JP5866619B2 - 抗酸化剤、及び、美白剤 - Google Patents

Description

本発明は、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ属の藻体又は藻体からの抽出物から得られる抗酸化剤及び美白剤に関する。

食品、化粧料、医薬品等の工業製品は大気中の酸素や製品中の溶存酸素により酸化され、変質、劣化を生じることがある。このような品質低下を防止するために抗酸化剤（酸化防止剤）を製品に配合する方法が知られている。

人工抗酸化物質としては、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）や、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）が広く用いられている。これらは食品添加物として認可され、化学的に安定で、酸化防止効果に優れる。しかし、動物実験による生体への悪影響も報告されており、食品、化粧料等への使用を懸念する動きもある。

天然物由来の抗酸化物質としては、例えば、Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）やトコフェロール類（ビタミンＥ）等のビタミン類、アントシアニン、クロロフィルのようなポリフェノール類、カテキン等のフラボノイド類がよく知られており、その安全性の高さから、医薬品、食品、化粧料、等への添加物として広く利用されている。しかし、例えばビタミン類は、安全性が高いものの、安定性に欠けるため、製品中において着色、変色、臭気の原因となる等の問題が生じる場合がある。こうしたことから、安全でなおかつ安定性の高い抗酸化剤の開発が期待されている。

一方、近年では生活習慣病が大きな問題となっている。生活習慣病は、遺伝的要因も関与するが、原因の大部分はアンバランスな食生活、アルコールやタバコ等嗜好品の過剰摂取、運動不足、ストレス、過剰な労働等、日常生活の悪習慣によって引き起こされることが知られている。これらの要因により発生する過剰な活性酸素種、活性窒素種又はフリーラジカルが引き起こす酸化ストレスは、人体に過剰な酸化を引き起こし、様々な疾病の原因となる。その予防、軽減又は治療手段として、抗酸化剤の摂取が提案されている。

また、こうした生活習慣や紫外線等の環境条件により、皮膚において過剰な酸化反応が起こり、過酸化脂質が生じ、肌荒れ、しわ、くすみ、老化等が引き起こされる。これに対し、抗酸化物質を化粧料等に配合し、アンチエイジングとして利用されることも多い。

体内で発生する活性酸素種としては、スーパーオキシドアニオンラジカル、過酸化水素、ヒドロキシラジカル及び一重項酸素の４種が知られている。また、不飽和脂肪酸の酸化物である不飽和脂肪酸ペルオキシラジカル、不飽和脂肪酸ラジカル、不飽和脂肪酸ヒドロペルオキシド、不飽和脂肪酸アルコキシラジカル等も同様の酸化障害を引き起こすことが知られている。これらの酸化物質が引き起こす疾病としては、動脈硬化性疾患、癌・腫瘍性疾患、細胞障害、糖尿病、脳神経疾患（脳梗塞・認知症・パーキンソン病）、皮膚の老化・色素沈着、白内障・網膜疾患、消化器・粘膜疾患、肺・気管支障害等が知られている。

また、海洋生物を起源とする天然抗酸化物質としては、緑藻類のヒトエグサ（特許文献１参照）、緑藻類のクロレラ、（特許文献２参照）、藍藻綱ネンジュモ目のノーストック属又はアファ二ゾメノン属及びユレモ目のオシラトリア属又はスピルリナ属、紅藻綱チノリモ目のポルフィリディウム属又はロドソルス属、緑藻綱クロロコックム目のクロレラ属及びオオヒゲマワリ目のデュナリエラ属及びホシミドロ目のミカヅキモ属、ハプト藻綱イソクリシス目のプリュウロクリシス属及びプリムネシウム目のフェオキィスティス属及びユーグレナ藻綱ユーグレナ目のユーグレナ属に属する微細藻類の抽出物を少なくとも１種類含有している抗酸化剤（特許文献３参照）等がある。

特開２００６−２４０９９１号公報 特開２００２−１１４７０３号公報 特開２００２−６９４４３号公報

しかしながら、上述の海洋生物を起源とする天然抗酸化物質は、その特性を抗酸化物質として十分に活用されているとは言い難い。

一方、肌のしみやそばかす等は、紫外線等の刺激によってメラノサイトが活性化され、その結果メラノサイトにて合成されたメラニン色素が皮膚内に沈着することにより発生することが知られている。このようなメラニン色素の合成、沈着を低減するために、Ｌ−アスコルビン酸、アルブチン、ハイドロキノン誘導体、コウジ酸、プラセンタエキス、グルタチオ等が配合された化粧料が市販されている。

