JP5758128B2 - 安定な補酵素による脱水素酵素の安定化 - Google Patents

Description

本発明は、安定な補酵素の存在下で酵素を保管することによる酵素を安定化する方法に関する。本発明は、さらに、安定な補酵素により安定化された酵素、および分析物を検出するためのテストエレメントにおけるその使用に関する。

生化学的測定システムは、臨床的に意義のある分析方法の重要な構成要素である。ここで優先されるのは、たとえば代謝物や基質などの分析物の測定であって、直接的にまたは間接的に酵素の助けをかりて測定される。このケースでは分析物は、酵素−補酵素複合体の助けをかりて変換され、ついで定量される。これは、測定されるべき分析物を適切な酵素および補酵素と接触させることを伴い、酵素は通常触媒量で用いられる。補酵素は、酵素反応により酸化型または還元型などに変えられる。このプロセスは直接的に、またはメディエーターを通して電気化学的もしくは光化学的に検出することができる。較正により、測定値と測定されるべき分析物の濃度との直接的な関係が提供される。

補酵素は、有機分子であり、共有結合でまたは非共有結合で酵素に結合し、分析物の変換により変化させられる。補酵素の良く知られた例は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）であり、それぞれＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨが反応により生成される。

先行技術において既知の測定システムは、限られた期間、およびこの安定性を達成するための冷却または乾燥保管などの環境の特別な要件に関して安定であることで有名である。したがって、たとえば、血糖値の自己モニタリングなどの最終ユーザー自身により実施されるテストなどの特別な応用に関して、間違った、気付かない間違った保管を通して、誤った結果を生じる可能性がある。とりわけ最初のパッケージングが開けられてから長くなり過ぎることによる乾燥剤の消尽が、誤った測定値を導き得、それはいくつかのシステムではユーザーによってほとんど同定することができない。

生化学的測定システムの安定性を増加させるために採用されている１つの既知の手段は、安定な酵素の使用、たとえば好熱性生物由来の酵素の使用である。さらなる可能性は、架橋などの化学的修飾や突然変異誘発により酵素を安定化することである。加えて、トレハロース、ポリビニルピロリドンおよび血清アルブミンなどの酵素安定剤も添加することができ、または酵素をポリマーネットワーク中に光重合により包み込むことができる。

安定なメディエーターを用いることによる生化学的測定システムの安定性を改善するための試みもなされている。これにより、できるだけ低い酸化還元電位を有するメディエーターの使用を通して、テストの特異性が高められ、反応中の妨害が排除される。しかしながら、酵素／補酵素複合体の酸化還元電位は、メディエーターの酸化還元電位の下限を形成する。これらの電位以下では、メディエーターとの反応は低下、または停止することさえある。

別の可能性は、たとえば、補酵素ＮＡＤＨなどの補酵素の直接的な検出がなされる、メディエーターを用いない生化学的測定システムを使用することである。しかし、そのような測定システムの１つの欠点は、ＮＡＤやＮＡＤＰなどの補酵素が不安定であるということである。

ＮＡＤおよびＮＡＤＰは、塩基に不安定な分子であり、その分解経路は文献に記載されている（N.J. Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982, editors J. Everese, B. Anderson, K. You, 第３章、５６〜６５頁）。ＮＡＤおよびＮＡＤＰの分解はそれぞれ、リボースとピリジン単位との間のグリコシル結合の切断により、本質的には結果ＡＤＰ−リボースを生じる。その一方で、還元型のＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、酸に不安定であり、たとえばエピマー化が既知の分解経路の１つである。両方の場合において、ＮＡＤ／ＮＡＤＰおよびＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの不安定性は、リボース単位とピリジン単位との間のグリコシル結合の不安定性に由来する。しかしながら、たとえば、水溶液中といった激烈ではない条件下さえ、補酵素ＮＡＤおよびＮＡＤＰはそれぞれ、周囲の水分のみで加水分解される。この不安定性が、分析物の測定に誤りをもたらし得る。

多数のＮＡＤ／ＮＡＤＰ誘導体が、たとえばB.M. Anderson in The Pyridine Nucleotide Coenzymes, Academic Press New York, London 1982, editors J. Everese, B. Anderson, K. You, 第４章に記載されている。しかしながら、これらのほとんどの誘導体は酵素によってあまり受け入れられていない。したがって、これまでに診断テストに用いられているただ１つの誘導体は、３−アセチルピリジンアデニンジヌクレオチド（アセチルＮＡＤ）であり、１９５６年に最初に記載された（N.O. Kaplan, J. Biol. Chem. (1956), 221, 823）。また、この補酵素は酵素による乏しい受け入れおよび酸化還元電位の変化しか示していない。

国際公開第０１／９４３７０号パンフレットは、修飾されたピリジンン基を有するさらなるＮＡＤ誘導体の使用を記載している。しかしながら、ニコチンアミド基の修飾は、一般に触媒反応に直接的な影響がある。ほとんどの場合、この影響は否定的なものである。

安定化のためのさらなる着想においては、リボース単位が変えられ、それによりグリコシル結合の安定性に影響を与える。このやり方は、直接的にニコチンアミド基の触媒反応を妨害するものではない。しかしながら、酵素がリボース単位への強く特異的な結合を示すと間接的な影響があるかもしれない。Kaufmannらは、これに関連して国際公開第９８／３３９３６号パンフレットおよび米国特許第５，８０１，００６号明細書、ならびに国際公開第０１／４９２４７号パンフレットにそれぞれ、多数のチオリボース−ＮＡＤ誘導体を開示している。しかし、ニコチンアミド−リボース単位の修飾と誘導体の酵素反応における活性との関連はこれまで示されていない。

グリコシル結合をもたない誘導体であるカルバＮＡＤは、１９８８年に最初に記載された（J.T. Slama, Biochemistry 1989, 27,183およびBiochemistry 1989, 28, 7688）。そこではリボースは炭素環糖単位により置換されている。カルバＮＡＤは脱水素酵素の基質として記載されているが、その活性はこれまで生化学的検出方法において臨床的に証明されていない。

