JP5713984B2 - 発現系 - Google Patents
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Description
(a)プロモーター;および
(b)完全パリンドロームオペレーター配列
を含む;そのプロモーターがT7ではないことを特徴とするタンパク質発現系を提供する。
eoおよびglnが含まれる。一つまたはそれを超える完全パリンドロームオペレーター配列を用いることができる。多くの好ましい態様において、二つの完全パリンドロームオペレーター配列を用いるが、最も好都合には、一方のオペレーター配列は、プロモーターの下流に位置していて、もう一方のオペレーター配列は、プロモーターの上流に位置している。二つのオペレーター系を用いる場合、それらオペレーター配列は、好ましくは、プロモーターの制御を最大にするように間隔を置く。多くの態様において、その間隔は、85〜150塩基対間隔、好ましくは、90〜126塩基対間隔、そして最も好ましくは、91または92塩基対間隔である。ある種の態様において、オペレーター配列は、転写出発点と重なる。
で用いることができる。適当なプラスミドまたは発現ベクターの構築は、当科学者に明らかであろう。
ラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などの酵
母が含まれる。用いることができる哺乳動物宿主細胞には、ヒト胚性腎およびPERC.6細胞などのヒト細胞系;NS0細胞などのネズミ細胞系;そして具体的には、乳児ハムスター腎細胞などのハムスター細胞系、特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞が含まれる。糸状菌、植物、昆虫、両生類の細胞または卵巣種のものなどの他の真核宿主細胞も、用いることができる。好ましい宿主細胞は、細菌、具体的には、腸内細菌(enterobacteriacae)、好ましくは、E.coli、特に、そのBまたはK12菌株である。
(a)プロモーター;
(b)完全パリンドロームオペレーター配列;および
(c)タンパク質のための発現カセット
を含む;プロモーターがT7ではないことを特徴とする発現系を発現することを含む方法を提供する。
その発現系は、用いられる細胞について当該技術分野において周知の方法によって発現される。好ましい発現方法は、リコンビナント細胞を増殖培地中で、特に、発酵によって培養後、発現されたタンパク質を回収することを包含する。「増殖培地」という用語は、リコンビナント細胞を成長させるのに用いられる栄養培地を意味する。多くの態様において、栄養素溶液を用いる。与えられたリコンビナント細胞に適する増殖培地は、当該技術分野において周知である。
pAVE011、pAVE012およびpAVE013ベクター
pAVE011の生成用の出発ベクターは、US6,537,779号に記載のように製造されたpZT7#2.0であった。pZT7#2.0は、pAT153ベクター主鎖、cer安定性配列、tetA/R、目的の遺伝子の上流の単一天然lacオペレーター配列および上流T4転写ターミネーターを有する。T7A3プロモーターおよび二重完全パリンドロームlacオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてNcoI、EcoRIおよびXbaI制限酵素部位によってクローン化した。
次に、そのリンカーを、プラスミドpZT7#2.0に連結し、そしてクローニング宿主菌株XL−1 Blue MR(Stratagene)中にNcoI/EcoRIフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、NcoIを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE012と称した。
pAVE038の生成用の出発ベクターは、US6,537,779号に記載のように
製造されたpZT7#2.0であった。tacプロモーターおよび単一天然lacオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてEcoRIおよびXbaI制限酵素部位によってクローン化した。
次に、そのリンカーを、プラスミドpZT7#2.0に連結し、そしてクローニング宿主菌株XL−1 Blue MR(Stratagene)中にXbaI/EcoRIフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、NcoIを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE038と称した。
pAVE037およびpAVE040ベクター
pAVE037の生成用の出発ベクターは、US6,537,779号に記載のように製造されたpZT7#2.0であった。tacプロモーターおよび単一完全パリンドロームlacオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてEcoRIおよびXbaI制限酵素部位によってクローン化した。
次に、そのリンカーを、プラスミドpZT7#2.0に連結し、そしてクローニング宿
主菌株XL−1 Blue MR(Stratagene)中にXbaI/EcoRIフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、NcoIを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE037と称した。
pAVE028およびpAVE030ベクター
pAVE028の生成用の出発ベクターは、pAVE012であった。T7A3プロモーターカセットを、プラスミドpAVE012に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド5および6:
pAVE007およびpAVE031ベクター
