SU1043568A1

SU1043568A1 - Способ определени активности дегидрогеназ крови

Info

Publication number: SU1043568A1
Application number: SU813302146A
Authority: SU
Inventors: Вадим Степанович Данилов; Ольга Александровна Беляева; Анвар Джураевич Исмаилов; Николай Сергеевич Егоров
Priority date: 1981-06-11
Filing date: 1981-06-11
Publication date: 1983-09-23

Description

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю- , крови, разбавл.енную в 10щ и и с тем, чуо в качестве иссле- 1000 раз в количестве дуемой жидкости используют сыворотку 0,005-1 мл. ,

1043568

. , ; . . . Изобретение ртноситс к способам определени ферментов и может быть применено,в микробиологической и -медицинской отрасл х промышленности, гематологии, физиологии и аналитической химии. .

ИзЬестны различные способы определени лак тив нос тиде гидрогена 3, основанные на проведении ферментативной реакции с последующим учетом пррДуктов реакции либо регистрацией про исход щих в ходе ее сопутствующих влё:ний . Примен емые способы условно могут быть охарактеризованы как колориметрический , спектрЬфотрметрический и биолк лйнесцентный.

Известен наиболее чувствительны и перспективный биолюминвсцентный Способ, заключающийс в смещении раст-вора анализируемой дегид.рогеназы с никртинамидадениндинуклеотидом (НАД), субстратом, иммобилизованными НАДН, ФМН-Оксидоредукт азой и бактериальной . J цифepaзoй и регистрации биолюмин ес.ценции , по уровню которой суд т об активности фермента дегидрогеназы. Чувствительность способа при анализе .чистых растворов индивидуальных дегидрогеназ 10 -10моль ,1 .

Недостатки Дан:н6го способа г- невысока стабильность фермента (фермент в иммобилизованном виде стабилен де ёолёе 1,5-2 мес.), а также невозможность использовани в анализе смеси веществ в биологических ткан х вследствие , подверженности денатурации. I Данный способ при анализе дегид . рогеназ в смеси веществ сыворотки КРОВИ оказываетс малопригодным . всл ствие побочных вли ний компо ентов . сыворотки на люциферазу.. Чувствихельность способа в таких средах Значительно ниже, чем в чистых раст вррах -индивидуальных дегидрогеназ, а воспроизводимость результатов не:удовлетворительна/ что делает способ, малопригодным дл использовани в естественных биологических средах . : Наиболее близким к изобретению по достигаемому результату вл етс спектрофотометрический способ определени активности дегидрогеназ кровиг Щредусматривающий инкубацию исслед}гемрй жидкости с субстратом оп:ред1ел ёмого (77,5 мМ) в при сУтстеий НАД (6,25 ММ) в буферной среде при рН 8,8 с по :ледуюцим пект

рофотометрированием образукадегос восстановленного НАД, по ко 1ичеству которого определ ют активность дегидрогеназы 2.

Известный способ позвол ет работать со сложными естеств.енными биоло. гцческими жидкост ми, однако н обладает следующими недостатками -. невысокой чувствит |Льностью (не выше 10 моль НАДН), невысокой надежностью (сцектрофотометрирование в присутст-j

; ВИИ посторонних дегидрогеназ в анализируемом растворе) , неэкономичностью (дл применени способа необходима дорогосто ща высокочувствительна

:спектральна аппаратура). целью изобретени йвл етс повышение чувствительности способа опреде ЛеНИЯ.-;; ; ,;,. / , /

i Поставленна цель достигаетс тем что согласно способу определени активности дегидрогвназ крови, предус|матривающему инкуба.цию исследуемой жидкости с субстратом определ емого фермента в присутствии «икотинамид-н . адениндинуклеотида в буферной среде,, инкубацию рсуществл ют при рН 7,0-8,5 при содержании субстрата в чСмесиЮ|10 М , никоТИнамидадениндинуклеотвДа 10 -10 Ми при дополнительном введеНИИ в инкубационную среду алифатического эльдегида-деканал в крли- У ;честве Ю -10 М, флавинмононуклео;Тнца - М и раствора бактериальной люциферазы Photobacterium fischeri с общим содержанием белка . 1 Ю -1,0 мг, с последук дим «змере;нием уровн биолюминесценции смеси, по кoтopo 4y с помсацью калибровочной кривой определ ют активность фермен-, Та., - . . .:.: / . ,;. -; , . , Причем в качестве исследуемой жидкости используют сыворотку крови, разбавленную в 10-1000 раз в количестве 0,005-1 мл.

