JP5722334B2

JP5722334B2 - 酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の複合体及びその用途

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Publication number: JP5722334B2
Application number: JP2012537814A
Authority: JP
Inventors: ナン−ヒュク・チョ; テク−チン・チョン; セウン−ヨン・ソン; ジ・ヒュン・ミン; ジュン・ファ・ウ; ヨン−ケウン・キム
Original assignee: コリア・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・ビジネス・ファウンデーション
Priority date: 2009-11-03
Filing date: 2010-11-03
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2030-11-03
Also published as: JP2013509452A; KR101276180B1; EP2500350A4; EP2500350B1; KR20110049724A; US20120219504A1; WO2011055980A2; EP2500350A2; WO2011055980A3; US9718860B2

Description

本発明は、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の複合体、医薬の製造のための薬物伝達体としてのその用途、上記複合体を含むワクチン組成物及び造影剤に関する。

ナノ技術は、多様な分野において応用されていて、特に医療分野と生命工学分野において最も広く利用されている。医療分野では、ナノ技術を利用して診断と治療の革命を可能にする迅速且つ効果的な塩基配列分析、または人体疾病を診断及び予防することができるナノ感知分析に応用されていて、生命工学分野では、遺伝子や薬物の伝達、またはナノ配列を基盤とした分析技術などに活用されている。

現在、さまざまな素材が多様なサイズのナノ粒子を製造するのに使用されていて、このようなナノ粒子は、免疫治療、磁気共鳴映像（ＭａｇｎｅｔｉｃＲｅｓｏｎａｎｃｅＩｍａｇｉｎｇ、ＭＲＩ）診断、薬物伝達体系開発などに活用されている。

これらのうち酸化亜鉛ナノ粒子は、その電気的、光学的特性に起因して、窯業分野、電気素材分野、センサー、医生物学分野に広く使用されている。特に最近になって、酸化亜鉛と有機物質を利用したナノ構造体合成を通じて生物学的感知装置などを開発するのに幅広く活用されていて、人体危害性が低いため（食品添加物として米国ＦＤＡの使用許可物質）食品、医薬品産業分野において軟膏、色素、食品添加物などにも広く使用されている。したがって、生体適用可能性が非常に高い素材として注目されていて、今後、多様な医生命工学分野への活用が期待されている。

酸化亜鉛ナノ粒子を医生命工学分野に活用するためには、タンパク質などの生体高分子と結合させる過程が必要である。しかし、この素材自体が他の有機物質と強く結合しない特性があるため、大部分の場合において、酸化亜鉛ナノ粒子の表面を化学的に処理する製造工程が導入されている。

Ｋｊａｅｒｇａａｒｄｅｔ．ａｌ、２０００Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６（１）１０−１４；Ｔｈａｉｅｔ．ａｌ．、２００４Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．８７（２）１２９−１３７

しかし、このような酸化亜鉛ナノ粒子の表面処理過程は、有機溶媒または化学的反応性が高い化合物を使用しなければならないので、人体に直接使用されることができるナノ粒子または構造体の製造及び活用に制約となっている。

本発明は、酸化亜鉛−結合性ペプチドを利用して酸化亜鉛ナノ粒子の生体適合性を改質し、これを医薬の製造のための薬物伝達体として活用するか、またはワクチン、造影剤、生物製剤を効果的に分離することができる分離剤、温熱治療をはじめとする治療剤、バイオセンサーに応用可能なビーズなどの製造に使用しようとする。

本発明者らは、酸化亜鉛ナノ粒子を化学的に改質する代わりに、酸化亜鉛−結合性ペプチドを導入し、酸化亜鉛ナノ粒子の生体利用性を改善させることができるという点に着目した。下記実施例で確認することができるように、酸化亜鉛−結合性ペプチドを酸化亜鉛ナノ粒子に導入する場合、酸化亜鉛ナノ粒子を利用して伝達しようとする腫瘍抗原の結合力が酸化亜鉛−結合性ペプチドを使用しない群に比べて著しく高い。したがって、本発明は、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の複合体を提供する。

本発明において使用しようとする酸化亜鉛−結合性ペプチドは、一般的なペプチドに比べて酸化亜鉛ナノ粒子に対する親和力（ａｆｆｉｎｉｔｙ）に優れたペプチドを言う。下記実施例から明らかなように、酸化亜鉛−結合性ペプチドを使用しない場合、タンパク質薬物は、酸化亜鉛ナノ粒子とほとんど結合しない。しかし、酸化亜鉛−結合性ペプチドを使用する場合、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの薬物は、特別な化学的固定方法を使用しなくても、酸化亜鉛ナノ粒子に導入することができるようになる。

酸化亜鉛に結合するペプチドをペプチドライブラリスクリーニングを通じて捜し出す方法については、既存に報告されているが（Ｋｊａｅｒｇａａｒｄｅｔ．ａｌ、２０００Ａｐｐ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６（１）１０−１４；Ｔｈａｉｅｔ．ａｌ．、２００４Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．８７（２）１２９−１３７）、これら論文では、大腸菌表面にペプチドを発現させて、酸化亜鉛フィルムに結合された大腸菌数を測定することによって、酸化亜鉛との結合有無を間接的に確認しただけであり、その結合力に対する詳細な分析は行われかった。また、これら論文では、酸化亜鉛−結合性ペプチドを酸化亜鉛ナノ粒子に導入し、これを薬物伝達体として使用するか、またはワクチン、または造影剤などとして使用することができることについては全然開示していない。

これより、上記先行技術に開示されたペプチドライブラリを利用した酸化亜鉛−結合性ペプチドのアミノ酸配列を分析した結果、酸化亜鉛−結合性ペプチドは、下記式（Ｉ）または（II）の構成を有することが好ましいという事実を知見した。

［（Ａｒｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ａｒｇ）_ｍ−リンカー］_ｎ（Ｉ）
［（Ａｒｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）_ｍ−リンカー］_ｎ（II）
上記式中、
Ｘ_１は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり、
Ｘ_２は、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、またはＡｒｇであり、
ｍは、１〜５の整数であり、
ｎは、１〜１００の整数である。

すなわち、Ａｒｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ａｒｇ−Ｌｙｓモチーフを共通的に含み且つ直列繰り返し（ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ）構造を有するようにすれば、上記酸化亜鉛−結合性ペプチドの酸化亜鉛に対する結合力が増加するものと現われた。直列繰り返し構造を有するようにするために、上記モチーフが流動的に結合することができるリンカーを含ませた。このようなリンカーとして、下記実施例では、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａを使用したが、モチーフ間の結合に流動性を提供することができる形態ならリンカーの構成は、特に制限されない。例えば、このようなリンカーには、Ｇｌｙが多数含まれることが好ましいことができる。例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｘａａ−Ａｌａ（Ｘａａは、任意のアミノ酸）の形態もリンカーに使用可能である。上記Ｘａａとしては、ＳｅｒやＶａｌが好ましいものと予想される。下記実施例で確認することができるように、このような酸化亜鉛−結合性ペプチドは、酸化亜鉛との結合性が非常に優れているので、酸化亜鉛ナノ粒子の生体内または細胞内活用のための酸化亜鉛ナノ粒子の表面改質のために使用されることができる。

したがって、本発明は、下記式（Ｉ）または（II）の酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の複合体を提供する。

一具体例において、Ｘ_１は、ＰｒｏまたはＴｈｒであり、Ｘ_２は、Ｈｉｓであり、ｍは、１〜５の整数であり、ｎは、３〜５０の整数であることができる。

他の具体例において、上記酸化亜鉛−結合性ペプチドは、配列番号１〜４のうちいずれか１つのアミノ酸配列を有するペプチドであることができる。

配列番号１：ＡｒｇＰｒｏＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｌａ
配列番号２：ＡｒｇＴｈｒＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｌａ
配列番号３：ＡｒｇＰｒｏＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｌａ
ＡｒｇＰｒｏＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｌａＡｒｇＰｒｏ
ＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｌａ
配列番号４：ＡｒｇＴｈｒＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｌａ
ＡｒｇＴｈｒＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｌａＡｒｇＴｈｒ
ＨｉｓＡｒｇＬｙｓＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｌａ

本発明において、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質は、式（Ｉ）または（II）の酸化亜鉛−結合性ペプチドそのものであることができる。この場合、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体に追加にタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化合物医薬、造影物質などの薬物が追加に導入されることができる。このような薬物は、例えば、複合体と物理的または化学的に結合されることができ、これにより、生体内または細胞内にこれら薬物を伝達する役目をするようになる。