pAVE007の生成用の出発ベクターは、US6,537,779号に記載のように製造されたpZT7#2.0であった。T7A3プロモーターおよび単一完全パリンドロームlacオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてEcoRIおよびXbaI制限酵素部位によってクローン化した。
オリゴヌクレオチド3および4を、アニーリングした後、形成されたリンカーを、プラスミドpZT7#2.0に連結し、そしてクローニング宿主菌株XL−1 Blue MR(Stratagene)中にXbaI/EcoRIフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE007と称した。
pAVE029およびpAVE027ベクター
pAVE029の生成用の出発ベクターは、US6,537,779号に十分に記載のように製造されたpZT7#2.0であった。λpLプロモーターおよび単一完全パリンドロームlacオペレーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてEcoRIおよびXbaI制限酵素部位によってクローン化した。
次に、リンカーを、プラスミドpZT7#2.0に連結し、そしてクローニング宿主菌株XL−1 Blue MR(Stratagene)中にXbaI/EcoRIフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、NcoIを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE029と称した。
ローン化して、pAVE027を生じた。
pAVE043およびpAVE044ベクター
pAVE043の生成用の出発ベクターは、pAVE012であった。tacプロモーターカセットを、プラスミドpAVE012に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド17および18:
pAVE034およびpAVE035ベクター
pAVE034の生成用の出発ベクターは、pAVE012であった。λpLプロモーターカセットを、プラスミドpAVE012に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド9および10:
ローン化して、pAVE035を生じた。
pAVE020およびpAVE021ベクター
pAVE020の生成用の出発ベクターは、pAVE012であった。λpLプロモーターカセットを、プラスミドpAVE012に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド7および8:
pAVE016およびpAVE017ベクター
pAVE016の生成用の出発ベクターは、pAVE012であった。tacプロモーターカセットを、プラスミドpAVE012に連結しているアニーリングされたオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド15および16:
ローン化して、pAVE017を生じた。
pAVE049ベクター
pAVE049の生成用の出発ベクターは、pAVE017であった。tacプロモーターカセットは、変化しなかった。二つのオペレーター間の91〜124塩基対間隔を増加させるために、EcoRIリンカーをクローン化した。これは、オリゴヌクレオチド19および20:
初期スクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE049と称した。
分泌ベクターpAVE046の生成用の出発ベクターは、pAVE027であった。D1.3Fab発現カセット(図1、SEQ ID NO17)を、NdeI−BamHIフラグメントとしてクローン化した。初期スクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE046と称した。
E.coli 菌株W3110(American Type Culture Collection よりATCC27325として入手可能)およびBL21(EMD Biosciences Inc, San Diego, USA より入
手可能)を、エレクトロポレーションにより、下の表2に記載のプラスミドで形質転換した。得られたリコンビナント菌株を精製し、グリセロール貯蔵液中において−80℃で維持した。
T7A3プロモーターを含むが、いずれのオペレーターも不含のプラスミドの生成用の出発ベクターは、pZT7#2.0であった。T7A3プロモーターを、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてEcoRIおよびXbaI制限酵素部位によってクローン化した。
次に、リンカーを、プラスミドpZT7#2.0に連結し、そしてクローニング宿主菌株XL−1 Blue MR(Stratagene)中にXbaI/EcoRIフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。22クローンを、制限消化物およびシークエンス法によってスクリーニングした。
単一天然Lacオペレーター配列の制御下のT7A3プロモーターを含むプラスミドの生成用の出発ベクターは、pZT7#2.0であった。T7A3プロモーターおよび天然Lacオペレーター(LacO)配列を、このプラスミド中に、合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いてEcoRIおよびXbaI制限酵素部位によってクローン化した。