後に、G. M. BlackburnがChem. Comm.（１９９６年）、２７６５頁に、天然のピロホスフェートの代わりに、メチレンビスホスホネート化合物を用いてカルバＮＡＤを製造する同様の試みについて記述している。メチレンビスホスホネートはホスファターゼに対しより高い安定性を示し、ＡＤＰ−リボシルシクラーゼの阻害剤として使用された。その目的は、加水分解に対して安定性を向上させることではなかった（J. T. Slama、G. M. Blackburn）。

国際公開第２００７／０１２４９４号パンフレットおよび米国特許出願１１／４６０，３６６号明細書には、安定なＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ誘導体がそれぞれ開示されており、これらの誘導体の酵素複合体、およびそれらの生化学的検出方法における使用、および試薬キットが開示されている。

本発明の目的は、酵素を安定化する方法、特には酵素の長期安定化のための方法を提供することであった。

この目的は、酵素を安定化する方法であって、該酵素が安定な補酵素の存在下に保管される方法により達成される。驚くべきことに、高い相対湿度でまたは液相中でさえ、また高温で、数週間または数ヶ月間という長期間の安定化が、安定な補酵素の助けにより可能であるということが見出された。この知見は、酵素は天然の補酵素の存在下では数時間という短期間では安定性の増加を示すが（Bertoldiら、Biochem. J. 389, (2005), 885-898；van den Heuvelら、J. Biol. Chem. 280 (2005), 32115-32121；およびPanら、J. Chin. Biochem. Soc. Vol.3 (1974), pp 1-8）、より長期間については安定性の低下を示すということが知られているため驚くべきことである（Nutrition Reviews 36 (1978), 251-254）。

先行技術との関連でこれらの知見と比較すると、酵素が安定な補酵素の存在下において、天然の補酵素の存在下における酵素の安定性より明らかに増加された長期安定性を有するということは、とりわけ安定な補酵素が天然の補酵素よりも酵素との低い結合定数を有するため、驚くべきことである。

安定な補酵素カルバ−ＮＡＤ（ｃＮＡＤ）の図である。 安定な補酵素ピロリジニル−ＮＡＤの図である。 ＮＡＤの存在下およびｃＮＡＤの存在下でのそれぞれ保管前後のグルコース脱水素酵素の反応速度の結果の図である。ＮＡＤ存在下１日後のＧｌｕｃＤＨの反応速度。 ＮＡＤの存在下およびｃＮＡＤの存在下でのそれぞれ保管前後のグルコース脱水素酵素の反応速度の結果の図である。ｃＮＡＤ存在下１日後のＧｌｕｃＤＨの反応速度。 ＮＡＤの存在下およびｃＮＡＤの存在下でのそれぞれ保管前後のグルコース脱水素酵素の反応速度の結果の図である。ＮＡＤ存在下で３２℃および８５％の相対湿度で５週間保管した後のＧｌｕｃＤＨの反応速度。 ＮＡＤの存在下およびｃＮＡＤの存在下でのそれぞれ保管前後のグルコース脱水素酵素の反応速度の結果の図である。ｃＮＡＤ存在下で３２℃および８５％の相対湿度で５週間保管した後のＧｌｕｃＤＨの反応速度。 ３２℃および湿度８５％で５週間までの期間にわたりＮＡＤの存在下におけるグルコース脱水素酵素およびｃＮＡＤの存在下におけるＧｌｕｃＤＨのそれぞれ空試験値との比較。 ３２℃および湿度８５％でＮＡＤの存在下グルコース脱水素酵素の保管後のグルコース脱水素酵素の様々な関数プロットの図である。保管期間は１日と５週間の間で変化された。 ３２℃および湿度８５％でｃＮＡＤの存在下グルコース脱水素酵素の保管後のグルコース脱水素酵素の様々な関数プロットの図である。保管期間は１日と５週間の間で変化された。 ３２℃および湿度８５％でｃＮＡＤの存在下グルコース脱水素酵素の保管後のグルコース脱水素酵素の様々な関数プロットの図である。保管期間は１日と２４週間の間で変化された。 ３２℃および湿度８５％で２４週間それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下グルコース脱水素酵素の保管後のＮＡＤおよびｃＮＡＤの残存含量の図である。 ３２℃および湿度８５％で５週間それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下グルコース脱水素酵素の保管後のＧｌｕｃＤＨ活性の図である。 ３２℃および湿度８５％で２４週間それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下グルコース脱水素酵素の保管後のＧｌｕｃＤＨ活性の図である。 ３２℃および８３％の相対湿度で２５週間の期間にわたる、それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下、グルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ−ｗｔ）、二重突然変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ９６Ｇ＿Ｅ１７０Ｋ（ＧｌｕｃＤＨ−Ｍｕｔ１）および二重突然変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌ（ＧｌｕｃＤＨ−Ｍｕｔ２）の保管後のＧｌｕｃＤＨ活性の図である。 それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下で保管後のゲル電気泳動によるグルコース脱水素酵素の分析。テスト条件：ＭＷ、１０〜２２０ｋＤａマーカー；１：ＧｌｕｃＤＨ／ＮＡＤ、６℃で５週間；２：ＧｌｕｃＤＨ／ＮＡＤ、３２℃／相対湿度８５％で５週間；３：ＧｌｕｃＤＨ／ｃＮＡＤ、６℃で５週間；４：ＧｌｕｃＤＨ／ｃＮＡＤ、３２℃／相対湿度８５％で５週間。 それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下５０℃で保管後のゲル電気泳動によるグルコース脱水素酵素の分析。テスト条件：ＭＷ、１０〜２２０ｋＤａマーカー；１：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ＮＡＤ、０時間；２：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ＮＡＤ、２２時間；３：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ＮＡＤ、９６時間；４：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ＮＡＤ、１１８時間；５：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ＮＡＤ、１４０時間；６：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ＮＡＤ、１８８時間；７：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ＮＡＤ、４７６時間；８：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ｃＮＡＤ、０時間；９：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ｃＮＡＤ、１８８時間；１０：ＧｌｕｃＤＨ ８．５ｍｇ／ｍｌ、ｃＮＡＤ、４７６時間。 液相中５０℃で４日間にわたり、それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下のグルコース脱水素酵素の安定性の図である。テスト条件：ＧｌｕｃＤＨ １０ｍｇ／ｍｌ；ＮＡＤおよびｃＮＡＤそれぞれ１２ｍｇ／ｍｌ；緩衝液：０．１Ｍトリス、１．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５；温度５０℃。 液相中５０℃で１４日間にわたり、それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下のグルコース脱水素酵素の安定性の図である。テスト条件：ＧｌｕｃＤＨ １０ｍｇ／ｍｌ；ＮＡＤおよびｃＮＡＤそれぞれ１２ｍｇ／ｍｌ；緩衝液：０．１Ｍトリス、１．２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５；温度５０℃。 それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下で保管後のゲル電気泳動による酵母由来のアルコール脱水素酵素の分析。テスト条件：ＭＷ、１０〜２２０ｋＤａマーカー；１：ＡＤＨ、６℃で６５時間；２：ＡＤＨ／ｃＮＡＤ、６℃で６５時間；３：ＡＤＨ／ＮＡＤ、６℃で６５時間；４：ＡＤＨ、３５℃で６５時間；５：ＡＤＨ／ｃＮＡＤ、３５℃で６５時間；６：ＡＤＨ／ＮＡＤ、３５℃で６５時間。 それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下３５℃で保管後のゲル電気泳動による酵母由来のアルコール脱水素酵素の分析。テスト条件：ＭＷ、１０〜２２０ｋＤａマーカー；１：ＡＤＨ／ＮＡＤ、０日；２：ＡＤＨ／ＮＡＤ、１日；３：ＡＤＨ／ＮＡＤ、２日；４：ＡＤＨ／ＮＡＤ、３日；５：ＡＤＨ／ＮＡＤ、５日；６：ＡＤＨ／ｃＮＡＤ、０日；７：ＡＤＨ／ｃＮＡＤ、１日；８：ＡＤＨ／ｃＮＡＤ、２日；９：ＡＤＨ／ｃＮＡＤ、３日；１０：ＡＤＨ／ｃＮＡＤ、６日。 液相中３５℃で６５時間にわたり、それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下の酵母由来のアルコール脱水素酵素の安定性の図である。テスト条件：ＡＤＨ ５ｍｇ／ｍｌ；ＮＡＤおよびｃＮＡＤそれぞれ５０ｍｇ／ｍｌ；緩衝液：７５ｍＭ Ｎａ₄Ｐ₂Ｏ₇、グリシン、ｐＨ９．０；温度３５℃。 室温でＮＡＤおよび種々のメディエーターの存在下で１１週間保管後のグルコース脱水素酵素の様々な関数プロットの図である。 種々のグルコース濃度で、ＮＡＤおよび１−（３−カルボキシプロポキシ）−５−エチルフェナジニウムトリフルオロメタンスルホネートの存在下でのグルコース脱水素酵素反応速度の結果の図である。 酵素としてＧｌｕｃＤＨを用い、メディエーターとしてジアホラーゼを用いるグルコース検出の図である。 それぞれピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）およびメディエーターとして［（４−ニトロソフェニル）イミノ］ジメタノール塩酸塩の存在下でのグルコース色素酸化還元酵素（ＧｌｕｃＤＯＲ）の関数プロット、およびＮＡＤおよびメディエーターとしてジアホラーゼ／［（４−ニトロソフェニル）イミノ］ジメタノール塩酸塩の存在下でのグルコース脱水素酵素の関数プロットの図である。 種々のグルコース濃度で、ＮＡＤおよびジアホラーゼの存在下でのグルコース脱水素酵素反応速度の結果の図である。 それぞれＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下でグルコース脱水素酵素を用いたグルコースの電気化学測定においてグルコース濃度の関数として測定された電流の図である。テスト条件：ＮＡＤおよびｃＮＡＤ それぞれ２５ｍＭ；遅延時間２．５秒；測定時間５秒。 二重突然変異体ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ９６Ｇ＿Ｅ１７０ＫおよびＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列の図である。