この場合、薬物の効果的な伝達のために、複合体表面には、標的指向性リガンドが結合されることができる。本発明の複合体が組職や細胞に導入されることができるように標的化させるリガンドを意味する。このような標的指向性リガンドとしては、抗体、アプタマーだけでなく、細胞表面の特定受容体と結合するものと知られている化合物リガンドも有用に使用することができる。このような抗体、アプタマー、化合物リガンドの具体的な種類は、当業界によく知られている。

上記複合体と薬物との物理的または化学的結合、または上記複合体と標的指向性リガンドとの物理的または化学的結合は、複合体表面に存在するタンパク質と薬物または標的指向性リガンドとの結合により行われ、これは、当業界に公知された方法を利用して容易に行われることができる。

例えば、複合体表面のタンパク質に存在する官能基と薬物や標的指向性リガンド上に存在する官能基との共有結合により行われることができる。このような官能基は、タンパク質、薬物または標的指向性リガンド上に本来存在するものであることができるが、必要な場合、相互結合可能な官能基を有するように改質することができる。タンパク質上に存在する官能基と薬物または標的指向性リガンド上に存在する官能基は、互いに結合を形成することができるように公知の官能基の結合例から選択されることができる。このようなこのような公知の官能基の結合例のうち代表的な例を下記表１に示した。

または、上記酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質は、酸化亜鉛−結合性ペプチドだけでなく、第２のペプチドをタンパク質内に含む融合タンパク質であることができる。このような融合タンパク質は、当業界に公知された通常の組換えタンパク質製造方法により容易に製造することができる。この際、第２のペプチドは、酸化亜鉛−結合性ペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置することができ、その位置は、特に制限されない。

例えば、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質に含まれる第２のペプチドは、抗原であることができる。

すなわち、一具体例において、上記タンパク質は、酸化亜鉛−結合性ペプチドと抗原を含む組換えタンパク質であることができる。

酸化亜鉛−結合性ペプチドと抗原を含む組換えタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体は、後述するように、非常に多様な用途に使用されることができる。例えば、酸化亜鉛−結合性ペプチドと抗原を含む組換えタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の複合体は、免疫治療のためのワクチン組成物の製造のために使用されることができる。酸化亜鉛ナノ粒子は抗原が含まれた組換えタンパク質に対する担体または薬物伝達体として利用される。

一具体例において、上記抗原は、腫瘍抗原であることができる。下記実施例では、酸化亜鉛−結合性ペプチドと腫瘍抗原を含む組換えタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の複合体を樹枝状細胞に導入し、このような樹枝状細胞をワクチンとして利用して癌を治療または予防することができることを示す。

このような腫瘍抗原の種類は、特に制限されず、当業界に公知されている腫瘍抗原ならいずれも使用可能である。癌の治療または予防のために使用されることができる腫瘍抗原の代表的な例は、癌腫胚芽抗原、サバイビン、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｉｇイディオタイプ、ＣＤＫ４、カスパーゼ−９、ベータ−カテニン、ＣＩＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、変異されたｐ２１／ｒａｓ、変異されたｐ５３、プロテナーゼ３、ＷＴ１、ＭＵＣ−１、正常ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｇ２５０、ＨＰＶＥ６／Ｅ７、ＥＢＶＬＭＰ２ａ、ＨＣＶ、ＨＨＶ−８、アルファフェトプロテイン、５Ｔ４、オンコ−トロホブラスト及びグリコプロテインなどを含む。このような腫瘍抗原の例及びこれらを発現する癌細胞については、当業界によく知られている。

なお、本発明において使用される酸化亜鉛ナノ粒子は、その全体が酸化亜鉛よりなる酸化亜鉛ナノ粒子だけでなく、その他の成分を含む酸化亜鉛ナノ粒子をも含むものと定義する。

一具体例において、本発明の酸化亜鉛ナノ粒子は、酸化亜鉛だけよりなるものであることができる。この場合、本発明の複合体は、酸化亜鉛ナノ粒子を通じてタンパク質などの薬物を生体内または細胞内に伝達する役目を行い、また酸化亜鉛ナノ粒子の本然の特性によって光学イメージングを可能にする。

一具体例において、本発明の酸化亜鉛ナノ粒子は、酸化亜鉛によってナノ構造の外部が一部または全部取り囲まれたナノサイズの物質よりなることができる。このような例として、ダンベル（ｄｕｍｂｂｅｌｌ）形状、ナノ線、合金、薄膜などを例示することができる。ダンベル形状では、一方は、一部／または全部が酸化亜鉛で構成されることができ、ダンベルの他方は、磁性、金属、高分子、セラミック、半導体などで構成されることができる。また、合金は、金属、セラミック、半導体と酸化亜鉛の合金よりなることができる。（例：ＦｅＯとＺｎＯ、ＡｕとＺｎＯ）、また、ナノ線の場合、電気化学的または湿式方法で形成されることができるが、ＺｎＯナノ線、ＺｎＯが含まれたナノ線（例：ＡｕＺｎＯ合金ナノ線）、ＺｎＯがコーティングされたナノ線を使用することができる。また、ＺｎＯが表面に存在する薄膜を使用することもでき、使用先によって上記構造が複合的に構成された構造（例：薄膜に１次元ナノ船が突出されている構造、粒子表面にナノ粒子、ナノ線などが付着された構造）も含まれることができる。

他の具体例において、上記酸化亜鉛ナノ粒子は、コア−シェル構造を有するものであることができる。コア−シェル構造を有する酸化亜鉛ナノ粒子において、シェルは、本発明のタンパク質との結合のために酸化亜鉛よりなり、コアには、本発明による複合体の適用目的によって適当な物質を選択して位置させることができる。

例えば、一具体例において、上記コアは、金属物質（ｍｅｔａｌｍａｔｅｒｉａｌ）、磁性物質（ｍａｇｎｅｔｉｃｍａｔｅｒｉａｌ）、磁性合金（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｏｙ）または半導体物質（ｓｅｍｉｃｏｄｕｃｔｏｒｍａｔｅｒｉａｌ）よりなるものであることができる。上記金属は、特に制限されないが、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｕ及びＡｕよりなるグループから選択されることが好ましい。上記磁性物質も、特に制限されないが、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｇｄ、Ｍｏ、ＭＭ’２Ｏ４、及びＭｘＯｙ（Ｍ及びＭ’は、それぞれ独立的にＣｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｄ、またはＣｒを示し、０＜ｘ≦３、０＜ｙ≦５）よりなるグループから選択されることが好ましい。また、上記磁性合金も特に制限されないが、ＣｏＣｕ、ＣｏＰｔ、ＦｅＰｔ、ＣｏＳｍ、ＮｉＦｅ、及びＮｉＦｅＣｏよりなるグループから選択されることが好ましい。また、半導体物質としては、これに制限されるものではないが、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅなどが選択されることができる。

一具体例において、上記コアは、磁性物質よりなるものであることができる。この場合、本発明の複合体を利用すれば、酸化亜鉛ナノ粒子内部の磁性物質によって外部磁場による生物製剤（ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞など）の効果的な分離、薬物伝達、高効率診断、外部磁場による温熱治療（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）をはじめとする治療、そしてＭＲＩ造影などが可能である。

一具体例において、上記コアは、Ｔ１またはＴ２造影物質よりなるものであることができる。この場合、本発明の複合体は、酸化亜鉛ナノ粒子を通じてタンパク質を生体内または細胞内に伝達することができると共に、酸化亜鉛内のＴ１またはＴ２造影物質によってＭＲＩ造影が可能であり、酸化亜鉛ナノ粒子本然の特性によって光学イメージングが可能なマルチモーダル特性を有するようになる。コア−シェル構造を有する酸化亜鉛ナノ粒子で使用されることができるＴ１またはＴ２造影物質の種類は、特に制限されず、Ｔ１またはＴ２造影物質の例は、当業界によく知られている（例えば、大韓民国特許公開１０−２０１０−００２３７７８号公報参照）。

一具体例において、上記コアは、酸化鉄よりなるものであることができる。下記実施例では、コアがＴ２造影物質である酸化鉄よりなり、シェルが酸化亜鉛よりなるコア−シェル構造の酸化亜鉛ナノ粒子を製造し、このような酸化亜鉛ナノ粒子と、酸化亜鉛−親和性ペプチドと腫瘍抗原を含むタンパク質との複合体を利用して癌細胞を造影し、癌細胞を死滅させることができることを示す。

