JP5889188B2 - 組織接着用シート製剤 - Google Patents

Description

本発明は、フィブリノゲン及びトロンビンを主成分として含有するシート様支持体より構成されるシート製剤、およびその調製方法に関する。詳細には、シート様支持体の一方の面にフィブリノゲン成分が、もう一方の面にトロンビン成分が固定化されていることを特徴とする組織接着等に用いられるシート製剤、およびその調製方法に関する。

フィブリノゲンは、いわゆる凝固カスケードの最終段階に存在する非常に重要な凝固因子である。フィブリノゲンは、例えば損傷後の凝固系の活性化において、トロンビンによりその可溶性形態から、止血および創傷治癒に重要な寄与をする不溶性のフィブリンに変換される。

フィブリノゲンは止血および創傷治癒に対して重要性を有し、例えば先天性および後天性のフィブリノゲン欠乏症における補充療法で静脈投与製剤として臨床的に使用され、血液中のフィブリノゲン濃度を高めることによって重篤な出血を阻止する。さらに、近年、フィブリノゲンとトロンビンより構成されるフィブリン接着剤は、外科手術において肝臓又は脾臓のような軟部器官の縫合代用の接着剤として、または縫合補助剤として使用されていると同時に、その他幅広い臨床の現場で応用されている。

このようなフィブリン接着剤は、傷または組織表面への接着能力を有し、接着部位または接ぎ合わされた傷の引っ張り強度を高めるとともに、生体内で完全に吸収されるものであり、傷の治癒を促進する特性を持つ。

フィブリン接着剤は溶液状態では安定とは言えず、冷凍保存液または凍結乾燥粉末の形で製剤化されたものが、医療現場において利用されている。従って、入手可能な市販の製剤は、適用前に解凍するか、凍結乾燥品から再水和する必要があり、いずれの方法でもその調製のために時間を要する。詳細には、凍結乾燥品から調製するフィブリン接着剤は、フィブリノゲン凍結乾燥粉末、フィブリノゲン溶解液、トロンビン凍結乾燥粉末、トロンビン溶解液より構成され、凍結乾燥粉末の溶解操作やフィブリノゲン溶液とトロンビン溶液の塗布準備・混合操作等に時間を要した場合、特に緊急を要する外科手術においては、患者に悪影響を及ぼすことも危惧される。

また、フィブリン接着剤としての接着作用を十分に得るためには、フィブリノゲンを高濃度に溶解させることが必要であり、凝固しうるフィブリノゲン濃度は高濃度であるほど有利である。ところが、このような高濃度フィブリノゲン溶液をフィブリノゲン凍結乾燥物から調製するにはかなりの時間を要し、緊急を要する外科手術での使用に適さないという問題がある。

トロンビンが固定化された生体吸収性シートとフィブリノゲン溶液とから構成されるシート製剤が報告されている（特許文献１、特許文献２）。本シート製剤は外科手術の現場において、フィブリノゲン溶液にトロンビン固定化シートを浸漬した後に、術部に適用されるもので、優れた止血効果や接着効果が認められるものである。しかしながら、トロンビンはシートに予め固定化されているものの、フィブリノゲン溶液を調製するための時間が必要なため、依然として緊急使用を可能とするものではない。

従って、臨床現場で求められている薬剤は、（１）高い接着・止血力を有する薬剤、（２）調製時間の不要な剤型、すなわちフィブリノゲンとトロンビンが一体化されたシート製剤であると言える。一体化されたシート製剤として、現在臨床的使用が認可されている製剤は、ウマコラーゲンの支持体にフィブリノゲンとトロンビンを混合固定したシート製剤（ＴａｃｈｏＣｏｍｂ（登録商標）：ＣＳＬベーリング社）がある。しかしながら、当該シート製剤の有効性は限定的であり、外科医を満足させるには至っていない。更に、当該シート製剤の製法は非常に複雑である（特許文献３）。従って、臨床現場では緊急時の手術に対応でき、かつ強力な組織接着・閉鎖・止血力を有した薬剤が望まれている。また、より簡便なシート製剤の製法を発明することは、臨床現場において強力かつ安価な組織接着・閉鎖・止血剤を供給することを可能にする。