本発明の方法により安定化される酵素は補酵素依存性酵素である。好適な酵素の例は、グルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、１．１．１．２８）、リンゴ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）、α−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素またはたとえばＬ−アミノ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．４．１．５）などのアミノ酸脱水素酵素から選択される脱水素酵素である。さらに好適な酵素は、たとえばグルコース酸化酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．３．４）またはコレステロール酸化酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．３．６）などの酸化酵素、およびたとえばアスパラギン酸もしくはアラニンアミノ基転移酵素などのアミノ基転移酵素、５’−ヌクレオチダーゼまたはクレアチンキナーゼである。酵素は好ましくはグルコース脱水素酵素である。

本発明の方法に照らして、突然変異されたグルコース脱水素酵素を使用することが特に好ましいことが判った。本願において使用される場合、用語「突然変異体（mutant）」は、天然の酵素の遺伝的に改変された変異体を意味し、アミノ酸数は同じであるが野生型酵素と比較して改変されたアミノ酸配列、すなわち野生型酵素由来のアミノ酸の少なくとも１つが異なるアミノ酸配列を有する。突然変異の導入は、部位特異的に、または非部位特異的に行われ、好ましくはこの分野で既知であり、特別な要件および条件にふさわしい、天然の酵素のアミノ酸配列内で少なくとも１つのアミノ酸の交換が生じる組換え法を用いて部位特異的に行われる。突然変異体は、特に好ましくは野生型酵素と比較して増加された熱安定性または加水分解安定性を有する。

突然変異されたグルコース脱水素酵素は、概して対応する野生型グルコース脱水素酵素と比較してそのアミノ酸配列の任意の位置で改変されたアミノ酸を含むことができる。突然変異されたグルコース脱水素酵素は、好ましくは野生型グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列の９６位、１７０位および２５２位の少なくとも１ヵ所に変異を含み、９６位および１７０位に変異を含む突然変異体および１７０位と２５２位に変異を含む突然変異体が特に好ましい。突然変異されたグルコース脱水素酵素にとって、これらの変異の上にさらに変異を含まないことが有益であることが判っている
９６位、１７０位および２５２位での変異は、概して野生型酵素の安定化、たとえば熱安定性または加水分解安定性の増加をもたらす任意のアミノ酸の交換を含む。９６位での変異は、好ましくはグルタミン酸からグリシンへのアミノ酸交換を含み、一方１７０位については、グルタミン酸からアルギニンまたはリジンへのアミノ酸交換、特にグルタミン酸からリジンへのアミノ酸交換が好ましい。２５２位の変異については、リジンからロイシンへのアミノ酸交換が好ましく含まれる。