次に、リンカーを、プラスミドpZT7#2.0に連結し、そしてクローニング宿主菌株XL−1 Blue MR(Stratagene)中にXbaI/EcoRIフラグメントとして形質転換した。初期スクリーニングは、プラスミドDNAの制限消化物によった。次に、配列をシークエンス法によって確認した。94クローンを、制限消化およびシークエンス法によってスクリーニングした。再度、正しい配列と一致したクローンは無かった。しかしながら、一つのクローンは、ほぼ無傷な配列を有することが判明した。このクローンは、その配列中の約−37位に追加の「G」を含有した。予想される配列は、この領域中に−GG−を含有するので、その突然変異の正確な位置を指定することは難しい。ヒトTNFα遺伝子を、ほぼ無傷な配列を有するプラスミド中にNdeI/XhoIフラグメントとしてクローン化した。クローニング宿主菌株XL−Blue MR(Stratagene)から20コロ
ニーをスクリーニングした。一つは、(上記の追加の「G」以外に)突然変異不含の陽性クローンであった。このプラスミドを、生産宿主(ATCC27325)中に形質転換し、そしてそのプラスミドを再度配列決定した。
CLD032バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)
、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている2個の250mlエルレンマイヤー(Erlenmeyer)フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、一方のフラスコを、0.0
5mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導し、もう一方のフラスコは、基底発現を監視するために未誘導のままにした。インキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表3に要約する。
CLD018バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)
、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。
その種培養物を、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlの種培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、0.05mMおよび1mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導した。フラスコは、未誘導のままにもし、そしてそれらフラスコのインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表4に要約する。
CLD026バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)
、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、0.05mMおよび0.005mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導した。フラスコは、未誘導のままにもし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表5に要約する。
CLD042およびCLD043バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。各々10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、別々に、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した各々2x5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。これらを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこれら培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに別々に接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、0.5mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導した。各々の菌株培養物が入っているフラスコは、未誘導のままにもし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。20時間インキュベーション後のCLD042およびCLD043の未誘導培養物中のhTNFαの基底蓄積レベルを、試料採取された細菌のSDS−PAGE後のウェスタンブロット分析(抗hTNFα抗体を用いた)によって比較した。それらブロットを走査し、データを規格化して、比較を可能にした。それら結果を、下の表6に要約する。
CLD019バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)
、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、それらフラスコを、0.5mM、0.1mM、0.05mMおよび0.005mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導した。フラスコは、未誘導のままにもし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、図2に示す。
CLD030バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)
、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、0.05mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導し、他のフラスコは未誘導のままにし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表7に要約する。
