JP2016150933A - エボジアミンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
上記エボジアミンの製造方法において、前記藻体は、デュナリエラ・サリーナ、デュナリエラ・ターティオレクタ、デュナリエラ・バーダウィル、ノストック・コミューネ、ノストック・スファエリコム、ノストック・フラジリフォルメ、ポルフィリディウム・プルプレウム、及びポルフィリディウム・クルエンタムから選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。
本実施形態のエボジアミンの製造方法は、特定の藻体を原料として、抽出工程を行うことによりエボジアミンを製造するものである。また、必要に応じて、抽出工程の後、エボジアミンを精製する精製工程を更に行うことによりエボジアミンを製造するものである。
本実施形態のエボジアミンの製造方法においては、原料として、緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属(Dunaliella)、藍藻綱ノストック目ノストック属(Nostoc)、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム(チノリモ)属(Porphyridium)の藻体が挙げられる。
抽出工程は、原料としての上記藻体から、エボジアミンを含む抽出物を抽出する工程である。
精製工程は、抽出工程にて得られた、エボジアミンを含む抽出物からエボジアミンを精製する工程である。エボジアミンは、上記抽出物を1又は2以上のクロマトグラフィを用いて精製することにより精製される。クロマトグラフィとしては、公知のクロマトグラフィ、例えば液体クロマトグラフィ、超臨界流体クロマトグラフィ、及び薄層クロマトグラフィを用いることができる。液体クロマトグラフィとしては、例えばカラムクロマトグラフィを用いることができ、より具体的には高速液体クロマトグラフィ(HPLC)及びオープンカラムクロマトグラフィを挙げることができる。クロマトグラフィ担体としては、例えばイオン交換クロマトグラフィ、分配クロマトグラフィ(順相・逆相クロマトグラフィ)、吸着クロマトグラフィ、及び分子排斥クロマトグラフィが挙げられる。分配クロマトグラフィとして、より具体的にはシリカゲル担体やODS担体を用いることが分離効率の観点から好ましい。それらのクロマトグラフィを適宜組み合わせて、公知の使用方法でエボジアミンを分離して精製することができる。なお、精製工程は任意の工程であり、エボジアミンを適用する用途に求められる精製度等に応じて、省略することも可能である。
(1)本実施形態のエボジアミンの製造方法は、緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体を原料として、抽出溶媒を用いて原料からエボジアミンを抽出する抽出工程を行うことにより、エボジアミンを製造するものである。
上記構成によれば、精製度(純度)の高いエボジアミンを得ることができる。
<試験例1>
(抽出工程)
デュナリエラ・ターティオレクタの乾燥粉末(3g)に70%メタノール水溶液(50ml)を加え、85〜95℃にて1時間の還流抽出を行った。還流抽出後の試料を遠心分離処理した後、濾過により上清と残渣とに分離した。得られた上清を50mlに定容し、ここから44ml採取して濃縮乾固した。その後、アセトニトリル(5ml)を加えて可溶部を回収するとともに、不溶部に対してアセトニトリル(5ml)を加えて可溶部を回収する処理を2回繰り返した。回収したすべての可溶部を濃縮乾固し、これをアセトニトリル(4ml)に溶解させた溶液を、0.2μmのメンブレンフィルターを用いて濾過することにより抽出物1を得た。
得られた抽出物1を10mmol/lアンモニア水・アセトニトリル混合溶液(4:6(v/v))にて100倍希釈し、これを0.2μmのメンブレンフィルターを用いて濾過して試料溶液とした。この試料溶液について、逆相高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いて精製を行った。HPLC条件は以下のとおりである。そして、溶出時間6.0〜6.9分の画分を回収するとともに、これを濃縮乾固することにより精製物1を得た。なお、市販のエボジアミン(和光純薬工業株式会社製)を用いた予備試験を行うことにより、下記HPLC条件におけるエボジアミンの溶出時間が6.0〜6.9分であることを予め確認している。
カラム :InertSustain C18 (φ2.1x150mm)
カラム温度:40℃
溶媒 :溶媒A(10mmol/lアンモニア水)、溶媒B(アセトニトリル)
流速 :200μl/分
溶出条件 :溶媒B 60%(0〜7分)、95%(8〜13分)
注入量 :5.0μl
(分析)
標準試料(市販のエボジアミン)及び精製物1について、m/z304のピークのMS/MS測定を行った。その結果をそれぞれ図1及び図2に示す。また、エボジアミンイオン、及びエボジアミンの代表的な断片化構造を以下に示す。エボジアミンの断片化機構は公知である(例えば、D.Wen et al.,Anal.Bioanal.Chem.,385(6),1075(2006).)。
(抽出工程)
抽出溶媒として、70%メタノール水溶液に代えて、70%エタノール水溶液を用いた点を除いて、試験例1と同様にして抽出工程を行うことにより抽出物2を得た。
得られた抽出物2について、試験例1と同様にして抽出工程を行うことにより精製物2を得た。
精製物2について、m/z304のピークのMS/MS測定を行った。その結果を図3に示す。
緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属の藻体であるデュナリエラ・サリーナ、及び藍藻綱ノストック目ノストック属の藻体であるノストック・コミューネ、ノストック・スファエリコム、ノストック・フラジリフォルメ、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属の藻体であるポルフィリディウム・プルプレウムについて、試験例1と同様の抽出工程及び精製工程を行った。その結果、精製工程において得られたHPLCクロマトグラム(検出波長:254nm)において、溶出時間6.0〜6.9分に試験例1の場合と同様のエボジアミンと考えられるピークを確認することができた。
(イ)緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体から抽出することにより得られることを特徴とするエボジアミン。
Claims (3)
- 緑藻綱オオヒゲマワリ目デュナリエラ属、藍藻綱ノストック目ノストック属、及び紅藻綱チノリモ目ポルフィリディウム属から選ばれる少なくとも一種の藻体を原料として、抽出溶媒を用いて前記原料からエボジアミンを抽出する抽出工程を有することを特徴とするエボジアミンの製造方法。
- 前記抽出工程において得られたエボジアミンを含む抽出物からエボジアミンを精製する精製工程を有することを特徴とする請求項1に記載のエボジアミンの製造方法。
- 前記藻体は、デュナリエラ・サリーナ、デュナリエラ・ターティオレクタ、デュナリエラ・バーダウィル、ノストック・コミューネ、ノストック・スファエリコム、ノストック・フラジリフォルメ、ポルフィリディウム・プルプレウム、及びポルフィリディウム・クルエンタムから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載のエボジアミンの製造方法。
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