JP5857357B2 - 使い捨てチップ型フローセルとそれを用いたセルソーター - Google Patents

Description

本発明は、フローサイトメーターなどの生体粒子の解析機能またはセルソーターなどの分離機能を有する装置、それを用いる新規な機能を実現する測定方法、および使い捨てフローセルチップに関する。

フローサイトメーターは、種々のタイプの細胞および生物学的粒子を鑑別するために一般に広く用いられている。従来のフローサイトメーターは、通常、石英から作製され、それを通って個々に識別されるべき細胞の流れができるように流路が形成された光学的に透明なフローセルを備えている。この流路を通る細胞の流れは、この細胞の流れを同心的に取り囲むシース液体によって、流路の中央部に集中して流れる。この流路の中央部は、レーザービームで照射され、細胞がその照射領域を通過したときに、細胞の大きさ、形、屈折率に依存した光散乱が生じる。このレーザー光の波長は、蛍光色素で特異的に染色した細胞を蛍光で検出するために、蛍光色素の種類との組み合わせで決定される。このように、個々の細胞について散乱光のほかに蛍光を波長別に複数の光検出器で検出することによって、細胞を多角的に解析することが可能となっている。上記のフローサイトメーターの技術は特許文献１に記載されている。また平板状のフローセルについては特開平２００３−３０２３３０（特許文献１０）および米国特許第７１０５３５５号（特許文献１１）に記載されている。使い捨てチップを利用するフローサイトメーターは特許４３５８８８８（特許文献１４）に記載されている。

次にセルソーティング方法の公知例について述べる。米国特許第３７１０９３３号（特許文献１）および米国特許第３８２６３６４号（特許文献２）に記述されている方法が現在一般的な製品に使用されている分離方法であって、液滴形成用ノズルから空気中に試料液を液滴として吐出し、分離対象の細胞を含む液滴は液滴単位で電場によって分離するという方法である。特開昭６４−３５４１（特許文献３）は、フローセルを流れる試料液の周囲にシース流を流し、試料液に電場を加えることで帯電した粒子を試料流からシース流の方へシフトさせて分離計測する方法を開示する。特開平１−１７０８５３（特許文献４）には、フローセルを流れる粒子に圧力パルスを与えて、フローセル内の定常的に流れている流路ではない流路に粒子を分離する方法が記載されている。国際公開番号ＷＯ９８／１０２６７（特許文献５）には、フローセル内に周囲をシース流でしぼって流した微粒子に場を与えて微粒子の流れをシフトさせて分離するという技術が公開されている。国際公開番号ＷＯ２００４／１０１７３１（特許文献６）には、フローセル内の流路の両側に設置したゲル電極によって液体中で帯電している細胞を電場で分離する方法が公開されている。米国特許第６８０８０７５号（特許文献７）には、粒子の流れに対して垂直にメニスカスを形成するバブルバルブにより圧力パルスを加えて流れをシフトさせて分離する方式が公開されている。ＷＯ２００６／０７６１９５（特許文献８）は、特許文献５と同様に物理的衝撃パルスを与えることを目的とする粒子を含む水滴単位で射出してコンテナに回収する方法を開示する。米国特許第４７５６４２７号（特許文献９）には、シース流で絞られた試料液の流れの中の粒子を計測しターゲットとなる粒子であると判断した場合に、ピエゾ素子を利用してパルス流で別流路に導入して分離する方法が記載されている。

特許文献１２に記載される細胞分離方法は、細胞を含む液滴をオイル内に形成して流すことにより、静電場によってターゲットとなる細胞を含む液滴に力を作用させる方法である。特許文献１３では、フローセル中の流路にセルソーティング用の分岐流路を形成し、ピエゾ素子を利用してパルス的な流れを発生して必要な細胞をソーティング流路に引き込む方法がとられている。

米国特許第３７１０９３３号 米国特許第３８２６３６４号 特開昭６４−３５４１号公報 特開平１−１７０８５３号公報 国際公開番号ＷＯ９８／１０２６７ 国際公開番号ＷＯ２００４／１０１７３１ 米国特許第６８０８０７５号 国際公開番号ＷＯ２００６／０７６１９５ 米国特許第４７５６４２７号 特開２００３−３０２３３０号公報 米国特許第７１０５３５５号 ＷＯ２００９／０２１２１５ 特開昭６１−１３７０６２号公報 特許４３５８８８８

（１．送液系の課題）
従来のセルソーターは、その送液系にバイオハザード上の課題が存在する。すなわち、測定サンプルへの外部異物の混入や測定サンプルの外部への拡散が生じる構造となっているからである。すなわち、試料液のリザーバーおよび送液パイプ、フローセルを含めた送液系は、簡単に取り替えることは不可能であり、従来のフローサイトメーターは、キャリーオーバーを低減するためには異なる試料の測定ごとに洗浄しなければならない。このことは、フローサイトメーターに粒子分離機能を追加した装置であるセルソーターについても同様である。その解決策の一つとして、フローセルを使い捨て可能とすることである。使い捨て可能とするためには、フローセルがスライドガラスのような平板状構造であると都合がよい。つまり、射出成形などで流路パターンの形成が容易かつ安価に量産できる構造であるためである。平板状のフローセルを用いる場合は、表面から垂直に照射レーザーを入射する方法が都合よい。しかしながら、平板の面内方向への散乱光つまり側方散乱光の検出に問題が存在する。側方散乱光検出の意義は、細胞内構造の情報を得られるからであり、通常のフローサイトメーターでは必須の機能である。通常のフローサイトメーターのフローセルはフローセルの断面が正四角であることが一般的であって、レーザーの照射方向と垂直方向の散乱光を計測することは問題がなく前方散乱光と同時に計測される。しかし、平板型のフローセルを用いた場合は、側方散乱光の方向にフローセル基板が存在するので、フローセルの平板構造自体が測定の障害となる。この課題を解決する方法として、特許文献１１にフローセルの流路の側面に光ファイバーを設置し流路内で発生した光を光検出器まで導く方法が記載されている。しかし、この場合は光ファイバーがフローセルに接続しているために測定ごとのフローセル交換には適さないので、使い捨て用途のフローセルに適用することはできない。本発明者による以前の発明である特許文献１４の使い捨てチップ型フローセルを利用するフローサイトメーターには、側方散乱光検出機能は含まない。

（２．フローセルの課題）
また、フローセルを安価に製造できなければ、使い捨てにすることは困難になる。安価に製造するためには、透明樹脂製であることが都合良い。しかしながら、樹脂は波長５００ｎｍより短波長領域ではわずかながら光吸収帯が存在し蛍光を発生するので、計測の背景ノイズとなる。つまり、使い捨てとして都合が良い透明樹脂製のフローセルの場合は、自家蛍光が計測の障害となる。

