JP5933365B2

JP5933365B2 - シート状止血材

Info

Publication number: JP5933365B2
Application number: JP2012140558A
Authority: JP
Inventors: 由佳子景山; 三由紀福井; 真佐竹; 兼子　博章; 博章兼子; 隆幸今村
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Teijin Pharma Ltd; Teijin Ltd
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken; Teijin Pharma Ltd; Teijin Ltd
Priority date: 2012-06-22
Filing date: 2012-06-22
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2032-06-22
Also published as: JP2014005219A

Description

本発明は、フィブリン糊が固定化された繊維成形体と、トロンビンが固定化された繊維成形体とからなるシート状止血材に関する。

フィブリノゲンは、止血に関与する血液凝固因子のひとつであり、健常人の血漿１００ｍＬ中に２００ｍｇから４００ｍｇ含まれている。フィブリノゲン製剤（フィブリン糊）とは、このフィブリノゲンをヒト血漿中から分離精製して製造される血液製剤の一種（血漿分画製剤）である。医療現場において、止血および組織閉鎖などの組織接着は重要な処置の一つであり、フィブリノゲン製剤は、広く外科手術の領域で使用されている。血管が損傷を受けると、まず凝固系の活性化が生じ、最終的に活性化されたトロンビンが可溶性フィブリノゲンを不溶性のフィブリンに変換する。このフィブリンは接着力を有しており、止血や組織接着に有効に働くのがフィブリノゲン製剤の作用機序である。
フィブリノゲン製剤は主に２液混合型の液状型製剤（特許文献１）とコラーゲンなどの支持体にフィブリノゲンとトロンビンを固定化したシート型製剤（特許文献２）が存在する。しかしながら、液状型製剤は、凍結乾燥されたフィブリノゲンとトロンビンをそれぞれ使用時に溶解して用いる必要があること、さらには完全に溶解させるのに時間がかかり、緊急時に使用できないなどの問題点を有している。

一方、シート状のフィブリン糊（製品名：タココンブ（登録商標）／ＣＳＬベーリング社）は、支持体であるコラーゲンは厚みがあり、また乾燥状態で臓器閉鎖部位に適用するには支持体自身が硬く、柔軟性を欠くため、閉鎖すべき創傷部位での密着性が低く、効果的な閉鎖は困難である。また、タココンブにおいては同一シート内にフィブリノゲンとトロンビンが共存しており、使用直前に溶液に浸すと同時にフィブリノゲンとトロンビンが溶解し反応が開始するが、その反応はシート内部で起こる。そのため、たとえフィブリンが溶出したとしても組織接着部位へ十分浸透する前に凝固反応が進み、組織表面のみの接着となるため、十分な組織接着効果を示さない。
したがって、これらの現行製剤により、全ての組織接着、止血が可能となるものではなく、現行製剤では要求される接着力、閉鎖力を示さない場合がある。そのため、医療現場ではより簡易的に使用でき、更に強力な接着力をも持った組織接着剤が求められている。

このような問題点を解決するために、生体吸収性材料からなるシート状フィブリン糊接着剤の検討がなされている（特許文献３）。しかしながら、フィブリノゲン固定化シートに非イオン性界面活性剤が必要であること、また、担持させる際に、シートの網目が大きいために、タンパク質溶液のロスが大きいこと、凍結乾燥後のシートは担持させたフィブリノゲンがシートから剥がれ落ちてしまうという問題点を抱えている。
このように、タンパク質の担持性に優れ、さらに担持させたフィブリノゲンが基材から剥がれることがなく、現場でより簡易的に使用でき、柔軟性が高く患部に密着し、強力な接着力を発揮する特性を兼ね備えた止血材は存在しない。

特許公開平９−２９７１号公報特許公表２００４−５２１１１５号公報特開２０１０−６９０３１号公報

本発明が解決しようとする課題は、フィブリノゲンおよびトロンビンの担持性に優れ、かつ基材の柔軟性が高く、高い接着力を発揮するシート状止血材を提供することである。

本発明は、第１に、繊維成形体（イ）にフィブリノゲンが固定化されたシートと、繊維成形体（ロ）にトロンビンが固定化されたシートとを重ねてなるシート状止血材であって、繊維成形体（イ）および繊維成形体（ロ）はいずれも、生分解性ポリマーからなりかつ嵩密度が１５０から２００ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ａ）と嵩密度が５から５０ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ｂ）とが連続的に複合化された内部構造をもつ長繊維繊維成形体である、シート状止血材（以下、本発明の第１シート止血材ということがある）である。