有効成分としてフィブリノゲンが固定化された生体吸収性支持体、及び有効成分としてトロンビンが固定化された生体吸収性支持体より構成されることを特徴とする２層の支持体からなるシート状フィブリン糊接着剤は公知である（特許文献４）。しかしながら、当該発明は２層の支持体から構成されるため、患部への適用操作が煩雑であり、鏡視下手術時には患部への適用が困難であると言える。更には緊急手術やイレギュラーな出血時に適用しづらい。

５−１００Ｎ／ｃｍの範囲の弾性係数、１−１０ｍｇ／ｃｍ^３の密度、直径が０．７５ｍｍより大きく４ｍｍ未満、および／または平均直径が３ｍｍ未満である小室の物理的特性の少なくとも一つを有する担体、ならびに該担体へ固体フィブリノゲン及び固体トロンビンが固定された固体組成物は公知である（特許文献５）。しかしながら、当該発明はシート製剤ではないため、圧迫して使用することが困難である。同時に引っ張り強度が弱く、組織閉鎖力に乏しい。また、患部に適用する際、アプリケーターを使用しなければならず、操作が煩雑である。更に、担体に固体フィブリノゲンと固体トロンビンを固定したことで、マトリックス内で瞬時に２成分が反応してフィブリンを形成してしまい、適用すべき組織との接着が不十分に終わってしまうと言える。高い接着力を発揮するためには、組織接着部位にフィブリノゲンが浸透した状態でトロンビンと反応してゲル化することが重要である。

再公表ＷＯ２００４／０６４８７８ 再公表ＷＯ２００５／１１３０３０ 特表２００４−５２０１２４号公報 特開２０１０−６９０３１号公報 特開２００７−１９０３９９号公報

このような状況下、本発明の課題は、（１）高い接着力・止血力を有する薬剤、（２）調製時間の不要な剤型、（３）製法が簡便であり、かつ安価な薬剤、すなわちフィブリノゲンとトロンビンが一体化されたシート製剤、およびその製造方法を提供することにある。より具体的には、現在臨床的使用が認可されている製剤と比較して、より強力な組織接着・閉鎖・止血力を発揮でき、かつ安価なシート製剤、およびその製造方法を提供することにある。

そこで、本願発明者等は上述の問題に鑑み鋭意検討した結果、シート様支持体の一方の面にフィブリノゲン溶液を含浸・凍結乾燥させてフィブリノゲン凍結乾燥粉末を固定化させた後、トロンビン粉末を分散させた粉末分散液を他方の面に塗布・乾燥してトロンビン乾燥粉末を固定化させることにより、フィブリノゲン成分とトロンビン成分が一体的に固定されたシート製剤が上記特性を具備していることを見出した。当該シート製剤は、フィブリノゲンを凍結乾燥粉末として固定することで、シート様支持体の固定面において、単位面積当りに高濃度でフィブリノゲンを固定化させている。そのため、当該シート製剤は既存製剤よりも優れた組織接着・閉鎖・止血効果を発揮する。以下、詳細に本発明を説明する。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］シート様支持体の一方の面にフィブリノゲン成分が固定され、フィブリノゲン成分が固定されていない他方の面にトロンビン成分が固定され、かつ両成分が互いに分離して固定化されていることを特徴とする、シート製剤。
［２］当該シート様支持体が、少なくとも厚さ０．３ｍｍのシート様支持体であることを特徴とする、［１］に記載のシート製剤。
［３］当該シート様支持体が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸およびポリブチレンサクシネート、並びにこれらの共重合体および誘導体からなる群より選択される生体吸収性材料より作製されるシート様支持体である、［１］又は［２］に記載のシート製剤。
［４］当該シート様支持体が、ポリグリコール酸を材料として作製されるシート様支持体である、［３］に記載のシート製剤。
［５］当該シート様支持体が、生体吸収性材料を用いて編、織成された編、織地を、ニードルパンチして製造された不織布からなるシート様支持体であることを特徴とする、［１］ないし［４］の何れか一項に記載のシート製剤。
［６］当該フィブリノゲン成分が、フィブリノゲン凍結乾燥粉末であることを特徴とする、［１］ないし［５］の何れか一項に記載のシート製剤。
［７］当該フィブリノゲン凍結乾燥粉末が、フィブリノゲン溶液をシート様支持体の片方の面に塗布または含浸させた後、凍結乾燥させたフィブリノゲン凍結乾燥粉末であることを特徴とする、［６］に記載のシート製剤。
［８］当該フィブリノゲン成分が、シート様支持体の固定面の表面積当りフィブリノゲンが少なくとも１．５ｍｇ／ｃｍ^２で固定されていることを特徴とする、［１］ないし［７］の何れか一項に記載のシート製剤。
［９］当該フィブリノゲン溶液が、１％〜１５％（ｗ／ｖ）フィブリノゲンが含まれるフィブリノゲン溶液であることを特徴とする、［１］ないし［８］の何れか一項に記載のシート製剤。

