sich beim Aufeinanderstapeln von zwei oder mehreren Zellkultur flaschen 1 - wie in Fig. 5 dargestellt - ein Formschluß ergibt, der ein Verrutschen der Zellkulturflaschen 1 beim Hantieren bzw. beim Stapeln im Brutschrank zuverlässig verhindert.

In einem Versuch wurde eine Zellkulturflasche 1 mit der Außen- und Querschnittskontur entsprechend den Fig. 1 bis 5 hergestellt. Die Zellkulturflasche 1 hatte die folgenden Abmessungen:

Maximale Breite	11,2 cm
Länge einschl. Flaschenhals	14,4 cm
Nutzbare Zellkulturfläche	75,0 cm
Max. Höhe	3,8 cm
Abstand Oberseite Deckwand 3/ Oberseite Bodenwand 2	3,4 cm
Dicke der Bodenwand 2 und der Deckenwand 3	max. 0,2 cm

Die aus Natron-Kalk-Silikatglas der 3. hydrolytischen Klasse mit einem SiO₂-Gehalt von 71,8% und einem Na-Gehalt von 16.1% hergestellte Zellkulturflasche 1 wurde einer ihre gesamte innere Oberfläche erfassenden Ionenaustauschbehandlung unterzogen. Hierzu wurde die Zellkulturflasche 1 im erzeugungswarmen Zustand (Temperatur ca. 500-600°C) mit einer Tablette aus 1 g Ammoniumsulfat bestückt und für 15 Minuten auf dieser Temperatur gehalten. Hierbei erfolgte ein oberflächlicher Austausch der Na-Ionen des Glases durch Sulfationen, so daß eine etwa 50 nm dicke Ionenaustauschschicht mit um mind. einen Faktor 20-30 reduziertem Natriumgehalt entstand.

(C. J. Peddle: Glas Technology, Vol. 21 (1937) 177 und: J. Greim, H. Knödler a. H. A. Schaeffer: Verres Refract. Vol. 35 (1981), 315 und: H. A. Schaeffer, M. Stengel a. J. Mecha: J. Non-Cryst. Solids, Vol. 80 (1986) 400).

Einen Schnitt durch die Bodenwand 2 der Zellkulturflasche 1 nach der Behandlung zeigt in schematischer und nicht maßstabsgerechter Darstellung die Fig. 4. Der Übergangsbereich von der Ionenaustausch schicht zum Glaswandinneren mit durch den Ionenaustausch praktisch nicht veränderter Glaszusammensetzung ist durch eine gestrichelte Linie dargestellt.

Die Fig. 6 bis 8 zeigen ein anderes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Zellkulturflasche 1. Wie in Fig. 6 gut erkennbar, weist der größte Teil der Zellkulturflasche 1 im Unterschied zum ersten Ausführungsbeispiel eine im wesentlichen rechteckige Außenkontur und damit eine im wesentlichen rechteckige Bodenwand 2 auf lediglich in einem relativ kurzen Übergangsbereich zum Flaschenhals 5 hin reduziert sich die Breite der Zellkulturflasche 1. Der Flaschenhals 5 kann leicht nach oben geneigt verlaufen, was das Pipettieren erleichtert.

In einem Versuch wurde eine Zellkulturflasche 1 mit der Außen- und Querschnittskontur entsprechend den Fig. 6 und 7 hergestellt. Die, Zellkulturflasche 1 hatte die folgenden Abmessungen:

Maximale Breite	11,2 cm
Länge einschl. Flaschenhals	14,4 cm
Nutzbare Zehlkulturfläche	75,0 cm
Max. Höhe	3,8 cm
Abstand Oberseite Deckwand 3/Oberseite Bodenwand 2	3,4 cm
Dicke der Bodenwand 2 und der Deckenwand 3	max. 0,2 cm

Die Zellkulturflasche 1 wurde nach der Formung auf ihrer inneren Oberfläche mit einer Beschichtung aus SnO₂ versehen.

