ES2436883T3 - Sistema de expresión - Google Patents
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Abstract
Sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en secuencias de operador palindrómicasperfectas para la expresión de proteínas en células procariotas, que comprende: a) un promotor; y b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia deoperador en el sentido de 3' del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en elsentido de 5' del promotor; caracterizado porque el promotor no es de T7.
Description
Sistema de expresión
La presente invención se refiere a un sistema de expresión adecuado para la expresión microbiana de polipéptidos recombinantes.
Se conocen sistemas de expresión de proteínas basados en secuencias de operador palindrómicas perfectas basadas en T7 a partir de la patente US 6.537.779. Los sistemas basados en T7 presentan inconvenientes porque el funcionamiento del sistema de T7 requiere polimerasa de fago que se proporciona comúnmente insertando un profago !DE3 que expresa la polimerasa de fago requerida en la cepa huésped de Escherichia coli para crear cepas huésped lisogénicas. La polimerasa de fago también puede suministrarse a la célula mediante infección con un fago de transducción ! especializado que porta el gen para la polimerasa de fago (por ejemplo ARN polimerasa de T7). El profago !DE3 carece de los elementos genéticos requeridos para la escisión del profago para formar partículas de fago líticas. Sin embargo, se ha mostrado que cepas huésped lisogénicas de !DE3 liberan partículas de fago y por tanto provocan infecciones no deseadas en plantas de fermentación. De hecho, no se permite el uso de cepas de !DE3 a determinados operadores de plantas de fermentación.
La expresión de la proteína heteróloga antes de la inducción no es deseable porque algunas proteínas heterólogas tienen efectos perjudiciales sobre el crecimiento de la célula huésped y la estabilidad del plásmido lo que reduce la productividad global. Para evitar esto, los sistemas de expresión basados en T7 controlan generalmente la expresión de proteínas heterólogas en dos niveles. En primer lugar, se requiere la inducción de la expresión del gen de ARN polimerasa de T7 para producir ARN polimerasa de T7 para impulsar la expresión a partir del promotor de T7. En segundo lugar, también se necesita inducir el propio promotor de T7. Esto aumenta la complejidad del funcionamiento de los sistemas de expresión basados en T7.
Existe un gran número de sistemas de expresión de proteínas heterólogas con diferentes modos de control e inducción, haciendo que la selección y optimización del sistema de expresión/procedimiento de fermentación para proteínas de interés sea un procedimiento ampliamente empírico. Esto requiere mucho tiempo y no se desea. Por tanto, hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar un control mejorado de la expresión y niveles mejorados de expresión de proteínas sin el uso de polimerasa de fago ni cepas huésped lisogénicas. También hay una necesidad de sistemas que puedan proporcionar una expresión heteróloga inducible en células procariotas, así como en células eucariotas tales como células de mamíferos y levaduras.
Según la presente invención, se proporciona un sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en secuencias de operador palindrómicas perfectas para la expresión de proteínas en células procariotas que comprende:
a) un promotor; y
b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;
caracterizado porque el promotor no es de T7.
Promotores que pueden emplearse en el sistema de expresión de la presente invención son comúnmente sistemas de promotor basados en ARN polimerasa de huésped, y preferiblemente sistemas de promotor basados en ARN polimerasa de E. coli. Los ejemplos de promotores que pueden emplearse incluyen T7A1, T7A2, T7A3, !pL, !pR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA y rrnB.
Las secuencias de operador que pueden emplearse en el sistema de expresión según la presente invención incluyen lac, gal, deo y gln. En muchas realizaciones preferidas, se emplean dos secuencias de operador palindrómicas perfectas. Cuando se emplean dos sistemas de operador, las secuencias de operador están preferiblemente separadas para maximizar el control del promotor. En muchas realizaciones, la separación es de desde 85 hasta 150 pares de bases, preferiblemente desde 90 hasta 126 pares de bases y lo más preferiblemente de 91 ó 92 pares de bases. En determinadas realizaciones, una secuencia de operador se solapa con el punto de inicio transcripcional.