突然変異されたグルコース脱水素酵素は、あらゆる生物学的源由来の野生型グルコース脱水素酵素の突然変異により得ることができる。ここで、用語「生物学的源」とは、本発明の文脈において、たとえば細菌などの原核生物ならびに哺乳類および他の動物などの真核生物の両方を含む。野生型グルコース脱水素酵素は、好ましくは細菌由来であり、特に好ましくは、バチルス メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス ズブチルス（Bacillus subtilis）またはバチルス チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来のグルコース脱水素酵素が好ましく、バチルス ズブチルス（Bacillus subtilis）由来のグルコース脱水素酵素が特に好ましい。

本発明の特に好ましい態様において、突然変異されたグルコース脱水素酵素は、バチルス ズブチルス（Bacillus subtilis）由来の野生型グルコース脱水素酵素の突然変異により得られるグルコース脱水素酵素であり、配列番号１に示すアミノ酸配列（ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ９６Ｇ＿Ｅ１７０Ｋ）、または配列番号２に示すアミノ酸配列（ＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌ）を有する。

安定な補酵素は、天然の補酵素と比較して化学的に修飾されている補酵素であり、天然の補酵素よりも高い安定性（たとえば加水分解安定性）を有する。安定な補酵素は、好ましくはテスト条件下で加水分解に安定である。天然の補酵素と比較して、安定な補酵素は、酵素に対する結合定数が低下しており、たとえば２倍またはそれ以上減少した結合定数を有する。

安定な補酵素の好ましい例は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）の安定な誘導体、またはたとえばＡＭＰ部分のない、または疎水性残基などの非ヌクレオシド残基を有する切断されたＮＡＤ誘導体である。同様に、本発明の文脈において安定な補酵素として好ましいのは、式（Ｉ）の化合物である。

ＮＡＤ／ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの好ましい安定な誘導体は、前述の参考文献に記述されており、その開示は、本明細書に参照として明確に組み込まれる。特に好ましい安定化された補酵素は、国際公開第２００７／０１２４９４号パンフレットおよび米国特許出願１１／４６０３６６号明細書にそれぞれ記載されており、その開示は、本明細書に参照として明確に組み込まれる。安定な補酵素は、特に好ましくは一般式（II）を有する化合物

式中、
Ａ＝アデニンまたはその類似体、
Ｔ＝それぞれ独立してＯ、Ｓ、
Ｕ＝それぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、ＢＨ₃ ^-、ＢＣＮＨ₂ ^-、
Ｖ＝それぞれ独立してＯＨまたはリン酸基、または２つの基が環状リン酸エステル基を形成する、
Ｗ＝ＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）₂、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）₂、Ｒ＝それぞれ独立してＨまたはＣ₁〜Ｃ₂−アルキル、
Ｘ¹、Ｘ²＝それぞれ独立してＯ、ＣＨ₂、ＣＨＣＨ₃、Ｃ（ＣＨ₃）₂、ＮＨ、ＮＣＨ₃、
Ｙ＝ＮＨ、Ｓ、Ｏ、ＣＨ₂、
Ｚ＝直鎖状または環状有機基（ただしＺおよびピリジン残基は、グリコシル結合により連結されない）
またはその塩、もしくは必要に応じて還元型
から選択される。

式（II）の化合物においてＺは、好ましくは４〜６個のＣ原子、好ましくは４Ｃ原子を有する直鎖状基であって、１個または２個のＣ原子が任意に、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１つまたはそれ以上のヘテロ原子で置換されている直鎖状基、または５個または６個のＣ原子を含み、任意にはＯ、ＳおよびＮから選択されるヘテロ原子および任意には１つまたはそれ以上の置換基を含む環状基、ならびにＣＲ⁴ ₂基（ＣＲ⁴ ₂は環状基およびＸ²に結合され、Ｒ⁴はそれぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ₃である）を含む基である。

Ｚは特に好ましくは、飽和または不飽和の炭素５員環または複素５員環、とりわけ一般式（III）の化合物

式中、単結合または二重結合がＲ^5'およびＲ^5''との間に存在でき、
Ｒ⁴＝それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ₃、
Ｒ⁵＝ＣＲ⁴ ₂、
式中、Ｒ^5'およびＲ^5''との間が単結合である場合、Ｒ^5'＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＣ₁〜Ｃ₂−アルキル基、ＣＲ⁴ ₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、および
Ｒ^5''＝ＣＲ⁴ ₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、および
式中、Ｒ^5'およびＲ^5''との間が二重結合である場合、Ｒ^5'＝Ｒ^5''＝ＣＲ⁴、および
Ｒ⁶、Ｒ^6'＝それぞれ独立してＣＨまたはＣＣＨ₃
が好ましい。

好ましい実施態様において、本発明の化合物は、アデニンまたはたとえばＣ₈−およびＮ₆−置換アデニンなどのアデニン類似体、７−デアザなどのデアザ変異体、８−アザなどのアザ変異体、または７−デアザもしくは８−アザなどの組合せ、またはホルモマイシンなどの炭素環類似体を含み、７−デアザ変異体はハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキニル、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルケニルまたはＣ₁〜Ｃ₆−アルキルによって７位が置換され得る。

また別の好ましい実施形態の１つでは、当該化合物は、リボースの代わりに、たとえば２−メトキシデオキシリボース、２’−フルオロデオキシリボース、ヘキシトール、アルトリトール、またはビシクロ糖、ＬＮＡ糖およびトリシクロ糖などの多環類似体を含むアデノシン類似体を含む。