［１０］当該トロンビン成分が、トロンビン粉末であることを特徴とする、［１］ないし［９］の何れか一項に記載のシート製剤。
［１１］当該トロンビン粉末が、トロンビン粉末を溶媒中に分散させた粉末分散液をフィブリノゲン成分が固定されていない他方の面に塗布した後、乾燥させたトロンビン粉末であることを特徴とする、［１０］に記載のシート製剤。
［１２］当該溶媒がアルコール類であることを特徴とする、［１１］に記載のシート製剤。
［１３］当該アルコール類が、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、イソペンチルアルコールからなる群より選択されることを特徴とする、［１２］に記載のシート製剤。
［１４］当該アルコール類が、エタノールであることを特徴とする、［１３］に記載のシート製剤。
［１５］当該トロンビン成分が、シート様支持体の固定面の表面積当りトロンビンが少なくとも０．２８Ｕ／ｃｍ^２で固定されていることを特徴とする、［１］ないし［１４］の何れか一項に記載のシート製剤。
［１６］血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アプロチニン、アルブミン、塩化カルシウム、非イオン界面活性剤、各種アミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、［１］ないし［１５］の何れか一項に記載のシート製剤。

［１７］シート様支持体の一方の面にフィブリノゲン成分を固定し、フィブリノゲン成分が固定されていない他方の面にトロンビン成分を固定することを特徴とする、［１］ないし［１６］の何れか一項に記載のシート製剤の製造方法。
［１８］（Ａ）シート様支持体の一方の面にフィブリノゲン溶液を塗布または含浸させた後、凍結乾燥させてフィブリノゲン凍結乾燥粉末を固定化させる工程、及び
（Ｂ）トロンビン粉末分散液をシート様支持体の他方の面に塗布させた後、乾燥させてトロンビン粉末を固定化させる工程
からなり、フィブリノゲン成分とトロンビン成分が別々の面に分離して固定化されていることを特徴とする、シート製剤の製造方法。
［１９］当該フィブリノゲン溶液が、シート様支持体のトロンビン粉末が固定化される他方の面に到達しない液量のフィブリノゲン溶液であることを特徴とする、［１８］に記載のシート製剤の製造方法。
［２０］ ［１］ないし［１６］の何れか一項に記載のシート製剤を用いることを含む止血方法。

本発明に従えば、フィブリノゲン凍結乾燥シートにトロンビン粉末を固定したシート製剤、およびその調製方法が提供される。本発明のシート製剤は、
（１）既存製剤よりも優れた組織接着・閉鎖・止血効果を発揮することができる；
（２）既存製剤には形成することができないγダイマーを形成することができ、フィブリン凝塊の物理的強度と安定性を高めることができる；
（３）調製時間が不要で緊急時に使用可能な利便性の高い製剤である；
（４）再水和に優れている；
（５）生体吸収性である；
（６）柔軟性・伸縮性に優れている；
（７）有効成分の固定に優れている；
（８）製法が簡便であり、安価に製造できる
といった優れた効果を有するものである。

本発明のシート製剤の接着力評価試験の結果を示す。 本発明のシート製剤の接着力評価試験の結果を示す。 本発明のシート製剤の接着力評価試験の結果を示す。 本発明のシート製剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。 本発明のシート製剤の止血力評価試験の結果を示す。