しかしながら、例えばＬ−アスコルビン酸は保存安定性が十分ではなく、熱や酸化に対して極めて弱い。このため、製品中では不安定でその効果が十分に発揮されない。また、製品中で経時的に分解して着色する等の問題点がある。
また、アルブチンは熱や酸化に対する安定性は改善されてはいるが、効果の面等で必ずしも満足できるものではない。その他の物質についてもメラニン生成抑制効果が低いものや、酸化されやすく不安定なもの、更に特有の異臭や沈殿が生じる等、製品中で変質するため美白効果が必ずしも十分とはいえない場合があった。

上述した問題の解決のため、本発明においては、新規な抗酸化剤及び美白剤を提供するものである。

本発明者等は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ属、Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ属、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属、Ｅｕｃａｍｐｉａ属の藻体抽出物が、抗酸化性及び美白活性を有するという知見を得て本発明に至った。
すなわち、本発明の抗酸化剤は、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ属、Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ属、又は、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属に属する藻体、及び、この藻体の抽出物を含む。
また、本発明の美白剤は、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ属、Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ属、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属、又は、Ｅｕｃａｍｐｉａ属に属する藻体、及び、この藻体の抽出物を含む。
また、本発明の飲食物、化粧料、及び、医薬部外品は、上記抗酸化性、又は、上記美白剤が配合されている。

本発明によれば、上述の微細藻類属に含まれる抗酸化成分及び美白成分により、効果に優れた抗酸化剤及び美白剤を提供することができる。

まず、本発明の具体的な実施形態の説明に先立ち、本発明の概要について説明する。
［藻体］
本発明においてＡｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ属、Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ属、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属、Ｅｕｃａｍｐｉａ属は、微細藻類の一種である珪藻植物門（Bacillariopohyta）に属する。珪藻は不等毛植物門珪藻綱に属する単細胞性の藻類であり、細胞が珪酸質の被殻に入っているのが特徴である。殻の形態が放射相称を示すものを中心珪藻、左右相称を示すものを羽状珪藻と呼ぶ。珪藻は海水中に幅広く分布している微細藻類である。

また、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ属、Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ属、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属、Ｅｕｃａｍｐｉａ属は、それぞれ下記に属する微細藻類を意味する（Round, F. E., et al., 「The diatoms」,1990, p.747, Cambridge Univ. Press, Cambridge.参照）。

Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ属は、オビケイソウ綱（Fragilariophyceae）オビケイソウ亜綱（Fragilariophycidae）オビケイソウ目（Fragilarales）オビケイソウ科（Fragilariaceae）に属する微細藻類を意味する。

Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ属は、コアミケイソウ綱（Coscinodiscophyceae）ツノケイソウ亜綱 (Chaetocerotophycidae)レプトキリンドゥルス目（Leptocylindales）レプトキリンドゥルス科（Leptocylindraceae）に属する微細藻類を意味する。

Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ属は、タラシオシーラ亜綱（Thalassiosirophycidae）タラシオシーラ目（Thalassiosirales）スケレトネマ科（Skeletonemataceae）に属する微細藻類を意味する。

Ｅｕｃａｍｐｉａ属は、コアミケイソウ綱（Coscinodiscophyceae）イトマキケイソウ亜綱（Biddulphiophycidae）ヘミアリウス目（Hemiaulales）ヘミアリウス科（Hemiaulaceae）にそれぞれ属する微細藻類を意味する。

本発明において微細藻類は、天然のもの又は培養によるもののいずれを用いても良い。なお、安定供給及び炭素固定の観点から、培養によるものを使用することが好ましい。
上述の微細藻類は地球温暖化の原因となる二酸化炭素を固定することが知られ、地球環境にやさしい微細藻類を提供できる。培養方法は特に限定されないが、培養に供する微細藻類が棲息していた領域近辺の水を用いることが好ましい。
特に深度２００ｍ以深の海水、いわゆる海洋深層水は、清浄性、栄養性が高い。このため、海洋深層水中の微細藻類を、この海水を用いて培養することで、生理活性の高い藻体及び藻体抽出物を効率よく得ることが可能となる。

