JP5884217B2 - 大豆のＲｈｉｚｏｐｕｓｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓｖａｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ発酵によるエストロゲン活性含有食品とその製法 - Google Patents

Description

本発明は、伝統食品とその製法に関するものであり、安全であり、脊椎動物の女性ホルモン（エストロゲン）不足を補う作用がある。この製法は、長期に及び食品として使用されてきた実績から安全性が保証された様々な植物食材のエストロゲン活性を独自の細胞生物学的テストを用いてスクリーニング調査し、そのひとつについてエストロゲン活性含有食品の生産に製造法を最適化して創出された。製造される食品は必ずしも脊椎動物エストロゲンを含まないが、エストロゲンとして代替可能な生理活性を含有する。

人々の平均寿命が伸びている近年、高齢者の健康維持および疾病の予防は、年々増え続ける社会の高齢者層のＱＯＬ向上と医療費の抑制を考えると極めて重要な課題である。特に、更年期後の女性に不足しがちなエストロゲンの補充は様々な疾病の予防につながり、ますます重要性が高まっていくと思われる。近年、マメ類等の食品に含まれるイソフラボン類に血中エストロゲン濃度が低下した中高齢の女性の健康改善効果があるとされ、高い関心を集めている。イソフラボンを含有する植物抽出物はエストロゲン様活性を持つことが知られ、更年期後の女性への有効なホルモンサプリメントとして期待されるが、物質ベースで同定、製造、提供されるこれらのサプリメントの人体への影響を迅速かつ正確に評価する測定系がいまだ開発されていないためエストロゲン補充療法に用いられることはない。これがエストロゲン補充目的に限り、もっぱらヒトを含む動物胎盤などから抽出された脊椎動物ホルモンそのものが用いられる理由である。脊椎動物ホルモンには発がん性があるとされ、動物組織の抽出物には未知のウィルスが潜んでいる可能性があるため、現行のエストロゲン補充法はリスクを伴う。

イソフラボンの定量法としては、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）や質量分析など、高感度物質同定／定量法によりゲニステインやダイゼインなどの主要なイソフラボンの量を標準物質を用いて正確に測定することが可能である。ただし、これらの技術では、様々なイソフラボンを含む成分が混在している植物由来のサプリメントが全体としてどの程度、または遺伝子発現変動レベルでどのような作用を人体に及ぼすのかという最も重要な情報は提供できない。

これに対し、発明者は植物のホルモン活性を細胞生物学的手法で数値化する技術をもち、それをエストロゲン標準物質（通常、脊椎動物エストロゲンの中でも最も比活性の高い１７β−エストラジオール「Ｅ_２」を用いる）と比較することにより、植物のもつエストロゲン活性が脊椎動物本来のエストロゲンに代替可能か否かを評価する手法をもつ。

すなわち、ホルモン活性の強さは、ヒト乳がん由来ＭＣＦ−７細胞に検体を添加して細胞増殖への影響をエストロゲン標準物質のそれと定量的に比較することで行う。さらに、ホルモン活性の質は、試験物質で処理した同細胞よりＲＮＡを抽出し、細胞増殖の制御や発生・分化等の主要機能に関連した遺伝子群の発現量の変動をＤＮＡマイクロアレイにより定量し、それをエストロゲン標準物質の変動値と統計的な比較をすることで遺伝子発現レベルで解析する。この２段階の細胞生物学的検査法は既存の機器分析とは原理を異にするため、検体が純粋化合物である必要はなく、混合物でも、未知の活性物質でも試験できる。加えて、感度も高く、機器分析にほぼ匹敵する。

発明者の技術を用いると、エストロゲンを含まない食材にも、それと区別のつかない生理活性が同定可能になる。初めて植物食材を用いたエストロゲン補充が可能になる。

食用、薬用を問わず、伝統的植物性食品にはしばしば女性ホルモン（エストロゲン）活性を発揮する物質が含まれている。しかし、エストロゲン活性の生物学的計測が困難であるため、これら安全性が証明された食品に含まれるエストロゲン活性が科学的に品質管理されたことはなく、副作用が全くなく、長期使用にも耐える、これら貴重なエストロゲン活性はホルモン補充目的では用いられたことはない。

発明者は上に述べたように細胞増殖試験とＤＮＡマイクロアレイ試験との２段階の試験手法によってエストロゲンに代替できるホルモン活性を同定する細胞生物学的分析技術をもつ。今回は、これをエストロゲン活性含有食品の開発に応用した。つまり、エストロゲンそのものを含有しなくとも、遺伝子発現レベルでも、細胞増殖速度促進効果からも、脊椎動物エストロゲンと区別のつかない生理活性を保持する食材を見つけだし、その製造方法を目的に合わせて改良した。重要なことは、生み出されるエストロゲン活性含有食品が製造工程でも、摂取量でも、既存の食品の枠を逸脱しないことで、これにより安全性を担保する。