本発明は、第２に、繊維成形体（イ）にフィブリノゲンが固定化されたシートと、繊維成形体（ロ）にトロンビンが固定化されたシートとを重ねてなるシート状止血材であって、繊維成形体（イ）および繊維成形体（ロ）はいずれも、生分解性ポリマーからなりかつ嵩密度が１５０から２００ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ａ）と、嵩密度が５から３０ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ｂ）とが連続的に複合化された内部構造をもつ長繊維繊維成形体の複数枚を部分的熱融着により積層してなる積層繊維成形体である、シート状止血材（以下、本発明の第２シート状止血材という）である。

すなわち、本発明のシート状止血材（以下、本発明の第１シート状止血材および第２シート状止血材を区別する必要がない場合は、単に本発明のシート状止血材という）は、繊維成形体（イ）にフィブリノゲンが固定化されたシートと、繊維成形体（ロ）にトロンビンが固定化されたシートとを重ねて構成される。
そして、本発明の第２シート状止血材では、繊維成形体（イ）および繊維成形体（ロ）はいずれも生分解性ポリマーからなる長繊維繊維成形体の複数枚を部分的熱融着により積層してなる積層繊維成形体が用いられる。
また、本発明において、長繊維繊維成形体は、嵩密度が１５０から２００ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ａ）と、第１シート状止血材では嵩密度が５から５０ｋｇ／ｃｍ^３であり、第２シート状止血材では嵩密度が５から３０ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ｂ）とが連続的に複合化された内部構造をもっている。

本発明のシート状止血材は、柔軟性が高く、さらにフィブリノゲンおよびトロンビンの担持性に優れ、接着性に優れる。

実施例１で製造されたフィブリノゲン固定化シートのＳＥＭ写真。実施例２で製造されたフィブリノゲン固定化シートのＳＥＭ写真。実施例３で製造されたフィブリノゲン固定化シートのＳＥＭ写真。実施例４で製造されたフィブリノゲン固定化シートのＳＥＭ写真。実施例５で製造されたフィブリノゲン固定化シートのＳＥＭ写真。比較例１で製造されたフィブリノゲン固定化シートのＳＥＭ写真。

本発明は繊維成形体（イ）にフィブリノゲンが固定化されたシートと、繊維成形体（ロ）にトロンビンが固定化されたシートから構成されるシート状止血材である。
本発明で用いられるフィブリノゲンやトロンビンは、動物から調製したものでも、遺伝子組換え技術により製造したものでもよい。動物由来のものはヒト由来のものが好ましい。また、アミノ酸配列を改変した蛋白質も使用できる。
なお、シート状止血材はフィブリノゲンおよびトロンビンを含有するため、保存中に一部でフィブリンを生じることがあるが、こうしたフィブリンを含むものも本発明の範囲である。
本発明でいう固定化とは、フィブリノゲンやトロンビンが繊維成形体の表面だけでなく、繊維成形体の内部にまで存在している状況を示している。

本発明のシート状止血材において、フィブリノゲンやトロンビンを固定化する方法は問わないが、例えばフィブリノゲン等の溶液に予め成形された繊維構造体を浸漬した後、凍結乾燥することにより作製できる。また、フィブリノゲン等をエタノールなどに分散させた溶液をスプレーなどで繊維構造体に噴霧して固定化してもよい。
フィブリノゲン固定化シート作製時に、フィブリノゲン等に加えて、薬学的に許容しうる添加剤を添加してもよい。そのような添加剤の例として、例えば血液凝固第ＸＩＩＩ因子（ヒト血液由来または遺伝子組換え技術により得られるものが好ましい）、アルブミン、イソロイシン、グリシン、アルギニン、グルタミン酸、界面活性剤、塩化ナトリウム、糖アルコール（グリセロール、マンニトール等）、およびクエン酸ナトリウムなどがある。これらの添加剤の一つ以上を適宜組み合わせてフィブリノゲン成分の溶解性や、フィブリノゲン固定化シートの柔軟性を向上させることが可能となる。

本発明で用いる生分解性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、ポリグリセロールセバシン酸、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリブチレンサクシネートなどの脂肪族ポリエステル類、ポリメチレンカーボネートなどの脂肪族ポリカーボネート類が挙げられる。好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体などの脂肪族ポリエステル類であり、さらに好ましくはポリ乳酸、乳酸−グリコール酸共重合体である。いずれの生分解性ポリマーも疎水性ポリマーであるため、ポリマーそのものは保水性を保有していない。そのため、本発明では、ポリマーの性質による保水ではなく、繊維成形体の構造による保水である。よって、いずれの生分解性ポリマーでも同様の保水性を達成することができる。
ポリ乳酸を用いる場合、ポリマーを構成するモノマーには、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸があるが、特に制限はない。またポリマーの光学純度や分子量、Ｌ体とＤ体の組成比は配列には特に制限はないが、好ましくはＬ体の多いポリマーがよく、ポリＬ乳酸とポリＤ乳酸のステレオコンプレックスを用いてもよい。

