JP5800327B2 - 脱共役タンパク質発現誘導剤 - Google Patents

Description

本発明は、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有する脱共役タ
ンパク質発現誘導剤に関する。

従来、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体から得られる抽出物には、脂肪細胞をアポトーシスによる消失に誘導させる作用やピロリ菌に対する抗菌作用があることが知られている（特許文献１及び特許文献２参照）。

特開２００７−２１０９１７号公報 特開２００７−２１７３８４号公報

本発明は、本研究者らによる鋭意研究の結果、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物が、脱共役タンパク質発現誘導作用を発揮することを新たに見出したことに基づいてなされたものである。本発明の目的は、脱共役タンパク質発現誘導剤を提供することにある。

上記の目的を達成するために請求項１に記載の脱共役タンパク質発現誘導剤は、脱共役タンパク質２の発現を促進する脱共役タンパク質２発現誘導剤、又は脱共役タンパク質３の発現を促進する脱共役タンパク質３発現誘導剤として用いられる脱共役タンパク質発現誘導剤において、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、カロテノイドを含有する黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の脱共役タンパク質発現誘導剤によれば、脱共役タンパク質の発現を効果的に誘導することができる。

マウスの各組織におけるＵＣＰ２の発現量を示すグラフ。 マウスの各組織におけるＵＣＰ３の発現量を示すグラフ。

［第１実施形態］
以下、本発明の脱共役タンパク質発現誘導剤について説明する。
まず、脱共役タンパク質（以下、「ＵＣＰ」と記載する。）について説明する。ＵＣＰ
は、脂肪組織、骨格筋、肝臓、脳、精巣等の細胞のミトコンドリアに存在する膜タンパク質であり、生体内の酸化的リン酸化において電子伝達で得られたエネルギーがＡＴＰ合成反応に共役することを阻害するとともに、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーを熱エネルギーに変換するプロトンチャンネルタンパク質として機能する。また、ＵＣＰにはＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、ＵＣＰ４、ＵＣＰ５等の複数のサブタイプが存在することが知られている。たとえば、ＵＣＰ２は主に白色脂肪において発現し、ＵＣＰ３は主に骨格筋において発現することが知られている。

上述したＵＣＰの性質から、ＵＣＰの発現量を増加させる、又はＵＣＰを活性化させることができれば、ＡＴＰ合成に共役される化学エネルギーの熱エネルギーへの変換効率が向上して生体のエネルギー代謝が亢進されると考えられる。さらに、こうした作用によって生体の適正体温への調整も可能となると考えられる。しかしながら、これまでにＵＣＰを制御する薬剤はほとんど知られておらず、その開発が求められている。

第１実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤は、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）オオヒゲマワリ目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）のデュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を含有する。

緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体としては、例えばデュナリエラ・サリーナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）、及びデュナリエラ・バーダウィル（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｂａｒｄａｗｉｌ）が挙げられる。緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体は、通常の生育条件では、光合成色素（クロロフィルａ，ｂ）を体内に蓄積するため、外観が緑色を呈するが、生育条件によっては、外観が黄橙色を呈することが知られている。本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤は、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体のうち、外観が黄橙色を呈する藻体が用いられる。なお、上記外観が黄橙色を呈する藻体は、特定の条件（例えば、高塩濃度）で生育することで、β−カロテン等のカロテノイドを生合成するとともに同カロテノイドを細胞内に蓄積して黄橙色を呈する。以下では、「緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、カロテノイドを蓄積して黄橙色を呈する藻体」について、「上記微細藻の藻体」と記載する。