本発明のシート製剤は、シート様支持体の一方の面にフィブリノゲン成分が固定され、フィブリノゲン成分が固定されていない他方の面にトロンビン成分が固定され、かつ両成分が互いに分離して固定化されていることを特徴とする、シート製剤である。

前記フィブリノゲン成分は、フィブリノゲンを含有する乾燥粉末、凍結乾燥粉末、ゲルであれば良く、好ましくは凍結乾燥粉末である。フィブリノゲン成分には、フィブリノゲンの他、血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アプロチニン、アルブミン、塩化ナトリウム、クエン酸３ナトリウム、ポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤、各種アミノ酸、グリセリン等を含んでもよい。

前記フィブリノゲン成分を固定する方法は、フィブリノゲン溶液をシート様支持体の一方の面に塗布または含浸させた後に凍結乾燥させて、フィブリノゲン凍結乾燥粉末を固定化させても良く、フィブリノゲン凍結乾燥粉末をシート様支持体の一方の面に直接散布しても構わない。特に、フィブリノゲン溶液をシート様支持体に含浸させた後、凍結乾燥させて固定する方法が好ましい。その際に、フィブリノゲン成分を他方の面に塗布、浸潤または表出させてはならない。

前記シート様支持体へのフィブリノゲン成分の固定は、シート様支持体の固定面の表面積当りフィブリノゲンが少なくとも１．５ｍｇ／ｃｍ^２であることが好ましい。さらに好ましくは１．５ｍｇ／ｃｍ^２〜３０ｍｇ／ｃｍ^２、さらに好ましくは１．５ｍｇ／ｃｍ^２〜１５ｍｇ／ｃｍ^２、さらに好ましくは１．５ｍｇ／ｃｍ^２〜１２ｍｇ／ｃｍ^２、さらに好ましくは３ｍｇ／ｃｍ^２〜１２ｍｇ／ｃｍ^２、さらに好ましくは６ｍｇ／ｃｍ^２〜１２ｍｇ／ｃｍ^２である。シート様支持体へ固定するフィブリノゲンの量は、シート様支持体の厚さやフィブリノゲン溶液の濃度に応じて、適宜変更しても構わない。

前記フィブリノゲン溶液は、１％〜１５％（ｗ／ｖ）フィブリノゲンが含まれる溶液が好ましい。さらに好ましくは１％〜１２％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは２％〜１２％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは３％〜１２％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは３％〜６％（ｗ／ｖ）である。フィブリノゲン溶液の濃度は、シート様支持体の厚さやシートに固定するフィブリノゲンの量に応じて、適宜変更しても構わない。

前記トロンビン成分は、トロンビンを含有する乾燥粉末、凍結乾燥粉末、ゲルであれば良く、好ましくは乾燥粉末である。トロンビン成分には、トロンビンの他、アルブミン、塩化ナトリウム、クエン酸３ナトリウム、ポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤、各種アミノ酸、グリセリン等を含んでもよい。

前記トロンビン成分を固定する方法は、トロンビン粉末を分散させた粉末分散液をシート様支持体に塗布した後、乾燥させても良く、トロンビン粉末をシート様支持体に直接散布しても構わない。特に、トロンビン粉末を分散させた粉末分散液をシート様支持体に塗布した後、乾燥させて固定する方法が好ましい。

前記シート様支持体へのトロンビン粉末の塗布量は、シート様支持体の固定面の表面積当りトロンビンが少なくとも０．２８Ｕ／ｃｍ^２であることが好ましい。さらに好ましくは０．２８〜６０Ｕ／ｃｍ^２、さらに好ましくは０．２８〜３０Ｕ／ｃｍ^２、さらに好ましくは０．２８〜１５Ｕ／ｃｍ^２、さらに好ましくは０．２８〜１３．８Ｕ／ｃｍ^２、さらに好ましくは１．３８〜１３．８Ｕ／ｃｍ^２、さらに好ましくは４．６〜１３．８Ｕ／ｃｍ^２である。シート様支持体に固定するトロンビンの量は、シート様支持体に固定するフィブリノゲンの量に応じて、適宜変更しても構わない。