Se reconocerá que el sistema de operador se emplea comúnmente con una secuencia represora apropiada. Las secuencias represoras producen proteína represora, por ejemplo la secuencia génica de lacl cuando se usan operadores de lac. También pueden usarse otras secuencias represoras de lac, por ejemplo puede usarse la secuencia laclQ para aumentar el nivel de la proteína represora de lac. La secuencia represora también puede proporcionarse mediante el genoma de célula huésped o mediante el uso de un plásmido compatible adicional.
El sistema de expresión puede estar integrado en el genoma de célula huésped, pero está comprendido preferiblemente dentro de un elemento extracromosómico tal como un plásmido. Alternativamente, el sistema de expresión puede estar incorporado en vectores de fago o virales y éstos usarse para suministrar el sistema de expresión en el sistema de célula huésped. Pueden ensamblarse plásmidos o vectores de expresión mediante métodos conocidos en la técnica. El plásmido también comprende normalmente uno o más de los siguientes: un marcador seleccionable, por ejemplo una secuencia que confiere resistencia a antibióticos, una secuencia de estabilidad cer y un casete de expresión. El sistema de expresión también incorpora una secuencia señal si se requiere secreción de la proteína deseada.
La expresión puede inducirse mediante la adición de un inductor tal como isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG), análogos de IPTG tal como isobutil-C-galactósido (IBCG), lactosa o melibiosa. Pueden usarse otros inductores y se describen más completamente en otra parte (por ejemplo véase The Operon, eds Miller and Renznikoff (1978)). Pueden usarse inductores individualmente o en combinación. La construcción de plásmidos o vectores de expresión apropiados resultará evidente para el científico habitual en la técnica.
El sistema de expresión de la presente invención se emplea para expresar proteínas recombinantes en células huésped procariotas, y especialmente en microorganismos. Tal como se usa en el presente documento, “proteínas” se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente 10 aminoácidos. Los ejemplos de células procariotas incluyen células bacterianas, por ejemplo células bacterianas gram-negativas, incluyendo E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marsescens y Pseudomonas aeruginosa, y células bacterianas gram-positivas incluyendo Bacillus subtilis.
Células huésped preferidas son bacterias, particularmente enterobacteriáceas, preferiblemente E. coli, y especialmente cepas B o K12 de la misma.
El sistema de expresión de la presente invención se emplea comúnmente en forma de un plásmido, y plásmidos que comprenden un promotor y dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor, en el que los promotor no es de T7, forman otro aspecto de la presente invención. Los plásmidos pueden ser plásmidos de replicación autónoma o plásmidos de integración.
El sistema de expresión de la presente invención se emplea para la fabricación de proteínas recombinantes, mediante el cultivo de células recombinantes. Para la expresión de proteínas recombinantes, se reconocerá que el promotor y la secuencia de operador están operativamente unidos a ADN que codifica para una proteína recombinante que va a expresarse.
Por consiguiente, la presente invención también proporciona un método para la producción de una proteína recombinante en una célula procariota que comprende expresar un sistema de expresión que comprende
a) un promotor;
b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas; y
c) un casete de expresión para una proteína recombinante, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;
caracterizado porque el promotor no es de T7.
Si se desea, pueden estar presentes uno o más promotores y casetes de expresión, que pueden ser los mismos o diferentes. Las secuencias de operador empleadas pueden ser las mismas o diferentes.
Becker et al. dan a conocer un sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en secuencias de operador palindrómicas que comprende: a) un promotor (promotor lac UV), y b) dos secuencias de operador (una secuencia de operador palindrómica perfecta 5’-AATTGTGAGC/GCTCACAATT-3’; y una secuencia de operador de O2 5’-AAATGTGAGC/GAGTAACAACC-3’), estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor; caracterizado porque el promotor no es de T7 (J. Mol. Biology 349, 716-730, 2005). Becker et al. dan a conocer datos referentes a la represión de la expresión basal y también el efecto de formación de bucles en expresión inducida. Aunque en la figura 4 se presentan datos sobre razones de represión y actividad de indicador normalizada para diversas combinaciones de separación de operadores, estos datos no muestran las cantidades reales de indicador producido. En la tabla 1 se presentan datos clave sobre la expresión de proteínas para vector que contiene Osym. Aunque el vector que contiene Osym tiene el nivel de expresión basal, no inducido, más bajo, y de hecho la razón de represión más alta, el nivel real de producción de proteína inducida logrado es en realidad muy bajo, y de hecho mucho más bajo que el logrado con los operadores O2 y O3 nativos.