上記微細藻の藻体は、天然に自生する藻体であってもよいし、人工的に培養した藻体であってもよい。なお、安定供給が可能である点や品質保持が容易である点から、人工的に培養した藻体を用いることが工業的に好適である。人工培養により上記微細藻の藻体を得る方法としては、公知の方法、例えば上記特許文献１に開示される方法が挙げられる。具体的には、上記微細藻の藻体の細胞を培地に摂取し、好気的条件下（炭酸ガス０〜１０％供給）、蛍光灯や太陽光等を光源として照度を３０００〜１５００００ｌｕｘに設定し、連続光照射（２４時間明）から、８時間（明）／１６時間（暗）にて培養を行なうことにより、上記微細藻の藻体を得ることができる。なお、培養温度は１５〜４０℃とすることが好ましく、２５〜３５℃とすることがより好ましい。

本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤は、上記微細藻の藻体を配合したものであってもよいし、上記微細藻の藻体を抽出原料とする抽出物を配合したものであってもよい。上記微細藻の藻体を配合する場合には、同藻体は、採取したままの状態、採取後に破砕処理した状態、採取後に乾燥処理した状態、並びに採取後に破砕処理及び乾燥処理した状態のいずれの状態で配合してもよい。

次に上記微細藻の藻体を抽出原料とする抽出物について説明する。抽出原料となる上記微細藻の藻体は、採取したままの状態、採取後に破砕処理した状態、採取後に乾燥処理し
た状態、又は採取後に破砕処理及び乾燥処理した状態として、抽出操作を行なうことができる。なお、抽出操作の効率化の観点から、上記微細藻の藻体を破砕したものを抽出原料として用いることが好ましい。

抽出操作に用いる抽出溶媒としては、水及び親水性有機溶媒のうちの少なくとも一種を用いることができる。水を用いる場合、温水抽出、熱水抽出、蒸気抽出のいずれの方法を用いても良い。なお、抽出溶媒として水を用いる場合の抽出温度は０〜３０℃であることが好ましく、０〜１５℃であることがより好ましい。また、抽出時間は１０〜１２０分間であることが好ましく、２０〜４０分間であることがより好ましい。

親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等の低級アルコール類、アセトン、及び酢酸エチルが挙げられる。また、抽出溶媒は、水及び各種親水性有機溶媒のうちの単独種を用いてもよいし、複数種を混合した混合溶媒を用いてもよい。なお、抽出溶媒中に、水及び親水性有機溶媒以外の溶媒が少量含有されていてもよいし、その他の添加剤、例えば、有機塩、無機塩、緩衝剤、及び乳化剤等が溶解されていてもよい。

抽出操作としては、抽出溶媒中に抽出原料を所定時間浸漬させる。その際、抽出溶媒中における抽出原料の濃度は特に限定されないが、５〜５０質量％とすることが好ましく、５〜１５質量％とすることがより好ましい。抽出原料の濃度を５％未満とした場合には、得られた抽出液中の有効成分濃度が低くなり、濃縮処理や有効成分の回収処理が煩雑となる。一方、抽出原料の濃度が５０％を超える場合には、有効成分の回収率が低くなるおそれがある。こうした抽出操作においては、抽出効率を高めるべく、必要に応じて攪拌処理、加圧処理、及び超音波処理等の処理をさらに行ってもよい。また、抽出操作は同一の抽出原料に対して一回のみ行なってもよいし、複数回繰り返して行なってもよい。

そして、抽出操作の後に固液分離操作が行われることで、抽出液と抽出原料の残渣とを分離する。固液分離処理の方法としては、例えば、ろ過や遠心分離等の公知の分離法を利用することができる。なお、固液分離処理して得られた抽出液を、そのままの状態で上記抽出物として用いてもよいし、さらに濃縮・乾固処理して得られる処理物を上記抽出物として用いてもよい。

以上のようにして得られた上記微細藻の藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有する脱共役タンパク質発現誘導剤は、生体に投与することにより、生体内におけるＵＣＰの発現量を増加させる。上で述べたとおり、ＵＣＰには複数のサブタイプが存在するが、本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤はいずれのＵＣＰの発現誘導にも有効であり、特に白色脂肪におけるＵＣＰ２の発現量、及び骨格筋におけるＵＣＰ３の発現量を効果的に増加させる。また、ＵＣＰの発現量を増加させることにより、生体のエネルギー代謝が亢進されて、生体の体温上昇作用（温まり感）や手足等の冷えの改善作用を得ることができる。