本発明による酸化亜鉛ナノ粒子は、好ましくは、高分子界面活性剤を利用して製造されたものであることができる。高分子界面活性剤のうち両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）界面活性剤を使用すれば、酸化亜鉛ナノ粒子を有機溶媒上で高温熱分解法（Ｔｈｅｒｍｏｄｅｃｏｍｐｏｓｔｉｏｎ）で製造することができ、共沈法（Ｃｏ−ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）など他の方法で製造したナノ粒子に比べて結晶性に優れていて、均一なサイズを有する酸化亜鉛ナノ粒子を得ることができると共に、両親媒性界面活性剤を使用せずに有機溶媒上で製造したナノ粒子に比べて水に対する分散性が相対的に優れているという長所を提供する。このような両親媒性界面活性剤としては、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ポリプロピレングリコール）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を使用することができる。

なお、上記酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体形成には、特別な方法が要求されない。酸化亜鉛−結合性ペプチドの酸化亜鉛に対する親和性によって、上記タンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子を単純にインキュベーションすることだけでも、簡単に複合体を形成することができる。

また、本発明は、上記酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の複合体を薬物伝達体として含む医薬組成物を提供する。前述したように、本発明の複合体は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞、化合物医薬、造影物質などの薬物と結合し、これら薬物を生体内または細胞内に伝達する薬物伝達体として機能することができる。このような薬物は、前述したように、上記複合体と物理的または化学的に結合されることができ、このような薬物以外にも、複合体に標的指向性を付与するための標的指向性リガンドが追加に結合されることができる。また、本発明の医薬組成物は、複合体と結合される薬物以外にも、追加の薬物をさらに含むことができ、医薬の製剤化のために一般的に利用されるさまざまな賦形剤を含むことができる。

また、本発明は、薬物を、上記酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の複合体と混合するか、または上記複合体に結合させることを含む薬物と上記複合体を含む医薬組成物の製造方法を提供する。

また、本発明は、酸化亜鉛−結合性ペプチド及び抗原を含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体を含むワクチン組成物を提供する。前述したように、酸化亜鉛−結合性ペプチド及び抗原を含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体は、ワクチン組成物の製造のために使用されることができる。酸化亜鉛−結合性ペプチドは、抗原が酸化亜鉛ナノ粒子に結合することを可能にして、酸化亜鉛ナノ粒子を薬物伝達体として抗原を生体内または細胞内に導入することを容易にする。生体内または細胞内に導入された抗原は、上記抗原に対する細胞性または体液性免疫反応を引き起こし、人体の免疫システムを通じて上記抗原によって媒介される疾患を治療または予防するようになる。このような抗原の種類は、特に制限されず、人為的に免疫反応を起こし、疾病を予防または治療するために使用される抗原なら、いずれも本発明のワクチン組成物の製造のために使用することができる。一具体例において、上記抗原は、腫瘍抗原であることができ、この場合、このようなワクチン組成物は、癌の治療または予防のために使用されることができる。

本発明の一具体例において、上記ワクチン組成物は、追加に兔疫細胞を含むものであることができる。本発明において、兔疫細胞は、免疫系を担当する細胞を総称するもので、具体的には、樹枝状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞などを含む。一具体例において、上記兔疫細胞は、樹枝状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞であることができる。なお、このような組成物には、細胞以外にも細胞を安定に維持することができる緩衝液などが含まれる。

兔疫細胞を利用した癌の免疫治療方法については、当業界によく知られている。例えば、患者から樹枝状細胞を回収した後、樹枝状細胞にＴＡＴタンパク質と腫瘍抗原の融合タンパク質を導入し、このように腫瘍抗原を収得した樹枝状細胞をさらに体内に注入し、樹枝状細胞にとって免疫反応を誘導するようにして、癌細胞を死滅させる方法である。腫瘍抗原を樹枝状細胞に導入するために、ＴＡＴ融合タンパク質を利用するなどの既存の方法は、手続が複雑であるだけでなく、培養時間が多く所要され、そのため、樹枝状細胞の生存率の低下、生体内の導入後の効果の低下などが問題になった。しかし、本発明の酸化亜鉛−結合性ペプチド及び抗原を含むタンパク質及び酸化亜鉛ナノ粒子の複合体を兔疫細胞に導入し、これをワクチン組成物に使用する場合、簡単な方法で短時間内に兔疫細胞を含む細胞治療剤、すなわちワクチンを製造することができる。さらに、下記実施例で確認することができるように、本発明の複合体は、樹枝状細胞の生存率、免疫効能などにも影響を及ぼすことなく、腫瘍抗原の伝達率が非常に高いため、効果的に癌細胞を死滅させることができるものと現われた。したがって、本発明の一具体例において、上記ワクチン組成物は、上記複合体が導入した兔疫細胞を含むものであることができる。

兔疫細胞を含む癌免疫治療剤またはワクチン組成物の組成、投与方法、有効量などについては、当業界によく知られている。

また、本発明は、上記酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体を含む造影剤を提供する。

前述した酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体は、薬物伝達体またはワクチンの役目を行うことができるだけでなく、酸化亜鉛ナノ粒子は、その自体で光学的造影が可能な特性を有しているため、同時に造影剤（ｉｍａｇｉｎｇａｇｅｎｔ）として作用することができる。

一具体例において、上記酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体には、標的指向性リガンドが結合されてもよい。この場合、造影剤の標的指向性が向上するようになる。

他の具体例において、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質は、酸化亜鉛−結合性ペプチド及び抗原を含むものであることができる。前述したように、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質に抗原が含まれる場合、上記抗原を発現する標的細胞に本発明の複合体が導入され、免疫反応を誘導することができると共に、複合体が持っている造影効果によって標的細胞の造影が可能になる。このような抗原の種類は、特に制限されない。一具体例において、上記抗原は、腫瘍抗原であることができ、この場合、上記造影剤は、癌の免疫治療と同時に造影を可能にする。上記腫瘍抗原は、これに制限されるものではないが、癌腫胚芽抗原、サバイビン、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｉｇイディオタイプ、ＣＤＫ４、カスパーゼ−９、ベータ−カテニン、ＣＩＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、変異されたｐ２１／ｒａｓ、変異されたｐ５３、プロテナーゼ３、ＷＴ１、ＭＵＣ−１、正常ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｇ２５０、ＨＰＶＥ６／Ｅ７、ＥＢＶＬＭＰ２ａ、ＨＣＶ、ＨＨＶ−８、アルファフェトプロテイン、５Ｔ４、オンコ−トロホブラスト及びグリコプロテインよりなる群から選択されるものであることができる。

上記造影剤に含まれる酸化亜鉛ナノ粒子の構成は、前述した通りである。一具体例において、上記酸化亜鉛ナノ粒子は、コア−シェル構造を有するものであることができる。例えば、金属物質（ｍｅｔａｌｍａｔｅｒｉａｌ）、磁性物質（ｍａｇｎｅｔｉｃｍａｔｅｒｉａｌ）、磁性合金（ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｏｙ）または半導体物質（ｓｅｍｉｃｏｄｕｃｔｏｒｍａｔｅｒｉａｌ）よりなり、シェルは、酸化亜鉛よりなるものであることができる。前述したように、酸化亜鉛ナノ粒子がＴ１またはＴ２造影物質よりなるコアと酸化亜鉛よりなるシェルで構成されたコア−シェル構造を有するものである場合、本発明の造影剤は、光学的イメージングだけでなく、磁気共鳴イメージングを可能にする。下記実施例で確認することができるように、酸化鉄コアと酸化亜鉛シェルよりなる酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドと癌腫胚芽抗原を含むタンパク質との複合体を含む本発明の造影剤は、癌細胞の死滅同時に注入した樹枝状細胞の位置を追跡診断することができる。磁気共鳴イメージングのための既存の酸化鉄ナノ粒子は、水溶液上での凝集を防止するために化学的表面処理をするか、または樹枝状細胞に導入するためにリポソームのような細胞伝達用化合物（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎａｇｅｎｔｓ）を利用するなど手続が複雑であるだけでなく、培養時間が多く所要され、そのため、樹枝状細胞の生存率の低下、生体内導入後の効果の低下などが問題になった。しかし、本発明の酸化亜鉛−結合性ペプチド及び抗原を含むタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子との複合体を樹枝状細胞に導入し、これをワクチン組成物に使用する場合、簡単な方法で短時間内に樹枝状細胞を含む細胞治療剤、すなわちワクチンを製造することができ、コアシェルに含まれた酸化鉄成分により磁気共鳴イメージングを可能にする。