El sistema de expresión se expresa mediante métodos bien conocidos en la técnica para las células empleadas. Los métodos de expresión preferidos incluyen cultivar las células recombinantes en medio de crecimiento, especialmente mediante fermentación, y luego recuperar la proteína expresada. El término “medio de crecimiento” se refiere a un medio de nutrientes usado para hacer crecer las células recombinantes. En muchas realizaciones, se emplea una disolución de nutrientes. En la técnica se conocen bien medios de crecimiento adecuados para células recombinantes dadas.
La presente invención se ilustra sin limitación mediante los siguientes ejemplos.
1. Generación de series de vectores pAVE
Vectores pAVE011, pAVE012 y pAVE013
El vector de partida para la generación de pAVE011 fue pZT7#2.0, preparado tal como se describe en el documento US 6.537.779. pZT7#2.0 tiene una estructura principal de vector pAT153, secuencia de estabilidad cer, tet A/R, una secuencia de operador lac nativa individual en el sentido de 5’ del gen de interés y un terminador de la transcripción de T4 en el sentido de 5’. Se clonaron un promotor T7A3 y operadores lac palindrómicos perfectos dobles en este plásmido usando ligadores oligonucleotídicos sintéticos por medio de los sitios de enzimas de restricción Nco I, EcoR I y Xba I.
Se preparó el ligador 12.1 hibridando los oligonucleótidos 1 y 2.1:
Oligonucleótido 1 (SEQ ID NO 1)
5’CATGTGGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCAAGAACAATCCTGCACG
Oligonucleótido 2.1 (SEQ ID NO 2)
5’AATTCGTGCAGGATTGTTCTTGGAATTGTGAGCGCTCACAATTCCCA
Entonces se ligó el ligador al plásmido pZT7#2.0 y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Nco I/EcoR I. Se realizó un examen inicial de transformantes mediante digestión de restricción usando Nco I. Se confirmó la secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE012.
Entonces se clonó el casete de promotor T7A3 en pAVE012 hibridando los oligonucleótidos 3 y 4:
Oligonucleótido 3 (SEQ ID NO 3)
Oligonucleótido 4 (SEQ ID NO 4)
Se ligaron los oligonucleótidos hibridados al plásmido pAVE012 y se transformaron en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. Entonces se confirmó la secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE011.
Se clonó el gen de TNF# humano en este plásmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE013. En la figura 11 se presenta un mapa de plásmido para pAVE013. Esto muestra la disposición de operadores y promotor, y los sitios de enzimas de restricción usados en la construcción. Los operadores son ambos operadores lac palindrómicos perfectos. RBS es el sitio de unión al ribosoma El vector incluye una estructura principal de vector pAT153, una secuencia de estabilidad cer, un gen de resistencia a tetraciclina inducible (tet A/R), y un terminador de la transcripción de T4 en el sentido de 5’.
Vectores pAVE038 y pAVE041
El vector de partida para la generación de pAVE038 fue pZT7#2.0, preparado tal como se describe en el documento US 6.537.779. Se clonaron un promotor tac/T7A1 híbrido y un operador lac nativo individual en este plásmido usando un ligador oligonucleotídico sintético por medio de los sitios de enzimas de restricción EcoR I y Xba I.
Se preparó ligador 1112 hibridando los oligonucleótidos 11 y 12 Oligonucleótido 11 (SEQ ID NO 5)
Oligonucleótido 12 (SEQ ID NO 6)
10 Entonces se ligó el ligador al plásmido pZT7#2.0 y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial de transformantes mediante digestión de restricción usando Nco I. Se confirmó la secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE038.
15 Se clonó un gen de TNF# humano en este plásmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar plásmido pAVE041.
Vector pAVE028 y pAVE030
20 El vector de partida para la generación de pAVE028 fue pAVE012. Se clonó un casete de promotor T7A3 en pAVE012 hibridando los oligonucleótidos 5 y 6.