本発明で用いる生分解性ポリマーは高純度であることが好ましく、とりわけポリマー中に含まれる添加剤や可塑剤、残存触媒、残存モノマー、成型加工に用いた残留溶媒などの残留物は少ないほうが好ましい。特に医療に用いる場合は、安全性の基準値未満に抑える必要がある。
また、本発明で用いる生分解性ポリマーの重量平均分子量は、１×１０^３〜５×１０^６が好ましく、より好ましくは１×１０^４〜１×１０^６、さらに好ましくは５×１０^４〜５×１０^５である。またポリマーの末端構造やポリマーを重合する触媒は任意に選択できる。

本発明の繊維成形体を構成する繊維には、所期の目的を損なわない範囲で他のポリマーや他の化合物を混合してもよい。例えばポリマー共重合、ポリマーブレンド、化合物混合である。
本発明で用いる繊維成形体は、リン脂質を生分解性ポリマーに対して０．１〜１０重量％含有することが好ましい。リン脂質の含有量が０．１重量％より少ないと、フィブリノゲンまたはトロンビン溶液との親和性に効果を示さず、１０重量％よりも多いと、繊維構造体自体の耐久性が低下するため好ましくない。好ましい含有量は０．２〜５重量％であり、さらに好ましくは０．３〜３重量％である。

かかるリン脂質は動物組織から抽出したものでも人工的に合成したものでもよく、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどが挙げられる。これらから１種類を選択してもよいし、２種類以上の混合物を用いてもよい。好ましくはホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンであり、さらに好ましくはジラウロイルホスファチジルコリンまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである。

本発明で用いる繊維成形体は長繊維よりなり、紡糸から繊維成形体への加工にいたるプロセスの中で、繊維を切断する工程を加えずに形成される。繊維長は３００ｍｍ以上が好ましい。
こうした長繊維を得る方法のひとつがエレクトロスピニング法である。エレクトロスピニング法は、ポリマーを溶媒に溶解させた溶液に高電圧を印加することで、電極上に繊維成形体を得る方法である。

本発明で用いる繊維成形体の平均繊維径は好ましくは０．５から１０μｍであり、より好ましくは３から５μｍである。０．５μｍよりも小さいか１０μｍよりも大きいと、それを繊維成形体にして医療用品として用いた場合に良好な特性が得られない。なお、繊維径とは繊維断面の直径を表す。繊維断面の形状は円形に限らず、楕円形や異形になることもありうる。楕円形の場合の繊維径とは、その長軸方向の長さと短軸方向の長さの平均をその繊維径として算出する。また、繊維断面が円形でも楕円形でもないときには円または楕円に近似して繊維径を算出する。
本発明で用いる繊維成形体を得る方法の一例を説明する。エレクトロスピニング法において、捕集電極を絶縁体で被覆し、３０ｋＶ以下の電圧で紡糸することにより嵩密度が１５０から２００ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ａ）を得て、その上に３５ｋＶ以上の高電圧で紡糸することにより、嵩密度が５から３０ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ｂ）が連続的に複合化された繊維成形体を得ることができる。紡糸の際の電極間距離は１０〜５０ｃｍ、吐出速度は３〜２０ｍｌ／ｈが好ましい。

なお、ここでいう「連続」とは、繊維構造体層（Ａ）と（Ｂ）をそれぞれ作製して積層するのではなく、製造途中での条件変更により一工程で（Ａ）と（Ｂ）の積層体相当の構造を作製するなどして、繊維構造体層（Ａ）と（Ｂ）との間に、嵩密度が変化すること以外の不連続性がない状態をいう。そして、後工程で積層したような不連続性がない構造であることを明確化するため、本発明の繊維成形体の層状構造をつくることを「複合化」と表現している。これに対し、後述する熱融着による積層は一般的意味の積層である。