Es wurden Zellen der Linien L-929 (Fibroblasten) und der Linie CHO-K-1 (Epithelien) in die Zellkulturflasche 1 (behandelt entweder mit dem Ionenaustauschverfahren oder mit der SnO-Beschichtung) eingebracht, und deren Wachstum wurde beobachtet.

Im Vergleich zu einer Zellkulturflasche der gleichen Glas zusammensetzung ohne erfindungsgemäße Beschichtung und einer Polystyrolzellkulturflasche ergab sich folgendes Resultat:
Während die unbehandelte Probe im Vergleich zur Polystyrolflasche (Zellausbeute nach 5 Tagen wurde als 100% gesetzt) ein um 10% reduziertes Wachstum auswies, wies die Flasche mit der SnO₂- Beschichtung ca. das gleiche Wachstum wie die Polystyrolflasche auf (102%). Demgegenüber erbrachte die Flasche mit dem Ionenaus tauschverfahren ein um 20% besseres Wachstum als die Kontrollflasche aus Polystyrol.

Dies zeigt, daß die erfindungsgemäße Behandlung mit Ammoniumsulfat eine Methode ist, die für die Anwendung von Weichglas zur Zellzüchtung hervorragend geeignet ist und zudem noch kostengünstiger, umweltneutraler und biologisch sicherer ist.

Bezugszeichenliste

1

Zellkulturflasche

2

Bodenwand

3

Deckwand

4

Umfangswand

5

Flaschenhals

6

Verschlußkappe

7

Zugangsöffnung

8

Ionenaustauschschicht

9

Beschichtung

Claims

1. Zellkulturflasche (1) aus anorganischem Glas, umfassend eine großflächige, im wesentlichen ebene Bodenwand (2), eine parallel dazu verlaufende, großflächige, im wesentlichen ebene Deckwand (3), eine im wesentlichen orthogonal dazu verlaufende Umfangswand (4) geringer Höhe sowie zumindest eine kopfseitige, verschließbare Zugangsöffnung (7), dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkultur flasche (1) aus Natron-Kalk-Silikatglas der hydrolytischen Klasse 2 oder 3 besteht, wobei zumindest die innere Oberfläche der Bodenwand (2) eine dünne anorganische Schicht (8, 9) mit reduziertem Alkaligehalt aufweist.

2. Zellkulturflasche nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihre gesamte innere Oberfläche eine anorganische Schicht (8, 9) mit reduziertem Alkaligehalt aufweist.

3. Zellkulturflasche nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenwand (2) und die Deckwand (3) mit das Verrutschen von gestapelten Zellkulturflaschen (1) verhindernden formschlüssigen Querschnittskonturen versehen sind.

4. Zellkulturflasche nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenwand (2) eine konvexe Querschnittskontur und die Deckwand (3) eine entsprechende konkave Querschnittskontur aufweist.

5. Zellkulturflasche nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 85%, vorzugsweise mehr als 90%, der Fläche der Bodenwand (2) eben verläuft.

6. Zellkulturflasche nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht mit reduziertem Alkaligehalt eine durch oberflächlichen Ionenaustausch im Natron-Kalk-Silikatglas erzeugte Ionenaustauschschicht (8) ist.

7. Zellkulturflasche nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Ionenaustauschschicht (8) eine Dicke von mind. 50 nm aufweist.

8. Zellkulturflasche nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht mit reduziertem Alkaligehalt einen gegenüber dem Glas-Basismaterial erhöhten Natriumbisulfat aufweist.

9. Zellkulturflasche nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Schicht mit reduziertem Alkaligehalt durch eine dünne Beschichtung (9) ihrer inneren Oberfläche gebildet ist.

10. Zellkulturflasche nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Glasoberfläche durchgeführte Beschichtung (9) aus einem Metalloxid SnO₂ besteht.

11. Zellkulturflasche nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung (9) eine Dicke von mindestens 50 nm aufweist.

12. Zellkulturflasche nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung (9) eine Alkalidiffusions sperrschicht ist.