本発明の造影剤において、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質は、酸化亜鉛−結合性ペプチド以外に抗体をさらに含むものであることができる。この場合、抗体は、造影剤に標的指向性を付与する役目を行い、もし上記抗体が治療用抗体の場合、追加的に治療剤の役目を行うようになる。一具体例において、このような抗体は、腫瘍抗原をターゲットにするものであることができる。造影剤に標的指向性を付与するか、または腫瘍抗原をターゲットにして治療効果を示す抗体の種類については、当業界によく知られている。例えば、癌治療用抗体としてよく知られているハーセプチンのＦｃ末端に酸化亜鉛−結合性ペプチドが存在するようにハーセプチンの組換え抗体を製造することができる。このような組換え抗体は、酸化亜鉛ナノ粒子に非常によく結合されることができ、このように形成された複合体は、癌の治療及び癌治療の予後を観察することができる治療剤と造影剤としての役目を同時に行うことができる。

また、このような造影剤組成物において、上記複合体には、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化合物医薬及び造影物質よりなる群から選択される１つ以上の薬物が物理的または化学的に結合されてもよい。例えば、上記複合体に治療用薬物が結合されている場合、診断と同時に治療の効果を奏することができ、もし上記複合体に造影物質が追加的に結合されている場合、多機能性造影剤として作用することができる。このような造影物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素または量子ドットなどを含む。

本発明による造影剤は、医薬分野において通常使用される担体及びビヒクルを含むことができる。具体的にイオン交換樹脂、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（例えば、各種リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分的なグリセライド混合物）、水、塩または電解質（例えば、プロタミンスルフェート、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム及び亜鉛塩）、膠質性シリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコールまたは羊毛脂などを含むことができるがこれに制限されない。また、本発明による造影剤は、上記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、または保存剤などを追加に含むことができる。

一具体例において、本発明による造影剤は、非経口投与のための水溶性溶液で製造することができ、好ましくは、ハンクス溶液（Ｈａｎｋ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）、リンガー溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ）または物理的に緩衝された塩水のような緩衝溶液を使用することができる。水溶性注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）懸濁液は、ソジウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのように懸濁液の粘度を増加させることができる基質を添加することができる。

本発明の造影剤の他の好ましい様態は、滅菌注射用水性または油性懸濁液の滅菌注射用製剤の形態であることができる。このような懸濁液は、適当な分散剤または湿潤剤（例えば、ツイン８０）及び懸濁化剤を使用して本分野に公知された技術によって剤形化することができる。また、滅菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液（例えば、１、３−ブタンジオール中の溶液）であることがある。使用されることができるビヒクル及び溶媒としては、マンニトール、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、滅菌非揮発性オイルが通常的に溶媒または懸濁化媒質として使用される。このような目的のために合成モノまたはジグリセライドを含めて刺激性が少ない非揮発性オイルは、いずれも使用することができる。

上記造影剤を生体に投与する段階は、医薬分野で通常的に利用される経路を通じて投与されることができ、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または局所経路を通じて投与することができる。

なお、本発明の酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質及び酸化亜鉛ナノ粒子の複合体は、上述した薬物伝達体、ワクチン、または造影剤の製造のための用途以外に生物製剤を効果的に分離することができる分離剤、温熱治療をはじめとする治療剤、ＭＲＩ造影剤、バイオセンサーに応用可能なビーズ（ｂｅａｄ）の製造のための用途を追加に提供する。例えば、酸化亜鉛ナノ粒子が持っている光学的特性によって本発明の複合体をＦＡＣＳのような光学分離に使用し、遺伝子、細胞などの生物学的物質の分離に利用することができる。他の具体例において、本発明の酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質及び酸化亜鉛ナノ粒子の複合体がコア−シェル構造を有していて、上記コアが磁性物質よりなり、シェルが酸化亜鉛よりなる場合、コアに存在する磁性物質に起因してＭＡＣＳのような物質の磁性分離への応用が可能である。また、本発明は、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質及び酸化亜鉛ナノ粒子の複合体を含む温熱治療用組成物、酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質及び酸化亜鉛ナノ粒子の複合体をビーズとして含むバイオセンサーなどを提供する。

酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むタンパク質は、酸化亜鉛ナノ粒子の生体内活用性を顕著に改善させるので、上記複合体は、医薬の生体内または細胞内伝達のための薬物伝達体として使用することができると共に、生体または細胞のイメージングのために使用することができ、生物製剤を効果的に分離することができる分離剤、温熱治療をはじめとする治療剤、ＭＲＩ造影剤、バイオセンサーに応用可能なビーズ（ｂｅａｄ）の製造のための用途を追加に提供する。

Ｆｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコアシェルナノ粒子のＴＥＭ分析、構造、成分分析、水溶液での分散、光学特性、及び磁性特性分析結果を示す。本発明のＺｎＯｐｅｐ−１と３×ＺｎＯｐｅｐ−１量を測定した４０５ｎｍでの吸光度結果を示す。本発明のＺｎＯｐｅｐ−１、３×ＺｎＯｐｅｐ−１及び３×ＺｎＯｐｅｐ−２がコアシェルナノ粒子と結合した量を測定した４０５ｎｍでの吸光度結果を示す。多様な種類の水溶液内での酸化亜鉛ナノ粒子とペプチドの間の結合力を示す。水溶液内で酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛結合ペプチドを含むＣＥＡ腫瘍抗原の組換えタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子の結合力を示す。図６ａは、ＤＡＢ−ｅｎｈａｎｃｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅ染色を通じてインキュベーション時間によるＦｅ_３Ｏ_４ナノ粒子とＦｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコアシェルナノ粒子の細胞内運搬状態を示し、図６ｂは、それぞれのサンプルでランダムに選択された１００個の細胞の光学強度を測定した結果を示す。図７ａは、樹枝状細胞内に導入されたコアシェルナノ粒子をＤＡＢ−ｅｎｈａｎｃｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅ染色を通じて確認した結果を示す。図７ｂは、コアシェルナノ粒子の光学的特性を利用して共焦点蛍光顕微鏡で導入されたコアシェルナノ粒子を確認した結果を示す。図７ｃは、樹枝状細胞内に導入されたコアシェルナノ粒子結合ペプチドを共焦点蛍光顕微鏡で観察した結果を示す。図７ｄは、樹枝状細胞内に酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛結合ペプチドを含むＣＥＡ腫瘍抗原の組換えタンパク質と酸化亜鉛ナノ粒子を伝達した場合に樹枝状細胞内に存在する腫瘍抗原の量をＦＡＣＳ分析した結果である。コアシェルナノ粒子のローディングが樹枝状細胞の細胞生存率に影響を及ぼさないことを示すグラフである。コアシェルナノ粒子のローディングが樹枝状細胞の成熟に影響を及ぼさないことを示すグラフである。酸化鉄ナノ粒子とコアシェルナノ粒子で標識された樹枝状細胞の磁気共鳴映像分析によるインビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）での探知結果を示す。酸化鉄ナノ粒子で標識された樹枝状細胞（○）とコアシェルナノ粒子で標識された樹枝状細胞（●）のＴ２弛緩時間を比較した磁気共鳴分析結果を示す。酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体で標識された樹枝状細胞によって誘導された抗−腫瘍兔疫性を評価した結果を示す。酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体で標識された樹枝状細胞によって誘導されたＣＥＡ−特異的Ｔ細胞反応の誘導結果を示す。酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体で標識された樹枝状細胞で兔疫されたマウスの腫瘍成長及び生存を分析した結果を示す（□：ＮＰ／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ、■：ＮＰ／ＣＥＡ、▽：３ｘＺＢＰ−ＣＥＡ、▼：ＣＥＡ、○：ＮＰ、●：ＤＣ）。

本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現され、ただ本実施例は、本発明の開示が完全になるようにし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものであり、本発明は、請求項の範疇によって定義される。

実施例１：Ｆｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコア−シェルナノ粒子の合成
Ｆｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコアシェルナノ粒子（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、ＣＳＮＰ）を改良されたナノエマルジョン方法により製造した。
Ｆｅ_３Ｏ_４コア合成のために０．５ｍｍｏｌ（０．１７６６ｇ）のアイアン（III）アセチルアセトネート（Ｆｅ（ａｃａｃ）３、９９．９％、Ａｌｄｒｉｃｈ）と２．５ｍｍｏｌ（０．６４６８ｇ）の１、２−ヘキサデカンジオール（１、２−ｈｅｘｄｅｃａｎｅｄｉｏｌ、Ｃ_１４Ｈ_２９ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２（ＯＨ）、９０％、Ａｌｄｒｉｃｈ）をポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（ポリプロピレングリコール）−ブロック−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ、Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．７５２９ｇ）とともに１０ｍｌ〜２０ｍｌのオクチルエーテル（Ｃ_８Ｈ_１７ＯＣ_８Ｈ_１７、９９％、Ｗａｋｏ）に溶解した。ナノ粒子の物理的、化学的特性制御のためにＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧの代わりに、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が使用されることができ、溶媒としては、オレイルアミン（ＯＡＭ、Ｃ_９Ｈ_１８＝Ｃ_９Ｈ_１７ＮＨ_２、７０％）、オレイン酸（ＯＡ、Ｃ_９Ｈ_１８＝Ｃ_８Ｈ_１５ＣＯＯＨ、９９％）などが使用されることができる。