本発明により、長年食用として用いられ安全性が保証された食品のエストロゲン様活性を、エストロゲン補充の目的で使用できるようになる。また、発明者のもつ細胞増殖試験を使えば、変動しやすいこれら天然食品のエストロゲン様活性の強さと質を生産ロットに左右されず一定に保つことができる。これは、女性ホルモンサプリメントとしての信頼性を高めるのに極めて重要である。

本発明では必要に応じて細胞生物学的にホルモン活性測定を行い、エストロゲン活性の強さと質をモニターする必要がある。

最適化された製造工程では、無菌室内で、蒸した原料大豆に純粋培養されたＲｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ ｖａｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓを植えつける。Ｒ．ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ ｖａｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓはクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の１種で、東南アジアなどでテンペと称される大豆発酵食品を製造するときに用いられる形態の類似した一連の菌類のひとつである。得られた大豆発酵物（食品）は適当なコンテナに蓄え、冷凍保存する。

以下は発酵物から機能成分を抽出する工程である。発酵物を解凍後適量の溶媒（通常エチルアルコール水溶液）を加えてブレンダーで粉砕後、遠心分離機で上清を分離回収し、過熱濃縮すると、エストロゲン活性を含有する液状食品が得られる。この食品は他の食品に添加して味や香りを付加して様々な食品に加工できる。化粧品などに混入して外用する方法もある。または、乾燥してカプセルや錠剤の形にしてサプリメントなどとして用いてもよい。

以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

原料大豆に等量の水を加え、圧力釜を用いて１２０℃で３０分〜１時間蒸す。冷却後、無菌室内に移し、純粋培養されたＲｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ ｖａｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓを１／１００量加え、よく混ぜる。これを滅菌したステンレスバットに１〜２ｃｍ厚に敷き、３５℃で１２時間経ったら、バットをインキュベーターから取り出し、室温の棚に移してさらに２４時間置く。菌糸が全体にいきわたったことを確認して、１００℃のオーブンに１時間置いて殺菌する。得られた大豆発酵物は適当なコンテナーに蓄え、冷凍保存する。

冷凍保存された大豆発酵物から機能成分の抽出を行う。解凍後に１．８倍量の７５％エタノールを加えてブレンダーで粉砕後、３，２００ｘｇ、１５分間の遠心分離で上清を分離する。沈殿は再びブレンダーに戻し、１．７倍量の５０％エタノールを加えて粉砕した後に３，２００ｘｇ、１５分間の遠心分離で上清を分離する。２回の遠心分離で得た上清を混ぜ固形分含量が２０％になるまで加熱濃縮する。それを耐熱性コンテナに移し、圧力釜で１２０℃で１５分間以上加熱殺菌すると、エストロゲン活性を含有する液体食品が得られる。

１）細胞増殖試験
ヒト乳がん由来のＭＣＦ−７細胞を２４ウェルプレートに播種し、５％炭酸ガス（ＣＯ_２）の存在下、３７℃で１日培養する。培地としては、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ １６４０培地に活性炭で処理した牛胎児血清を１０％添加したものを用いる。２４時間後、新しい培地に交換し、試験物質を添加した後に５％炭酸ガス（ＣＯ_２）の存在下、３７℃で３日間培養する。その後、培地を捨てて１０％トリクロロ酢酸を加え、４℃で３０分間静置。トリクロロ酢酸を純水で洗浄して、０．４％ＳＲＢ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）を含む１％酢酸で２０分間染色する。余分なＳＲＢを１％酢酸で洗浄後、波長４９０ｎｍにおける吸光度（Ａ_４９０）を定量した。比較のために、１０ｎＭエストロゲン標準物質（Ｅ_２）による試験を並行して行う。試験物質による増殖への影響は、エストロゲン標準物質によるＡ_４９０の増大に対する比率（％）の平均値および標準偏差で評価した（図１）。

図１は発酵大豆抽出液の細胞増殖試験の結果である。このグラフより、エストロゲン標準物質の８０％の活性（グラフ内の横点線）を得るのに必要な抽出液の濃度（縦点線矢印とグラフ横軸との交点）が求められる。また、細胞毒性の有無（安全性）も同時に調べることができる。

２）マイクロアレイ解析１−Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出
細胞増殖試験に用いたＭＣＦ−７細胞を、今度は同培地を満たした１０ｃｍシャーレに播種し、細胞増殖試験と同様の条件で３日間培養、トリプシンを加え３７℃、５分間処理して細胞を回収した後に、新しい培地に播種し、試験物質を添加して３日間培養する。その後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）０．５ｍｌ加えて細胞溶解液を回収し、０．１５ｍｌのクロロホルムを加えて１分間激しく攪拌した後に５分間静置、２０，０００ｘｇで４℃、１５分間の遠心分離後、水層を回収、等量の２−プロパノールを加えて混和する。室温で５分間静置、２０，０００ｘｇで４℃、１０分間の遠心分離を行い、沈殿を７５％エタノールで洗ってから１５分間風乾、ＤＥＰＣ処理水に溶解する。対照として、試験物質を添加しない未処理細胞からのＴｏｔａｌ ＲＮＡも同様にして調製する。