本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤は、ＵＣＰの発現誘導作用、体温上昇作用、及び冷えの改善作用の発揮を目的とする製品に適用して使用することができる。脱共役タンパク質発現誘導剤含有製品としては、例えば、のど飴、のどスプレー等の医薬用部外品及び医薬品等の医療用剤や、健康飲料、健康食品等の飲食品が挙げられる。

本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤を医薬品や医薬部外品に適用して使用する場合には、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与、粘膜投与等のあらゆる投与方法、皮膚や物品等へ塗布する方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤、塗布剤等が挙げられる。また、本発明の目的を損なわない範囲にお
いて、添加剤としての賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。

本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤を飲食品に適用して使用する場合には、種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって、例えば、粉末状、錠剤状、顆粒状、液状（ドリンク剤等）、カプセル状、シロップ、キャンディー等の形状に加工して健康食品製剤、栄養補助食品等として使用することができる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、基材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤等を適宜添加してもよい。

次に本実施形態における作用効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤は、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有している。これにより、生体内におけるＵＣＰの発現量、特に白色脂肪におけるＵＣＰ２の発現量、及び骨格筋におけるＵＣＰ３の発現量を増加させることができる。

（２）また、ＵＣＰの発現量が増加することにより、生体のエネルギー代謝が亢進されて生体の体温を上昇させることができる。そのため、本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤は、体温上昇剤や冷え改善剤としても用いることができる。

（３）本実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤に含有される、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体の抽出物は天然成分であるため、副作用が少なく、生体に対してより安全に適用することができる。それにより、医薬品、飲食品に容易に適用することができる。

［第２実施形態］
以下、本発明の冷え改善剤について説明する。
第２実施形態の冷え改善剤は、緑藻綱（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）オオヒゲマワリ目（Ｖｏｌｖｏｃａｌｅｓ）のデュナリエラ属（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を含有する。第２実施形態の冷え改善剤に含有される上記微細藻の藻体、及び該藻体から得られる抽出物は、第１実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤に含有されるものと同様であるため、ここでは記載を省略する。

上記微細藻の藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有する冷え改善剤は、生体に投与することにより、身体の冷え、特に手足の冷えを改善する。本実施形態の冷え改善剤は、冷えの改善作用の発揮を目的とする製品に適用して使用することができる。冷え改善剤含有製品としては、例えば、のど飴、のどスプレー等の医薬用部外品及び医薬品等の医療用剤や、健康飲料、健康食品等の飲食品が挙げられる。

本実施形態の冷え改善剤を医薬品や医薬部外品に適用して使用する場合には、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与、粘膜投与等のあらゆる投与方法、皮膚や物品等へ塗布する方法を採用することが可能である。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤、塗布剤等が挙げられる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、添加剤としての賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。

本実施形態の冷え改善剤を飲食品に適用して使用する場合には、種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって、例えば、粉末状、錠剤状、顆粒状、液状（ドリンク剤等）、カプセル状、シロップ、キャンディー等の形状に加工して健康食品製剤、栄養補助食品等として使用することができる。また、本発明の目的を損なわない範囲において、基
材、賦形剤、添加剤、副素材、増量剤等を適宜添加してもよい。

次に本実施形態における作用効果について、以下に記載する。
（４）本実施形態の冷え改善剤は、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有している。これにより、身体の冷え、特に手足の冷えを効果的に改善することができる。

（５）本実施形態の冷え改善剤に含有される、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体の抽出物は天然成分であるため、副作用が少なく、生体に対してより安全に適用することができる。それにより、医薬品や飲食品に容易に適用することができる。

なお、上記各実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・ 第１実施形態の脱共役タンパク質発現誘導剤、及び第２実施形態の冷え改善剤を、例えば馬、牛、鳥等のヒト以外の動物に使用してもよい。