Oligonucleótido 5 (SEQ ID NO 9)
Oligonucleótido 6 (SEQ ID NO 10)
Se ligaron los oligonucleótidos hibridados al plásmido pAVE012 y se transformaron en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. Entonces se confirmó la secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante
35 se denominó pAVE028.
Se clonó un gen de TNF# humano en este plásmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE030.
Vectores pAVE043 y pAVE044
40 El vector de partida para la generación de pAVE043 fue pAVE012. Se clonó un casete de promotor tac en pAVE012 hibridando los oligonucleótidos 17 y 18:
Oligonucleótido 17 (SEQ ID NO 37)
Oligonucleótido 18 (SEQ ID NO 38)
Se ligaron los oligonucleótidos hibridados al plásmido pAVE012 y se transformaron en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. Entonces se confirmó la secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante
55 se denominó pAVE043.
Se clonó un gen te TNFA# humano en este plásmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE044.
Vectores pAVE034 y pAVE035
El vector de partida para la generación de pAVE034 fue pAVE012. Se clonó un casete de promotor !pL en pAVE012
hibridando los oligonucleótidos 9 y 10:
Oligonucleótido 9 (SEQ ID NO 39)
Oligonucleótido 10 (SEQ ID NO 40)
15 Se ligaron los oligonucleótidos hibridados al plásmido pAVE012 y se transformaron en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. Entonces se confirmó la secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE034.
20 Se clonó un gen de TNF# humano en este plásmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE035.
Vector pAVE020 y pAVE021
El vector de partida para la generación de pAVE020 fue pAVE012. Se clonó un casete de promotor !pL en pAVE012 25 hibridando los oligonucleótidos 7 y 8.
Oligonucleótido 7 (SEQ ID NO 11)
Oligonucleótido 8 (SEQ ID NO 12)
35 Se ligaron los oligonucleótidos hibridados al plásmido pAVE012 y se transformaron en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. Entonces se confirmó la secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE020.
40 Se clonó un gen de TNF# humano en este plásmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE021.
Vectores pAVE016 y pAVE017
El vector de partida para la generación de pAVE016 fue pAVE012. Se clonó un casete de promotor tac en pAVE012 45 hibridando los oligonucleótidos 15 y 16.
Oligonucleótido 15 (SEQ ID NO 13)
Oligonucleótido 16 (SEQ ID NO 14)
55 Se ligaron los oligonucleótidos hibridados al plásmido pAVE012 y se transformaron en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. Entonces se confirmó la secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante
se denominó pAVE016. Se clonó un gen de TNF# humano en este plásmido como fragmento de Nde I/Xho I para generar pAVE017. 5 Vector pAVE049 El vector de partida para la generación de pAVE049 fue pAVE017. No se alteró el casete de promotor tac. Para aumentar la separación entre los dos operadores desde 91 hasta 124 pares de bases, se introdujo por clonación un ligador de EcoR I. Éste estaba constituido por los oligonucleótidos 19 y 20.
Oligonucleótido 19 (SEQ ID NO 15)
5’AATTCACCGGTGTACAGTCATGTACAACCGGTG
15 Oligonucleótido 20 (SEQ ID NO 16) 5’AATTCACCGGTTGTACATGACTGTACACCGGTG Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. Entonces se confirmó la
20 secuencia mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE049. Tabla 1: Resumen de vectores pAVE
- Plásmido
- Promotor Sistema de operador Comentarios
- pAVE041
- tac/T7A1 Secuencia lac nativa individual
- pAVE017
- tac Secuencias palindrómicas perfectas dobles (DPPS) Separación de operador de 91 pares de bases (DPPS91)
- pAVE049
- tac Secuencias palindrómicas perfectas dobles Separación de operador 124 pares de bases (DPPS124)
- pAVE013
- T7A3 Secuencias palindrómicas perfectas dobles Separación de operador de 91 pares de bases (DPPS91)
- pAVE030
- T7A3 Secuencias palindrómicas perfectas dobles Separación de operador de 92 pares de bases (DPPS92)
- pAVE021
- !pL Secuencias palindrómicas perfectas dobles Separación de operador de 91 pares de bases (DPPS91)
- pAVE035
- !pL Secuencias palindrómicas perfectas dobles Separación de operador de 92 pares de bases (DPPS92)
25 2. Generación de cepas recombinantes
Se transformaron cepas de E. coli W3110 (disponible de la Colección Americana de Cultivos Tipo como cepa ATCC27325) y BL21 (disponible de EMD Biosciences Inc, San Diego, EE.UU.) mediante electroporación con los plásmidos tal como se describen en la tabla 2 a continuación. Se purificaron las cepas recombinantes resultantes y
30 se mantuvieron en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.