還元過程は、上記混合溶液を１時間８０℃〜１３０℃までゆっくり加熱し、その温度で１時間〜２時間循環させた。その後、１５分間２６０℃〜３００℃まで早く加熱し、２６０℃〜３００℃で１時間〜２時間循環させた。混合溶液を室温まで冷却させれば、磁性体コア物質が形成される。合成過程は、アルゴンのような不活性ガス雰囲気で進行することができる。上記磁性体コアを製造した後、特別な精製過程なしにＺｎＯコーティング工程を進行した。既に形成されたＦｅ_３Ｏ_４コアに０．２５ｍｍｏｌ（０．０６５９ｇ）の亜鉛アセチルアセトネート（ｚｉｎｃａｃｅｔｙｌａｃｅｔｏｎａｔｅ、Ｚｎ（ａｃａｃ）２）、０．３２３４ｇ（１．２５ｍｍｏｌ）の１、２−ヘキサデカンジオール（１、２−ｈｅｘｄｅｃａｎｅｄｉｏｌ）が溶解されたオクチルエーテル（ｏｃｔｙｌｅｔｈｅｒ、５ｍｌ）を添加した後、加熱手段と磁力攪拌器（ＭａｇｎｅｔｉｃＳｔｉｒｒｉｎｇ）を使用して上記反応混合物を８０℃〜１３０℃まで温度を上げ、１時間〜２時間均一に混合した。次いで、混合溶液を加熱し、２６０℃〜３００℃の間で１時間〜２時間程度維持した結果、ＺｎＯ層がＦｅ_３Ｏ_４上に形成された。反応後、Ｆｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコア−シェルナノ粒子を無水エタノール（ａｎｈｙｄｒｏｕｓｅｔｈａｎｏｌ）を添加し、遠心分離及び磁性分離を利用して洗浄した。製造されたコア−シェルナノ粒子の形態、組成及びナノ構造は、エネルギー分散型Ｘ線分析(Energy dispersive X-ray spectrometry) が備えられたＴＥＭ（ＪＥＯＬ２０１０Ｆ、ＴｅｃｈｎａｉＦ２０（ＦＥＩＣｏ．））で測定した。ＴＥＭ測定のためのサンプルの製造のために、ヘキサン中に分散したナノ粒子と水とＰＢＳに分散されたペプチド−ナノ粒子複合体は、それぞれｃａｒｂｏｎ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｃｏｐｐｅｒｇｒｉｄｓ上に落とした。Ｆｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯＮＰｓの構造的分析は、粉末ｘ−線回折分析機（１０Ｃ１ｂｅａｍｌｉｎｅ、ＰｏｈａｎｇＡｃｃｅｌｅｒａｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＳｏｕｔｈＫｏｒｅａ）により行われた。磁性特性は、試料振動型磁力計（ｖｉｂｒａｔｉｎｇｓａｍｐｌｅｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｅｒ）（Ｌａｋｅｓｈｏｒｅ７３００）、物理特性測定装置（Ｐｈｙｓｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｙｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｙｓｔｅｍ）（ＰＰＭＳ、ＱｕａｎｔｕｍＤｅｓｉｇｎ）を使用して測定された。ヘキサン中に分散されたナノ粒子と水とＰＢＳに分散されたペプチド−ナノ粒子複合体の光学特性は、それぞれＵＶ− 可視分光法（Ｖｉｓｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）（Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３Ｅ）及び分光蛍光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＳｈｉｍａｄｚｕＲＦ−５３０１ＰＣ）により分析された。図１は、Ｆｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯナノ粒子のＴＥＭ分析、水分散性、磁性特性及び光学特性分析結果を示す。具体的に、図１ａは、Ｆｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯナノ粒子の球形形態及び均一なサイズ分布を示すＴＥＭ結果である（Ｓｃａｌｅｂａｒ：１００ｎｍ）。図１ｂは、コア−シェルナノ粒子の構造的模式図である。図１ｃは、単一コアシェルナノ粒子がＦｅとＺｎよりなることを示すＴＥＭ−ＥＤＸｐｏｉｎｔ−ｐｒｏｂｅａｎａｌｙｓｉｓの結果である。図１ｄは、ＰＢＳ中での茶色のコアシェルナノ粒子の均質な分散を示し、図１ｅは、磁石によってナノ粒子の回収後、きれいで且つ透明な溶液を示す。図１ｆは、Ｆｅ_３Ｏ_４コア部分（赤色）とＦｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコアシェルナノ粒子（青色）の磁性履歴曲線を示す。図１ｇは、ペプチドが結合されたコアシェルナノ粒子のＵＶ及び可視光放出を示す光発光（Ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）スペクトルを示す。

実施例２：ＺｎＯ−結合性ペプチドの設計及び製造
ＺｎＯ−結合性ペプチド（ＺｎＯ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅ、ＺＢＰ）の設計のために、先行研究から高−親和性ＺｎＯ結合パターンの配列を収集した。高−親和性結合ペプチドのクラスタリングによりＲＸＸＲまたはＲＸＸＲＫの結合モチーフがＺｎＯ結合に重要な役目を行うことを知見し、ＲＰＨＲＫまたはＲＴＨＲＫを下記実施例で使用されるＺｎＯ−結合性ペプチドのモチーフとして選択した。また、酸化亜鉛ナノ粒子とＺｎＯ−結合性ペプチドの間の結合力を増加させるために、酸化亜鉛−結合性ペプチドの製造時に、ＺｎＯ結合モチーフの直列繰り返しを導入しようとした。周辺モチーフ間の柔軟性を増加させることができる柔軟性リンカーとしてＧＧＤＡを選択し、これをモチーブの間に導入した。

酸化亜鉛−結合性ペプチドの酸化亜鉛ナノ粒子に対する結合性を定量分析することができるように、酸化亜鉛−結合性ペプチドをビオチンで標識し、ストレプトアビジンとの結合性を調査する方法を使用した。このために、まず、ビオチンが標識された酸化亜鉛−結合性ペプチドとストレプトアビジンの間の結合を確認しようとした。ペプチド合成器（ＰｅｐｔｒＥＸＴＭ、Ｐｅｐｔｒｏｎ）を利用してビオチンで標識されたペプチドとして、ｂｉｏｔｉｎ−ＲＰＨＲＫＧＧＤＡ（ｂｉｏｔｉｎ−ＺｎＯｐｅｐ−１）、ｂｉｏｔｉｎ−ＲＰＨＲＫＧＧＤＡＲＰＨＲＫＧＧＤＡＲＰＨＲＫＧＧＤＡ（ｂｉｏｔｉｎ−３ｘＺｎＯｐｅｐ−１）、ｂｉｏｔｉｎ−ＲＴＨＲＫＧＧＤＡ（ｂｉｏｔｉｎ−ＺｎＯｐｅｐ−２）及びｂｉｏｔｉｎ−ＲＴＨＲＫＧＧＤＡＲＴＨＲＫＧＧＤＡＲＴＨＲＫＧＧＤＡ（ｂｉｏｔｉｎ−３ｘＺｎＯｐｅｐ−２）を合成した後、滅菌された水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かした。ＴＢＳ（Ｔｒｉｓｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）に希釈した上記ペプチドをそれぞれ１０μｇ／ｗｅｌｌ、１μｇ／ｗｅｌｌ、０．１μｇ／ｗｅｌｌ及び０．０１μｇ／ｗｅｌｌずつとなるように、９６ウェルプレート（９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅ）に分注した後、４℃で１６時間反応させて、上記プレートにコーティングした。その後、各ウェルに遮断溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ：５％ＢｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎｉｎＴＢＳ）を入れ、常温で一時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを使用して３回洗浄した。その後、ＡＰ−ストレプトアビジン結合体（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を１：１，０００で希釈し、常温で一時間反応させた。反応が終わった後、さらに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを使用して残留ＡＰ−ストレプトアビジン結合体を除去した。その後、ｐＮＰＰホスファターゼ（ｐＮＰＰｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）基質を添加し、２０分間常温で反応させた後、停止バッファーを入れ、反応を停止した後、ＶＩＣＴＯＲ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社）を使用して４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果、図２から明らかなように、単一酸化亜鉛−結合性ペプチドより３Ｘ酸化亜鉛−結合性ペプチドがさらに高い吸光度を示し、これは、コーティングされた量に依存的に増加することを確認することができた。この結果は、酸化亜鉛−結合性ペプチドのビオチンとストレプトアビジンの結合力を利用して定量分析が可能であることを示唆する。