柔軟性と保水性の二つの特徴を保持するためには、繊維構造体層（Ｂ）のような疎な構造が重要となる。柔軟性と保水性を上げるためには、嵩密度を低下させることが重要となるが、嵩密度を低下させるとシートの構造保持力に欠け、毛羽立ちやすくなるため取扱性が低下する。本発明では、嵩密度が１５０から２００ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ａ）を複合化させていることから、繊維構造体層（Ｂ）の構造保持力の低下が補われ、さらには毛羽立ちが抑えられている。繊維構造体層（Ａ）と（Ｂ）のそれぞれの嵩密度は、（Ａ）では１５０から２００ｋｇ／ｍ^３である。１５０ｋｇ／ｍ^３以下では構造保持が難しく、２００ｋｇ／ｍ^３以上では自己支持性が高くなり、柔軟性が得られない。一方、（Ｂ）は第１シート状止血材については、５から５０ｋｇ／ｃｍ^３であり、第２シート状止血材については５から３０ｋｇ／ｍ^３である。５ｋｇ／ｍ^３以下では水分を保持した際に構造保持が難しく、上限値（５０ｋｇ／ｃｍ^３または３０ｋｇ／ｍ^３）以上では柔軟性が得られない。

繊維構造体層（Ａ）と（Ｂ）のそれぞれの厚みは、（Ａ）では５から３０μｍであることが好ましい。５μｍ以下では構造保持が難しく、３０μｍ以上では自己支持性が高くなり、柔軟性が得られない。一方、（Ｂ）は２００から１０００μｍであることが好ましい。２００μｍ以下では保水性に乏しく必要量のフィブリノゲンおよびトロンビンが担持できず好ましくない、１０００μｍ以上では柔軟性が低下し、さらに必要となるフィブリノゲンおよびトロンビンの量が過剰量必要となり好ましくない。
また、第２シート状止血材について、部分的熱融着の方法は特に限定されるものではないが、熱した金型等を押し付ける方法が好ましい。熱融着は、十分に融着することができればシート片面のみの処理であっても両面からの処理であってもよい。熱融着に用いる金型等の温度は用いる生分解性ポリマーのガラス転移点より１０℃以上、好ましくは３０℃以上高い温度条件である。熱融着温度が用いる生分解性ポリマーのガラス転移点より１０℃以上高温でない場合、シート裏面もしくは内部まで熱が伝わらず、本発明で用いる繊維成形体（イ）、（ロ）を製造することができない。

熱融着面積は、好ましくは５から２０％、より好ましくは５から１０％である。５％以下では積層構造の維持が困難であり、２０％以上では嵩高さと柔軟性を欠くものとなる。
積層枚数は、好ましくは３から１０枚、より好ましくは３から５枚である。２枚以下であると保水量が不十分となり、１１枚以上であると柔軟性が低下する。

本発明に用いる繊維成形体は、凍結乾燥法を用いてフィブリノゲンおよびトロンビンを担持させる場合、保水性に優れていることが好ましい。このような条件を満足する繊維成形体の保水率は、第１シート状止血材については、好ましくは１２００から２０００重量％、より好ましくは１５００〜２０００重量％であり、第２シート状止血材については、好ましくは１２００から２２００重量％、より好ましくは１５００から２２００重量％である。
シート状繊維成形体の柔軟性は、剛軟性で測定することができる。具体的には、ＪＩＳＬ１０９６８．１９．２Ｂ法（スライド法）などを用いて測定することができる。剛軟度は２．０ｍＮ・ｃｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１．５ｍＮ・ｃｍ以下である。２．０ｍＮ・ｃｍ以上であると繊維成形体は柔軟性に欠け、表面が凹凸な組織表面への追従性に欠けるので好ましくない。

本発明で用いる繊維成形体の表面に、さらに綿状の繊維構造物を積層することや、綿状構造物を本発明で用いる繊維成形体ではさんでサンドイッチ構造にするなどの加工は、所期の目的を損ねない範囲で任意に実施しうる。
本発明のシート状止血材は、フィブリノゲンが固定化されたシートと、トロンビンが固定化されたシートから構成される。好ましくはこれらの二層構造であるが、フィブリノゲンが固定化されたシートおよびトロンビンが固定化されたシートは、それぞれ二層以上あってもよく、また各シートを積層する順序も問わない。さらに、使用時にそれぞれのシートを重ねて使用するようになっているシート状止血材キットであってもよい。
トロンビン固定化シートのトロンビン保持量は、１２６０μＬ／ｃｍ^３以上が好ましく、１３００μＬ／ｃｍ^３以上がより好ましい。これ以下であるとシートの厚みを増加させることで、保持量を増加させなくてはならず、コストと時間の増加につながり好ましくない。上限については特に指定はないが、シートの柔軟性や取扱性などを鑑みて適宜決められる。