Tabla 2: Cepas recombinantes construidas
- Huésped
- Plásmido Descripción (proteína:promotor:sistema de operador) N.º de designación recombinante
- ATCC27325
- pAVE013 TNF#:T7A3:DPPS91 CLD018
- ATCC27325
- pAVE030 TNF#:T7A3:DPPS92 CLD026
- ATCC27325
- pAVE041 TNF#:tac/T7A1:IacO nativo individual CLD043
- ATCC27325
- pAVE017 TNF#:tac:DPPS91 CLD019
- ATCC27325
- pAVE049 TNF#:tac:DPPS124 CLD050
- ATCC27325
- pAVE021 TNF#:!pL:DPPS91 CLD021
- ATCC27325
- pAVE035 TNF#:!pL:DPPS92 CLD038
- BL21
- pAVE013 TNF#:T7A3:DPPS91 CLD035
- BL21
- pAVE030 TNF#:T7A3:DPPS92 CLD028
35 Comparación 1
El vector de partida para la generación de un plásmido con el promotor T7A3 sin ningún operador fue pZT7#2.0. Se clonó un promotor T7A3 en este plásmido usando ligador oligonucleotídico sintético por medio de los sitios de enzimas de restricción EcoR I y Xba I.
Se preparó ligador 2122 hibridando los oligonucleótidos 21 y 22 Oligonucleótido 21 (SEQ ID NO 18)
Oligonucleótido 22 (SEQ ID NO 19)
Entonces se ligó el ligador al plásmido pZT7#2.0 y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de ADN de plásmido. Entonces se confirmó la secuencia mediante secuenciación. Se examinaron ochenta y dos clones
15 mediante digestión de restricción y secuenciación.
No se identificó ningún clon con la secuencia de promotor T7A3 correcta (todos contenían mutaciones en la secuencia). Esto sugiere que la construcción de plásmidos que contienen este promotor constitutivo potente es problemática.
Comparación 2
El vector de partida para la generación de un plásmido con el promotor T7A3 bajo el control de una secuencia de operador lac nativa individual fue pZT7#2.0. Se clonó un promotor T7A3 y secuencia de operador Lac (LacO) nativa
25 en este plásmido usando ligador oligonucleotídico sintético por medio de los sitios de enzimas de restricción EcoR I y Xba I.
Se preparó ligador 2324 hibridando los oligonucleótidos 23 y 24
30 Oligonucleótido 23 (SEQ ID NO 20)
Oligonucleótido 24 (SEQ ID NO 21)
Entonces se ligó el ligador al plásmido pZT7#2.0 y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de Xba I/EcoR I. Se realizó un examen inicial mediante digestión de restricción de
40 ADN de plásmido. Entonces se confirmó la secuencia mediante secuenciación. Se examinaron noventa y cuatro clones mediante digestión de restricción y secuenciación. De nuevo no se identificó ningún clon con la secuencia correcta. Sin embargo, se encontró que un clon tenía una secuencia casi intacta. Este clon contenía una ‘G’ adicional en la secuencia aproximadamente en la posición -37. Es difícil asignar la posición exacta de la mutación puesto que la secuencia esperada contiene -GG- en esta región. Se clonó el gen de TNF# humano en el plásmido
45 con la secuencia casi intacta como fragmento de Nde I/Xho I. Se examinaron veinte colonias de la cepa huésped de clonación XL-Blue MR (Stratagene). Una fue el clon positivo sin mutaciones (aparte de la ‘G’ adicional descrita anteriormente). Se transformó este plásmido en un huésped de producción (ATCC27325) y volvió a secuenciarse el plásmido.
50 Esto indicó que el plásmido contenía mutaciones visibles en las secuencias tanto de promotor T7A3 como de TNF# humano lo que indica que el uso del promotor T7A3, incluso bajo el control de la secuencia de operador lac nativa, da como resultado inestabilidad del plásmido.