また、本発明において使用する微細藻類は、生体又は乾燥体のいずれであっても良く、いずれかの抽出物を用いても良い。藻体から抽出物を製造する方法は特に限定されず、従来公知の方法により抽出することができる。例えば、エタノールに藻体を懸濁させ、必要により撹拌や超音波破砕処理をしながら抽出物を抽出する。

藻体から抽出物を抽出する際の藻体濃度は用途に応じ、１質量％〜９９質量％の範囲で自由に選択できる。特に、約５質量％〜３０質量％の範囲で実施することが好ましい。藻体濃度が高すぎると藻体からの成分回収率が悪くなる。また、濃度が低過ぎると抽出液中の有効成分濃度が低くなり、抽出液の濃縮等でコストがさらにかかるため好ましくない。

抽出溶媒は、水、海水、海洋深層水、緩衝液等の水、メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール、プロピレングリコール、１，３ーブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール、エーテル類、エステル類、ケトン類等の溶媒及びこれらの混合物を適宜用いることができる。また、超臨界抽出、蒸留等の操作と組み合わせても良い。

藻体抽出物は公知の方法により得ることができる。例えば、藻体の分散溶液を遠心分離後、その上澄み液を、フィルター等を用いてろ過し、藻体と抽出液とを分離することで抽出物を得ることができる。また、必要に応じこの抽出物を減圧濃縮や、凍結乾燥や、噴霧乾燥等の方法により加工してもよい。

［抗酸化作用］
本発明において、抗酸化剤の特性は、スーパーオキシド消去作用、又は、ＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去能を指標として評価する。つまり、本発明における抗酸化剤は、少なくともいずれか一方以上の特性評価において効果を有する。

［スーパーオキシド消去作用］
スーパーオキシドラジカルを酸素と過酸化水素とに分解する酵素を、スーパーオキサイドディスムターゼ（Super Oxide Dismutase、以下ＳＯＤ）という。スーパーオキシドラジカルは、ミトコンドリアが酸素からエネルギーを生成するとき、また、白血球などの免疫細胞が体内に侵入してきた細菌を攻撃するとき等に最も頻繁に発生する活性酸素種である。スーパーオキシドラジカルそのものは、人体に及ぼす影響がそれほど高くないが、短時間でより毒性の強い活性酸素種へと変化するため、様々な疾患や老化などに関与していると考えられている。

生体内には、余分に発生したスーパーオキシドラジカルをＳＯＤによって分解する機構が存在しているが、細胞内のＳＯＤ活性は、年齢とともに低下していく。また若い細胞であっても、スーパーオキサイドアニオンによるダメージは少なからず受けている。そこで、少しでも多く余分なスーパーオキサイドアニオンを除去することができれば、老化のスピードを抑えることができ、若々しい肌を保つ可能性が高くなると考えられ、ＳＯＤ活性を持つ物質は化粧品素材として有用であるといえる。

［ＤＰＰＨラジカル消去能］
ラジカルは、化学的には「不対電子」とよばれるもので、他の物質と反応しやすいため、反応性が高い物質であるとされている。しかし、全てのラジカルが悪い物質というわけではなく、特に問題となるのは酸素から発生するラジカル（活性酸素）である。これらには、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、ヒドロペルオキシルラジカル、アルコキシルラジカル、アルキルペルオキシルラジカル、一酸化窒素などがあり、生体内で様々な物質を酸化させてしまい、病気や老化の原因となる場合がある。

通常ラジカルは不安定な物質であり、短時間で別の物質へと変換されていくため、評価試験で使用することは難しい。しかし、ＤＰＰＨは人工的に作られた安定なラジカルなので、試験用としては非常に有益な物質として知られている。
一般的に、ＤＰＰＨの持つラジカルを取り除くことができる物質であれば、この物質は、酸素から作られるラジカルも取り除くことができると考えられている。この結果、酸素から作られるラジカルは別の安全な物質へと変化するため、細胞内で他の物質を酸化させることがなくなり、疾患や老化を抑えることができるようになると推察できる。

［美白作用］
本発明において、美白剤としての評価はチロシナーゼ活性阻害作用、又は、メラニン産生阻害作用を指標とする。つまり、本発明における美白剤は、少なくともいずれか一方以上の特性評価において効果を有する。

［チロシナーゼ活性阻害作用］
チロシナーゼとは、メラニン色素をつくり出す色素細胞（メラノサイト）だけが持っている酸化酵素である。一般にシミ・ソバカスは過剰なメラニン色素が生成されることによって引き起こされる。そのメラニン色素の生成は次のようなメカニズムで説明される。