（３．細胞分離方法の課題）
セルソーティングの課題について述べる。第一の課題としてバイオハザード対策上の問題がある。

特許文献１または特許文献２に記述されているジェットノズルにより液滴を吐出し、分離対象の細胞を含む液滴を液滴単位で電場によって分離するという方法（ジェットインエアー方式）は、バイオハザード対策上問題がある。つまりサンプルが病原性のウイルスや細菌に汚染された細胞の場合、非常に危険なものをエアロゾルとして大気中に拡散させてしまうというリスクを有している。第一の課題を解決する方式としては、エアロゾルを大気中に拡散せずフローセル内に閉じ込めたまま分離する方法が考えられる。このような方法として、次のいくつかの技術が公開されている。特許文献３は、フローセルを流れる試料液の周囲にシース流を流し、試料液に電場を加えることで帯電した粒子を試料流からシース流の方へ電場でシフトさせて分離計測する方法を開示する。特許文献４は、フローセルを流れる粒子にピエゾ素子で発生させた圧力パルスを与えて、フローセル内の定常的に流れている流路ではない流路に粒子を分離する方法を開示するが、この方法では分離した粒子がまたもとの流路に戻らないために空気の定常的な流れを形成する必要があるなど複雑な制御が問題である。特許文献５は、フローセル内を流れる試料液の周囲にシース流を流して試料液の流れを絞り、試料液中の微粒子に電場や磁場などの場を与えて微粒子の流れをシフトさせて分離するという技術を開示する。この方法において場として電場を適用する場合は、上記特許文献３の内容に相当する。これらの電場を利用する方法は、特許文献６における方法と同じで、電気分解による気泡発生を何らかの方法で防止したとしても、細胞の有する電荷は周囲の電解質中に含まれるイオンによってシールドされ、粒子に作用する力が低下するので、電解質中での分離には実用的でない。特許文献７は、チップ内での細胞分離技術を開示する。これは、一個の微粒子の流れを側面からの圧力でシフトさせて下流で分離する方法である。しかし、圧力を与えるためにメニスカスの往復運動が必要であり、行きと帰りで逆方向の流れが生じるため、粒子が十分に遠ざかるのを待ったのちにメニスカス位置を元に戻す必要がある。特許文献８は、特許文献４と同様に物理的衝撃パルスを与えて目的とする細胞を含む領域を水滴単位で射出してコンテナに回収する方法を開示する。これは使い捨てフローセルチップ内で実現できる内容ではなく、他のサンプルとのコンタミネーションが存在する。特許文献９の方法は使い捨てチップに適用できない。特許文献１２の方法は、細胞を含む液滴をオイル内に形成して流すことにより、目的の細胞を含む帯電した液滴に静電気力を作用させて分離する方法である。この場合はオイルには静電気力をシールドするイオンが存在しないというメリットがあるが、粘性が高いオイル中で細胞より大きな液滴のソーティングはスピードが遅いという欠点がある。特許文献１３に記載されているようにピエゾ素子を利用してパルス流を発生させて細胞を分岐流路に分離させる方法も、フローセルとピエゾとの接続は使い捨て型を前提としていない。もし、ピエゾ素子をフローセルに組み込む場合は、フローセルは高価になるので、使い捨てチップには適さない。

（４．多検体対応フローサイトメーターの課題）
次に、多検体対応のフローサイトメーターにおける課題をのべる。通常のフローサイトメーターは多検体対応として９６穴プレートを自動ＸＹＺステージに乗せて、順次計測する方法を採用している。この方法は、送液系は使いまわしなのでキャリーオーバーおよび検体間のクロスコンタミネーションが発生する。そこで、複数流路を形成したチップで、多数の検体を低ランニングコストで短時間に計測することが考えられる。この場合は、上記でも述べたように側方散乱光検出が困難になる。複数流路を形成した場合は、特許文献１１に記載される方法のように流路の側面に光ファイバーを差し込んで光ファイバー経由で信号光を検出器に導いて側方散乱を検出することが考えられるが、光ファイバーも含めて使い捨てチップにすることは実用的ではない。

（５．使い捨てチップを利用した正確な濃度計測の課題）
次に、使い捨てチップによる計測において、測定試料の正確な濃度を計測する場合の課題をのべる。細胞は重力のために沈降するため、試料液の細胞濃度が底面近傍の密度が時間ともに増大する現象がある。この現象にも関わらず正確な濃度を計測するためには、試料液全体を計測する必要がある。その場合に次の問題がある。例えば、公知例の特許文献１４に記載されているチップに、試料液を入れて計測すると、試料液がなくなった直後に気泡が発生して、細胞の計測データに気泡のデータが混在する。この気泡の発生は、細胞の正確な個数計測の障害となっている。

（６．データ解析の課題）
次に、フローサイトメーターのデータ解析上の課題をのべる。フローサイトメーターのマルチカラー解析は一般的に蛍光補正を行う。しかし、この蛍光補正では、検出波長が異なる複数の検出器間に分布した複数の信号強度から蛍光ラベルごとに１つの信号強度に補正するため、測定前に測定用試料を用いて装置調整を行う必要がある。そのため、測定用試料は測定データ取得と装置調整用に蛍光色の数だけの単独で染色した試料が必要である。また、蛍光検出器は少なくとも3個以上、つまり3色以上有ることが一般的である。このような状況において、2次元のデータを2次元グラフで表示することは可能であるが、3次元のデータ解析と表示は、現在のフローサイトメーターにおいて問題がある。すなわち、複数個の2次元表示や、回転表示できる3次元表示で行われており、すぐに理解できる表示が実現されていない。