前記トロンビン粉末分散液は、有機溶媒を主溶媒とすることが好ましい。特に、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、イソペンチルアルコール等のアルコール溶媒、又は人体へ影響しない種類での低沸点溶媒を主溶媒とすることが好ましい。人体への安全性を考慮した場合には、エタノールを主溶媒とすることが好ましい。

前記トロンビン粉末を分散させたトロンビン粉末分散液は、５．６Ｕ／ｍＬ〜１３８０Ｕ／ｍＬトロンビン、０．０６４ｍｇ／ｍＬ〜６４ｍｇ／ｍＬ塩化カルシウムを含むことが好ましい。特に、２７．６Ｕ／ｍＬ〜２７６Ｕ／ｍＬトロンビン、０．６４ｍｇ／ｍＬ〜６．４ｍｇ／ｍＬ塩化カルシウムを含むことが好ましい。トロンビン粉末の濃度は、シート様支持体の厚さやシート様支持体に固定するトロンビンの量に応じて、適宜変更しても構わない。

前記フィブリノゲン成分及びトロンビン成分をシート様支持体に固定化させる順番は、フィブリノゲン成分とトロンビン成分が適用前に互いに接触・反応しない限り、フィブリノゲン成分を先にシート様支持体へ固定化させた後にトロンビン成分を固定化させてもよく、トロンビン成分を先にシート様支持体へ固定化させた後にフィブリノゲン成分を固定化させてもよい。ただし、作製方法の簡便さの観点から、シート様支持体へフィブリノゲン成分を固定化させた後にトロンビン成分を固定化させる方法が好ましい。具体的には、シート様支持体の片方の面をフィブリノゲン溶液に浸漬し、フィブリノゲン溶液を含浸させた後、凍結乾燥してフィブリノゲン固定化シートを作製する。その際、フィブリノゲン溶液の液量は、用いるシート様支持体の面積と厚さを考慮し、トロンビン成分が固定化される面に到達しない量に調整する必要がある。その後、フィブリノゲン成分が固定化された面の反対側の面にエタノールに分散させたトロンビン粉末分散液を塗布し乾燥する。

前記シート様支持体の厚さは、少なくとも０．１５ｍｍであることが好ましい。さらに、少なくとも０．３ｍｍであることが好ましい。さらに好ましくは少なくとも０．４ｍｍ、さらに好ましくは少なくとも０．８ｍｍ、さらに好ましくは少なくとも１ｍｍである。シート様支持体の厚さの上限は適用組織や塗布するフィブリノゲン溶液の量に応じて適宜変更して構わない。

前記シート様支持体に使用される生体吸収性材料は、脂肪族ポリエステルであることが好ましい。生体吸収性材料としては、具体的には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネートなどや、これらの共重合体および誘導体が例示できる。好ましくは、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、およびそれらの共重合体や誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種である。さらに好ましいのは、ポリグリコール酸およびその誘導体である。

前記シート様支持体の構造は、不織布、スポンジ状、織布、編物、組紐及びそれらの複合体であることが好ましい。特に、不織布であることが好ましい。

前記不織布としては、例えば、メルトブロー法、ニードルパンチ法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法等の方法により製造された不織布であることが好ましい。特に、生体吸収性材料（例えばポリグリコール酸）を用いて編、織成された編、織地をニードルパンチして不織布化した不織布が好ましい（特公平５−１８５７９）。

本発明に使用されるフィブリノゲン、トロンビン、アルブミン、アプロチニン、血液凝固第ＸＩＩＩ因子を製造する方法は特に限定されることはなく、例えばヒト血液より分離する方法あるいは遺伝子組み換え技術により作製する方法などによって製造することができる。

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に何等限定されるものではない。

実施例１
（シート製剤の作製方法）
シート様支持体としては生体吸収性シートを使用し、具体的な生体吸収性シートとして、ネオベール０１５Ｇ（登録商標）（グンゼ社製、組成：ポリグリコール酸、厚さ０．１５ｍｍ）、ネオベール０３Ｇ（登録商標）（グンゼ社製、組成：ポリグリコール酸、厚さ０．３ｍｍ）、ネオベール０５Ｇ（登録商標）（グンゼ社製、組成：ポリグリコール酸、厚さ０．５ｍｍ）を使用した。