以下の実施例において、保水率、柔軟性、トロンビン保持量、ウサギ皮膚接着力、効能は次のようにして求めた。

保水率：１ｃｍ×１ｃｍ角の試料を切り取り、試料に５μＬずつ水を含浸させ、含水量を求めた。
保水率（重量％）＝（Ｗ２−Ｗ１）／Ｗ１×１００
Ｗ１：初期試料重量Ｗ２：含水時試料重量
柔軟性：（ＪＩＳ−Ｌ−１９０６８．１９．２Ｂ法）スライド法で、試験片の大きさを１ｃｍ×７．５ｃｍとして剛軟度測定を行った。
トロンビン保持量：シート体積当りに含有した溶液量（μＬ／ｃｍ^３）
ウサギ皮膚接着力：ウサギ皮膚を採取し、皮下組織を剥離した。皮膚を３×３ｃｍ^２に裁断し、３７℃に加温した。台座に固定化したウサギ皮膚の上に冶具を設置し、その上にフィブリノゲン固定化シート（２ｃｍ×２ｃｍ）を設置し、蒸留水２００μｍを滴下した。トロンビン固定化シート（２ｃｍ×２ｃｍ）をフィブリノゲン固定化シートの上に重層し、タッピング後、３７℃で３分間インキュベートした。冶具をプッシュプルゲージにセットし、一定の力で引き上げ、剥離する時の力を測定した。
効能：ウサギ腹部大動脈噴出性出血モデル
麻酔下、日本白色ウサギの頚動脈を露出させ、カテーテルを挿入して血圧トランスデューサーに接続し、腹部を正中切開し、腹部大動脈を露出させる。ヘパリンナトリウム注射液を耳静脈より３００Ｕ／ｋｇ投与し、平均血圧が８０ｍｍＨｇ〜１００ｍｍＨｇの範囲にあることを確認する。露出させた腹部大動脈に２１Ｇ注射針を穿刺して出血を作製する。出血部位に検体を適用して３分間圧迫し、止血を行い、１分間の出血の有無を観察した。

実施例１
０．４％のホスファチジルコリンジラウロイルを添加したポリ乳酸（重量平均分子量１３万３千、ＰＵＲＡＣ）１１重量部を、７９重量部のジクロロメタンと１０重量部のエタノールに溶解し、均一な溶液を得た。これを用いてエレクトロスピニング法で紡糸し、シート状の繊維成形体を調製した。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、噴出ノズルから陰極平板までの距離は３５ｃｍ、吐出量は１０ｍｌ／ｈ、湿度３５％であった。陰極平板には絶縁体として、縦糸がレーヨンであり横糸がポリエステルである編み布を貼付した。電圧は紡糸開始時は２３ｋＶとし、３分後に４５ｋＶに変更した。得られた繊維成形体の繊維径は４．３μｍであった。疎構造の嵩密度は３３ｋｇ／ｍ^３、厚みは７８６μｍ、密構造の嵩密度は１７２ｋｇ／ｍ^３、厚みは１１μｍであった。得られた繊維成形体の目付けは２．７ｍｇ／ｃｍ^２、保水率は１８８０重量％、柔軟性は０．７２ｍＮ・ｃｍであった。

市販の生体組織接着剤であるボルヒール（登録商標、一般財団法人化学及血清療法研究所製、以下同じ）のキットに含まれるフィブリノゲン溶液１．２５ｍＬを、上で作製した繊維成形体（５×５ｃｍ^２）上に染み込ませた。フィブリノゲン溶液は、容易に繊維成形体内に染み込んだ。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲンは、シート内部全面に均一に担持されていた。フィブリノゲン担持シートの両端をピンセットで挟み、１０回折りまげを実施し、重量変化を確認したが、担持されているフィブリノゲンが崩壊することはなく、重量変化はなかった（１００％保持）。そのＳＥＭ像を図１に示す。

次に、ボルヒールのキットに含まれるトロンビンを付属の溶解液により溶解し、１８７５単位／ｍＬのトロンビン溶液を作製した。このトロンビン溶液を、上で作製した繊維成形体（２×２ｃｍ^２）上に均一に染み込ませた。トロンビン溶液は、容易に繊維成形体内に染み込んだ。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。トロンビン固定化シートのトロンビン保持量は１５７１μＬ／ｃｍ^３であった。
フィブリノゲン固定化シートとトロンビン固定化シートとを用いたウサギ皮膚への接着力は７．２Ｎであった。