本発明は、上記状況を鑑み、以下の使い捨てチップ型のフローセルを使用して生体粒子を解析識別し分離する装置、および使い捨てフローセルを提供する。

［１］平板基板内に流路を形成してなるフローセルと、
上記流路を流れる試料液中の微粒子に光を照射する光照射手段と、
上記光を照射した際に上記微粒子から発生する散乱光または蛍光を検出し、それらの信号強度に基づいて上記微粒子を識別し、目的の微粒子を検出する検出手段と、
上記フローセルの上記流路を流れる上記試料液中の上記微粒子に圧力パルスを与える定圧ポンプおよびそれに接続された電磁バルブと、
上記検出手段からの信号に基づいて上記電磁バルブの動作を制御する制御部と、を備える微粒子分離装置であって、
上記フローセルは、
上記試料液の導入用流路とその両側に配置した１対のシース液導入用流路と、
上記試料液の導入用流路に上記１対のシース液導入用流路が合流してなる合流流路であって、該合流流路内で上記試料液を挟んで両側にシース液が流れる、合流流路と、
上記合流流路上にある光照射領域と、
上記光照射領域より下流で上記合流流路に接続する1対の対向する分岐流路とを備え、
上記１対の対向する分岐流路の一方には通常閉状態の第一の電磁バルブと負圧の定圧ポンプが接続しており、
上記１対の対向する分岐流路の他方には通常閉状態の第二の電磁バルブと陽圧の定圧ポンプが接続しており、
上記検出手段は、上記微粒子が上記光照射領域を通過したときに発生する光信号を検出し、
上記制御部は、上記検出手段からの上記光信号に基づいて、上記微粒子が分離すべき目的の微粒子か否かを判断し、分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が上記１対の対向する分岐流路が接続する上記合流流路の領域を通過中に、上記第一および第二の電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号を与えることにより、上記対向する１対の分岐流路から上記領域を通過中の上記目的の微粒子に対してプッシュ（PUSH）およびプル（PULL）の圧力を与え、それによって上記目的の微粒子の流れを変化させることによって上記目的の微粒子を分離することを特徴とする、微粒子分離装置。
［２］上記［１］に記載の微粒子分離装置であって、
上記制御部は、上記微粒子が分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が上記一対の対向する上記分岐流路が接続する上記合流流路の領域を通過中に、上記電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号を与え、
それによって、上記対向する分岐流路間の上記合流流路の上記領域中に存在する上記目的の微粒子に対してプッシュおよびプルの圧力を与え、上記目的の微粒子の流れを変化させて、プル側の上記分岐流路に上記目的の微粒子を取り込むことで上記目的の微粒子を分離することを特徴とする、微粒子分離装置。
［３］上記［１］に記載の微粒子分離装置であって、
上記フローセルがさらに、上記１対の対向する分岐流路が接続する上記合流流路の領域よりも下流に上記合流流路から分岐する１対の追加的分岐流路を備え、
上記制御部は、上記微粒子が分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が最初の上記一対の分岐流路が対向する上記最初の分岐流路が接続する上記合流流路の上記領域を通過中に、上記電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号を与え、
それによって、上記対向する上記最初の分岐流路間の上記合流流路の上記領域中に存在する上記目的の微粒子に対してプッシュおよびプルの圧力を与え、上記目的の微粒子の流れを変化させて、下流の上記追加的分岐流路に上記目的の微粒子を分離することを特徴とする、微粒子分離装置。
［４］試料液を流路に流した状態で試料液に含まれる微粒子を分離するための平板状のフローセル装置であって、
上記フローセルは透明基板中に流路が形成されてその流路の上流側と下流側の基板上部にそれぞれ上記流路と流体接続する（fluidly connected）リザーバーが形成されている構造であって、
上記透明基板上に形成された、
上記試料液の導入用流路とその両側に配置した１対のシース液導入用流路と、
上記試料液の導入用流路とその両側に配置された上記１対のシース液導入流路とが合流してなる合流流路であって、上記試料液を挟んで両側に上記シース液が流れる、合流流路と、上記合流流路の側面に接続する対向する一対の分岐流路と、
を備え、上記１対の分岐流路は外部ポンプと気密接続可能なポートを備えることを特徴とするフローセル装置。
［５］生体微粒子を含有する試料液をフローセル中の流路に流した状態で試料液に光照射し、該試料液に含まれる試料粒子から発生する光を検出するための多検体対応フローサイトメーターであって、
フローセルを載置するステージと
光照射手段と、
上記生体微粒子を検出する検出手段と
上記各部の動作を制御する制御部とを備え、
上記フローセルは平板状であって、透明な平板基板上に複数の試料液リザーバーおよび複数のシース液リザーバー、複数の廃液リザーバーおよび複数の回収試料液リザーバー、ならびにこれらにそれぞれ流体接続する複数の流路が形成されており、
各上記試料液リザーバーは各上記シース液リザーバー内に、それぞれの液体が混ざらないように仕切られて形成されており、
各上記試料液リザーバーに各試料液用流路が接続しており、
各上記シース液リザーバーに１対のシース液用流路が接続しており、
各上記試料液流路の側面に上記１対のシース液用流路が接続しており、
各上記試料液流路に上記１対のシース液用流路が接続することにより、上記試料液流の左右からシース流が合流した流路を形成し、合流した流路は平行な等間隔に形成されており、最下流はフローセル上に形成した上記廃液リザーバーおよび上記回収試料リザーバーに接続する構造となっており、
複数の上記流路の各々には一個の流路のみ照射されるサイズの光ビームを順次ステップアンドリピード方式で、照射光またはフローセルを移動させることで、複数の試料を計測することを特徴とする多検体対応フローサイトメーター。
［６］上記［５］に記載の多検体対応フローサイトメーターであって、
上記フローセルの上記透明な平板基板の上記流路の側面方向の両端に傾斜をつけることで、各上記流路内から発生する側方散乱光を両端で全反射させて検出することを特徴とする多検体対応フローサイトメーター。
［７］照射光源と、
複数の波長領域の蛍光を計測するように構成された蛍光測定装置と、を備えるフローサイトメーターであって、
複数の蛍光分子を含む細胞の解析において、光照射によって発生する波長の異なる２種類の蛍光強度の比を個々の細胞について分布を導出し表示する機能を備え、
その値によって、細胞に含まれる複数の蛍光分子の存在比を評価する機能を備えることを特徴とするフローサイトメーター。
［８］平板基板内に流路を形成してなるフローセルと、
試料液中の微粒子をフローセルにシース液とともに上記流路に流した状態で光照射する照射光源と、
上記光照射した際に上記微粒子から発生する散乱光または蛍光を検出し、それらの信号強度に基づいて上記微粒子を識別し、目的の微粒子を検出する検出手段と、
上記各部を制御し、上記検出手段からの情報に基づいて上記微粒子を解析する、制御・解析部と
を備える、液体中微粒子計測装置であって、
上記試料液がすべて流れ終わった時点で発生する気泡を表す信号を利用して、上記試料液計測の終点を検知することで上記試料液全体に含まれる粒子数を定量することを特徴とする、液体中微粒子計測装置。
［９］照射光源と、
光照射によって個々の微粒子から発生する光を、複数の波長領域で計測するように構成された光測定装置と、を備える生体微粒子解析装置であって、
粒子個々について、粒子の測定項目に応じた複数の信号強度間の演算により指数を求め、その指数の値に基づいて、粒子特性を解析する機能を有することを特徴とする生体微粒子解析装置。
［１０］上記［９］に記載の生体微粒子解析装置であって、
細胞膜を透過する染色剤と透過しない染色剤で同時に染色した細胞や細菌の生死判定の測定解析を行う場合に、
光照射によって発生する波長の異なる２種類の蛍光信号強度の比を指数として、その指数の値に基づいて、死細胞か生細胞かを判定する演算手段を備えることを特徴とする生体微粒子解析装置。
［１１］照射光源と、
光照射によって個々の微粒子から発生する光を、複数の波長領域で計測するように構成された光測定装置と、を備える生体微粒子解析装置であって、
粒子個々について、複数の信号強度間の演算式で定義した指数を導出し、その指数をデータの表示グラフの軸として選択できることを特徴とする生体微粒子解析装置。

本発明によれば、キャリーオーバーやクロスコンタミネーションが無い条件を満足する、１）セルソーター、２）側方散乱光検出が可能なフローサイトメーター、３）正確な細胞密度計測、４）蛍光補正が不要な多重染色解析等が実現する。

（Ａ）流路内においてパルス流によってセルソーティングを行う場合の課題を示した図である。（Ｂ）上記の課題を本発明によって解決する原理を示した図である。 a)本発明によるセルソーターの一例を示した図であり、電磁バルブＯＦＦの状態を示している。b）本発明によるセルソーターの一例を示した図であり、電磁バルブＯＮの状態を示している。 a）本発明によるセルソーターの第2の形態を示した図であり、電磁バルブＯＦＦの状態を示している。b）本発明によるセルソーターの第2の形態を示した図であり、電磁バルブＯＮの状態を示している。 本発明による使い捨てチップ型フローセルを用いた細胞分離を行うためのフローセル構造と電磁バルブと定圧ポンプを示した図である。 本発明による使い捨てチップ型フローセルを用いた細胞分離を行うためのフローセルと光学系と制御系を示した図である。 本発明による使い捨てチップ型多検体対応フローセルの構造を示した図である。 本発明による使い捨てチップ型多検体対応フローセルを用いた側方散乱検出光学系を示した図である。 本発明による使い捨てチップ型多検体対応フローセルを用いた側方散乱検出光学系とチップ移動との関係を示した図である。 本発明による使い捨てチップ型フローセルを用いたフローサイトメーターにおいて、試料液全体を計測したときに発生する気泡の影響を除去できることを示した図である。 a)蛍光スペクトルと２つの蛍光検出波長領域(FL1,FL2)を示す図である。b)FL1とFL2の散布図上の2種類の蛍光試薬分子でラベルされた粒子分布を模式的に示した図である。 本発明による２重染色細胞の解析法を示した図である。（A）のグラフのデータを、縦軸をFL1/FL2の対数スケールとして表示すると、（B）のグラフのようになる。 従来の細胞の生死判定解析法を説明する図である。 本発明の多重染色解析方法を細菌の生死判定解析に適用した例の結果を示す図である。 本発明による指数による生死判定の多次元情報表示例。 本発明による指数による他の多次元情報表示例。

１．微粒子分離装置
本発明は１つの実施形態において、微粒子分離装置を提供する。この微粒子分離装置は、典型的には、
i) 平板基板内に流路を形成してなるフローセルと、
ii) 上記流路を流れる試料液中の微粒子に光を照射する光照射手段と、
iii) 光を照射した際に微粒子から発生する散乱光または蛍光を検出し、それらの信号強度に基づいて上記微粒子を識別し、目的の微粒子を検出する検出手段と、
iv) 上記フローセルの流路を流れる試料液中の微粒子に圧力パルスを与えるための定圧ポンプおよびそれに接続された電磁バルブと、
v) 検出手段からの信号に基づいて電磁バルブの動作を制御する制御部とを備える。

典型的には、上記フローセルは、
a) 試料液の導入用流路とその両側に配置した１対のシース液導入用流路と、
b) 試料液の導入用流路に上記１対のシース液導入用流路が合流してなる合流流路と［合流流路内で上記試料液を挟んで両側にシース液が流れる］、
c) 上記合流流路上にある光照射領域と、
d) 光照射領域より下流で上記合流流路に（ほぼ直角に）接続する1対の対向する分岐流路とを備える。

典型的には、上記１対の対向する分岐流路の一方には通常閉状態の第一の電磁バルブと負圧の定圧ポンプが接続しており、上記１対の対向する分岐流路の他方には通常閉状態の第二の電磁バルブと陽圧の定圧ポンプが接続している。

典型的には、上記検出手段は、上記微粒子が光照射領域を通過したときに発生する光信号を検出する。

典型的には、上記制御部は、上記検出手段からの上記光信号に基づいて、上記微粒子が分離すべき目的の微粒子か否かを判断し、分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が上記１対の対向する分岐流路が接続する上記合流流路の領域を通過中に、上記第一および第二の電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号を与えることにより、上記対向する１対の分岐流路から上記領域を通過中の上記目的の微粒子に対してプッシュ（PUSH）およびプル（PULL）の圧力を与える。このようにして、目的の微粒子の流れを変化させることによって目的の微粒子をその他の微粒子から分離することができる。