太陽光の中の紫外線、ストレス、大気汚染などに曝されると皮膚の表面で活性酸素が発生し、その刺激によってメラノサイトが活性化され、チロシナーゼの生成が始まる。生成したチロシナーゼはアミノ酸の一種であるチロシンと反応し、さらにいくつかの段階を経てメラニンを作り出す。

チロシナーゼはメラニンを作る酵素であるため、チロシナーゼ阻害効果の知られている物質(陽性対象)と比較し、添加の有無によるチロシナーゼ活性への影響を調べる事によって、メラニンの生成抑制効果が評価できる。この試験を利用し、化粧品や化粧品原料、化粧品原料となる素材（植物、酵母などの微生物、海産物など）のメラニン生成抑制による美白効果について予測することができる。

［メラニン産生阻害作用］
メラニンは皮膚に紫外線が当たる事で生成される色素で、メラノサイトという細胞で作られる。その役割は紫外線から人体を守ることであり、メラニンはその紫外線を吸収したり、散乱したりする働きにより、強い紫外線から細胞を守る。しかし、紫外線を浴び続けるとメラノサイトが常に活性化した状態となり、必要以上にメラニンを作り続けてしまうため、シミが発生し、肌の重大な悩みの一つとなっている。このようなシミを作らせないためには、メラニンの生成を抑制することが重要となる。

Ｂ１６メラノーマ細胞とは、癌化したマウスのメラノサイトのことで、マウス黒色腫細胞株とも呼ばれている。正常な細胞は細胞数を一定に保つため、分裂・増殖しすぎないように制御機構が働いているが、癌化した細胞は制御が働いておらず、無制限に増殖を続ける。Ｂ１６メラノーマ細胞は、メラニンを生成する機能をメラノサイトと同様に持っている。このため、Ｂ１６メラノーマ細胞は、メラノサイトをターゲットとした簡易的な美白評価試験によく利用される細胞である。
本試験は、試験物質を添加した状態でＢ１６メラノーマ細胞を培養し、産生されたメラニン量を測定することによってメラニン生成抑制力を評価する。この試験を利用し、化粧品や化粧品原料、化粧品原料となりうる素材（植物、酵母等の微生物、海産物等）等の美白作用について予測することができる。

上述の藻体及び藻体抽出物を、例えば、飲食物、化粧料又は医薬部外品等に配合して用いることができる。飲食物としては、例えば、茶、果汁飲料、栄養ドリンク剤、健康食品、ダイエット食品、即席食品類、嗜好飲料類、小麦粉製品、菓子類、調味料類、乳製品、冷凍食品、水産加工品、畜産加工品及び農産加工品、その他の市販食品等が好ましい例として挙げられ、特に抗酸化活性を有する機能性飲食物又は抗酸化機能を必要とする飲食物に含有させることが好ましい。

化粧料としては、石けん、ローション、美容液、乳液、クリーム、ファンデーション、化粧水、水系ファンデーション、水系チーク、水系アイシャドー、水系マスカラ、水系リップ、クレンジング、洗顔料、シャンプー、リムーバ、マッサージ剤等が例示でき、特に抗酸化活性又は美白活性を有する機能性化粧料に含有させることが好ましい。

医薬部外品に対して該藻体抽出物を利用する場合、該抽出物自体を施用してもよいが、好ましくは、公知の方法によって該抽出物が配合された医薬部外品として施用することができる。その形態は限定されないが、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等をあげることができる。

上述の藻体及び藻体抽出物を、飲食物、化粧料又は医薬部外品等に含有させて用いる場合には、本発明の効果を損なわない範囲において配合すればよく、配合量は特に限定されないが、例えば、製品に対して該抽出物が好ましくは０．００００１〜１０質量％、より好ましくは０．０００１〜５質量％、更に好ましくは０．００１〜１質量％配合されていればよい。上記範囲内であれば本発明の効果を得るために充分であり、しかも製品本来の特性、物性等を損なうおそれが小さい。