フィブリノゲン溶液Ｉは、約１２．０％（ｗ／ｖ）フィブリノゲン、約９０ＩＵ／ｍＬ血液凝固第ＸＩＩＩ因子、１．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン、２．６％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム、１．８％（ｗ／ｖ）クエン酸３ナトリウム、０．５％（ｗ／ｖ）イソロイシン、０．７％（ｗ／ｖ）グリシン、１．６％（ｗ／ｖ）アルギニン塩酸塩、１．２％（Ｗ／Ｖ）グルタミン酸ナトリウム、０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０、１．０％グリセリンを含むｐＨ６．７〜６．９となるように調製した。フィブリノゲン溶液ＩＩは、フィブリノゲン溶液Ｉを注射用水で２倍に希釈した約６．０％（ｗ／ｖ）フィブリノゲン溶液にグリセリンを加えて１．０％グリセリン溶液としたものである。フィブリノゲン溶液ＩＩＩは、フィブリノゲン溶液Ｉを注射用水で４倍に希釈した約３．０％（ｗ／ｖ）フィブリノゲン溶液にグリセリンを加えて１．０％グリセリン溶液としたものである。トロンビン凍結乾燥粉末は、ボルヒール（登録商標）（一般財団法人化学及血清療法研究所製）のトロンビン凍結乾燥粉末を使用した。塩化カルシウム粉末は、塩化カルシウム二水和物（ナカライテスク社製）を使用した。粉末分散液は、エタノール（和光純薬工業社製、純度：９９．５％）を使用した。

シャーレ上に２．５×２．０ｃｍのサイズの生体吸収性シートを静置した。厚さ０．８ｍｍのシート様支持体としてネオベール０３Ｇとネオベール０５Ｇを重ねたものを、厚さ０．４５ｍｍのシート様支持体としてネオベール０１５Ｇとネオベール０３Ｇを重ねたもの、またはネオベール０１５Ｇを３枚重ねたものを、厚さ０．３ｍｍのシート様支持体としてネオベール０３Ｇ、またはネオベール０１５Ｇを２枚重ねたものを使用した。発明品Ａ， Ｂ， Ｊ， Ｋ， Ｌは、生体吸収性シートの固定面の表面積当り５０μＬ／ｃｍ^２のフィブリノゲン溶液Ｉを含浸し、凍結乾燥してフィブリノゲン固定化シートを作製した。発明品Ｃ、Ｄは、生体吸収性シートの固定面の表面積当り１００μＬ／ｃｍ^２のフィブリノゲン溶液Ｉを含浸し、凍結乾燥してフィブリノゲン固定化シートを作製した。発明品Ｅは、生体吸収性シートの固定面の表面積当り５０μｌ／ｃｍ^２のフィブリノゲン溶液ＩＩＩを含浸し、凍結乾燥してフィブリノゲン固定化シートを作製した。発明品Ｆは、生体吸収性シートの固定面の表面積当り１００μＬ／ｃｍ^２のフィブリノゲン溶液ＩＩＩを含浸し、凍結乾燥してフィブリノゲン固定化シートを作製した。発明品Ｇは、生体吸収性シートの固定面の表面積当り５０μＬ／ｃｍ^２のフィブリノゲン溶液ＩＩを含浸し、凍結乾燥してフィブリノゲン固定化シートを作製した。各フィブリノゲン固定化シートに対して、エタノールにトロンビン凍結乾燥粉末と塩化カルシウム粉末を分散させた粉末分散液を、フィブリノゲン固定面とは反対面に塗布して乾燥させた。トロンビン凍結乾燥粉末の塗布量は、生体吸収性シートの固定面の表面積当りで示し、次の通りであった。発明品Ａ， Ｂ， Ｃ， Ｄ， Ｅ， Ｆ， Ｇは１３．８Ｕ／ｃｍ^２、発明品Ｊは０．２８Ｕ／ｃｍ^２、発明品Ｋは１．３８Ｕ／ｃｍ^２、発明品Ｌは４．６Ｕ／ｃｍ^２とした。塩化カルシウム粉末の塗布量は、０．３２ｍｇ／ｃｍ^２とした。
各発明品の条件を下表にまとめた。