あるいは、本発明の微粒子分離装置においては、上記制御部は、微粒子が分離すべき目的の微粒子であると判断される場合に、その微粒子が上記一対の対向する分岐流路が接続する合流流路の領域を通過中に、電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号を与え、それによって、上記対向する分岐流路間の合流流路の領域中に存在する目的の微粒子に対してプッシュおよびプルの圧力が与えられ、目的の微粒子の流れが変化して、プル側の分岐流路に目的の微粒子を取り込むようにしてもよい。

本発明の微粒子分離装置は、フローセルがさらに、１対の対向する分岐流路が接続する合流流路の領域よりも下流に合流流路から分岐する１対の追加的分岐流路を備えていてもよい。そして、上記制御部により、微粒子が分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が最初の一対の分岐流路が対向する最初の分岐流路が接続する合流流路の上記領域を通過中に、上記電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号が与えられ、それによって、対向する最初の分岐流路間の合流流路の領域中に存在する目的の微粒子に対してプッシュおよびプルの圧力が与えられ、目的の微粒子の流れを変化させて、下流の追加的分岐流路に目的の微粒子を分離することによって、微粒子を分離することができる。

２．平板状フローセル装置
本発明はさらに別の実施形態において、試料液を流路に流した状態で試料液に含まれる微粒子を分離するための平板状のフローセル装置を提供する。このフローセル装置は、典型的には、透明基板中に流路が形成されてその流路の上流側と下流側の基板上にそれぞれ上記流路と流体接続する（fluidly connected）リザーバーが形成されている構造を有する。

より具体的には、このフローセル装置は、透明基板上に形成された、
i) 試料液の導入用流路とその両側に配置した１対のシース液導入用流路と、
ii) 上記試料液の導入用流路とその両側に配置された上記１対のシース液導入流路とが合流してなる合流流路であって、上記試料液を挟んで両側に上記シース液が流れる、合流流路と、
iii) 上記合流流路の側面に（ほぼ直角に）接続する対向する一対の分岐流路と、
を備える。
iv) 上記１対の分岐流路は外部ポンプと気密接続可能なポートを備えている。

上記の分岐流路が接続する上記合流流路の領域よりも下流に上記合流流路から分岐する1対の追加的分岐流路を備えるフローセル構造でもよい。

３．多検体対応フローサイトメーター
本発明は別のさらなる実施形態において、生体微粒子を含有する試料液をフローセル中の流路に流した状態で試料液に光照射し、該試料液に含まれる試料粒子から発生する光を検出するための多検体対応フローサイトメーターを提供する。このフローサイトメーターは、典型的には、
i) フローセルを載置するステージと
ii) 光照射手段と、
iii) 生体微粒子を検出する検出手段と
iv) 上記各部の動作を制御する制御部と
を備える。

上記フローセルは平板状であってもよい。さらに上記フローセルは、透明な平板基板上に複数の試料液リザーバーおよび複数のシース液リザーバー、複数の廃液リザーバーおよび複数の回収試料液リザーバー、ならびにこれらにそれぞれ流体接続する複数の流路が形成されていてもよい。さらに、各上記試料液リザーバーは各上記シース液リザーバー内に、それぞれの液体が混ざらないように仕切られて形成されていてもよい。さらに、各上記試料液リザーバーに各試料液用流路が接続していてもよい。さらに、各上記シース液リザーバーに１対のシース液用流路が接続していてもよい。さらに、各上記試料液流路の側面に上記１対のシース液用流路が接続していてもよい。

各上記試料液流路に上記１対のシース液用流路が接続することにより、上記試料液流の左右からシース流が合流した流路を形成し、合流した流路は平行な等間隔に形成されており、最下流はフローセル上に形成した上記廃液リザーバーおよび上記回収試料リザーバーに接続する構造となっていてもよい。

本発明の多検体対応フローサイトメーターによれば、複数の上記流路の各々には一個の流路のみ照射されるサイズの光ビームを順次ステップアンドリピード方式で、照射光またはフローセルを移動させることで、複数の試料を計測することができる。

本発明の多検体対応フローサイトメーターにおいては、上記フローセルの上記透明な平板基板の上記流路の側面方向の両端に傾斜をつけることで、各上記流路内から発生する側方散乱光を両端で全反射させて検出系に導いて検出してもよい。

４．その他のフローサイトメーター
本発明はさらに別の実施形態において、複数の蛍光分子を含む細胞の解析において、レーザー光照射によって発生する波長の異なる２種類の蛍光強度の比を個々の細胞について分布表示する機能を有し、その値によって、細胞に含まれる複数の蛍光分子の存在比を評価する機能を有することを特徴とするフローサイトメーターを提供する。また、別の実施形態では、細胞膜を透過する染色剤と透過しない染色剤で同時に染色した細胞や細菌の評価において、レーザー光照射によって発生する波長の異なる２種類の蛍光信号強度の比に対して、前もって設定した基準値に対する大小関係によって、死細胞か生細胞かを判定することを特徴とする生体微粒子解析装置を提供する。

これらのフローサイトメーターまたは生体微粒子解析装置は、典型的には、レーザー光照射源と、複数の波長領域の蛍光を計測するように構成された蛍光測定装置とを少なくとも備える。

以下、図面を参照しながら、本発明のより具体的な実施形態について説明するが、本発明の範囲はこれらの実施形態に限定されないことはいうまでもない。

１）細胞分離方法および装置
使い捨てチップ内の細胞分離を実現する、本発明の細胞分離方法および装置を、図1を用いて詳細に説明する。図1（Ａ）は細胞が流れる主流路に側面で接続したセルソーティング流路100から圧力を加えた場合にその圧力が引き起こす流れを図示したものである。流路中の圧力より十分低い陰圧の場合は、流れが引き込まれる（ＰＵＬＬ状態）。流路中の圧力より十分高い場合は、流れが押し出される（ＰＵＳＨ状態）。主流路を目的の細胞が流れてソーティング流路を横切る瞬間に、ＰＵＬＬまたはＰＵＳＨの圧力を加えて目的の細胞のみを移動させることは不可能である。つまり、圧力によって特定の細胞のみを分離流路に分離する場合は、広範囲の液体に力が及ぶので、分離の空間分解能が悪くなる。

以上の問題を解決する手段として、図1（Ｂ）に示すように主流路の側面においてＰＵＳＨ用とＰＵＬＬ用のソーティング流路を対向させて配置し、通常は主流路とソーティング流路とには流れが存在しないが、分離すべき目的の細胞が対向した領域内を通過する時間のみに、ＰＵＳＨの圧力とＰＵＬＬの圧力を発生させる。この場合、ＰＵＳＨの流量とＰＵＬＬの流量をほぼ同じにして、ソーティング流路からの圧力が主流路の流体に影響する領域をソーティング流路幅にほぼ限定する。この方法を図2に示す。

図２において、フローセル内に形成した流路１に細胞を含む試料液が流れ、流路２に細胞を含まないシース液が流れ、合流することで細く絞られた状態で試料液が流れる。その試料が流れる流路の側面に2つの分岐流路4-1、4-2が対向して接続している。流路4-1がＰＵＬＬ用流路あって、流路4-2がＰＵＳＨ用流路である。流路4-1には、目的の細胞を蓄えるリザーバー5と電磁バルブ7-1とシリンダーポンプ8-1が接続している。シリンダーポンプ8-1は流路１より十分低い一定の圧力を保持している一方、ＰＵＳＨの流路には、電磁バルブ7-2とシリンダーポンプ8-2が接続している。シリンダーポンプ8-2は流路１より十分高い一定の圧力を保持している。試料液に含まれる細胞がレーザー照射領域３を通過するときに細胞から散乱光や蛍光が発生する。その光を光検出器で検出しその信号強度を定量化し、予め設定された必要な細胞の信号条件と比較される。その細胞が必要な細胞か否かが信号処理回路で判定され、必要な細胞である場合はその細胞が分岐流路を通過する時間にトリガー信号を発生し、そのトリガー信号によって電磁バルブ7-1と7-2を短時間のみＯＰＥＮ状態にする。ＯＰＥＮ状態の間は、主流路から分離流路4-1に取り込まれる流量と同じ流量を流路4-2から主流路に供給することで、流路4-1と流路4-2の間にソーティングの流れを限定し、細胞分離の空間分解能を流路4-1の幅より悪くなることを防止する。この方式では、パルス的な圧力を発生させる方法として、定圧ポンプと電磁バルブを接続することで、ソーティング力とソーティング発生時間幅を独立に制御する。定圧ポンプはエアロゾルを発生しないためバイオハザードとして適している。