Ejemplo 3
55 Se extrajeron viales de CLD018 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelaran. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Se incubó el cultivo de siembra a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l del cultivo de siembra para
60 inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Se incubaron los matraces a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujeron los matraces con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 0,05 mM y 1 mM. También se dejó un matraz sin inducir y se continuó la incubación de los matraces, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del
5 crecimiento, acumulación de hTNF# dentro de las células bacterianas. Se determinó el nivel de acumulación de hTNF# usando exploración de densitometría de geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. A continuación se resumen los resultados en la tabla 3.
Tabla 3
- Tiempo con IPTG 0,05 mM (horas)
- Nivel de acumulación de hTNF (% de TCP)
- 3
- 2
- 4
- 5
- 6
- 8
- 8
- 13
- 24
- 19
- 24 (basal, sin IPTG)
- No detectado
- Tiempo con IPTG 1 mM (horas)
- Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)
- 5
- 7
- 6
- 12
- 8
- 19
- 24
- 26
Estos datos demostraron que puede realizarse un control adicional del promotor T7A3 potente usando dos secuencias de operador palindrómicas perfectas separadas por 91 pb. Se ha reducido significativamente la expresión basal (en ausencia de inductor) con respecto a la lograda usando un operador palindrómico perfecto
15 individual para controlar la represión. El control de la expresión basal logrado usando las secuencias palindrómicas perfectas dobles era inesperado en comparación con el sistema de T7 del documento US 6.537.779 en el que el control de la expresión basal requiere dos elementos de control diferentes. En este ejemplo se logró el control de la expresión basal en un fondo alto de ARN polimerasa de E. coli.
20 Ejemplo 4
Se extrajeron viales de CLD026 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelaran. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Esto se incubó a 25 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Se incubaron los matraces a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujeron los matraces con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 0,05 mM y 0,005 mM. También se dejó un matraz sin inducir y se continuó la incubación, en las condiciones
30 descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, acumulación de hTNF# dentro de las células bacterianas. Se determinó el nivel de acumulación de hTNF# usando exploración de densitometría de geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. A continuación se resumen los resultados en la tabla 4.
35 Tabla 4
- Tiempo de inducción con IPTG 0,005 mM (horas)
- Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)
- 8
- 15
- 24 (basal, sin IPTG)
- No detectado
Los resultados demostraron que cambiar la separación entre las dos secuencias de operador palindrómicas perfectas en 1 pb (desde 91 hasta 92 pb) no influyó de manera adversa en el rendimiento tanto en cuanto a la
40 expresión basal como en cuanto al nivel de acumulación final logrado. Inesperadamente, reducir la concentración de IPTG 10 veces (desde 0,05 mM hasta 0,005 mM) no redujo significativamente la productividad inducida.
Ejemplo 5
45 Se extrajo un vial de CLD019 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelara. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Esto se incubó a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Se
50 incubaron los matraces a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7.
En este punto se indujeron los matraces con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM y 0,005 mM. También se dejó un matraz sin inducir y se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, y acumulación de hTNF# dentro de las células bacterianas. Se determinó el nivel de acumulación de hTNF# usando
5 exploración de densitometría de geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. Se presentan los resultados en la figura 1.
Los datos presentados en la figura 1 demostraron que la combinación del promotor tac con secuencias de operador palindrómicas perfectas dobles conduce a un sistema en el que puede modularse directamente la tasa de expresión10 mediante la concentración de IPTG usado para la inducción. Tales sistemas pueden aprovecharse para modular la expresión de proteínas heterólogas, por ejemplo, para maximizar la acumulación de proteínas en una forma soluble
o para evitar el problema del efecto perjudicial que puede tener la secreción de proteínas heterólogas sobre el crecimiento y la productividad de células recombinantes.