実施例２
（シート製剤の接着力評価試験）
生理食塩液は、日本薬局方生理食塩液（大塚製薬社製）を使用した。注射用水は、日本薬局方注射用水（一般財団法人化学及血清療法研究所製）を使用した。シート製剤の対照として、ＴａｃｈｏＣｏｍｂ（登録商標）（ＣＳＬベーリング社製）を使用した。

二つの検査治具にそれぞれ貼り付けたブタ皮膚（接着面積２．５ｃｍ^２）の間に５０μＬ／ｃｍ^２の生理食塩液を塗布し、その上にシート製剤を静置した。５分間圧着後、直ちに片方の検査治具を水平方向に牽引して最大抗張力（Ｎ：ニュートン）を測定し、その値をシート製剤の接着力として記載した。ｎ数は、ＴａｃｈｏＣｏｍｂ：２２、発明品Ｅ／Ｇ：５、発明品Ａ／Ｂ／Ｄ／Ｆ／Ｊ／Ｋ／Ｌ：６、発明品Ｄ：８。結果は図１、２、３に示した。

図１、２、３から明らかなように、本発明品の接着力値は、Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定によりＴａｃｈｏＣｏｍｂと比較して有意差を認めた（＊＊Ｐ＜０．０１）。従って、現在臨床的使用が認可されている製剤と比較して、より強力な組織接着・閉鎖・止血力を発揮できることを明らかにした。

また、図２において、発明品Ｅ、Ｆ、及びＧは発明品Ａと比べて、シート様支持体へのフィブリノゲン塗布量が少ないにもかかわらず、優れた接着効果を発揮した。シート様支持体にフィブリノゲンを高濃度で存在させておけば、高い接着力が得られると安易には考えられるが、シート様支持体でのフィブリノゲン存在量以外の要因（塗布するフィブリノゲン溶液の濃度）も接着力に寄与する点を示した、発明者にとっても驚くべき知見である。

実施例３
（シート製剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
〔ゲル化前の検体作製：０分〕
試験群は、ＴａｃｈｏＣｏｍｂと実施例１で作製した発明品Ｂである。０．５×０．８ｃｍ＝０．４ｃｍ^２のシートを準備し、サンプルチューブに入れた。サンプルチューブに還元用処理液を加えた。シートの入った処理液を適宜攪拌し、室温で４８時間溶解させた。煮沸処理を行い、泳動・染色（ＣＢＢ）・脱色を行った。

〔ゲル化後の検体作製：５、６０分〕
試験群は、ＴａｃｈｏＣｏｍｂと実施例１で作製した発明品Ａである。０．５×０．８ｃｍ＝０．４ｃｍ^２のシートを準備し、サンプルチューブに入れた。サンプルチューブに４０μＬの生食を加え、シートを溶解・ゲル化させた。生食を添加・ゲル化５分後、または６０分後に還元用処理液を加えてゲル化反応を停止させた。ゲル化したシートの入った処理液を適宜攪拌し、室温で４８時間溶解させた。煮沸処理を行い、泳動・染色（ＣＢＢ）・脱色を行った。結果は図４に示した。

図４から明らかなように、既存製剤には形成することができないγダイマーを本発明品は形成することを確認した。従って、フィブリンゲル−マトリックス内の架橋形成によりフィブリン凝塊の物理的強度と安定性を高めることができ、強力な接着・閉鎖・止血力を発揮できることを明らかにした。