特に、式（II）の化合物においても、（ジ）ホスフェート酸素は等電子数的に、たとえばＯ^-をそれぞれＳ^-およびＢＨ₃ ^-によって、ＯをそれぞれＮＨ、ＮＣＨ₃およびＣＨ₂によって、ならびに＝Ｏを＝Ｓによって置換することができる。

本発明の式（II）の化合物において、Ｗは好ましくはＣＯＮＨ₂またはＣＯＣＨ₃である。

式（III）の基において、Ｒ⁵は好ましくはＣＨ₂である。さらにＲ^5'はＣＨ₂、ＣＨＯＨおよびＮＨから選択されることが好ましい。特に好ましい実施態様では、Ｒ^5'およびＲ^5''は互いにＣＨＯＨである。なおさらに好ましい実施態様では、Ｒ^5'がＮＨかつＲ^5''がＣＨ₂である。好ましい安定化された補酵素の具体的な例は、図１Ａおよび１Ｂに示す。

最も好ましい実施態様において、安定な補酵素は、カルバＮＡＤである。

本発明の方法は、特に酵素の長期間の安定化に適している。これは、安定な補酵素により安定化された酵素が、たとえば乾燥物として、たとえば少なくとも２週間、好ましくは少なくとも４週間、そして特に好ましくは少なくとも８週間にわたって保管された場合、当初の酵素活性に対して好ましくは５０％未満、特に好ましくは３０％未満、そして最も好ましくは２０％未満の酵素活性の低下を示すということを意味する。

本発明の方法は、さらに安定な補酵素により安定化された酵素の高温、たとえば少なくとも２０℃、好ましくは少なくとも２５℃、そして特に好ましくは少なくとも３０℃での保管も含む。この場合、酵素活性は、その当初レベルに対して好ましくは５０％未満、特に好ましくは３０％そして最も好ましくは２０％未満低下する。

本発明の安定化により、安定な補酵素により安定化された酵素を、乾燥剤なしでさえ、上述したような長期間および／または上述したような高温で保管することが可能である。さらに、安定化された酵素はまた、高い相対湿度、たとえば少なくとも５０％の相対湿度でも保管することができる。このような場合、酵素活性は、その当初レベルに対して好ましくは５０％未満、特に好ましくは３０％そして最も好ましくは２０％未満低下する。

安定な補酵素により安定化された酵素の保管は、一方では乾燥物として、そして他方では液相中で行うことができる。安定化された酵素の保管は、好ましくは分析物を測定するために適したテストエレメント上またはテストエレメント内で行われる。安定な補酵素で安定化された酵素は、この場合、好ましくは検出試薬の成分であり、検出試薬は必要に応じてさらに、たとえば塩、緩衝液などの成分も含み得る。検出試薬は、この場合、好ましくはメディエーターを含まない。

安定な補酵素により安定化された酵素は、分析物、たとえば血液、血清、血漿または尿などの体液中または廃水試料中もしくは食品中のパラメータを検出するために使用することができる。

たとえば補酵素依存性酵素の基質または補酵素依存性酵素自体といった、酸化還元反応によって検出できる生物学的または化学的物質であればいずれも分析物として測定することができる。分析物の好ましい例としては、グルコース、乳酸、りんご酸、グリセロール、アルコール、コレステロール、トリグリセリド、アスコルビン酸、システイン、グルタチオン、ペプチド、尿素、アンモニウム、サリチル酸塩、ピルビン酸塩、５’−ヌクレオチダーゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、乳酸塩脱水素酵素（ＬＤＨ）、二酸化炭素などがある。分析物としてはグルコースが好ましい。

本発明の別の実施態様は、本発明の化合物または本発明にしたがい安定な補酵素により安定化された酵素の、酵素反応による試料中の分析物の検出のための使用に関する。これに関しては、グルコース脱水素酵素（ＧｌｕｃＤＨ）の助けによるグルコースの検出が特に好ましい。

分析物との反応による安定な補酵素における変化は、原則として任意の方法で検出することができる。それには、原則として、先行技術から公知のあらゆる酵素反応検出法が使用できる。しかし、補酵素の変化は光学的方法による検出が好ましい。光学的検出法には、たとえば吸光、蛍光、円偏光二色性（ＣＤ）、旋光分散（ＯＲＤ）の測定、屈折率測定などが含まれる。

本願に照らして好ましく使用される光学的検出法は、測光法である。しかしながら、分析物との反応の結果生じる補酵素の変化の光度測定には、還元された補酵素の反応性を増加させ、電子が好適な光学的指示薬または光学的指示薬系に移動できるようにさせる少なくとも１つのメディエーターの付加的な存在が必要とされる。

本発明のこの目的に適切なメディエーターとしては、とりわけ、たとえば［（４−ニトロソフェニル）イミノ］ジメタノール塩酸塩などのニトロソアニリン、たとえばフェナントレンキノン、フェナントロリンキノンまたはベンゾ［ｈ］キノリンキノンなどのキノン、たとえば１−（３−カルボキシプロポキシ）−５−エチルフェナジニウムトリフルオロメタンスルホネートなどのフェナジン、または／およびジアホラーゼ（Ｅ．Ｃ．１．６．９９．２）がある。フェナントロリンキノンの好ましい例には、１，１０−フェナントロリン−５，６−キノン、１，７−フェナントロリン−５，６−キノン、４，７−フェナントロリン−５，６−キノン、およびそれらのＮ−アルキル化またはＮ，Ｎ’−ジアルキル化塩が含まれ、Ｎ−アルキル化またはＮ，Ｎ’−ジアルキル化塩それぞれの場合のカウンターイオンとしては、溶解性を増加させるハロゲン化物、トリフルオロメタンスルホン酸または他のアニオンが好ましい。

光学指示薬または光学指示薬系としては、還元可能であり、還元した場合、たとえば色、蛍光、反射率、透過率、偏光または／および屈折率などのその光学的性質が検出可能に変化するあらゆる物質を使用することができる。試料中の分析物の存在または／および量の測定は、裸眼で、または／および当業者にふさわしいことが明らかな測光法を用いた検出装置により行うことができる。