以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。
［スーパーオキシド消去作用］
（実施例１）
（１）微細藻類Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａの培養
駿河湾深層水水産利用施設沖に設置された取水管より、深度３９７ｍの海洋深層水を汲み上げ、孔径３μｍのカートリッジフィルターで除菌ろ過したものを培養海水とした。約４トン容の水槽に３．５トンの培養海水を満たし、ここに駿河湾深層水中より採取したＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａを初期密度７５０細胞／ｍｌで接種した。培養温度は２０℃、光条件は室内太陽光を基準とし、１０，０００ルクスに満たない場合は９：００〜１７：００までの間ナトリウムランプを点灯した。

（２）抽出物の調整
Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ培養液を中空糸膜ろ過方式で濃縮した後、さらに遠心分離を用いて藻体を捕集した。得られた藻体を−３０℃で凍結した後、凍結乾燥した。凍結乾燥物は０．５ｍｍ以下に粉砕した。粉砕後、藻体粉砕物の乾燥質量に対し、質量基準で２０倍となるように蒸留水で分散した。分散液を超音波破砕装置により周波数２０ｋＨｚ、出力１００Ｗで３分間破砕し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）して上澄みを取り出すことで実施例１の藻体の水抽出物を得た。

（実施例２）
上述の実施例１と同様の方法で、駿河湾海洋深層水中より採取したＡｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａを培養し、実施例２の藻体の水抽出物を得た。

（実施例３）
上述の実施例１と同様の方法で、駿河湾海洋深層水中より採取したＬｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓを培養し、実施例３の藻体の水抽出物を得た。

（試験例１）
実施例１、実施例２、及び、実施例３で得られた藻体の水抽出物の抗酸化活性（活性酸素消去活性）を確認するため、スーパーオキサイド消去作用の評価を行った。
スーパーオキサイド消去作用の測定は、ＳＯＤ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ (DOJINDO MOLECULAR TECHNOLOGIES, INC., Lot No. VT677)を用いて行った。試料溶液の調製は、キットに準じて行った。
まず、上述の各実施例の藻体の水抽出物 ２０μｌ，ＷＳＴ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２００μｌ，およびＥｎｚｙｍｅ ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ２０μｌを９６穴プレートで混合後、３７℃で２０ｍｉｎ反応させた後に４５０ｎｍで吸光値を測定し、スーパーオキサイド消去率（％）を求めた。
結果を表１に示す。

（試験結果）
表１から明らかな通り、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ水抽出物は高いスーパーオキサイド消去作用を示した。また、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓの水抽出物も高いスーパーオキサイド消去作用を示した。

［ＤＰＰＨラジカル消去能］
（比較例１）
ニンジンの可食部をエタノール抽出し、藻体抽出試料と同様の測定を行った。
ニンジン可食部生重２０ｇに対し、エタノール８０ｇを加えてホモジナイズを行った。そして、減圧乾固した後、５０ｍｌ蒸留水に溶解し、比較例１のニンジンの抽出物を得た。

（試験例２）
０．１ＭのＤＰＰＨ（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）溶液（５０％エタノール水溶液）に、上述の実施例１〜３の藻体の水抽出物及び比較例１の抽出物を添加し、ＤＰＰＨラジカルをどの程度消去できるかで判定した。

具体的には、９６穴マイクロプレートに、２０μＬの上述の実施例１〜３の藻体の水抽出物（又は比較例１の抽出物）、Ｔｒｏｌｏｘ希釈系列、及び、２５０μＬのＤＰＰＨ溶液を加え、室温で２０分間撹拌後、マイクロプレートリーダーで５２０ｎｍにおける試料の吸光度（Ａsample）を測定した。

また、コントロールとして、被検試料の代わりに２００ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）を添加した場合の吸光度（Ａcontrol）を測定した。
ブランクとして、ＤＰＰＨ溶液の代わりに同量の緩衝液を添加した場合の吸光度（Ａblank）をそれぞれ測定した。

ＤＰＰＨラジカル消去能（％）は次式に従って求めた。
消去能（％）＝［｛Ａcontrol−（Ａsample−Ａblank）｝／Ａcontrol］×１００
別途、Ｔｒｏｌｏｘの濃度を横軸、吸光度変化量を縦軸として検量線を描き、各試料のＴｒｏｌｏｘ換算濃度を求めた。
結果を表２に示す。

（試験結果）
表２から明らかな通り、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａの水抽出物は高いＤＰＰＨラジカル消去率を示した。また、Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓの水抽出物も高いＤＰＰＨラジカル消去能を示した。それぞれ、一般的に抗酸化作用を有するニンジンの抽出部よりも優れたＤＰＰＨラジカル消去能を示している。このことから、実施例１〜３の水抽出物が良好な抗酸化作用を有していることがわかる。