図３は、PUSH&PULLによる流速が流路27の流速より遅く、ソーティングリザーバー5に取り込むことが出来ない場合において分離する方法である。図３a)は電磁バルブがＯＦＦの場合を示している。下流側には流路1,2と対称的に流路11、23、24を形成してある。層流における流体力学的な効果のために、シース液は流路23と24に分離し、試料液1は流路11に回収される。図３b)は電磁バルブがONの場合を示している。この場合には目的の細胞がソーティング流路4-1、4-2からの圧力で発生する流れで位置がわずかに流路4−1よりにシフトして流路27を流れる。下流側では、このシフトによって、流路23に目的の細胞が分離される。

必要に応じて、細胞や細菌が電磁バルブへ流れ込まないようにフィルターを設置することで、フローセルの外部から流路内に細菌や細胞の混入防止、フローセル外へのサンプルの散逸防止に役立つことができる。

次に、使い捨てチップ内の細胞分離を実現する実施形態を図４および図５を用いて説明する。

図４は、使い捨てチップ型フローセルに、シリンダーポンプと電磁バルブを接続した状態を示している。使い捨てチップは、以前の発明である特許文献１４に記載したものに、図2に示したソーティング用の流路4-1と流路4-2とそれぞれソーティングリザーバー5-1、5-2を対称的に追加した構造とする。使い捨てチップ型のフローセルは、透明な樹脂製である。樹脂の種類としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、シクロオレフィン・コポリマー（ＣＯＣ）、メチルペンテンポリマーなどが使用できる。特に、波長が350nmから410nm程度のUV波長領域のレーザーを照射光源として用いる場合は、フローセルの素材としてはメチルペンテンポリマーが適している。ソーティングリザーバーを流路4-2にも設置した対称構造として電磁バルブとシリンダーポンプを接続する。対称構造は、電磁バルブがＯＰＥＮしたときに同一時間に同一の圧力が流路27に対して加わるようにするためである。

図5にはさらに光学系と制御系回路との接続関係を示した。チップの断面図は図4のＢＢ断面である。図４に示したように、チップの上流側に空気圧を加えることで、シース液とともにサンプル液を流路27に流し、対向するソーティング流路4-1、4-2の領域よりやや上流の主流路の中央部にレーザー光５２を照射する。細胞がこの照射領域を通過した瞬間に散乱光と蛍光がパルス的に発生する。散乱光はダイクロイックミラー54とバンドパスフィルター57によって照射レーザー光と同じ波長を選択して検出器６１で検出する。検出器６１の前には遮光板60を設置して、レーザー透過光を除去する。蛍光は、ダイクロイックミラー５５、５６とバンドパスフィルター５８，５９によって照射レーザー光よりも長波長で複数の波長領域を分割してそれぞれ異なる検出器６２、６３で検出する。各検出パルス信号は、増幅してＡＤ変換する回路64によってデジタル化し、マイクロコンピューター６９によって、予め設定した分離条件を複数の検出信号が満たすか否かを判断し、満足する場合に電磁バルブドライバー６６にトリガー信号を一定遅延時間後に出力する。この遅延時間は、細胞がレーザー照射領域からソーティング流路4-1、4-2の領域に流れるまでの時間に調整する。トリガー信号を受信した電磁バルブドライバー６６は、電磁バルブ7-1,7-2に一定時間だけＯＰＥＮする信号を出力する。バルブがＯＰＥＮ状態の時間幅は、流路4-1と流路4-2の幅を等しくＷとして、細胞が流路27を流れる流速をＶとすると、Ｗ／Ｖ（秒）と設定するのが望ましい。電磁バルブＯＰＥＮ時に目的の細胞がソーティングリザーバー５に流れ込む。主流路とソーティング流路との間の流れは、バルブ7-1と7-2とがＣＬＯＳＥ状態では発生しないので、一旦ソーティングリザーバー5に取り込まれた細胞はその場に安定して保存される。

図４に示したようにチップの上流側のリザーバー20の内部には、図には記していないが定圧ポンプで一定の空気圧を加えるようにしてある。リザーバー20の内部には試料液リザーバー10がありその内側に試料液をいれ、その外側にシース液を入れる。シース液としてはphosphate buffer saline（ＰＢＳ）を用いるがのぞましい。共通の空気圧によって、試料液１と左右のシース液２が下流に向かって流れ、3本の流路が合流したあと流路27を試料液がシース液によって細く絞られた状態で流れる。流路27の幅は80μｍであり、深さは50μｍである。合流後の試料液の幅は流路幅の約1/10である。流路27には、側面から対向するソーティング流路4-1、4-2があり、その流路はリザーバー５に接続している。この対向領域よりも数100μｍだけ上流側の流路27の中央部に、波長488nmのレーザー光52を照射する。そのビームサイズは長さ50μｍ幅20μｍの長円としている。

細胞がこの照射領域を通過した瞬間に散乱光と蛍光がパルス的に発生する。散乱光はダイクロイックミラー54とバンドパスフィルター57によって照射レーザー光と同じ波長を選択して検出器６１で検出する。検出器６１の前には遮光板60を設置して、レーザー透過光を除去する。蛍光は、ダイクロイックミラー５５、５６とバンドパスフィルター５８，５９によって照射レーザー光よりも長波長で複数の波長領域を分割してそれぞれ異なる検出器６２、６３で検出する。各検出パルス信号は、増幅してＡＤ変換する回路64によってデジタル化し、マイクロコンピューター６９によって、予め設定した分離条件を複数の検出信号が満たすか否かを判断し、満足する場合に電磁バルブドライバー６６にトリガー信号を一定遅延時間後に出力する。この遅延時間は、細胞がレーザー照射領域からソーティング流路4-1、4-2の領域に流れるまでの時間と同じにする。トリガー信号を受信した電磁バルブドライバー６６は、電磁バルブ7-1,7-2に一定時間だけＯＰＥＮする信号を出力する。バルブがＯＰＥＮ状態の時間幅は、流路4-1と流路4-2の幅を等しくＷとして、細胞が流路27を流れる流速をＶとすると、Ｗ／Ｖ（秒）と設定するのが望ましい。電磁バルブＯＰＥＮ時に目的の細胞がソーティングリザーバー5-１に流れ込む。主流路とソーティング流路との間の流れは、バルブ7-1と7-2とがＣＬＯＳＥ状態では発生しないので、一旦ソーティングリザーバー5-1に取り込まれた細胞はその場に安定して保存される。また、図4に示したフローセルは、下流側に分離流路11,23,24を形成してあるので、目的の細胞がソーティング流路4−1と4−2による圧力によって、ソーティングリザーバー5−1に取り込まれるほどの移動量がなかった場合は、下流側で流路23へ分離される。したがって、図４に示したフローセルは、流路27の流速が早い場合は流路23へ分離し、流速が遅い場合はソーティングリザーバー5−1に分離するという流速に対して2段階のマージンの広い分離を実現する構造となっている。