ヘテロポリ酸、とりわけ２，１８−リンモリブデン酸は、光学的指示薬として好ましく使用され、対応するヘテロポリブルーに還元される。

補酵素の変化は、蛍光を測定することにより特に好ましく検出される。蛍光測定は高感度であり、小型システム内での低濃度の分析物でさえ検出可能である。

たとえば電気化学的テストストラップなどの適切なテストエレメントを使用し補酵素の電気化学的変化を検出することもまた別の可能性である。これに関する前提条件は、前述と同じ、還元された補酵素により、電子の移動により還元型に変換されることができる適切なメディエーターの使用である。分析物は、還元されたメディエーターを再酸化するために必要とされ、試料中の分析物の濃度と相関する電流を測定することにより測定される。電気化学的測定に使用することができるメディエーターの例としては、特に光度測定のために使用される前述のメディエーターが挙げられる。

分析物を検出するために液体テストを使用することも可能である。この場合、試薬はたとえば、水性または非水性液体の溶液または懸濁液の形態で、または粉末もしくは凍結乾燥物の形態である。しかしながら、乾式テストを使用することも可能である。この場合、試薬は支持体、テストストラップに塗布されている。支持体としては、たとえば、調査されるべき液体試料により湿潤される吸収材料および／または膨潤性材料を含むテストストラップなどが挙げられる。

特に好ましいテスト形式には、グルコースを検出するための安定なＮＡＤ誘導体を伴う酵素グルコース脱水素酵素の使用が含まれる。この場合、還元された補酵素ＮＡＤＨの誘導体が形成される。ＮＡＤＨは光学的な方法、たとえばＵＶ励起後の光度測定または蛍光測定により検出される。特に好ましいテスト系は米国特許出願２００５／０２１４８９１号明細書に記載されており、本明細書に明確に参照として述べられる。

本発明はさらに、安定な補酵素により安定化された酵素であって、好ましくは少なくとも２週間、特に好ましくは少なくとも４週間そして最も好ましくは少なくとも８週間、好ましくは少なくとも２０℃、特に好ましくは少なくとも２５℃そして最も好ましくは少なくとも３０℃、必要に応じて高い湿度でかつ乾燥剤なしでの保管において、当初のレベルと比較して５０％未満、好ましくは３０％未満そして最も好ましくは２０％未満の酵素活性の低下を示す安定化された酵素にも関する。

本発明はさらに、分析物を検出するための検出試薬であって、前述のとおり安定な補酵素により安定化された酵素を含む検出試薬にも関する。本発明はまた、本発明にしたがい安定化された酵素および本発明による検出試薬それぞれを含むテストエレメントに関する。検出試薬およびテストエレメントはそれぞれ、乾式テストまたは液体テストを実施するのに適している。テストエレメントは、好ましくは分析物の蛍光または光度検出用のテストストリップである。このようなテストストリップは、安定な補酵素により安定化され、たとえばセルロース、プラスチックなどの吸収材料および／または膨潤性材料上に固定された酵素を含む。

本発明は以下の図面および実施例によってより詳細に説明される。

実施例１
カルバ−ＮＡＤ（図１Ａ）またはＮＡＤをグルコース特異的ＧｌｕｃＤＨに添加した。これらの処方を、いずれの場合もＰｏｋａｌｏｎ ｆｉｌｍ（Ｌｏｎｚａ）に塗布し、乾燥後、温かく湿気のある条件下（３２℃、相対湿度８５％）で保管した。その後、反応速度および関数プロット（function plot）を定期的に測定した。平行して、各測定時間でｃＮＡＤ／ＮＡＤ分析および酵素の残存活性の測定を行った。

第１日目に測定されたＮＡＤ（図２Ａ）およびｃＮＡＤ（図２Ｂ）に関する反応速度プロットが比較され、良く似たグルコース依存的上昇を示す。しかしながら、反応速度プロットにおける目立った相違が５週間後に明らかとなる。ＮＡＤに関する反応速度（図２Ｃ）は、それらの動力学が大いに減少するのに対し、ｃＮＡＤにより安定化された酵素の反応速度は事実上変化しないままである（図２Ｄ）。

図３から明らかなように、空試験値（血液試料の適用前の乾燥空試験値）に目立った変化がある。ＮＡＤに関する乾燥空試験値の上昇は蛍光粒子の形成に寄与する（Oppenheimer (1982)、前出）。驚くべきことに、これはｃＮＡＤでは生じていない。

ＮＡＤおよびｃＮＡＤそれぞれの存在下におけるグルコース脱水素酵素の異なる安定性も図４および５の比較から明らかである。５週間後、ｃＮＡＤにより安定化された酵素に関する関数プロットは、なお一連の先の測定値（図５Ａ）にあり、一方、ＮＡＤにより処理した酵素に対するプロット（図４）は、より高い濃度で低下が見られる。この低下は、酵素／補酵素の量が低すぎるという典型的なしるしである。図５Ｂは、２４週間の期間にわたるｃＮＡＤにより安定化されたグルコース脱水素酵素の様々な関数プロットを示す。これに関しては、酵素の機能は、期間を通して高いグルコース濃度で僅かに変化するのみであり、２４週間後が５週間後に得られた値におおよそ相当することが明らかである。

補酵素の構造と所定の期間にわたるその安定性との関係は図６から明らかである。これによると、２４週間保管（３２℃および相対湿度８５％）後のグルコース検出試薬中のｃＮＡＤの残存含量は、なお当初のレベルの約８０％であり、一方ＮＡＤにより安定化されたグルコース検出試薬中のＮＡＤの含有量は、たった５週間後には当初のレベルの約３５％に低下し、外挿により約１７週間後にはゼロに減少した。

３２℃および相対湿度８５％で５週間後の活性なＧｌｕｃＤＨ酵素の残存活性の測定結果（図７Ａ）は、全く驚くべきものである。ＮＡＤにより安定化された酵素はここで極めて低い酵素活性（０．５％）しか示さず、一方ｃＮＡＤにより安定化された酵素は、７０％の残存活性をなお有する（いずれの場合でも、乾燥剤と一緒に冷蔵庫に保管した試料と比べて）。３２℃および相対湿度８５％で２４週間後（図７Ｂ）、ｃＮＡＤによる安定化の場合、酵素の残存活性はなお約２５％である。