CLD021およびCLD038バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。各々10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、別々に、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。これらを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、1mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導し、もう一つのフラスコは、未誘導のままにし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積は、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルおよびSDS−PAGE後のウェスタンブロット分析(抗hTNFα抗体を用いた)を用いて決定した。そのデータを、表8に要約する。CLD038菌株についてのウェスタンブロット分析を、図3に示す。
CLD028およびCLD035バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。各々10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、別々に、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した各々2x5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。これらを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこれら培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに別々に接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、1mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導し、そしてインキュベーションを上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表9に要約する。
12およびB双方の菌株を用いることができるということを示した。
実施例11
発酵接種材料は、下記の菌株について各々200μlのグリセロール貯蔵液を、15μg/mlのテトラサイクリンを補足した200mLの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)が入っている2.0Lバッフル付きシェークフラスコに加えることによって増大させた。接種材料は、シェーカー・インキュベーター中、37℃において250rpmの撹拌で12時間増殖させた。200mlのシェークフラスコ接種材料を用いて、10Lのバッチ増殖培地が入っている15L作業容量発酵装置に接種した。発酵は、下記の操作条件下で行った。温度は、37℃で制御し、そして35%(w/v)水酸化アンモニウムの自動添加によって、pHを6.8で制御した。溶存酸素張力(dissolved oxygen tension)(dOT)設定点は、30%の空気飽和とし、発酵装置撹拌機速度の250rpm最小値〜1500rpm最大値までの自動調整、および入口ガス流への酸素の自動補給によって制御した。発酵装置容器への空気流量は、最後まで10L/分であった。発酵装置中の圧力は、50〜200mbarで維持した。
CLD050バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)
、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、0.05mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導し、別のフラスコは未誘導のままにし、そしてインキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のhTNFαの蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。hTNFαの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。それら結果を、下の表13に要約する。
の有効な制御を達成することができる。
CLD048バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン(10μg/ml)およびグルコース(1g/L)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)
、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。
これを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている250ml Erlenmeyer フラスコに接種した。そのフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、0.1mMの最終濃度へのIPTG(イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド)で誘導し、そしてインキュベーションを、上記の条件下で更に2時間続けた。次に、細胞と、残留細胞不含増殖培地を採取した。採取された細胞に、浸透圧ショック細胞分画を更に行って、可溶性E.coli ペリプラ