２）使い捨てチップの多検体対応における側方散乱検出における課題を解決する手段としての本発明の細胞分離方法および装置
次に、使い捨てチップ型マルチ流路フローセルを用いるフローサイトメーターの実施例を図6と図7を用いて説明する。多数の検体をコンタミフリーおよびキャリーオーバーゼロという条件で計測するために、図6に記したように、1個のチップに8本の試料流路を形成し、それぞれに接続した試料液シザーバー３１が接続している。リザーバー30の中で混合しないように間仕切りされた8個の部屋３７はシース液リザーバーとなっている。試料液リザーバーは各部屋に一個ずつ設置されている。シース液リザーバーがシース液流路に接続するポートは各部屋は2個ずつ存在する。シース液と試料液の流れは、各部屋に順次空気圧を加えることで、各部屋に接続する試料液とシース液の流れを制御、測定を行う試料液が入っている部屋のみ加圧することで、試料液やシース液の無駄な流れによる消費を無くす。流路断面は、図4の流路断面と同じサイズである。測定時の圧力は10kPaから20kPaまでの間の値に設定し、測定時以外の圧力は下流部と同じ大気圧とする。各部屋の内部では共通の空気圧がシース液と試料液に加わり下流側へ押し出す。シース液はシース液ポート32から基板内流路と接続し、試料液流路と左右から合流して下流側に流れる。図７はこのチップの断面図と測定光学系を示したものである。測定光学系のうちレンズ51を利用する検出光学系は、図5とほぼ同じであるが流路を画像観察する光学系を追加している。それは、1%反射ミラーと結像用レンズ81とカメラ82である。レーザーを含む照射光学系と検出光学系は固定であり、チップを搭載した自動ステージが移動することで8流路の測定を行う方式をとる。 8本の流路のチップでは、射出成形により製造するため製造上の流路間の制限から8本分の移動距離を5mmとした。ステージの移動は、一番端のＮｏ１の流路にレーザーの照射位置を画像認識で位置合わせを行う。その次に、Ｎｏ１の流路が接続している上流のリザーバーを一定圧力で加圧してＮｏ１流路のみに試料液を流して計測を開始する。Ｎｏ1の流路の計測が終了したら、Ｎｏ１に接続している上流のリザーバーへの加圧をゼロとして大気圧にする。次にステージ移動を行いＮｏ２の流路にレーザー照射位置を合わせ、Ｎｏ２の流路に接続しているリザーバーに加圧して、計測を開始する。これをＮｏ８の流路まで順次繰り返す。測定中の側方散乱光は、平面基板の端面を約45度の斜面で下に反射し、下側に設置した透明樹脂で形成した導光ブロック45に入射させ、導光ブロックに接続した光ファイバーを経由してバンドパスフィルター43により照射レーザー光と同じ波長の光のみを光検出器44で検出する。両端の導光ブロックで集光して検出した側方散乱信号は合算して計測する。図７は両端の測定散乱光は2個の検出器で検出し信号にしてから和を計測する方法となっている。これに対して両端の導光ブロックに接続している光ファイバーを1個の検出器に接合させて計測してもよい。導光ブロック45の幅は、8本の流路のチップでは、8本分の移動距離より大きくする必要があるため10ｍｍとした。以上によって、使い捨てチップ型の8流路チップで、1チップで8検体を前方散乱と側方散乱と複数の蛍光信号検出を連続して計測する装置を実現した。

図6に示すように、一つの透明な平面基板に複数の流路が形成され、上流側リザーバー30と下流側のリザーバー３４に接続している。リザーバーは各流路間でサンプル液が混合しないように、リザーバーは流路ごとに仕切られた構造となっている。図７はこのチップの断面図と測定光学系を示したものである。測定光学系のうちレンズ51を利用する検出光学系は、図5とほぼ同じであるが流路を画像観察する光学系を追加している。それは、1%反射ミラーと結像用レンズ81とカメラ82である。これで、流路とレーザー照射位置関係を画像認識により把握してステージ移動にフィードバックすることにより、レーザー位置と流路との位置調整を自動的に行うことができる。レーザー光と検出光学系は固定であり、チップを自動ステージ上でステップアンドリピート走査により各流路の中心領域を順次照射する。側方散乱光は、平面基板の端面を約45度の斜面で下に反射し、下側に設置した透明樹脂で形成した導光ブロック45に入射させ、導光ブロックに接続した光ファイバーを経由してバンドパスフィルター43により照射レーザー光と同じ波長の光のみを透過させて光検出器４４で検出する。

図８a)は複数の流路のうち左端の流路中心にレーザー光が照射される場合のチップと両端の導光ブロックとの位置関係を示したものである。図８ｂ)は複数の流路のうち右端の流路中心にレーザー光が照射される場合のチップと両端の導光ブロックとの位置関係を示したものである。どちらの場合も、両端で反射された側方散乱光は導光ブロックに入射するように、導光ブロックの走査方向の幅は、走査範囲の距離より大きい値とする。さらに、両端の導光ブロックで集光して検出した側方散乱信号を足し算することで、検出される側方散乱光の検出感度の各流路依存性を低減する。和をとる方法としては、両端の導光ブロックに接続している光ファイバーを直接一つの検出器に接合させても良い。

３）測定試料液に含まれる正確な粒子濃度を計測する手段としての本発明の細胞分離方法および装置
次に、正確な溶液中粒子濃度計測方法の実施例を図6と図9とを用いて説明する。正確な濃度測定のために、試料液リザーバーに投入した試料液量を全て計測し、カウントした細胞を液量で割ればよい。そこで試料液全量を気泡を含んで測定し、測定後に気泡をデータから除去することで正確な細胞濃度を計測する方法をとる。図6の試料液リザーバー31の容量は100μLである。そこで、細胞を含む試料液50μLを試料液リザーバー31に入れて、測定時間として6分間とし、流量を10μL/minと設定する。すると、試料液は約5分でなくなり、約1分間は気泡を含んだ計測となる。図9a)はＭＣＦ−７という乳がん由来の細胞を測定したものであるが、試料液全体を測定したために気泡を含んでいる。気泡は試料液がなくなると、試料リザーバーから押された空気は流路ないで気泡となって測定領域を通過して、カウント数を増大させる。細胞よりも大きな分布（前方散乱信号ＦＳが大きい）が試料液がなくなると図9a)のＡ分布が発生する。
測定後、測定データから検出時刻の後のデータを削除すると、細胞の分布や細胞以外の異物を残したままでＡ分布を除去できることがわかる。これはＡ分布が測定の後半で試料液がなくなった時点以降に発生した気泡に由来する分布であるからである。さらにＡ分布一緒に除去される分布は気泡由来の分布であると判断することができる。

使い捨てチップでは、流路は試料液リザーバーの下側に接続している。試料液リザーバーに100マイクロリットルを入れて、その試料液を全部計測し、粒子の計数が10000個であったとすると、粒子の濃度は100000個/ミリリットルと導出することができるはずである。しかし、これは従来方法では不可能である。すなわち、試料液がなくなると直後から粒子とは異なる分布を示す気泡が高頻度で発生し、この気泡の分布が粒子の計数の障害となる。通常のフローサイトメーターでは、試料液容器に上から試料液を吸い上げる方式が普通なので、試料液全量を計測することは行わないし、行えない。そこで、使い捨てチップで正確な濃度を計測するために、気泡の影響をうけない試料液全量計測方法を以下に記述する。気泡は試料液が無くなった直後以降に発生するので、計測したデータから検出時間が最後のデータから時間的にさかのぼって除去することで、気泡の分布を除去した粒子のみのデータを得ることができる。本発明者による発明である特許文献１４に記載したチップで試料液全体を計測して得た、気泡の分布を含んでいるデータを図9a)に示した。横軸は前方散乱であり、縦軸は蛍光信号強度である。図9b)は、全データから検出時間が後の部分を除去したデータである。前方散乱光強度が大きな分布が除去されることがわかる。この気泡由来の分布の一つに注目し、その分布がなくなるまで検出の最後からデータを除去すれば気泡を除去することができるということである。これによって試料液全体を測定することが可能となり正確な粒子濃度を求めることができる。

４）フローサイトメーターの多次元データ解析方法およびその表示方法と装置
図10(A)は2種類の蛍光検出信号ＦＬ１、ＦＬ２の波長領域と、2種類の蛍光分子Ａ，Ｂのスペクトルを示している。ＦＬ１とＦＬ２の蛍光信号によって、細胞をＡとＢの2種類の蛍光分子で蛍光染色した場合に、細胞内のＡ分子とＢ分子の存在比を求める方法を説明する。蛍光検出信号ＦＬ１とＦＬ２との間には、蛍光スペクトルの形状によって規定される関係が存在する。それは比率が一定という関係である。例えば、蛍光スペクトルＡのＦＬ１の検出波長領域の面積をＡ１とし、ＦＬ２の検出波長領域の面積をＡ２とすると、ＦＬ１とＦＬ２との検出信号強度比は、Ａ１／Ａ２となる。つまり数式で表現すると以下のようになる。