実施例４
（シート製剤の止血力評価試験）
止血評価動物モデルは、１０〜１２週齢ＳＤ系雄性ラットを用いて作製した。キシラジン塩酸塩とケタミン塩酸塩麻酔下で腹部を正中線に沿って切開して開腹した。ガーゼ等を用いて腹大動脈を露出させた。腹大静脈よりヘパリンナトリウム注射液を３００Ｕ／ｋｇ投与した。ヘパリン投与２分後に、腹大動脈に注射針を穿刺して出血を作製した。直ちに出血部位に１×１ｃｍの試験群を適用し、３分間圧迫した。圧迫終了後、３分間再出血の有無を観察した。再出血した場合は試験群を除去して、新しい試験群を適用し、再度止血操作を実施した。止血に要した止血操作回数によって止血力を評価した。ｎ数は、ＴａｃｈｏＣｏｍｂ：７、発明品Ａ／Ｃ／Ｇ：３。結果は図５に示した。

図５から明らかなように、本発明品の止血力は、ＴａｃｈｏＣｏｍｂと比較して高いと考えられた。従って、現在臨床的使用が認可されている製剤と比較して、より強力な組織接着・閉鎖・止血力を発揮できることを明らかにした。

本発明のシート製剤は、外科手術時における組織接着、止血および組織閉鎖等を行う際に、調製時間が不要で緊急時に使用可能な利便性の高い製剤である。従来技術よりも優れた組織接着・閉鎖・止血効果を発揮すると共に、既存製剤には形成することができないγダイマーを形成することができ、フィブリン凝塊の物理的強度と安定性を高めることができる。更に、従来技術よりも簡便な製法であることから、安価で有効性の高いシート製剤を供給することができる。本発明は、有効性と利便性が高く、かつ安価なシート製剤、およびその調製方法を提供することができる。

Claims (10)

1. 厚さ０.３ｍｍから０.８ｍｍの一体形成されたシート様支持体の一方の面にフィブリノゲン成分が１.５〜３.０ｍｇ／ｃｍ ^２ で固定され、フィブリノゲン成分が固定されていない他方の面にトロンビン成分が固定され、かつ両成分が互いに分離して固定化されていることを特徴とする、シート製剤。
2. 当該シート様支持体が、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸およびポリブチレンサクシネー卜、並びにこれらの共重合体および誘導体からなる群より選択される生体吸収性材料より作製されるシート様支持体である、請求項１に記載のシート製剤。
3. 当該シート様支持体が、ポリグリコール酸を材料として作製されるシート様支持体である、請求項２に記載のシート製剤。
4. 当該シート様支持体が、生体吸収性材料を用いて編、織成された編、織地を、ニ一ドルパンチして製造された不織布からなるシート様支持体であることを特徴とする、請求項１ないし請求項３の何れか一項に記載のシート製剤。
5. 当該フィブリノゲン成分が、フィブリノゲン凍結乾燥粉末であることを特徴とする、請求項１ないし請求項４の何れか一項に記載のシー卜製剤。
6. 当該トロンビン成分が、トロンビン粉末であることを特徴とする、請求項１ないし請求項５の何れか一項に記載のシート製剤。
7. 当該トロンビン成分が、シート様支持体の固定面の表面積当り卜口ンビンが少なくとも０.２８Ｕ／ｃｍ^２で固定されていることを特徴とする、請求項１ないし請求項６の何れか一項に記載のシート製剤。
8. 血液凝固第ＸＩＩＩ因子、アプロチニン、アルブミン、塩化カルシウム、非イオン界面活性剤、各種アミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１ないし請求項７の何れか一項に記載のシート製剤。
9. （Ａ）厚さ０.３ｍｍから０.８ｍｍのシート様支持体の一方の面にフィブリノゲン溶液を塗布または含浸させた後、凍結乾燥させてフィブリノゲン凍結乾燥粉末を１.５〜３.０ｍｇ／ｃｍ ^２ で固定化させる工程、及び
   （Ｂ）トロンビン粉末分散液をシート様支持体の他方の面に塗布させた後、乾燥させてトロンビン粉末を固定化させる工程
   からなり、フィブリノゲン成分とトロンビン成分が別々の面に分離して固定化されていることを特徴とする、シート製剤の製造方法。
10. 該フィブリノゲン溶液が、シート様支持体のトロンビン粉末が固定化される他方の面に到達しない液量のフィブリノゲン溶液であることを特徴とする、請求項９に記載のシート製剤の製造方法。

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