野生型酵素（バチルス ズブチルス由来）の代わりに突然変異体が使用される場合、残存ＧｌｕｃＤＨ活性はさらにもっと上昇させることができる。ｃＮＡＤの存在下で３２℃および相対湿度８５％での２４週間の保管後、野生型酵素の９６位でグルタミン酸 → グリシンおよび１７０位でグルタミン酸 → リジンというアミノ酸置換を有するＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ９６Ｇ＿Ｅ１７０Ｋ突然変異体（ＧｌｕｃＤＨ−Ｍｕｔ１）の残存活性は約７０％であり、一方、１７０位でグルタミン酸 → リジンおよび２５２位でリジン → ロイシンというアミノ酸置換を有するＧｌｕｃＤＨ＿Ｅ１７０Ｋ＿Ｋ２５２Ｌ突然変異体（ＧｌｕｃＤＨ−Ｍｕｔ２）の残存活性は約５０％である（図８）。

ＳＤＳゲルにおけるゲル電気泳動によるグルコース脱水素酵素の分析（図９および１０）も、ＮＡＤおよびｃＮＡＤそれぞれの存在下での保管の間の相違を明確に示す。酵素はなお、ｃＮＡＤの存在下で３２℃および相対湿度８５％で５週間保管後、予期される移動度を有するバンドとして識別できるが、ＮＡＤの存在下で保管された酵素は完全に消失した（図９）。同時に、図１０から、ＮＡＤにより安定化され５０℃で保管された酵素のバンドが保管時間の増加と共に弱くなり、４７６時間後に事実上消失する一方、ｃＮＡＤの存在下で保管された酵素の対応するバンドは、実験の開始時に検出されたバンドと比較して僅かな変化しか示さないことが明らかである。

この結果は、液相中での保管の場合も確認することができる（図１１および１１Ｂ）。５０℃で９５時間後、天然の補酵素ＮＡＤの存在下でのグルコース脱水素酵素の残存活性は≒５％であり、一方、人工の補酵素ｃＮＡＤの存在下でのＧｌｕｃＤＨの残存活性は７５％である（図１１Ａ）。５０℃で３３６時間保管後、ＮＡＤで安定化された酵素の残存活性はもはや約１％のみであり；ｃＮＡＤの存在下で保管された酵素の残存活性はなお約７０％であることが観察される。対応するＳＤＳゲルも天然の補酵素ＮＡＤの存在下でのＧｌｕｃＤＨバンドの変化を同様に示し、新しいバンドがより高い分子量に現れ、３０ｋＤａバンドシフトする。

結局、まさに酵素のより良い結合の協同効果を通してではなく、補因子の安定化が同時に酵素の安定化をもたらすということは非常に驚くべき結果である。補因子ＮＡＤの分解は、酵素ＧｌｕｃＤＨの安定性に負に作用し、実際その不活性化の速度が速まる。天然のＮＡＤを人工の類似体に換えることにより、ＧｌｕｃＤＨはストレスのある条件下（たとえば高温下）でその補因子の存在下いっそう保管可能となる。

そのような系で、かなり改善された安定性を有する血中グルコーステストストリップを製造することができ、そのため乾燥剤なしの提示が可能である。

実施例２
ｃＮＡＤまたはＮＡＤがアルコール検出溶液に添加された。これらの混合物を３５℃で保管した。ついで酵素の安定性を定期的に調べ、酵素の残存活性を測定した。

もう一度、ＳＤＳゲルにおけるゲル電気泳動による分析（図１２および１３）は、ＮＡＤおよびｃＮＡＤの存在下における保管の間の違いを示す。よって、ｃＮＡＤにより安定化されたアルコール脱水素酵素のバンドは、６℃および３５℃のそれぞれで６５時間保管した後僅かに相違し、人口の補酵素による酵素の安定化を示す。対して、ＮＡＤの存在下３５℃で保管された酵素のバンドは、完全に消失する（図１２）。

さらに、図１３からＮＡＤにより安定化され、３５℃で保管された酵素のバンドは、保管期間が増加するにつれて弱くなり、５日後にほぼ完全に消失する。３５℃で６日間保管された後に検出されたｃＮＡＤにより安定化された酵素のバンドは、明確に酵素の分解をほとんど示さず、つまり安定性の増加を示す。

この結果は、液相中での保管の場合も確認することができる（図１４）。３５℃で６５時間後、天然の補酵素ＮＡＤの存在下でのアルコール脱水素酵素の残存活性は約６％であり、一方、人工の補酵素ｃＮＡＤの存在下でのその酵素の残存活性はなお約６０％である。

実施例３
グルコースを測定するために、各ケースにグルコース脱水素酵素、ＮＡＤ、メディエーターおよび、必要に応じ光学的指示薬を含んだ種々のテスト系が、光学的および電気化学的に測定された。

光学的測定については、最初に、各ケースとも室温で１１週間保管され、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤおよびメディエーターに加えて２，１８−リンモリブデン酸を含む４つのテストエレメントが種々のグルコース濃度で調べられた。

図１５から明らかなように、グルコース濃度の増加と共に使用された４つのメディエーター、すなわち、［（４−ニトロソフェニル）イミノ］ジメタノール塩酸塩（Ｍｅｄ Ａ）、１−メチル−５，６−ジオキソ−５，６−ジヒドロ−１，１０−フェナントロリニウムトリフルオロメタンスルホネート（Ｍｅｄ Ｂ）、７−メチル−５，６−ジオキソ−５，６−ジヒドロ−１，７−フェナントロリニウムトリフルオロメタンスルホネート（Ｍｅｄ Ｆ）および１−（３−カルボキシプロポキシ）−５−エチルフェナンジニウムトリフルオロメタンスルホネート（Ｍｅｄ Ｇ）の全てについて反射率の下落が観察された。したがって、前記メディエーターは、原則的に光学測定によるグルコースの測定に適している。