実施例２
０．４％のホスファチジルコリンジラウロイルを添加したポリ乳酸（重量平均分子量１３万３千、ＰＵＲＡＣ）１１重量部を、７９重量部のジクロロメタンと１０重量部のエタノールに溶解し、均一な溶液を得た。これを用いてエレクトロスピニング法で紡糸し、シート状の繊維成形体を調製した。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、噴出ノズルから陰極平板までの距離は３５ｃｍ、吐出量は６ｍｌ／ｈ、湿度３５％であった。陰極平板には絶縁体として、縦糸がレーヨンであり横糸がポリエステルである編み布を貼付した。電圧は紡糸開始時は２３ｋＶとし、３分後に４５ｋＶに変更した。得られた繊維成形体の繊維径は３．２μｍであった。疎構造の嵩密度は４０ｋｇ／ｍ^３、厚みは８７５μｍ、密構造の嵩密度は１８６ｋｇ／ｍ^３、厚みは８．５μｍであった。得られた繊維成形体の目付けは２．７ｍｇ／ｃｍ^２、保水率は１６８５重量％、柔軟性は１．２４ｍＮ・ｃｍであった。

ボルヒールのキットに含まれるフィブリノゲン溶液１．２５ｍＬを、上で作製した繊維成形体（５×５ｃｍ^２）上に染み込ませた。フィブリノゲン溶液は、容易に繊維成形体内に染み込んだ。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲンは、繊維成形体内部全面に均一に担持されていた。フィブリノゲン固定化シートの両端をピンセットで挟み、１０回折りまげを実施し、重量変化を確認したが、担持されているフィブリノゲンが崩壊することはなく、重量変化はなかった（１００％保持）。そのＳＥＭ像を図２に示す。

次に、ボルヒールのキットに含まれるトロンビンを付属の溶解液により溶解し、１８７５単位／ｍＬのトロンビン溶液を作製した。このトロンビン溶液を、上で作製した繊維成形体（２×２ｃｍ^２）上に均一に染み込ませた。トロンビン溶液は、容易に繊維成形体内に染み込んだ。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。トロンビン固定化シートのトロンビン保持量は１５４０μＬ／ｃｍ^３であった。
フィブリノゲン固定化シートとトロンビン固定化シートとを用いたウサギ皮膚への接着力は６．４Ｎであった。

実施例３
０．４％のホスファチジルコリンジラウロイルを添加した乳酸−グリコール酸共重合体（重量平均分子量１２万６千、モル比＝５０／５０、ＰＵＲＡＣ）１２重量部を、８８重量部のジクロロメタンに溶解し、均一な溶液を得た。これを用いてエレクトロスピニング法で紡糸し、シート状の繊維成形体を調製した。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、噴出ノズルから陰極平板までの距離は３０ｃｍ、吐出量は１０ｍｌ／ｈ、湿度１１％であった。陰極平板には絶縁体として、縦糸がレーヨンであり横糸がポリエステルである編み布を貼付した。電圧は紡糸開始時は２３ｋＶとし、３分後に４５ｋＶに変更した。得られた繊維成形体の繊維径は４．１μｍであった。疎構造の嵩密度は２４ｋｇ／ｍ^３、厚みは８７５μｍ、密構造の嵩密度は１５２ｋｇ／ｍ^３、厚みは１４．５μｍであった。得られた繊維成形体の目付けは３．０ｍｇ／ｃｍ^２、保水率は１５００重量％、柔軟性は０．９１ｍＮ・ｃｍであった。

ボルヒールのキットに含まれるフィブリノゲン溶液１．２５ｍＬを、上で作製した繊維成形体（５×５ｃｍ^２）上に染み込ませた。フィブリノゲン溶液は、容易に繊維成形体内に染み込んだ。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲンは、繊維成形体内部全面に均一に担持されていた。フィブリノゲン固定化シートの両端をピンセットで挟み、１０回折りまげを実施し、重量変化を確認したが、担持されているフィブリノゲンが崩壊することはなく、重量変化はなかった（１００％保持）。そのＳＥＭ像を図３に示す。

次に、ボルヒールのキットに含まれるトロンビンを付属の溶解液により溶解し、１８７５単位／ｍＬのトロンビン溶液を作製した。このトロンビン溶液を、上で作製した繊維成形体（２×２ｃｍ^２）上に均一に染み込ませた。トロンビン溶液は、容易に繊維成形体内に染み込んだ。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。トロンビン固定化シートのトロンビン保持量は１３３０μＬ／ｃｍ^３であった。
フィブリノゲン固定化シートとトロンビン固定化シートとを用いたウサギ皮膚への接着力は６．８Ｎであった。