次に、各試験例を挙げて上記実施形態をさらに具体的に説明する。
［緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体の培養］
本試験では、緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体として、デュナリエラ・サリーナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）を用いた。

新鮮なろ過海水９９９ｍｌに対して、ＮａＣｌ（８７ｇ）、ＫＮＯ_３（７６ｍｇ）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（８．７ｍｇ）及びＮａＨＣＯ_３（４．２ｇ）を添加した溶液に、微量元素混合水溶液（２００ｍｇ／ｌ ＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１００ｍｇ／ｌ ＺｎＣｌ_２、２００ｍｇ／ｌ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、６００ｍｇ／ｌ ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、４００ｍｇ／ｌ ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１．２ｇ／ｌ （ＮＨ_４）６Ｍｏ_７Ｏ_２４・４Ｈ_２Ｏ、２．２ｇ／ｌ ＥＤＴＡ２Ｎａ・２Ｈ_２Ｏ）１ｍｌを添加することにより培地を調整した。次いで、上記培地に対して、細胞数が１×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにデュナリエラ・サリーナを接種し、デュナリエラ・サリーナの培養を１０日間行なった。なお、培養は２００リットル容のアクリル製円筒培養リアクターを用い、５％の炭酸ガスを含有する空気の通気下、かつ蛍光灯照射下（３５００ｌｕｘ）、２３℃にて行なった。培養後、培養液を連続遠心分離機（１５０００回転）にて分離処理し、得られたペースト状の藻体を凍結乾燥して藻体乾燥粉末（２０ｇ）を得た。

［ＵＣＰ発現誘導作用に関する試験］
３週齢の雄マウス（自然発症アポＥ欠損高脂血症（ＳＨＬ）マウス）２０匹を投与群（１０匹）と対照群（１０匹）とに郡別し、それぞれ２ヶ月間飼育した。投与群のマウスには、飼料として、１％コレステロール負荷マウス用市販粉末飼料に、藻体乾燥粉末を２％添加したものを与えた。なお、この藻体乾燥粉末を含む飼料は、使用時まで−２０℃で保存することにより、藻体乾燥粉末中に含まれる成分の失活を抑制している。また、対照群のマウスには、１％コレステロール負荷マウス用市販粉末飼料に、内在するカロテノイドを失活させた藻体乾燥粉末を２％添加したものを与えた。内在するカロテノイドを失活させた藻体乾燥粉末は、藻体乾燥粉末を室温にて２４時間の空気暴露処理及び蛍光灯照射処理することにより作製している。なお、同処理後の藻体乾燥粉末は、内在するカロテノイドが失活して黄橙色から緑色となることから、カロテノイドを含まない緑色を呈する藻体と同じものとみなすことができる。また、同処理を行うことにより、処理前の藻体乾燥粉末に含まれる他のタンパク質、脂質、炭水化物等の基本的な成分はほとんど変化しないものと考えられる。

各試料は週に３回交換し、自由摂取とさせた。２ヶ月後、投与群及び対照群のマウスから各組織（白色脂肪、褐色脂肪、肝臓、骨格筋）を摘出し、各組織におけるＵＣＰ２及びＵＣＰ３の発現量を以下の方法により測定した。

摘出した組織をホモジネートし、公知の方法によりＲＮＡを抽出した後、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）を用いてＲＮＡからＤＮＡを作成した。次いで、ＵＣＰ２遺伝子及びＵＣＰ３遺伝子に特異的なプライマーを用いて定量的ＰＣＲを行うとともに、各組織におけるＵＣＰ２遺伝子及びＵＣＰ３遺伝子の発現量を測定した。なお、ＵＣＰ２遺伝子及びＵＣＰ３遺伝子の発現量の測定は、シクロフィリン（Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）を内部標準として用い、シクロフィリンの発現量に対する相対的な発現量にて評価を行なった。図１及び２はその結果を示すグラフである。