８００ｍｇ／ｄｌ領域の高いグルコース濃度で、［（４−ニトロソフェニル）イミノ］ジメタノール塩酸塩および１−（３−カルボキシプロポキシ）−５−エチルフェナンジニウムトリフルオロメタンスルホネートのそれぞれを使用した場合の測定試料の反射率は、なお約２０％あり、これら２つのメディエーターが、グルコース脱水素酵素／ＮＡＤ系を用いる光度測定に特に適していること、したがってグルコース脱水素酵素／ｃＮＡＤ系にも適していることを示している。グルコース濃度０〜８００ｍｇ／ｄｌの範囲で、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤ、１−（３−カルボキシプロポキシ）−５−エチルフェナンジニウムトリフルオロメタンスルホネートおよび２，１８−リンモリブデン酸系を用いるグルコースの変換の反応速度は、図１６に示される。

図１７の図から明確なように、グルコースの光学的な測定は、中継メディエーターとしてのジアホラーゼの使用（追加として）でも行われた。図１８は、グルコース脱水素酵素、ＮＡＤ、ジアホラーゼ、［（４−ニトロソフェニル）イミノ］ジメタノール塩酸塩および２，１８−リンモリブデン酸系（系１）、における反射率の濃度依存的減少を示す。比較として供される系は、グルコース色素オキシドリダクターゼ、ピロロキノリンキノン、［（４−ニトロソフェニル）イミノ］ジメタノール塩酸塩および２，１８−リンモリブデン酸（系２）であり、同様に反射率の濃度依存的減少を生じるが、グルコース色素オキシドリダクターゼの低い特異性という不利益を有する。０〜８００ｍｇ／ｄｌの範囲のグルコース濃度で系１を用いるグルコース変換の反応速度は、図１９に示される。

光学測定の代替法として、分析物の測定の目的で電気化学的測定法を採用することもできる。したがって、還元されたメディエーターを再酸化するために必要な電流は、グルコース脱水素酵素に加え、補酵素としてＮＡＤそしてメディエーターとして１−（３−カルボキシプロポキシ）−５−エチルフェナンジニウムトリフルオロメタンスルホネートを含有するテストエレメントと、対応するＮＡＤの代わりに安定化された補酵素ｃＮＡＤを含む系とのいずれにおいてもグルコース濃度に直線的に依存する（図２０）ことが見出された。

したがって、脱水素酵素／安定な補酵素系を用いる分析物の測定は、電気化学的検出および補酵素とは独立している別の波長での評価によっても可能である。全ての処方は、安定な酵素／補酵素対の使用によりさらに安定化されるべきでもある。

Claims (15)

1. 酵素を安定化する方法であって、該酵素を安定な補酵素の存在下で保管することを特徴とする方法であって、
   前記酵素が、グルコース脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．４７）、乳酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２７、１．１．１．２８）、リンゴ酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．３７）、グリセロール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）、アルコール脱水素酵素（Ｅ．Ｃ．１．１．１．１）、α−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素またはアミノ酸脱水素酵素から選択される脱水素酵素であり、前記安定な補酵素が、一般式（II）を有する化合物
   

   

   （式中、
   Ａ＝アデニン、または７−デアザアデニン、８−アザアデニンおよび７−デアザ−８−アザアデニンであって、７−デアザアデニンおよび７−デアザ−８−アザアデニンは、任意には、第７位でハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルキニル、Ｃ₁〜Ｃ₆−アルケニルまたはＣ₁〜Ｃ₆−アルキルにより置換されていてもよい、
   Ｔ＝それぞれ独立してＯ、Ｓ、
   Ｕ＝それぞれ独立してＯＨ、ＳＨ、
   Ｖ＝それぞれ独立してＯＨまたはリン酸基、
   Ｗ＝ＣＯＯＲ、ＣＯＮ（Ｒ）₂、ＣＯＲ、ＣＳＮ（Ｒ）₂、Ｒ＝それぞれ独立してＨまたはＣ₁〜Ｃ₂−アルキル、
   Ｘ₁＝Ｏ、
   Ｘ₂＝Ｏ、
   Ｙ＝Ｏ、
   Ｚは下記一般式（III）で表される飽和の炭素環またはヘテロ環の五員環であって、
   

   

   上記式（III）のＣ（Ｒ⁴）₂が上記式（II）のＸ²に結合し、
   上記式（III）のＲ^6'が上記式（II）のピリジン環の窒素原子に結合し、
   Ｒ^5'およびＲ^5''との間が単結合であり、
   Ｒ⁴＝それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ₃、
   Ｒ⁵＝ＣＲ⁴ ₂、
   Ｒ^5'＝ＮＨ、ＮＣ₁〜Ｃ₂−アルキル基、ＣＲ⁴ ₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
   Ｒ^5''＝ＣＲ⁴ ₂、ＣＨＯＨ、ＣＨＯＣＨ₃、
   Ｒ⁶、Ｒ^6'＝それぞれ独立してＣＨまたはＣＣＨ₃）
   またはその塩、もしくは必要に応じて還元型
   から選択されることを特徴とする方法。
2. グルコース脱水素酵素が酵素として使用されることを特徴とする請求項１記載の方法。
3. Ｗ＝ＣＯＮＨ₂またはＣＯＣＨ₃である請求項１または２記載の方法。
4. Ｒ⁵がＣＨ₂である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. Ｒ^5'がＣＨ₂、ＣＨＯＨおよびＮＨから選択される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. Ｒ^5'およびＲ^5''がそれぞれＣＨＯＨである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. Ｒ^5'がＮＨであり、かつＲ^5''がＣＨ₂である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
8. 安定な補酵素がカルバＮＡＤであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
9. 安定な補酵素により安定化される酵素が、少なくとも２週間保管されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 安定な補酵素により安定化される酵素が、少なくとも２０℃の温度で保管されることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 安定な補酵素により安定化される酵素が乾燥剤なしで保管されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 安定な補酵素により安定化される酵素が、少なくとも５０％の相対湿度で保管されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 安定な補酵素により安定化される酵素の保管が乾燥物として行われることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 安定な補酵素により安定化される酵素の保管が液相において行われることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
15. 安定な補酵素により安定化される酵素の保管が、テストエレメントにおいて行われることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。

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