実施例４
０．４％のホスファチジルコリンジラウロイルを添加したポリ乳酸（重量平均分子量１３万３千、ＰＵＲＡＣ）１１重量部を、７９重量部のジクロロメタンと１０重量部のエタノールに溶解し、均一な溶液を得た。これを用いてエレクトロスピニング法で紡糸し、シート状の繊維成形体を調製した。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、噴出ノズルから陰極平板までの距離は３５ｃｍ、吐出量は６ｍｌ／ｈ、湿度２６％であった。陰極平板には絶縁体として、縦糸がレーヨンであり横糸がポリエステルである編み布を貼付した。電圧は紡糸開始時は２３ｋＶとし、３分後に４５ｋＶに変更した。得られた繊維成形体の繊維径は３．３μｍであった。疎構造の嵩密度は１３ｋｇ／ｍ^３、厚みは６５０μｍ、密構造の嵩密度は１５８ｋｇ／ｍ^３、厚みは１７μｍであった。この繊維成形体を部分的熱融着により３枚積層した。融着面積は９％とした。得られた積層繊維成形体の目付けは２．８２ｍｇ／ｃｍ^２、保水率は２０７５重量％、柔軟性は０．９６ｍＮ・ｃｍであった。

市販の生体組織接着剤（製品名：ボルヒール：一般財団法人化学及血清療法研究所製）のキットに含まれるフィブリノゲン溶液１．２５ｍＬを、上記で作製した繊維構造体（５×５ｃｍ^２）上に染み込ませた。フィブリノゲン溶液は、容易にシート内に染み込んだ。この検体を凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲンは、シート内部全面に均一に担持されていた。シートの両端をピンセットで挟み、１０回折りまげを実施し、重量変化を確認した。本シートを取り扱っても担持したフィブリノゲンが崩壊することはなく、重量変化はなかった（１００％保持）。そのＳＥＭ像を図４に示す。

次に、市販の生体組織接着剤であるボルヒール（登録商標、一般財団法人化学及血清療法研究所製、以下同じ）のキットに含まれるトロンビンを付属の溶解液により溶解し、１８７５単位／ｍＬのトロンビン溶液を作製した。このトロンビン溶液を、上記で作製した積層繊維成形体（２×２ｃｍ^２）上に均一に染み込ませた。トロンビン溶液は、容易に積層繊維成形体内に染み込んだ。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。トロンビン固定化シートへのトロンビン保持量は１６１９μＬ／ｃｍ^３であった。
フィブリノゲン固定化シートとトロンビン固定化シートを用いたウサギ皮膚への接着力は６．８Ｎであった。
これらのシートを用いた効能評価では、噴出性出血に対して、出血部位に検体を適用して３分間圧迫後の１分間の出血の有無は、４例中４例で止血効果が認められた。

実施例５
０．４％のホスファチジルコリンジラウロイルを添加した乳酸−グリコール酸共重合体（重量平均分子量１２万６千、モル比＝５０／５０、ＰＵＲＡＣ）１２重量部を、８８重量部のジクロロメタンに溶解し、均一な溶液を得た。これを用いてエレクトロスピニング法で紡糸し、シート状の繊維成形体を調製した。噴出ノズルの内径は０．８ｍｍ、噴出ノズルから陰極平板までの距離は３０ｃｍ、吐出量は１０ｍｌ／ｈ、湿度１１％であった。陰極平板には絶縁体として、縦糸がレーヨンであり横糸がポリエステルである編み布を貼付した。電圧は紡糸開始時は２３ｋＶとし、３分後に４５ｋＶに変更した。得られた繊維成形体の繊維径は５．２μｍであった。疎構造の嵩密度は１８ｋｇ／ｍ^３、厚みは８３３μｍ、密構造の嵩密度は１５２ｋｇ／ｍ^３、厚みは１４．５μｍであった。この繊維成形体を部分的熱融着により３枚積層した。融着面積は９％とした。得られた積層繊維成形体の目付けは２．６４ｍｇ／ｃｍ^２、保水率は１９２３重量％、柔軟性は０．９０ｍＮ・ｃｍであった。

市販の生体組織接着剤（製品名：ボルヒール：一般財団法人化学及血清療法研究所製）のキットに含まれるフィブリノゲン溶液１．２５ｍＬを、上記で作製した繊維構造体（５×５ｃｍ^２）上に染み込ませた。フィブリノゲン溶液は、容易にシート内に染み込んだ。この検体を凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲンは、シート内部全面に均一に担持されていた。シートの両端をピンセットで挟み、１０回折りまげを実施し、重量変化を確認した。本シートを取り扱っても担持したフィブリノゲンが崩壊することはなく、重量変化はなかった（１００％保持）。そのＳＥＭ像を図５に示す。