Способ осуществл ют следующим образом.. -. / :. / - -,

Берут сыворотку крови,, разбавл ют ее в 10-1000 раз, смешивают 0,0051 мл разбавленной сыворотки крови с люцйферазиой смесью, содержащей нико11та « (Ш эиаениндинуклеотид (НА.д} конечной концентрации 0,0001 - 17701 Ш 0,01 - 0,1 мл.алифатического альдегида - с коначвой крнцентраодвй Mr 0,,1 МП флаайй- монрнуклеотшха с конечной концентрацаей .10 -10-М; ,1 мп бактериальной люциферазы с конечной концентрацией по белку 0,01-10 мг в 0,1-1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,0-8,5), добавл ют субстрат ана лизируемой дегидрогеназы конечной концентрации 0,001-0,05 М и определ ют уровень биолюминесценции :меси за 1 - 5 мин. Предлагаемый способ требует незна чительных количеств крови (дл анализа достаточно 10 мкл разбавленной в 100 раз сыворотки или лиофилиэфван ной плазмы крови), чувствительность его выше, чем у известньах (спектррскопических и флуориметрических) , дл анализа дегидрогеназ в крови в 100-100-0 раз, а проведение способа требует незначительных затрат времени . На фиг. 1 изображена зависимость ,интенсивности биолюминесценции люцифераэной смеси от увеличени концентрации сБ вороткикро и в присутствии лалтата (что характеризует активност лактатдеги рогейазы крови); на фиг.2 , зависимость интенсивности биолюми- нерценции люциферазной смеси от увеличени концентраций лиофилизованной плазмы крови в присутствии малата (что характеризует /активность малатдегидрогеназы ); на фиг. 3 - зависимость интенсивности биолюминесцён цйи люциферазной смеси, от увеличени кон центрации лиофилизованной плазмы кро ви, предварительно подвергнутой йагрёваиию до бО и 65 в присутствии лактата -(что .характеризует активност изрфермецтрв, лактатдегидрогеаазы) .. Бактериальную люциферазу .получают на основе изв.естного способа (31. Бактерии выращивают на среде, содержащей , г/л пептон 1О, глицерин 3 мл дрожжевой экстракт 2 NaCl 30; Na2HPO .5,3; KH2PO42,lj . (NH4 ), НРОд 0,5; MgS04 0,1, рН 7,.4 при , 0.одержании кислорода 4-10% в течение 16 ч, сепарируют, разрушают под прес сом при температуре жидкого азота, . гсроматографируют на ирнооЪменнике flEAE 50 в 20-50%-ном этиленгликолевом буфере и либо перераствор ют в О,05 М триэтиламин-НС1 буфере, добав л BSA 0,1 мг/мл, и лиофилизируюф, либо оса здают 80%-ным сульфатом -аммони и хран т при -20С. . Способ позвол ет получать преда- рат люциферазы с высокой стабильное;ть« , T.ei препарат тпоциферазы в йофйлйзованном виде тер ет за год. при хранении при актив-ность до. , препарат в сульфате аммони npjj хранении в тех же услови х йр«к-г тически не тер ет в течение года своей активности. П р и М е р 1. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыврротке крови человека при использовании лиофилизоваНного препарата бактериальной люциферазы с содержанием белка 0/1 мг/мл с удельной активностью Ю квант/с, мг белка. Приготавливают растворы фосфатного буфера, бактериальной люциферазы в фосфатном буфере, субстрата анализируемой дегщцрогеназы, НАД, ФМН, альдегида-деканал , сыворотки крови человека в. различных разведени х в фосфатном буфере. Берут набор стекл нных стаканчиков . (5-20 шт.) и во всех стаканчиках готов т люциферазную смесь, содержащую 600 мкл 0/1 М Ng-фосфатногр буфера (рН 8,0), 10 мкл 0,01 М НАД, 40 мкл 0,001 М ФМН, 100 мкл лактата Na, 0,1 М люциферазу {0,1 мг/мл).В стаканчик с люциферазной смесью, содержащей субстрат анализируемой : дегидрогеназы - лак-тат, добавл ют 10 разбавленной сыворотки крови, помещают в кюветное отделение фото- . ме.тра с детектором света и определ - ют интенсивность люминесценции смеси за определенный промежуток времени (1 мин). Интенсивность люминесценции выражают в милли(макрр) вольтах или в квантах в секунду (1 мВ равен 10 10 ° KB ант/с) . Получе нную интенсивность люминесценции, использу калибровочную кривую люминесценции от НАДН, выражают в единицах активности фермента - моль НАДН/мин/мл. На фиг. 1 приведена зависимость интенсивности биолюминесценции люциферазной смеси и активности лактат- дегидрогеназы от концентрации сыворотки крови человека. Видно, что с увеличением концентрации сыворотки линейно увеличиваетс интенсивность биолюминесценции. Таким образом, мож-. но сделать вывод, что, например, 0,04% раствор сыворотки крови содерт ;чшт лактатдегидрогеназу, вызывающую увеличение: люминесценции смесина 35 мВ (5,5 «10 KB ант/с), что соответствует изменению активности лактатдегидрогеназы на 7 10 моль НАДН/ мин/мл,; П, р и ме р 2. Определение-активности малатдегидрогеназы крови челрвека при использовании лиофилизован- ного препарата бактериальной люииферазы с срдержанием белка 0,1 .wi, е удельной активностью 1о квад1т/с лг белкам; Препарат людиферазы получают .аналогично примеру 1. Люциферазнал сМесь готовитс из тех же веществ и той. же пропорции, чтои в примере 1, с той лишь разницей, что в качестве субстрата анализируемой дегидрогеназы дрбавл ют 10 мкл малата с конечнрй крнцентрацией 10 мМ. В стаканчик с Люциферазнрй смесью/ срдержащей.малат, внос т сыворотку . крови и измер ют уровень люминесценции за 1 мин. Пр калибровочной