［チロシナーゼ活性阻害作用］
（実施例４）
（１）微細藻類Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａの培養
駿河湾深層水水産利用施設沖に設置された取水管より、深度３９７ｍの海洋深層水を汲み上げ、孔径３μｍのカートリッジフィルターで除菌ろ過したものを培養海水とした。約４トン容の水槽に３．５トンの培養海水を満たし、ここに駿河湾深層水中より採取したＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａを初期密度７５０細胞／ｍｌで接種した。培養温度は２０℃、光条件は室内太陽光を基準とし、１０，０００ルクスに満たない場合は９：００〜１７：００までの間ナトリウムランプを点灯した。

（２）抽出物の調整
Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ培養液を中空糸膜ろ過方式で濃縮した後、濃縮液を遠心分離して藻体を捕集した。得られた藻体を−３０℃で凍結した後、凍結乾燥した。凍結乾燥物は０．５ｍｍ以下に粉砕した。粉砕後、藻体粉砕物の乾燥質量に対し、質量基準で２０倍となるように蒸留水で分散した。分散液を超音波破砕装置により周波数２０ｋＨｚ、出力１００Ｗで３分間破砕し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）して上澄みを取り出すことでＳｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ抽出物（脱塩無）を得た。
次に、Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ抽出物（脱塩無）に付着した塩分を除くため、蒸留水にて２回洗浄し、得られた藻体を−３０℃で凍結した後、凍結乾燥した。凍結乾燥物は０．５ｍｍ以下に粉砕し、蒸留水に分散した。分散液を超音波破砕装置により周波数２０ｋＨｚ、出力１００Ｗで３分間破砕し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）して上澄みを取り出すことで実施例４の水抽出物（脱塩有）を得た。

（実施例５）
上述の実施例４と同様の方法で、駿河湾海洋深層水中より採取したＡｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａを培養し、実施例５の藻体の水抽出物を得た。

（実施例６）
上述の実施例４と同様の方法で、駿河湾海洋深層水中より採取したＬｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓを培養し、実施例６の藻体の水抽出物を得た。

（実施例７）
上述の実施例４と同様の方法で、駿河湾海洋深層水中より採取したＥｕｃａｍｐｉａを培養し、実施例７の藻体の水抽出物を得た。

（試験例３）
抽出液の美白機能をチロシナーゼ活性阻害により評価した。
具体的には、９６穴マイクロプレートに、上述の実施例４〜７の藻体の水抽出物１００μＬを入れ、次に１２０Ｕ／ｍＬのチロシナーゼ（シグマ製）１００μＬを添加し、３７℃で１０分間プレインキュベートを行った。ここに２．５ｍＭのＬ−ＤＯＰＡ（L-dioxyphenylalanin）１００μＬを添加した後、さらに３７℃で５分間インキュベートを行い、マイクロプレートリーダーにて４９０ｎｍにおける吸光度（Ｂsample）を測定した。
別途、Ｌ−ＤＯＰＡの代わりに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えたものの吸光度（Ｂblank）、被検溶液の代わりに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えたものの吸光度（Ｂcontrol）を同様の操作にて測定を行った。

チロシナーゼ阻害活性（％）は次式に従って求めた。
阻害活性（％）＝［｛Ｂcontrol−（Ｂsample−Ｂblank）｝／Ｂcontrol］×１００
測定した上述の実施例４〜７の藻体の水抽出物のチロシナーゼ阻害活性（％）を表３に示す。

（試験結果）
表３に示すように、上述の実施例４〜７の藻体の水抽出物は、安定してチロシナーゼ活性阻害作用を有することが判る。これにより、該抽出物は美白機能を有する素材となることが判る。また、表３から明らかな通り、ＡｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａおよびＬｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓの水抽出物はいずれも高いチロシナーゼ活性阻害能を示した。