ズム画分に分配されたタンパク質を含有する細胞画分を単離した。可溶性ペリプラズム抽出物および残留増殖培地中の生物学的に活性なD1.3Fabの蓄積は、精製された活性D1.3Fabで作成された標準曲線に関するELISA検定において、リゾチーム(lysoszyme)(抗原)へのD1.3Fabの結合を決定することによって算定した。E.coli のペリプラズム中および残留増殖培地中(ペリプラズムから増殖培地への物質の漏出による)の生物学的に活性なD1.3Fabの蓄積を、表14に示す。ペリプラズムおよび残留増殖培地中のD1.3Fabの蓄積を、1単位のバイオマス(OD600)につき培養物1リットル当たりのμg活性物質として規格化した。
によって例示される。更に、バッチ供給発酵(例えば、前の実施例11または下の実施例14に記載の)を用いて、このようなタンパク質を高収率で製造することができる方法は、当業者に明らかであろう。
実施例11に記載の発酵法を、CLD048を用いて繰り返した。誘導は、発酵中のバイオマスレベルがOD600=約50に達したら、0.15mMの最終濃度へのIPTGの添加によって行った。バッチ供給相は、誘導後35〜45時間続けた。次に、細胞と、残留細胞不含増殖培地を採取した。採取された細胞に、浸透圧ショック細胞分画を更に行って、可溶性E.coli ペリプラズム画分に分配されたタンパク質を含有する細胞画分を
単離した。可溶性ペリプラズム抽出物および残留増殖培地中の生物学的に活性なD1.3Fabの蓄積は、精製された活性D1.3Fabで作成された標準曲線に関するELISA検定において、リゾチーム(lysoszyme)(抗原)へのD1.3Fabの結合を決定す
ることによって算定した。ペリプラズムおよび残留増殖培地中のD1.3Fabの蓄積を、「培養物1リットル当たりのmg活性物質」として規格化した。
質の漏出による)の生物学的に活性なD1.3Fabの蓄積を、表15に示す。
実施例15
合成二重特異性単一鎖四価ダイアボディー(diabody)(bsctDb)を設計したが
、それは、D1.3からの可変軽領域および可変重領域(抗リゾチーム)と、A5B7(抗CEA(癌胎児性抗原))を、単一ポリペプチド鎖上で連結していた。この分子のDNA配列を、図5に示す(SEQ ID NO22)。これを、NdeIおよびNotIで消化されたpAVE46中にNdeI/NotIフラグメントとしてクローン化した。リコンビナントプラスミドを、制限消化物によってスクリーニングし、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE078と称した。pAVE078を、E.coli W3110中に形質転換して、CLD073を製造し、それを精製し、グリセロ
ール貯蔵液中において−80℃で維持した。
)、10g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した
。これを、オービタルシェーカー中において37℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている2個の250ml Erlenmeyer フラスコに接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において37℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、フラスコを、0.5mMかまたは0.1mMの最終濃度へのIPTGで誘導し、そしてインキュベーションを、上記の条件下で更に20時間続けた。次に、細胞と、残留細胞不含増殖培地を採取した。採取された細胞に、浸透圧ショック細胞分画を更に行って、可溶性E.coli ペリプラズム画分に分配されたタ
ンパク質を含有する細胞画分を単離した。ペリプラズム抽出物および残留増殖培地中の生物学的に活性なD1.3−A5B7 bsctDbの発現、分泌、フォールディングおよび蓄積は、競合的ELISA検定においてCEA(抗原)への抗CEA単クローン性抗体の結合の阻害を決定することによって、および競合的ELISA検定においてリゾチーム(抗原)への抗リゾチームFab抗体フラグメントの結合によって算定した。
において抗CEAおよび抗リゾチーム双方の抗体の結合を競合的に阻害するということを示している。0.1mMのIPTGで誘導された培養物からの残留増殖培地試料は、低下した阻害レベルを示して、この試料中の生物学的に活性なD1.3−A5B7 bsctDbの一層低い蓄積レベルを示している。
異種タンパク質を生じることが可能である。これは、生物学的に活性な形の二重特異性単一鎖四価ダイアボディーが、新しい発現系を用いてE.coli 中で生じることができると
いうことを示すことによって例示された。これは、更に、発現系の有用性を例示している。
グルタチオン−S−トランスフェラーゼ−3Cプロテイナーゼ融合(GST−3C)遺伝子を、NdeIおよびXhoIで消化されたpAVE011中にNdeI/XhoIフラグメントとしてクローン化した。インサートの配列を、図6に示す(SEQ ID NO23)。リコンビナントプラスミドを、制限消化物によってスクリーニングし、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE052と称した。pAVE052を、E.coli BL21中に形質転換して、CLD054を製造し、それを精製し
、グリセロール貯蔵液中において−80℃で維持した。
転換して、CLD059を製造し、それを精製し、グリセロール貯蔵液中において−80℃で維持した。
であったが、それを、NdeIおよびXhoIで消化されたpAVE011中にNdeI/XhoIフラグメントとしてクローン化した。インサートの配列を、図8に示す(SEQ ID NO25)。リコンビナントプラスミドを、制限消化物によってスクリーニングし、シークエンス法によって確認した。得られたプラスミドを、pAVE061と称した。pAVE061を、E.coli W3110中に形質転換して、CLD060を製造し