実施例３：酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドの間の結合力
実施例３では、実施例２に基づいて酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドの間の結合力を確認しようとした。実施例１で得た酸化亜鉛ナノ粒子（エタノール内に保管）を１．５ｍｌチューブに移し、マグネチックスタンドに２０分間静置させて、コア−シェル（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ）酸化亜鉛粒子を分離した。上記酸化亜鉛ナノ粒子からエタノールを完全に除去した後、ＴＢＳを添加した後、超音波を利用してナノ粒子を水溶液に分散させた。１００μｇのナノ粒子と１０μｇ、１μｇ、０．１μｇ、０．０１μｇ及び０．００１μｇのペプチドをＴＢＳに希釈して混合した後、常温で１時間回転して反応させた。反応後、遠心分離機を利用して（１５，０００ｇ、２ｍｉｎ）複合体を沈殿させた後、マグネチックスタンドに１５分間静置させて、ナノ粒子−ペプチド複合体を分離した。

同一の方法で複合体をＴＢＳを利用して６回洗浄した。１：１０００で希釈されたＡＰ−ストレプトアビジン結合体（１．５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、常温で一時間回転して反応させた。反応が終わった後、さらに遠心分離機を利用して上記ＡＰ−ストレプトアビジン結合体を分離し、マグネチックスタンドに１５分間静置させて溶液を除去した後、ＴＢＳを利用して６回洗浄した。その後、ｐＮＰＰホスファターゼ基質を入れ、２０分間常温で反応させ、停止バッファーを入れて反応を停止した後、ＶＩＣＴＯＲ（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ社）を利用して４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果、図３から明らかなように、酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドの間の結合が酸化亜鉛−結合性ペプチドの濃度に依存的に増加することを確認することができた。また、単一酸化亜鉛−結合性ペプチドより３Ｘ酸化亜鉛−結合性ペプチドが酸化亜鉛ナノ粒子とさらによく結合することを確認することができた。それぞれのペプチドの結合は、１００μｇのコアシェルナノ粒子に対して約１μｇ以下のペプチド（１ｘＺＢＰに対して〜１ｎｍｏｌ、３ｘＺＢＰに対して〜０．３ｎｍｏｌに均等）が使用される時に飽和され、１μｇのコアシェルナノ粒子当たり約３〜１０ｐｍｏｌのペプチドが結合するものと現われた。

実施例４：多様な水溶液での酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドの間の結合力
実施例４では、実施例３から確認した酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドの間の結合力を多様な水溶液条件でも結合が可能であるかを調べるために行った。実施例１で得た酸化亜鉛ナノ粒子（エタノール内に保管）を１．５ｍｌチューブに移し、マグネチックスタンドに２０分間静置させてコア−シェル（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ）酸化亜鉛粒子を分離した後、エタノールを完全に除去した。分離したナノ粒子（１００μｇ）をＴＢＳ、ＲＩＰＡバッファー（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ソジウムドデシルスルフェート、０．５％ソジウムジオキシコレート、１５０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２ｍＭＥＤＴＡ）、または多様な濃度（６Ｍ、３Ｍ、１．５Ｍ、０．７５Ｍ、０．３７５Ｍ）のヨウ素が添加されたバクテリア溶菌バッファー（ｂａｃｔｅｒｉａｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．６］、５００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０）に浮遊させた後、０．１μｇのペプチド（３×ＺｎＯｐｅｐ−１）を添加し、常温で一時間回転して反応させた。遠心分離機を利用して複合体を分離し、マグネチックスタンドに１５分間入れた後、水溶液を除去した後、ＴＢＳを利用して６回洗浄した。ＡＰ−ストレプトアビジン結合体を入れて常温で一時間回転して反応させた。反応が終わった後、さらに遠心分離機を回転して上記複合体を分離した後、マグネチックスタンドに１５分間静置させて反応溶液を除去した後、ＴＢＳを利用して６回洗浄した。ｐＮＰＰホスファターゼ基質を入れ、２０分間常温で反応させた後、反応停止バッファーを入れ、４０５ｎｍの波長で吸光度を測定した。その結果、図４から明らかように、ＴＢＳ、ＲＩＰＡ、そして多様な濃度のヨウ素が添加された水溶液上でも酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドがよく結合されていることを確認することができた。これは、酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドが多様な水溶液条件でもよく結合することを意味する。

実施例５：癌腫胚芽抗原と酸化亜鉛−結合性ペプチドとの融合タンパク質の製造
Ｂａｅ、Ｍ．Ｙ．、など［Ｂａｅ、Ｍ．Ｙ．、Ｃｈｏ、Ｎ．Ｈ．＆Ｓｅｏｎｇ、Ｓ．Ｙ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓｂｙｍｕｒｉｎｅｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｐｕｌｓｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＴａｔ−ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７、１２８−１３８（２００９）］に開示された方法を利用してＥ．ｃｏｌｉからアミノ酸３５から３３２（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏ．Ｍ１７３０３）に相当するヒト癌腫胚芽抗原（ＣＥＡ）を精製した。組換えＺＢＰ−ＣＥＡ融合タンパク質の製造のために、３ｘＺｎＯｐｅｐ−１（ＲＰＨＲＫＧＧＤＡＲＰＨＲＫＧＧＤＡＲＰＨＲＫＧＧＤＡ）をコーディングするａｎｎｅａｌｅｄｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡ（５’−ＣＴＡＧＣＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＧＡＴＧＣＧＧ−３’）をＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ位置の切断後（下線で表示）、上記Ｂａｅ、Ｍ．Ｙ．、などに開示されたｐＥＴ２３ａ−ＣＥＡプラスミドでクローニングした。Ｂａｅ、Ｍ．Ｙ．、などに開示された方法によって組換えタンパク質を生産し精製した。同じ方法で、ＺｎＯｐｅｐ−１、ＺｎＯｐｅｐ−２及び３ｘＺｎＯｐｅｐ−２を生産した。精製されたタンパク質は、使用前にエンドキシン除去カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理された。精製された組換えタンパク質のエンドトキシン汚染は、ＱＣＩ−１０００Ｅｎｄ−ＰｏｉｎｔＣｈｒｏｍａｇｅｎｉｃＥｎｄｏｔｏｘｉｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を利用して調査した。

実施例６：酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含む組換えＣＥＡ腫瘍抗原の結合力
実施例５では、酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含む組換え癌腫胚芽抗原（Ｃａｒｃｉｎｏ−ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＡｎｔｉｇｅｎ、ＣＥＡ）の結合力を確認した。互いに異なる濃度の酸化亜鉛結合ペプチドが含まれた組換えＣＥＡ腫瘍抗原と上記酸化亜鉛−結合性ペプチドが含まれていない腫瘍抗原を５０μｇの酸化亜鉛ナノ粒子とＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）で１時間反応させ、反応が終わった後、さらに遠心分離機を利用して複合体を分離した後、マグネチックスタンドに１５分間静置させた後、溶液を除去した後、ＰＢＳを利用して６回洗浄した。収去された酸化亜鉛ナノ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに入れ、１００℃で１０分間反応させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、クマシブルー染色法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇ）を使用して酸化亜鉛ナノ粒子に結合された組換えタンパク質の量を確認した。その結果、図５から明らかなように、酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含まない組換えＣＥＡ腫瘍抗原は、酸化亜鉛ナノ粒子と非常に少ない量だけ結合したのに対し、酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含む組換えＣＥＡ腫瘍抗原と酸化亜鉛の亜鉛は,ペプチドの濃度に依存的に増加することを確認することができた。これは、酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含む組換え腫瘍抗原の間にも結合が可能であることを意味する。