кривой интенсивность люминесценции в МИЛЛИ(микро) вольтах выражают в единицах активности фермента НАДН/мин/мл. . ,

На фиг 2 приведена зависимость интенсивности люминесценции люцифераэыой смеси, с малатом от концентраций сыворотки крови. Видно, что добавление . 0,2% раствора сыворотки крови вызывает возраста:ние .люминесценции смеси на 5 мВ, что соответствует изменению активности мала1тдегидрогеназы а НАДН/мин/мл.

Приме р 3. Определение активности изоферментов лактатдегндрогеназы в лиофилиэованной плазме крови человека с помощью препарата бактериальной люциферазы в сульфате аммони с содержанием белка 0,2 мг/мл с удельной активностью 10 квант/с«мг белка. :

Препарат люциферазы получен из бактерий/ вЕфащенных в описанных услови х , отличающихс тем, что, посде хроматографировани на ионообменнигке ДБАБ-50 и переоса}кдени в триэтилН&1 буфер, препарат подвергаетс высаливанию 80%-ным сульфатом аммони , осгикдаетс центрифугированием при 18000 и хранитс при -20°С в сульфате с1ММОНИЯ.

Берут лиофилизованную плазму кро .ви, раствор ют её в 0,1 М фосфатном буфере, помацают раствор .плазмы крови в термостат и выдерживают. 15 мин при 60°С (получают термостабильные изоферменты лактатдег-идрогеназы ЛД-1,2) или при (получают термостабильный изофермент ЛД-1, после чего подвергают плазму быстрому охлаждению во льду.

Полученную плазму крови,добавл ют к люциферазной , приготовлен ной по методике, описанной в примере

1, и измер ют уровень люминесценции смеси, по которому суд т об активности изо(1 ерментов лактатдегидрогеназы. На фиг. 3 приведена зависимость интенсивности люминесценции рмеси от .концентрации плазмы, прогретой до 60

(крива 1) и до 65°(крива 2) в присутствии лактата - 11а.

Видно, что с увеличением концентра1ции плазмы крови линейно возрастает активность люминесценции. .Увеличение концентрации плазмы на 0,4 мг/мл вызывает возрастание люминесценции на 18 мВ (ЛД-1) или на 35 MB (ЛД-1,2) Это изменение .люминесценции смеси соответствует изменению активности ЛД-1,2 на 2,310- моль НАДН и ЛД-1,3 на 4 ,5 10 моль НАДН/мин/мл.

Изобретение,обеспечивает повышение чуствительности способа (по сравнению с известными способами определени активности дегидрогеназ крови предлагаемый позвол етповысить чувствительность до 10 10 моль), повышение зкономичности способа (препарат люциферазы дл указанных целей . получают по.простой методике очистки , что удешевл ет препарат), на измерение активности ферментов исполь- зуют незначительные количества сыворотки или .пирфилизованной плазмы крови . Препарат не подвергаетс денатутрирукщему воздействию компонентов крови, что позвол ет использовать его дл анализа в смеси веществ. Препарат люциферазы эффективен в широком диапазоне рН и температур (рН 5,5 -8,.5гТ°- 5-25с), что существенно расшир ет возможности его применени . Предл1агаемые дл использовани в анализе препараты .пюциферазы обладают устойчивой кинетикой свечени и высокой стабильностью..

(;

i ем/ 2,0 MrJNn-(плазм 1.2 W Фиг.З }

Claims

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ДЕГИДРОГЕНАЗ КРОВИ, предусматривающий инкубацию исследуемой жидкости с субстратом определяемого Фер мента в присутствии никотинамидадениндинуклеотида в буферной среде, отличающийся тем, что, .с чувствительности спо· осуществляют при целью повышения соба, инкубацию pH 7,0-8,5 при содержании субстрата в смеси 1О’’-1О'⁵М, никотинамидадениндинуклеотида - 1О*⁴-1(Г^{2 3}М и при допол нительном введении в инкубационную среду алифатического альдегида-деканаля в количестве lO^-lO^M, флавинмононуклеотида - 10'⁵-10⁷М и раствора бактериальной люциферазы Photobacterium fischeri с общим содержанием белка 1 10^-1,0 мг, с последующим измерением уровня биолюминесцен ции смеси, по которому с помощью калибровочной кривой определяют активность фермента.

,SU „..1043568

2. Способ по π. 1, о т л и ч a rain и й с я тем, чуо в качестве исследуемой жидкости используют сыворотку крови, разбавленную в 101000 раз в количестве 0,005-1 мл..

' · (

1 '