、それを精製し、グリセロール貯蔵液中において−80℃で維持した。
1に記載の培地および方法条件を用いて行った。発酵は、表19に記載のように30℃または37℃で維持した。発酵は、バッチ様式で、炭素源(すなわち、グリセロール)が消耗するまで行った。バッチ供給発酵は、この時点で、グリセロール(714g/L)および硫酸マグネシウム(30g/L)を含有する供給材料の添加によって開始した。誘導は、発酵中のバイオマスレベルがOD600=50〜60に達したら、IPTGの添加によって行った。用いられるIPTG濃度を、表17に記載する。バッチ供給相は、誘導後12〜15時間続けた。試料を、発酵の間中採取して、バイオマスレベル(OD600)およびタンパク質生産物を決定した((GST−3C、IFNα2およびEPO)タイター(g/L)、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルを用いて)。
シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)からのL−2−ハロアルカノエートデハロゲナーゼ(hadL)遺伝子を、PCRを用いて遺伝子操作されたNdeIおよびSpeI部位を用いてクローン化した。その遺伝子配列を、図9に示す(SEQ ID NO26)。プラスミドpAVE011を、NdeIおよびSpeIで消化し、バンドをゲル抽出した。hadL遺伝子を、NdeIおよびSpeIで消化し、そしてhadL遺伝子を、ゲル抽出し且つpAVE011に連結して、pAVE075を生じた。シュードモナス・サバスタノイ(Pseudomonas savastanoi)複製起点を、PCRを用いて、プラスミドpCN60(ATCC77101;Nieto C, et al. (1990) Gene 87: 145-149)から
コピーした。
よって形質転換して、CLD075を製造し、それを精製し、グリセロール貯蔵液中において−80℃で維持した。CLD075バイアルを、−80℃フリーザーから取り出し、融解させた。10μlの融解したグリセロール貯蔵液を、テトラサイクリン(10μg/ml)を補足した5mlの Luria Broth(LB;5g/Lの酵母抽出物(Oxoid)、10
g/Lのトリプトン(Oxoid)および5g/Lの塩化ナトリウム)中に接種した。これを
、オービタルシェーカー中において30℃で16時間インキュベートした。次に、500μlのこの培養物を用いて、50mlの Luria Broth(上記の組成)が入っている2個の250ml Erlenmeyer フラスコに別々に接種した。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において30℃、200rpmでインキュベートした。増殖は、OD600=0.5〜0.7まで監視した。この時点で、一つのフラスコを、0.5mMの最終濃度へのIPTGで誘導し、もう一つのフラスコは、未誘導のままにして、基底発現を監視した。インキュベーションを、上記の条件下で続け、その間に、細菌細胞内のHadLタンパク質の蓄積と増殖の測定用に試料を採取した。HadLの蓄積レベルは、試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲルのデンシトメトリー走査を用いて決定した。
Pseudomonas putida CLD075を用いたバッチ供給発酵を、実施例11に記載の包
括的なE.coli 培地および方法条件を用いて行った。発酵は、30℃およびpH7.0
で維持した(25%水酸化アンモニウムおよび10%リン酸で制御される)。発酵は、バッチ様式で、炭素源(すなわち、グリセロール)が消耗するまで行った。バッチ供給発酵は、この時点で、グリセロール(714g/L)および硫酸マグネシウム(30g/L)を含有する供給材料の添加によって開始した。誘導は、発酵中のバイオマスレベルがOD600=50に達したら、1mMのIPTG(最終濃度)の添加によって行った。バッチ供給相は、誘導後12〜15時間続けた。試料を、発酵の間中採取して、バイオマスレベル(OD600)およびHadLタンパク質蓄積((%TCP)試料採取された細菌の全細胞溶解産物の Colloidal Blue 染色SDS−PAGEゲル)を決定した。誘導後のCLD075の増殖およびHadLタンパク質の発現/蓄積を、図11に示す。
おいて発現系を用いて、E.coli で用いるために設計された包括的な増殖培地を用いる
だけで達成した。
合成Galリプレッサー遺伝子(E.coli)を、(EP0502637号に記載の)ベクターpZen042中に、PstI部位中へのPstIフラグメントとしてクローン化した。クローンは、時計回りおよび反時計回り双方の配向のGalリプレッサー遺伝子で識別した。反時計回り配向のクローンを選択して、pAVE071を生じた。
次に、そのリンカーを、プラスミドpZT7#2.0に連結し、そしてクローニング宿主菌株XL−1 Blue MR(Stratagene)中にEcoRI/XbaIフラグメントとして形質転換した。形質転換細胞の初期スクリーニングは、AgeIを用いた制限消化によった。配列は、シークエンス法によって確認した。hTNFα遺伝子を、このプラスミド中にNdeI/XhoIフラグメントとしてクローン化した。
リンカーの存在は、MfeIでの消化で検出し、シークエンス法によって確認した。このプラスミドを、E.coli 菌株W3110中に形質転換して、CLD085を生じ、そ
れを精製し、グリセロール貯蔵液中において−80℃で維持した。
非組込み酵母ベクターを、次のように構築した。
(1)XhoIで消化されたpCR2.1(Invitrogen)中へのXhoIフラグメントとしてのクローン配列1(Saccharomyces cerevisiae CYC1プロモーターの下流のE
.coli LacI)。クローン配列1を、図15に示す(SEQ ID NO35)。