実施例７：樹枝状細胞にローディングされた酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体のインビトロモニタリング
Ｂａｅ、Ｍ．Ｙ．、などに記述された方法を利用してマウス細胞から樹枝状細胞を製造し、これにコアシェルナノ粒子をローディングした。未成熟樹枝状細胞をコアシェルナノ粒子と共培養した。これは、成熟樹枝状細胞に比べて未成熟樹枝状細胞が捕食作用が活発するからである。インキュベーション時間とＺｎＯシェルのローディング効率に対する効果を評価するために、未成熟樹枝状細胞を１００μｇ／ｍｌのＦｅ_３Ｏ_４ＮＰｓまたはＦｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコアシェルナノ粒子と多様な時間条件でインキュベーションした。導入されたナノ粒子は、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）−ｅｎｈａｎｃｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅ染色法により探知され、光学強度の測定を用いて定量した。図６ａは、ＤＡＢ−ｅｎｈａｎｃｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅ染色を用いてインキュベーション時間によるＦｅ_３Ｏ_４ＮＰｓとＦｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコアシェルナノ粒子の細胞内運搬状態を示し、図６ｂは、それぞれのサンプルでランダムに選択された１００個の細胞の光学強度を測定した結果を示す。図６から明らかなように、８時間以前の反応時間では、Ｆｅ_３Ｏ_４−ＺｎＯコアシェルナノ粒子がＦｅ_３Ｏ_４ＮＰｓに比べてさらに効率的に樹枝状細胞により摂取されたが、インキュベーション２０時間後には、何らの差異がなかった。この結果は、ＺｎＯシェルがコアシェルナノ粒子の細胞内運搬を促進し、コアシェルナノ粒子を利用する場合、樹枝状細胞内への導入に必要なインキュベーション時間を低減することができることを提示する。

図７は、コアシェルナノ粒子の光学的特性を利用した樹枝状細胞にローディングされた抗原のインビトロモニタリング結果を示す。図７ａは、ＤＡＢ−ｅｎｈａｎｃｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅ染色後に可視化されたコアシェルナノ粒子がローディングされた樹枝状細胞とコアシェルナノ粒子がローディングされていない樹枝状細胞を示す。図７ａから明らかなように、インキュベーション１時間後、約９５％以上の樹枝状細胞がコアシェルナノ粒子で標識されたものと現われた。ＺｎＯナノ粒子が数時間内に捕食性細胞と非−捕食性細胞により効率的に吸収されることはよく知られている。正確なメカニズムは、まだわからないが、この結果は、ＺｎＯによるＦｅ_３Ｏ_４ＮＰｓの表面コーティングが細胞性吸収（ｕｐｔａｋｅ）を促進することができることを提示する。通常的な超常磁性Ｆｅ_３Ｏ_４粒子が細胞内伝達のためにプロタミンスルフェートのようなトランスフェクション促進化合物や長いインキュベーション時間（略１６時間〜４８時間）を必要とするという点を考慮する時、本発明のコア−シェルナノ粒子は、少ないインキュベーション時間を必要とし、トランスフェクションのための試薬や表面改質を必要とないという点から大きい長所を有する。

ＺｎＯの光発光は、樹枝状細胞サイトゾル内への運搬後、レーザースキャニング共焦点顕微鏡を利用して調査した。図７ｂは、コアシェルナノ粒子がローディングされた樹枝状細胞（下端）またはローディングされていない樹枝状細胞（上端）を共焦点顕微鏡で観察した結果を示す（励起：４０５ｎｍ、発光：＞４２０ｎｍ）。ＴｏＰｒｏ−３染色試薬で染色された樹枝状細胞の核は、青色で現われる（Ｗｈｉｔｅｂａｒ：１０μｍ）。コアシェルナノ粒子−標識された樹枝状細胞は、４０５ｎｍの波長で励起され、４６５〜６７９ｎｍの広い発光波長で高い蛍光強度を示した。しかし、ピーク発光は、５２９〜５５０ｎｍで観察され、これは、通常的なＦＡＣＳまたは共焦点顕微鏡を通じて容易に観察されることができる（図示せず）。コアシェルナノ粒子は、サイトプラズムにわって分散されていて、凝集された形態で発見されたが、これは、捕食作用により吸収されたことを意味することができる。細胞内コアシェルナノ粒子分布の類似のパターンが非−食細胞性エピセリウム（ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）から由来したＨｅＬａ細胞でも現われた（データ不図示）。エンドソーム性またはリソソーム性小胞の共染色は、凝集されたコアシェルナノ粒子が初期エンドソーム性マーカーであるＥＥＡ１またはリソソーム性マーカーであるＬＡＭＰ２との共存を示し、これは、凝集されたナノ粒子がエンドサイトーシスを通じて内在化されることを提示する。コアシェルナノ粒子がサイトプラズム及び細胞内輸送小胞（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｖｅｓｉｃｌｅｓ）内で探知されることを考慮する時、それらは、ファゴサイトーシスまたはエンドサイトーシスによって内在化されるものと思われる。

また、コアシェルナノ粒子上に固定されたポリペプチドの細胞内運搬を調査した。図７ｃから明かなように、３×ＺＢＰ−結合されたコアシェルナノ粒子が樹枝状細胞のサイトプラズム内に効率的に運搬された。一部のペプチド−コアシェルナノ粒子凝集体は、ペプチドが結合されていないコアシェルナノ粒子のようにエンドソームまたはリソソームに部分的に共存したりした（Ｗｈｉｔｅｂａｒ：１０μｍ）。

実施例８：酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体の樹枝状細胞内伝達効率
実施例８では、酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体の樹枝状細胞内に伝達される効率を調べた。酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体の樹枝状細胞内伝達効率をＦＡＣＳ分析法を使用して確認した。マウスの骨髓から分離した未成熟樹枝状細胞（１×１０^６ｃｅｌｌｓ）をＣＥＡ腫瘍抗原と３７℃で１時間反応させた後、細胞内に伝達された腫瘍抗原の量をＦＡＣＳで分析した。酸化亜鉛ナノ粒子（５０μｇ）とＣＥＡ腫瘍抗原（２０μｇ）複合体をＰＢＳで１時間反応させた。

対照群及び実験群としてａ）酸化亜鉛ナノ粒子処理群、ｂ）ＣＥＡ腫瘍抗原処理群、ｃ）酸化亜鉛−結合性ペプチドを含む組換えＣＥＡ腫瘍抗原処理群、ｄ）酸化亜鉛ナノ粒子とＣＥＡ腫瘍抗原を一緒に処理した群、ｅ）酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体処理群に分析した結果、図７ｄから明らかなように、酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原が複合体を形成することができる実験群だけで樹枝状細胞内でＣＥＡ腫瘍抗原が細胞内に伝達されたことを確認することができた（コアシェルナノ粒子：酸化亜鉛コアシェルナノ粒子、ＣＥＡ：腫瘍抗原、３Ｘｚｂｐ−ＣＥＡ：酸化亜鉛−結合性ペプチド（３×ＺｎＯｐｅｐ−１）が結合された腫瘍抗原）。これは、今後、酸化亜鉛ナノ粒子を利用して酸化亜鉛−結合性ペプチドを含むＣＥＡ腫瘍抗原の複合体を樹枝状細胞内に導入することができる伝達体として使用可能であることを意味する。

実施例９：酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体の樹枝状細胞内伝達による樹枝状細胞の生存率及び成熟
コアシェルナノ粒子のローディングが樹枝状細胞の生存率及び成熟に及ぶ影響に対して評価した。図８ａは、１００μｇ／ｍｌコアシェルナノ粒子を１〜７日間樹枝状細胞とインキュベーションした時の細胞生存率を示し、図８ｂは、多様な濃度のコアシェルナノ粒子（１２．５〜４００μｇ／ｍｌ）を３日間樹枝状細胞とインキュベーションした時の細胞生存率を示す。図８から明らかなように、コアシェルナノ粒子のローディングは、樹枝状細胞の細胞生存率に影響を及ぼさない。図９は、コアシェルナノ粒子のローディングの前と後の樹枝状細胞の成熟マーカーを示す。バクテリアのＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）が樹枝状細胞の成熟のために使用された。樹枝状細胞上の成熟マーカー（ＭＨＣII、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ａｎｄＣＤ８６）の表面発現は、コアシェルナノ粒子ローディングによって影響を受けなかった。総合すれば、これら結果は、コアシェルナノ粒子ローディングが樹枝状細胞の細胞生存率や成熟に影響を及ぼさないことを提示する。