FL1/FL2 = A1/A2 （１）
対数グラフ用に変形すると、

Log FL1 = Log FL2 + Log (A1/A2) （２）
同様に、蛍光スペクトルＢの場合のＦＬ１／ＦＬ２は信号強度比はＢ１／Ｂ２となる。つまり、
FL1/FL2 = B1/B2 （３）
対数グラフ用に変形すると

Log FL1 = Log FL2 + Log (B1/B2) （４）
したがって、蛍光分子Ａで蛍光染色した細胞を計測した場合のＦＬ１とＦＬ２の対数軸の散布図は、図10（Ｂ）の黒丸で示したライン分布になる。同様に蛍光分子Ｂで蛍光染色した細胞の場合は、白丸で示したライン分布になる。このように散布図では、異なる蛍光スペクトルの粒子は、縦軸の切片の値が異なる直線上に分布する。次に、蛍光分子Ａと蛍光分子Ｂの両方が存在する場合を考える。それぞれの数をxとｙとすると、信号強度FL1とFL2は次の式５と式6で表される。

FL1 = A1 x + B1 y （５）
FL2 = A2 x + B2 y （６）
式5と式6より、次の式が得られる。

Log FL1 = Log FL2 + Log [(A1 x + B1 y)/(A2 x + B2 y)] （７）
この式は、図11(A)に示すように式２と式４の表す2つの直線の間に存在する直線を示し、xとyの比率によって位置が変化する。
式5と式6との比をとって変形すると、x/yをFL1/FL2から求める以下の式が得られる。

x/y = [(B1/B2) - (FL1/FL2)] / [(FL1/FL2) - (A1/A2)] (B2/A2) （８）
式8の右辺の第1項は、 B1/B2は100%Bで染色したサンプルデータで求められる定数、A1/A2は100％Aで染色したサンプルデータから得られる定数、FL1/FL2はサンプルの測定データである。第2項は、同じ分子数でＡとＢとで別々に染色したサンプルのＦＬ２の比率で得られる定数である。したがって、検出した細胞個々について、x/yの値を求めることが出来る。図11(B)に示す様に、縦軸をFL1/FL2の対数スケールとして表示すると、この軸の値が、x/yに依存した分布となる。図11(B)の横軸としては細胞サイズを示す前方散乱信号強度(FS)を採用することで、x/y情報と細胞サイズ情報を同時に表示する事ができる。横軸はFS以外の信号を取ることもできる。本発明では、このFL1/FL2のように解析の重要な量となるものを解析の指数(インデックス)として、グラフの軸として表示することで、多次元情報を1次元にまとめて表示することと、この指数に対して閾値を設定することで定量的な判定を行うことを実現するものである。

次に、上記のデータ解析の実施例を説明する。生体膜を透過する核染色剤ＳＹＴＯ９と、生体膜を透過しない核染色剤ＰＩとの2種類の核染色剤を用いて生死判定解析する場合の従来の解析方法を図１２に示している。これに対して本発明では生死判定用に指数を定義して、生死判定を、その指数で設定した閾値をもとに自動判定する。この方法を図12と図１３を用いて説明する。ＦＬ１の波長領域は約500nmから550nmまでであって、FL2の波長領域は570nmから610nmまでである。従来のＬＩＶＥ＆ＤＥＡＤ解析は、図12の分布に示すようにＬＩＶＥ分布（SYTO9のみで染色された分布）と、ＤＥＡＤ分布（SYTO9とPIの両方で染色された分布）とを区別する。この区別方法は人間の画像認識に依存している。そこで、本発明ではＬＩＶＥとＤＥＡＤの自動判定のためには定量的な指数を作り、その指数において判定の閾値を設定してＬＩＶＥとＤＥＡＤを区別する方法とする。具体的には、細胞のＬＩＶＥ＆ＤＥＡＤ解析をするためには細胞膜を透過する核染色剤であるＳＹＴＯ９と透過しない核染色剤であるＰＩの2種類で以下のプロトコールで染色を行う。ＰＢＳ1mLに3.34 mMのSYTO 9を1.5μLと30mMのPIを1.5μLを加えた染色溶液を準備し、その溶液から2μLを試料液200μLに加えて、20分間暗黒中で染色反応を行う。

この処理でMCF-7という細胞を染色して測定した結果が図12である。この散布図において、ＬＩＶＥ分布はＳＹＴＯ９のみで染色された細胞の分布であり一つのライン状分布を示す。一方、ＤＥＡＤ分布は細胞膜の破壊によってＰＩでも染色されるため2重染色状態となっている。この分布ではSYTO9染色量とPI染色量との比率はほぼ一定である。このためＤＥＡＤ分布の位置は、ＬＩＶＥ分布の位置より下の方にずれた直線分布となる。

次に式９に示すようにFL1/FL2を考えると、その値の対数は直線の縦軸の切片を意味する。そこで、FL1/FL2の対数はLIVE分布の値とDEAD分布の値とを比較するとLIVE分布の値の方が大きくなる。図13は、上記の方法で緑膿菌に対する抗菌剤の効果を調べたグラフである。抗菌剤混入させて一定時間後に、SYTO9とPIで20分間染色して、FL1/FL2を測定したヒストグラム分布である。抗菌剤を混入しない場合は単一ピークの分布を示すが、抗菌剤を混入すると、値が小さい分布が生じて、抗菌剤の濃度が高くすると、値の小さい分布の割合が大きくなる結果が得られた。図13の破線で示した値に生死判定の閾値は、前もって100%生菌と100%死菌と別々に測定して得た分布の境界で設定した値であり、この閾値を基準として自動的に生死判定が可能となる。したがって、FL1/FL2は生死自動判定の指数として有効であることが分かる。上記の内容を式で説明すると次のようになる。式９に示すようにFL1/FL2を考え、式10に変形するとわかるようにその値の対数は図12のグラフの直線の縦軸の切片を意味する。そこで、FL1/FL2はＬＩＶＥからＤＥＡＤに変化するにつれて値が小さくなると予想されるので、生死解析の指数として都合が良い。

FL1/FL2 = Δ （９）
Log FL1 = Log FL2 + Log Δ （１０）
これまでの生死解析として用いられる図12の散布図に対して、同一測定結果を本発明の生死判定指数を用いた散布図で示したのが図14である。縦軸をFL1/FL2とし、さらに横軸を細胞サイズを示す前方散乱強度信号であるFSとすることで、細胞の生死情報と細胞サイズ情報を1個の2次元散布図での表現を実現した。この図14の散布図は、測定サンプルであるMCF-7細胞について、死んだ細胞は生きている細胞よりサイズが小さいという結果を表している。

上記の様に、フローサイトメーターの多次元データの表示方法として、測定目的によって信号強度間の演算式で定義した指数を、グラフ表示の軸として採用することで、2次元散布図で表現する情報量を増やすことができる。図15は、細胞の2種類の表面マーカーを一方はFITC蛍光標識抗体で染色し、他方はPE蛍光標識抗体で染色したサンプルの測定データにおいて、縦軸としてPE/(FITC+PE)を、横軸としてFSを採用した表示例である。ここでPEやFITCは蛍光補正後の蛍光量であって、それぞれの蛍光分子数に比例する量である。この指数は、2種類の表面マーカーの発現比率を示す量として定義したものであり、図15は2種類の表面マーカーの発現比率の細胞サイズ依存性を一つのグラフで示す表示例である。この指数の値によって細胞個々の発現比率についての過不足を細胞個々について解析することができる。また、検出した細胞が一個の細胞かまたは複数凝集した細胞であるかを評価するための指数として、(信号パルス面積)/(信号パルス時間幅)などを定義することができる。白血球などの浮遊系の細胞は単一細胞の状態で流れるが、血液中のがん細胞などは単一のままで血液中を循環しているとは限らない。このような評価では、凝集か非凝集かにかかわらずに、細胞数を評価する必要がある。この指数はこの凝集や非凝集かの解析に役に立つ指数である。
以上のように、複数の信号間の演算により解析内容に都合のよい指数を定義し、その指数の値で細胞個々の特性を定量的に評価することはメリットが多い。そのメリットとしては多次元情報を一つの指数としてまとめることで、一つの2次元散布図で3種類以上の信号による情報を表現可能であることや、その指数に対して前もって判定閾値を設定することで細胞個々についての定量的な判定を実現する。この方法は定量的な医療診断に有効である。