次に、市販の生体組織接着剤であるボルヒール（登録商標、一般財団法人化学及血清療法研究所製、以下同じ）のキットに含まれるトロンビンを付属の溶解液により溶解し、１８７５単位／ｍＬのトロンビン溶液を作製した。このトロンビン溶液を、上記で作製した積層繊維成形体（２×２ｃｍ^２）上に均一に染み込ませた。トロンビン溶液は、容易に積層繊維成形体内に染み込んだ。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。トロンビン固定化シートへのトロンビン保持量は１２６２μＬ／ｃｍ^３であった。
フィブリノゲン固定化シートとトロンビン固定化シートを用いたウサギ皮膚への接着力は６．５Ｎであった。

比較例１
積層繊維成形体に代えてポリグリコール酸系繊維成形体であるネオベール（登録商標、グンゼ株式会社製、平均繊維径２０μｍ、厚さ１５０μｍ、シート柔軟性１．２３ｍＮ・ｃｍ）を用いた以外は、実施例１と同様に、フィブリノゲン固定化シートおよびトロンビン固定化シートを作製した。ＳＥＭ観察により０．０１ｍｍ^２以上の貫通孔が観察された。
フィブリノゲン溶液は繊維成形体へ染み込みにくかった。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをフィブリノゲン固定化シートとした。フィブリノゲン固定化シートの両端をピンセットで挟み、１０回折りまげを実施し、重量変化を確認した。フィブリノゲンは、シート内部全面に均一に担持されておらず、フィブリノゲン固定化シートはピンセットで取り扱うと、担持されていたフィブリノゲンが剥落した（重量変化８９％）。ＳＥＭ像を図６に示す。

同様に、トロンビン溶液も繊維成形体への染み込みが悪かった。これを凍結後、２４時間凍結乾燥させたものをトロンビン固定化シートとした。トロンビンは、シート内部全面に均一に担持されていた。シートへのトロンビン保持量は１２５４μＬ／ｃｍ^３であった。
フィブリノゲン固定化シートとトロンビン固定化シートを用いたウサギ皮膚への接着力は４．１Ｎであった。

これらのシートを用いた効能評価では、噴出性出血に対して、出血部位に検体を適用して３分間圧迫後の１分間の出血の有無は、３例中２例で止血効果が見られたが、１例では出血が認められた。

本発明のシート状止血材はフィブリノゲンおよびトロンビンの担持性に優れ、かつ柔軟性が高く表面が凹凸な組織表面への追従性が高いため、止血材として有用である。

Claims

繊維成形体（イ）にフィブリノゲンが固定化されたシートと、繊維成形体（ロ）にトロンビンが固定化されたシートとを重ねてなるシート状止血材であって、繊維成形体（イ）および繊維成形体（ロ）は、いずれも、生分解性ポリマーからなりかつ嵩密度が１５０から２００ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ａ）と嵩密度が５から５０ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ｂ）とが連続的に複合化された内部構造をもつ長繊維繊維成形体である、シート状止血材。
繊維成形体（イ）にフィブリノゲンが固定化されたシートと、繊維成形体（ロ）にトロンビンが固定化されたシートとを重ねてなるシート状止血材であって、繊維成形体（イ）および繊維成形体（ロ）は、いずれも、生分解性ポリマーからなりかつ嵩密度が１５０から２００ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ａ）と嵩密度が５から３０ｋｇ／ｍ^３である繊維構造体層（Ｂ）とが連続的に複合化された内部構造をもつ長繊維繊維成形体の複数枚を部分的熱融着により積層してなる積層繊維成形体である、シート状止血材。
生分解性ポリマーがポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、乳酸−グリコール酸共重合体、乳酸−カプロラクトン共重合体、およびそれらを主成分とした共重合体からなる群から選択された一つ以上である、請求項１または２に記載のシート状止血材。
繊維成形体が平均繊維径０．５から１０μｍの繊維からなる、請求項１〜３のいずれかに記載のシート状止血材。
繊維成形体が生分解性ポリマーに対してリン脂質を０．１から１重量％含有する繊維からなる、請求項１から４のいずれかに記載のシート状止血材。
リン脂質がホスファチジルコリンまたはホスファチジルエタノールアミンである請求項５に記載のシート状止血材。
リン脂質がジラウロイルホスファチジルコリンである請求項５に記載のシート状止血材。
リン脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求項５に記載のシート状止血材。