３）マイクロアレイ解析２−ＤＮＡマイクロアレイの処理
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからのアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）の合成は、ＲｉｂｏＡＭＰ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラ）を用い、添付のプロトコールに従って行っている。ａＲＮＡから蛍光標識ｃＤＮＡの調製は、Ａｔｌａｓ Ｐｏｗｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラ）を用い、添付のプロトコールに従う。試験物質で処理した細胞由来のａＲＮＡからはＣｙ３で蛍光標識してｃＤＮＡを調製し、未処理細胞由来のａＲＮＡからはＣｙ５で蛍光標識したｃＤＮＡを調製している。蛍光標識ｃＤＮＡの精製はＣｙＳｃｒｉｂｅ ＧＦＸ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）を用る。精製したＣｙ３標識ｃＤＮＡとＣｙ５標識ｃＤＮＡをハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ。１ｘＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウムと１５ｍＭクエン酸ナトリウムから成る）と混ぜ、ＤＮＡマイクロアレイ（ＥｓｔｒＡｒｒａｙ）に加えて、６５℃で一晩静置。その後、同アレイを０．２％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを含む０．２ｘＳＳＣ、さらに０．２ｘＳＳＣの順でそれぞれ５分間洗浄して乾燥する。これをＣｈｉｐＲｅａｄｅｒ（Ｖｉｒｔｅｋ）でスキャンし、ＩＰＬａｂ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ）で解析する。各遺伝子のＣｙ３の蛍光強度とＣｙ５の蛍光強度との比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）を計算し、補正用コントロール遺伝子の比（Ｃｙ３／Ｃｙ５）の平均値で割って補正する。

マイクロアレイ解析の結果を図２に示す。発酵大豆抽出液を最終濃度２００ｍｇ／Ｌ（発酵大豆湿重量換算）になるように細胞に添加し、それによって生じる遺伝子発現量の変動をエストロゲン標準物質（Ｅ_２）による変動値と比較した。発酵大豆抽出液とＥ_２との相関係数は０．８で、近似直線の傾きも１に近く、両者の生理活性は遺伝子発現レベルで同一であることが示された。

本発明により安全性が保証された食品をエストロゲン補充目的で使うことが可能になる。伝統食品なら副作用の心配もなく、長期間の使用にも耐える。
高齢化社会では中高年、特に女性の血中エストロゲンの枯渇は、更年期障害、骨粗しょう症、リュウーマチなど医療費を押し上げる要因のひとつになっている。エストロゲン補充は現在はヒト胎盤抽出物などが用いられ、ウィルス感染や発がんの危険性を伴う高価で危険を伴う医療行為である。
本発明により、エストロゲン補充は極めて安全で、手軽なものとなる。このため、高齢者のＱＯＬ向上と医療費抑制に貢献できると考える。

ヒト乳がん由来ＭＣＦ−７細胞に、発酵大豆抽出液を様々な濃度で添加し、細胞増殖試験により増殖促進活性を調べた結果。未処理細胞の増殖を０％、１０ｎＭ１７β−エストラジオール（Ｅ_２）による増殖能を１００％としてプロットした。 ヒト乳がん由来ＭＣＦ−７細胞に発酵大豆抽出液を最終濃度で２００ｍｇ／Ｌ（発酵大豆湿重量換算）添加し、それによって起こる約２００種の遺伝子の発現量の変動をＤＮＡマイクロアレイを用いて調べた結果。１０ｎＭＥ_２により生じた変動値と比較した。縦軸に発酵大豆抽出物による変動値を、横軸にエストロゲン標準物質による変動値をプロットし、相関係数Ｒ値および近似直線にて両者の類似性を評価した。

Claims (3)

1. 脊椎動物エストロゲンに代替可能なエストロゲン活性含有食品を得ることを目的とした食品の製造方法であり、大豆を原料とし、ヒト細胞を用いた生理活性測定により製造工程で同活性が現れ製品中にも同活性が存在することの確認作業を伴う、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｓ ｖａｒ．ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓによる発酵と同活性を抽出する工程を含む食品の製造法。
2. 脊椎動物エストロゲンに代替可能なエストロゲン活性含有食品を得ることを目的とした食品の製造方法であり、請求項１の方法を用いる、大豆皮、大豆胚芽、または大豆子葉由来のエストロゲン活性含有食品の製造法。
3. 脊椎動物エストロゲンに代替可能なエストロゲン活性含有食品を含む製品の製造方法であり、請求項２のエストロゲン活性含有食品を、飲料、食品、サプリメント、化粧品、医薬品などに添加することによって得られるエストロゲン活性含有製品の製造法。

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