本発明は、キャリーオーバーやクロスコンタミネーションが無い、１）セルソーター、２）側方散乱光検出が可能なフローサイトメーター、３）正確な細胞密度計測装置、４）蛍光補正が不要な多重染色解析装置、およびこれらを用いた細胞分離・解析方法等として有用である。

１…試料液流路
２…シース液流路
３…照射光
４−１…ソーティング流路（ＰＵＬＬ側）
４−２…ソーティング流路（ＰＵＳＨ側）
５…ソーティングリザーバー
６…フィルター７−１、７−２…電磁バルブ
８−１…負圧定圧ポンプ
８−２…陽圧定圧ポンプ
９−１…分離対象である細胞
９−２…分離非対象の細胞
１０…試料液リザーバー
１１…回収試料液リザーバー
２０…シース液リザーバー
２２…シース液用ポート
２３…シース液回収ポート
２４…シース液回収ポート
２５…チップ用基板
２７…流路
３１…試料液リザーバー
３２ …シース液用ポート
３４…廃液リザーバー
３５ …回収試料液リザーバー
３６ …試料液
３７…シース液リザーバー
３９−１、３９−２…側方散乱検出用反射面
４０…レーザービーム走査領域
４１…流路
５０…レーザー光源
５１ …対物レンズ
５２…レーザー光
５３…ソーティング流路4−1と4−2で挟まれた領域
５４，５５，５６…ダイクロイックミラー
５７，５８，５９…バンドパスフィルター
６０…透過レーザー光遮断用空間フィルター
６１…フォトダイオード
６２，６３…光電子増倍管
６４…ＡＤ変換器
６９…ＡＤ変換器
７０…キーボード
７１…ディスプレイ

Claims (5)

1. 平板基板内に流路を形成してなるフローセルと、
   前記流路を流れる試料液中の微粒子に光を照射する光照射手段と、
   前記光を照射した際に前記微粒子から発生する散乱光または蛍光を検出し、それらの信号強度に基づいて前記微粒子を識別し、目的の微粒子を検出する検出手段と、
   前記フローセルの前記流路を流れる前記微粒子に対して側面からパルス流を与えるための、前記流路の側面に接続する1対の対向する分岐流路と、
   前記１対の対向する分岐流路の一方から他方にパルス流の流れを発生させる手段であって、分岐流路に電磁バルブを介して接続する手段と、
   パルス流を取り込む側の分岐流路に前記微粒子を蓄える手段と、
   前記検出手段からの信号に基づいて前記電磁バルブの動作を制御する制御部と、を備える微粒子分離装置であって、
   前記フローセルは、
   前記試料液の導入用流路とその両側に配置した１対のシース液導入用流路と、
   前記試料液の導入用流路に前記１対のシース液導入用流路が合流してなる合流流路であって、該合流流路内で前記試料液を挟んで両側にシース液が流れる、合流流路と、
   前記合流流路上にある光照射領域と、
   前記光照射領域より下流で前記合流流路に接続する1対の対向する分岐流路とを備え、
   前記検出手段は、前記微粒子が前記光照射領域を通過したときに発生する光信号を検出し、
   前記制御部は、前記検出手段からの前記光信号に基づいて、前記微粒子が分離すべき目的の微粒子か否かを判断し、分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が前記１対の対向する分岐流路が接続する前記合流流路の領域を通過する時間のみに、前記２つの分岐流路間でパルス流を発生させることによって、前記目的の微粒子を
   パルス流を取り込む側の分岐流路に接続するリザーバーに回収することを特徴とする、微粒子分離装置。
2. 平板基板内に流路を形成してなるフローセルと、
   前記流路を流れる試料液中の微粒子に光を照射する光照射手段と、
   前記光を照射した際に前記微粒子から発生する散乱光または蛍光を検出し、それらの信号強度に基づいて前記微粒子を識別し、目的の微粒子を検出する検出手段と、
   前記フローセルの前記流路を流れる前記試料液中の前記微粒子に圧力パルスを与える定圧ポンプおよびそれに接続された電磁バルブと、
   前記検出手段からの信号に基づいて前記電磁バルブの動作を制御する制御部と、を備える微粒子分離装置であって、
   前記フローセルは、
   前記試料液の導入用流路とその両側に配置した１対のシース液導入用流路と、
   前記試料液の導入用流路に前記１対のシース液導入用流路が合流してなる合流流路であって、該合流流路内で前記試料液を挟んで両側にシース液が流れる、合流流路と、
   前記合流流路上にある光照射領域と、
   前記光照射領域より下流で前記合流流路に接続する1対の対向する分岐流路とを備え、
   前記１対の対向する分岐流路の一方には通常閉状態の第一の電磁バルブと負圧の定圧ポンプが接続しており、
   前記１対の対向する分岐流路の他方には通常閉状態の第二の電磁バルブと陽圧の定圧ポンプが接続しており、
   前記検出手段は、前記微粒子が前記光照射領域を通過したときに発生する光信号を検出し、
   前記制御部は、前記検出手段からの前記光信号に基づいて、前記微粒子が分離すべき目的の微粒子か否かを判断し、分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が前記１対の対向する分岐流路が接続する前記合流流路の領域を通過中に、前記第一および第二の電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号を与えることにより、前記対向する１対の分岐流路から前記領域を通過中の前記目的の微粒子に対してプッシュ（PUSH）およびプル（PULL）の圧力を与え、それによって前記目的の微粒子の流れを変化させることによって前記目的の微粒子を分離することを特徴とする、微粒子分離装置。
3. 請求項２に記載の微粒子分離装置であって、
   前記制御部は、前記微粒子が分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が前記一対の対向する前記分岐流路が接続する前記合流流路の領域を通過中に、前記電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号を与え、
   それによって、前記対向する分岐流路間の前記合流流路の前記領域中に存在する前記目的の微粒子に対してプッシュおよびプルの圧力を与え、前記目的の微粒子の流れを変化させて、プル側の前記分岐流路に前記目的の微粒子を取り込むことで前記目的の微粒子を分離することを特徴とする、微粒子分離装置。
4. 請求項２に記載の微粒子分離装置であって、
   前記フローセルがさらに、前記１対の対向する分岐流路が接続する前記合流流路の領域よりも下流に前記合流流路から分岐する１対の追加的分岐流路を備え、
   前記制御部は、前記微粒子が分離すべき目的の微粒子であると判断される場合は、その微粒子が最初の前記一対の分岐流路が対向する前記最初の分岐流路が接続する前記合流流路の前記領域を通過中に、前記電磁バルブに短時間のみ開状態とする信号を与え、
   それによって、前記対向する前記最初の分岐流路間の前記合流流路の前記領域中に存在する前記目的の微粒子に対してプッシュおよびプルの圧力を与え、前記目的の微粒子の流れを変化させて、下流の前記追加的分岐流路に前記目的の微粒子を分離することを特徴とする、微粒子分離装置。
5. 試料液を流路に流した状態で試料液に含まれる微粒子を分離するための平板状のフローセル装置であって、
   前記フローセルは透明基板中に流路が形成されてその流路の上流側と下流側の基板上部にそれぞれ前記流路と流体接続する（fluidly connected）リザーバーが形成されている構造であって、
   前記透明基板上に形成された、
   前記試料液の導入用流路とその両側に配置した１対のシース液導入用流路と、
   前記試料液の導入用流路とその両側に配置された前記１対のシース液導入流路とが合流してなる合流流路であって、前記試料液を挟んで両側に前記シース液が流れる、合流流路と、前記合流流路の側面に接続する対向する一対の分岐流路と、
   を備え、前記１対の分岐流路は外部ポンプと気密接続可能なポートを備え、そして少なくとも１つの分岐流路が微粒子を蓄える手段を有していることを特徴とするフローセル装置。