ラスミド中へのHindIIIフラグメント(PCRで製造される)としてのクローン配列
2(Saccharomyces cerevisiae MF−α1遺伝子プロモーターであって、MF−α1プ
ロモーター領域の両側に完全パリンドロームlacオペレーター配列を含むものと、タンパク質エラフィン(elafin)の遺伝子配列であって、下流に位置するC末端c−myc標識(エラフィン−cmyc)を含むものから成る)。クローン配列2を、図16に示す(SEQ ID NO36)。
TCC204688)中にエレクトロポレーションによって形質転換し、そして陽性コロニーを、ロイシン不含の酵母脱落培地(yeast drop-out medium)上で選択した(Kaiser C, Michaelis S and Mitchel A (Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Manual, 1994))。エラフィン−cmycタンパク質発現を決定するシェークフラスコ増殖研究を、同じ培地を用いて行った。それらフラスコを、オービタルシェーカー中において30℃、200rpmでインキュベートした。クローンを、約3のODへと増殖させ、そして0.5mMのIPTG(最終濃度)で誘導した。インキュベーションを、上記の条件下で更に16時間続け、その間に、増殖培地中へのエラフィン−cmycタンパク質の分泌と増殖の測定用に試料を採取した。残留増殖培地中へのエラフィン−cmycの分泌は、Wiedow O, et al, J Biol Chem. (1990) 265(25):14791-5 に記載のように、
エラスターゼ阻害酵素検定を用いて決定した。4時間のIPTG誘導後、増殖培地中に30mg/Lの活性エラフィンタンパク質が存在した。これは、本発明の発現系が、酵母において有効であることを示している。
二重完全パリンドロームlacオペレーター配列に隣接した構成的ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)プロモーターを含有するDNAフラグメントを合成した。これを、発現ベクター中にクローン化したところ、IgG Fcタンパク質を発現した。得られたプラスミドを、pAVE081と称したが、それは、pCMV−Script(Stratagene)に由来し、そしてNdeI/NheIフラグメント上の二重完全パリンドロームlacオペレーター配列に隣接したhCMVプロモーターを、ベクターの多重クローニング部位中のIgG FcDNA配列と一緒に含有する。hCMVプロモーターおよび二重完全パリンドロームlacオペレーターのDNA配列を、図12に示す(SEQ ID NO33)。IgG Fcタンパク質のDNA配列を、図13に示す(SEQ ID NO34)。IgG Fcタンパク質を発現するpAVE081およびlacリプレッサーを発現するpCMVlacI(Stratagene)の一時的コトランスフェクションを、当該技術分野において十分に記載されているように行って、IgG Fcタンパク質が、IPTG誘導性hCMVプロモーター・二重完全パリンドロームlacオペレーター発現系の制御下で発現されうるか否かを決定した。
懸濁増殖に適応したCHO細胞系ECACC85050302)懸濁培養物を、1.5x105個/mlの生菌数で、6ウェル組織培養プレートの各ウェルに加えた。次に、それら6ウェル組織培養プレートを、給湿37℃インキュベーター中において5%CO2で一晩(16時間)インキュベート後、トランスフェクション配合物を、等量のpCMVlacI(Stratagene)DNAを含む2μgのpAVE081 DNA、6μlのトランスフェクション試薬および94μlの増殖培地を1ウェルに付き含有して調製した。100μlのトランスフェクション配合物を、CHO細胞が入っている各々のウェルに加えた。次に、それら6ウェル組織培養プレートを、給湿37℃インキュベーター中において5%CO2でインキュベートした。増殖培地中へのIgG Fcタンパク質の発現/分泌レベルを決定するために、一組のウェル(2日目)を、5mMのIPTG(最終濃度)で誘導し、別の組のウェルを未誘導のままにした。3日目に、IPTGで誘導された組のウェルおよび未誘導のままのものから試料採取した(IPTG誘導後および未誘導)。IgG Fcタンパク質のCHO細胞による増殖培地中への発現および分泌は、当該技術分野において十分に確立されているELISAによって決定した。得られたデータを、図14に示す。
Claims (24)
- 原核細胞における組換えタンパク質発現のためのタンパク質発現系であって、
(a)T7A1、T7A2、T7A3、λpL、λpR、lacUV5、trp、trc、phoAおよびrrnBからなる群から選択されたプロモーター;および
(b)一つの完全パリンドロームオペレーター配列
を含み;完全パリンドロームオペレーター配列が転写出発点と重なっている、前記タンパク質発現系。 - オペレーター系が、lac、gal、deoまたはglnである、請求項1記載の発現系。
- 一つの完全パリンドロームオペレーター配列を用い、好ましくはプロモーターの下流に位置している、請求項1および請求項2のいずれかに記載の発現系。
- プロモーターがλpLまたはT7A3である、請求項1、2、および3のいずれか1項に記載の発現系。
- オペレーターがGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC(配列番号3の核酸塩基51から74)の配列を有する、請求項1,2,3、および4のいずれか1項に記載の発現系。
- 原核細胞における組換えタンパク質の発現のためのベクターであって、
(a)T7A1、T7A2、T7A3、λpL、λpR、lacUV5、trp、trc、phoAおよびrrnBからなる群から選択されたプロモーター;および
(b)一つの完全パリンドロームオペレーター配列