［メラニン産生阻害作用］
（試験例４）
抽出液の美白機能をＢ１６メラノーマ細胞により評価した。
直径６０ｍｍの細胞培養用シャーレに、ウシ胎児血清１０％含有ＭＥＭ（minimum essential medium）培地中で前培養したＢ１６メラノーマ細胞を２．５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう、０．１％コウジ酸を含む同培地中に接種した。ＣＯ_２濃度５％、３７℃で２４時間培養後、培地を除去し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ緩衝液）を用いて洗浄した。ここに、１．０％テオフィリン、及び、１．０％の上述の実施例５，６の藻体の水抽出物を含む同培地を加え７２時間培養した。培養終了後、トリプシン処理によって細胞を剥離し、得られた細胞を遠心分離し、培地を除去後ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、細胞の色相を観察した。以下の基準に基づいて美白効果を評価した。
なお、実施例の水抽出物を用いる代りに、ＰＢＳ緩衝液を加えたものをコントロールとした。また、１．０％Ａｓｔｅｒｉｏｎｅｌｌａ抽出物を用いる代りに、コウジ酸を用いて陽性コントロールとした。

（試験結果）
上述の実施例５，６の藻体の水抽出物の美白機能の評価結果を、表４に示す。また、コントロール（ＰＢＳ緩衝液）、及び、陽性コントロール（コウジ酸）を用いた美白機能の評価結果を、表４に示す。
なお、表４に示す美白効果は下記の基準により評価した。
（美白効果評価基準）
「５」： コントロールと同程度又はそれ以上の黒色
「１」〜「４」： 数字が小さいほど白色に近い色調
「０」： 白色

（試験結果）
表４から明らかなように、上述の実施例５，６の藻体の水抽出物はＢ１６メラノーマ細胞のメラニン色素産生を抑制し、細胞を白化する効果を有することが示された。これにより、実施例５，６の藻体抽出物は美白機能を有する素材であることが判る。また、表４から明らかなように、実施例５，６の藻体抽出物はＢ１６メラノーマ細胞のメラニン色素産生を抑制し、細胞を白化する効果を有することが示された。これにより、実施例５，６の藻体抽出物は美白機能を有する素材であることが判る。

次に、本実施の形態で説明する抗酸化剤及び美白剤を用いた、飲食物及び医薬部外品の参考例として、健康食品入浴剤の配合例を示す。
［参考例１］
（健康食品の製造）
上述の実施例４と同様の方法を用いて得られたＬｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ藻体粉末１ｇ、乳糖９９ｇ、乾燥コーンスターチ２ｇ、タルク１．８ｇ、ステアリン酸カルシウム０．２ｇを混和した。そして、一錠の重量０．５ｇで打錠し、健康食品として約２００錠の錠剤を作製した。この健康食品によれば、抗酸化作用に優れたＬｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ藻体を含むことにより、優れた抗酸化活性を有する。

［参考例２］
（入浴剤の製造）
硫酸ナトリウム：５２重量部、炭酸水素ナトリウム：４２重量部、上述の実施例４と同様の方法を用いて得られたＬｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ抽出液粉末：５重量部、香料１重量部、色素：適量を攪拌混合して入浴剤を作製した。この入浴剤によれば、美白作用に優れるＬｅｐｔｏｃｙｌｉｎｄｒｕｓ抽出物を含むことにより、メラニン生成抑制による美白効果を有する。

なお、本発明は上述の実施形態例において説明した構成に限定されるものではなく、その他本発明構成を逸脱しない範囲において種々の変形、変更が可能である。

Claims (6)

1. 藻体、及び、前記藻体を粉砕して溶媒により抽出した抽出物から選ばれる少なくとも１つ以上を含み、
   前記藻体が、アステリオネラ（Asterionella）属に属する
   ことを特徴とする抗酸化剤。
2. スーパーオキサイド消去作用、及び、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）ラジカル消去能から選ばれる少なくとも１以上の抗酸化作用を有する請求項１記載の抗酸化剤。
3. 前記藻体が、海洋深層水中からの採取物、又は、前記海洋深層水中での培養物であることを特徴とする請求項１又は２に記載の抗酸化剤。
4. 藻体、及び、前記藻体を粉砕して溶媒により抽出した抽出物から選ばれる少なくとも１つ以上を含み、
   前記藻体が、アステリオネラ（Asterionella）属に属する
   ことを特徴とする美白剤。
5. 美白作用がチロシナーゼ活性阻害、及び、メラニン産生阻害から選ばれる少なくとも１以上の美白作用を有する請求項４に記載の美白剤。
6. 前記藻体が、海洋深層水中からの採取物、又は、前記海洋深層水中での培養物であることを特徴とする請求項４又は５に記載の美白剤。