図１及び２のグラフから、上記微細藻の藻体を摂取した場合、白色脂肪においてＵＣＰ２の発現量が有意に増加するとともに、骨格筋においてＵＣＰ３が有意に増加することが確認された。この結果から、上記微細藻の藻体を摂取することにより、特定の組織におけるＵＣＰの発現が促進されることがわかった。したがって、上記微細藻の藻体は、ＵＣＰ発現誘導剤として有効に用いることができる。なお、上記微細藻の藻体の冷え改善作用は、ＵＣＰの発現量が増加して、生体のエネルギー代謝が亢進されたことに基づく作用であると考えられる。

また、データは示していないが、飼料として、マウスに１％コレステロール負荷マウス用市販粉末飼料のみ、又は１％コレステロール負荷マウス用市販粉末飼料にカロテノイドを添加したものを用いて同様の試験を行なったところ、各細胞における各ＵＣＰの発現量は、対照群の発現量と略同程度であった。これらの結果から、本発明の脱共役タンパク質発現誘導剤の脱共役タンパク質発現誘導作用は、単なるカロテノイド成分由来の作用ではなく、上記微細藻の藻体に含まれる何らかの成分又はその成分と内在するカロテノイドとの協働により発揮されるものであると考えられる。

［冷え改善作用に関する試験］
日常的に冷えを感じやすい（手足の冷え性を自覚している）２１〜７２歳の女性２０名を被験者として、本発明の冷え改善剤を摂取させ、その冷え改善効果に関する有効性を評価した。試験は、本発明の冷え改善剤と偽薬を用いた単盲検法を採用し、偽薬を対照とした２期クロスオーバー試験とした。

試験薬は、藻体乾燥粉末３５０ｍｇを充填したハードカプセル（実施例）と、乳糖３５０ｍｇを充填したハードカプセル（偽薬）を用いた。試験日程を順に、第１摂取期間７日間、第１試験日、摂取休止期間２日（第１試験日を含む）、第２摂取期間７日間、第２試験日に設定し、被験者には第１摂取期間及び第２摂取期間の毎日、１日２カプセルの実施例又は偽薬を摂取させた。なお、被験者には試験期間中を通して、それまでの食生活及び運動等の日常生活を変えないように指導している。

第１試験日及び第２試験日には、各被験者に、２３℃に設定した部屋で６０分間座ってもらい、６０分経過後の手足の冷えについて、普段と比較して「緩和された」、「変わらない」、「ひどくなった」の３項目で評価してもらった。その結果を表１及び２に示す。

表１及び２に示すように、偽薬を摂取した場合に「（手足の冷えが）緩和された」と評価した被験者の割合は０％（０人／２０人）であるのに対して、実施例を摂取した場合に「（手足の冷えが）緩和された」と評価した被験者の割合は８０％（１６人／２０人）であった。この結果から、上記微細藻の藻体（実施例）を摂取することにより、冷えが緩和されることがわかった。したがって、上記微細藻の藻体は、冷え改善剤として有効に用いることができる。

次に、上記実施形態及び別例から把握できる技術的思想について記載する。
（イ） 緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、カロテノイドが蓄積された黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする脱共役タンパク質発現誘導剤。

（ロ） 緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする脱共役タンパク質発現誘導剤（ただし、脂肪細胞縮小剤及び抗ピロリ菌組成物として用いる場合を除く）。

（ハ）緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする冷え改善剤。

（ニ）緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、カロテノイドが蓄積された黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分と
して含有することを特徴とする冷え改善剤。

Claims (1)

1. 脱共役タンパク質２の発現を促進する脱共役タンパク質２発現誘導剤、又は脱共役タンパク質３の発現を促進する脱共役タンパク質３発現誘導剤として用いられる脱共役タンパク質発現誘導剤において、
   緑藻綱オオヒゲマワリ目のデュナリエラ属に属する微細藻の藻体であって、カロテノイドを含有する黄橙色を呈する藻体、又は該藻体から得られる抽出物を有効成分として含有することを特徴とする脱共役タンパク質発現誘導剤。