を含み;完全パリンドロームオペレーター配列が転写出発点と重なっている、前記ベクター。 - 組換えタンパク質のための発現カセットを更に含む、請求項6に記載のベクター。
- ベクターがプラスミドであり、好ましくは自律複製性プラスミドである、請求項6および請求項7のいずれかに記載のベクター。
- オペレーター系が、lac、gal、deoまたはglnである、請求項6、7、および8のいずれか1項に記載のベクター。
- 一つの完全パリンドロームオペレーター配列を用い、好ましくはプロモーターの下流に位置している、請求項6、7、8、および9のいずれか1項に記載のベクター。
- プロモーターがλpLまたはT7A3である、請求項6、7、8、9、および10のいずれか1項に記載のベクター。
- オペレーターがGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC(配列番号3の核酸塩基51から74)の配列を有する、請求項6、7、8、9、10、および11のいずれか1項に記載のベクター。
- 請求項6、7、8,9、10、11、および12のいずれか1項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
- 原核細胞における組換えタンパク質の製造方法であって、
(a)T7A1、T7A2、T7A3、λpL、λpR、lacUV5、trp、trc、phoAおよびrrnBからなる群から選択されたプロモーター;
(b)一つの完全パリンドロームオペレーター配列;および
(c)組換えタンパク質のための発現カセット
を含み;完全パリンドロームオペレーター配列が転写出発点と重なっている、前記方法。 - オペレーター系が、lac、gal、deoまたはglnである、請求項14に記載の方法。
- 一つの完全パリンドロームオペレーター配列を用い、好ましくはプロモーターの下流に位置している、請求項14および15のいずれかに記載の方法。
- プロモーターがλpLまたはT7A3である、請求項14、15、および16のいずれか1項に記載の方法。
- オペレーターがGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC(配列番号3の核酸塩基51から74)の配列を有する、請求項14、15、および16のいずれか1項に記載の方法。
- タンパク質を製造する方法であって、
(a)請求項7に記載のベクターで形質転換された原核宿主細胞を培養し;そして
(b)該タンパク質を回収すること
を含む方法。 - 宿主細胞が、E.coli である、請求項19に記載の方法。
- ベクターが、lac、gal、deoまたはglnであるオペレーター系からなる群より選択されるオペレーターを含む、請求項19および20のいずれかに記載の方法。
- ベクターが一つの完全パリンドロームオペレーター配列を含み、好ましくはプロモーターの下流に位置している、請求項19、20、および21のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターが、GGAATTGTGAGCGCTCACAATTCC(配列番号3の核酸塩基51から74)の配列を有するオペレーターを含む、請求項19、20、21、および22のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターが、λpLおよびT7A3からなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項19、20、21、22、および23のいずれか1項に記載の方法。
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AU4964697A (en) | 1996-11-15 | 1998-06-10 | Institute Of Cytosignal Research, Inc. | Methods for detecting and isolating genes |
US6355775B1 (en) * | 1996-11-15 | 2002-03-12 | Institute Of Cytosignal Research, Inc. | Transcriptional inhibitor |
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GB0227346D0 (en) * | 2002-11-22 | 2002-12-31 | Chiron Spa | 741 |
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WO2005058946A2 (en) * | 2003-12-12 | 2005-06-30 | Zymogenetics, Inc. | Methods for enhancing expression of recombinant proteins |
US7498166B2 (en) * | 2004-01-12 | 2009-03-03 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Dual expression vector system and screening methods |
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JP2005314252A (ja) * | 2004-04-27 | 2005-11-10 | Okayama Univ | 糖尿病性腎症の予防・治療剤 |
JP2005341803A (ja) * | 2004-05-31 | 2005-12-15 | Institute Of Physical & Chemical Research | 非対称な塩基配列を認識して切断する酵素I−CsmI及びその製造方法 |
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