実施例１０：酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体で標識された樹枝状細胞の磁気共鳴分析によるインビトロ及びイン秘宝での探知
ナノ粒子を利用したインビトロまたはインビボ磁気共鳴映像分析実験において、効果的な細胞標識リングのための最適の条件を決定することは非常に重要である。このために、まず、樹枝状細胞を多様な濃度のコアシェルナノ粒子（０〜１６０μｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。図１０ａから明らかなように、樹枝状細胞のインビトロ磁気共鳴イメージング結果は、コアシェルナノ粒子の濃度が増加するにつれてＴ２弛緩時間が漸進的に減少するものと現われ（イメージが暗くなる）、１００μｇ／ｍｌ未満で飽和されるものと現われた。最適のインキュベーション時間を定めるために、４０μｇ／ｍｌのコアシェルナノ粒子の存在下で０．５〜２４時間樹枝状細胞を培養した。図１０ｂから明らかなように、樹枝状細胞は、１時間内にコアシェルナノ粒子に飽和され、これは、前述したように、コアシェルナノ粒子が１時間内に樹枝状細胞により効率的に吸収されることを示し、磁気共鳴イメージングにおいてＴ２弛緩時間の十分な減少を示す。図１１から明らかなように、Ｆｅ_３Ｏ_４−標識された樹枝状細胞（○）と比較する時、最初４時間コアシェルナノ粒子−標識された樹枝状細胞（●）の磁気共鳴映像分析結果は、Ｔ２弛緩時間においてさらに迅速な減少を示した。これら結果は、コアシェルナノ粒子が非浸湿的磁気共鳴映像分析を利用したインビボでの樹枝状細胞移動モニタリングのために適用されることができることを示す。

磁気共鳴映像分析による樹枝状細胞輸送のインビトロモニタリングに対するコアシェルナノ粒子の潜在的用途を検証するために、コアシェルナノ粒子が標識された樹枝状細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの後足の裏に注射した。注射された足の裏から膝窩リンパ節に移動した樹枝状細胞をＴ２−ｗｅｉｇｈｔｅｄｍｕｌｔｉｇｒａｄｉｅｎｔｅｃｈｏ磁気共鳴シーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を利用して観察した。図１０ｃから明らかなように、注射４８時間後、左側リンパ節内でコアシェルナノ粒子−標識された細胞の存在を示す低信号強度（ｈｙｐｏｉｎｔｅｎｓｅ）を示す領域が観察された（赤色矢印）。予想したように、ＺｎＯＮＰで標識された樹枝状細胞の注射部位に相当する膝窩リンパ節では、Ｔ２減少が観察されなかった（白色矢印）。

コアシェルナノ粒子で標識された樹枝状細胞は、排出リンパ節の中心部で観察され、これは、Ｔ２減少がリンパ管を通じて輸送されたコアシェルナノ粒子よりはコアシェルナノ粒子で標識された樹枝状細胞によるものであることを示す。ガラスナノ粒子は、一般的にリンパ管を通じて輸送された後、リンパ節の被膜下領域（subcapsular region）に位置する。切断したリンパ節の免疫組職学的分析は、磁気共鳴映像分析により観察されたＴ２減少がＴ細胞領域に移動したコアシェルナノ粒子−標識樹枝状細胞により惹起されたものであることを示す（図１０ｄ）。ＤＡＢ−ｅｎｈａｎｃｅｄＰｒｕｓｓｉａｎｂｌｕｅ染色と免疫組職化学染色（ａｎｔｉ−Ｔｈｙ１．２、図１０ｄの上端；ａｎｔｉ−Ｂ２２０、図１０ｄの下端）の結果を組み合わせて見れば、コアシェルナノ粒子で標識された樹枝状細胞は、大部分Ｂ２２０＋Ｂ細胞小胞（ｆｏｌｌｉｃｌｅ）ではないＴｈｙ１．２＋Ｔ細胞領域内に存在することが分かる。対照的に、酸化亜鉛でラベルされたＤＣｓを注入したリンパ節では、鉄成分を測定することができなかった。

実施例１１：酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体で標識された樹枝状細胞により誘導された抗−腫瘍免疫
酸化亜鉛ナノ粒子と酸化亜鉛−結合性ペプチドアミノ酸配列を含むＣＥＡ腫瘍抗原複合体で標識された樹枝状細胞でＣ５７ＢＬ／６マウスを兔疫し、ＣＥＡ−特異的細胞性免疫を分析した。兔疫されたマウスの脾臓からリンパ球を得、インビトロで多様な濃度のＣＥＡで再刺激した。図１２ａから明らかなように、樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰＣＥＡ）で免疫化されたマウスのリンパ球は、対照群のリンパ球よりＣＥＡに対する反応においてさらに高い投与量−依存的な増殖を示した。ＣＥＡ特異的な細胞毒性リンパ球が全身的に生成されるか否かを調査するために、免疫化されたマウスから得た脾臓細胞（Ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を分析した。樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）で免疫化されたマウスからの脾臓細胞を利用する時、ＣＥＡ−発現癌細胞（（ＭＣ３８／ＣＥＡ）に対する著しい細胞毒性反応が観察されたのに対し、対照群では、有意な細胞毒性が観察されなかった（図１２ｂ、右側パネル）。ＣＥＡ−陰性ＭＣ３８標的細胞に対する脾臓細胞の細胞毒性は、実験群のうちいずれも有意に現われなかった（図１２ｂ、左側パネル）。これは、兔疫されたマウスで探知された反応が腫瘍抗原ＣＥＡ特異的であることを提示する。次に、細胞−媒介免疫反応の典型的な標識サイトカインであるＩＦＮ−γを生成するＴ細胞の生成を調査した。脾臓細胞でＣＥＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫反応を細胞内サイトカイン染色及びＣＥＡ抗原の存在または不在下でフローサイトメトリーを用いて調査した。ＩＦＮ−γ−分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）で免疫化されたマウスから得たＣＤ８＋Ｔ細胞だけでただ腫瘍抗原による刺激後、略１０倍程度増加した。対照的に、他の対照群から得たＣＤ８＋Ｔ細胞は、免疫後、有意なＩＦＮ−γ分泌を示さなかった（図１２ｃ）。樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰＣＥＡ）群は、他の樹枝状細胞群に比べてリンパ節でＣＥＡ−特異的な、ＩＦＮ−γ−生産ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を生成するにあたってさらに効果的であった（図１３）。この結果は、樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）がインビボでＣＥＡ特異的な細胞性免疫を効果的に生成することができることを示す。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスのわき腹にＭＣ３８／ＣＥＡ細胞を注入し、樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）免疫による腫瘍の成長を観察し、樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）の抗腫瘍兔疫性を評価した。腫瘍接種後７日後、マウスを一週間間隔をもって週１回ずつ樹枝状細胞を４回兔疫した。図１４ａから明らかなように、対照群と比べて樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）が注入されたマウスで腫瘍成長がより抑制された（□：ＮＰ／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ、■：ＮＰ／ＣＥＡ、▽：３ｘＺＢＰ−ＣＥＡ、▼：ＣＥＡ、○：ＮＰ、●：ＤＣ）。また、図１４ｂから明らかなように、腫瘍接種４０日後、樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）で処理された５匹のマウスが全部生存したのに対し、他のすべての群のマウスは、死んだ。樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）で免疫化されたマウスの平均生存期間は、対照群マウスに比べて平均１０．５〜１９．５日延長された。このような結果は、樹枝状細胞（コアシェルナノ粒子／３×ＺＢＰ−ＣＥＡ）が対照群に比べてＣＥＡ−陽性腫瘍に対するさらに強力な保護免疫反応を誘導することを示す。

Claims

酸化亜鉛−結合性ペプチド及び抗原を含むタンパク質並びに酸化亜鉛ナノ粒子の複合体と、兔疫細胞とを含むワクチン組成物。
上記酸化亜鉛−結合性ペプチドは、下記式（Ｉ）または（II）の構造を有することを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物：
［（Ａｒｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ａｒｇ）_ｍ−リンカー］_ｎ（Ｉ）
［（Ａｒｇ−Ｘ_１−Ｘ_２−Ａｒｇ−Ｌｙｓ）_ｍ−リンカー］_ｎ（II）
上記式中、
Ｘ_１は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり、
Ｘ_２は、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、またはＡｒｇであり、
ｍは、１〜５の整数であり、
ｎは、１〜１００の整数である。
上記抗原は、腫瘍抗原であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
上記腫瘍抗原は、癌腫胚芽抗原、サバイビン、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−１２、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｉｇイディオタイプ、ＣＤＫ４、カスパーゼ−９、ベータ−カテニン、ＣＩＡ、ＢＣＲ／ＡＢＬ、変異されたｐ２１／ｒａｓ、変異されたｐ５３、プロテナーゼ３、ＷＴ１、ＭＵＣ−１、正常ｐ５３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、Ｇ２５０、ＨＰＶＥ６／Ｅ７、ＥＢＶＬＭＰ２ａ、ＨＣＶ、ＨＨＶ−８、アルファフェトプロテイン、５Ｔ４、オンコ−トロホブラスト及びグリコプロテインよりなる群から選択されることを特徴とする請求項３に記載のワクチン組成物。
上記ワクチン組成物は、癌の治療または予防のためのものであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
上記複合体は、上記免疫細胞に導入されていることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
上記兔疫細胞は、樹枝状細胞、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であることを特徴とする請求項１または６に記載のワクチン組成物。