15 Ejemplo 6
Se extrajeron viales de CLD021 y CLD038 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelaran. Se inocularon por separado 10 ∃l de cada disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y20 glucosa (1 g/l). Éstos se incubaron a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Se incubaron los matraces a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujo un matraz con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 1 mM mientras que se dejó sin inducir un segundo matraz y se continuó la 25 incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, acumulación de hTNF# dentro de las células bacterianas. Se determinó la acumulación de hTNF# usando geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue y análisis de inmunotransferencia de tipo Western (usando anticuerpo anti-hTNF#) siguiendo SDS-PAGE de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. Se resumen los datos en la tabla 5. El análisis de inmunotransferencia de tipo Western para la cepa
30 CLD038 se presenta en la figura 2.
Tabla 5
- Análisis
- Acumulación de hTNF -CLD021 (!pL:DPPS91) Acumulación de hTNF# -CLD038 (!pL:DPPS92)
- SDS-PAGE con Colloidal Blue (tras la inducción con IPTG )
- No detectado No detectado
- Transferencia de tipo Western (tras la inducción con IPTG )
- Positivo Positivo (véase la figura 1)
- SDS-PAGE con Colloidal Blue (Basal sin inducción con IPTG, 24 h)
- No detectado No detectado
- Transferencia de tipo Western (Basal sin inducción con IPTG, 24 h)
- No detectado No detectado
35 Estos resultados demuestran que la combinación de secuencias de operador palindrómicas perfectas dobles con el promotor !pL con la separación de o bien 91 pb o bien 92 pb dio como resultado una represión muy ajustada. Las transferencias de tipo Western indican que no se detectó ninguna expresión basal de la proteína diana. Con la inducción se logró un nivel de expresión de bajo nivel. Estos resultados fueron totalmente inesperados dado que el promotor !pL es un promotor extremadamente potente. Un sistema de este tipo puede usarse, por ejemplo, para
40 dirigir la expresión de proteínas de alta toxicidad a la célula huésped. Puede usarse cuando es ventajosa una expresión controlada, por ejemplo, para la expresión e inserción de proteínas de membrana.
Ejemplo 7
45 Se extrajeron viales de CLD028 y CLD035 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelaran. Se inocularon por separado 10 ∃l de cada disolución madre en glicerol descongelada en cada uno de 2x5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Éstos se incubaron a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de estos cultivos para inocular por separado matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria
50 (composición tal como se describió anteriormente). Se incubaron los matraces a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujeron los matraces con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 1 mM y se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, acumulación de hTNF# dentro de las células bacterianas. El nivel de acumulación de hTNF# se determinó usando exploración de densitometría de geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. A continuación se resumen los resultados en la tabla 6.
Tabla 6
- CLD035: Promotor T7A3, operadores palindrómicos perfectos dobles con 91 pb de separación
- Tiempo (horas) tras la inducción con IPTG
- Nivel de acumulación de hTNF (% de TCP)
- 2
- 7
- 4
- 14
- 20
- 27
- CLD028: Promotor T7A3, operadores palindrómicos perfectos dobles con 92 pb de separación
- Tiempo (horas) tras la inducción con IPTG
- Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)
- 2
- 10
- 4
- 15
- 20
- 23
Estos datos tomados junto con los datos presentados en los ejemplos 4 y 5 anteriormente indicaron que pueden usarse las cepas tanto K-12 como B de E. coli.
10 Ejemplo 8
Se prepararon los inóculos de fermentación añadiendo 200 ∃l de disolución madre en glicerol de cada una de las cepas descritas a continuación a un matraz de agitación con deflectores de 2,0 l que contenía 200 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con 15 15 ∃g/ml de tetraciclina. Se hicieron crecer los inóculos durante 12 h a 37ºC en un agitador-incubador con una agitación de 250 rpm. Se usó un inóculo de matraz de agitación de 200 ml para inocular un fermentador de 15 l de volumen de trabajo que contenía 10 l de medio de crecimiento discontinuo. Se llevaron a cabo fermentaciones en las condiciones de funcionamiento descritas a continuación. Se controló la temperatura a 37ºC y el pH a 6,8, controlado mediante adición automática de hidróxido de amonio al 35% (p/v). El punto de referencia de tensión de oxígeno
20 disuelto (dOT) fue del 30% de saturación de aire y se controló mediante ajuste automático de la velocidad del agitador del fermentador, desde un mínimo de 250 rpm hasta un máximo de 1500 rpm, y complementación automática de oxígeno a la corriente de gas de entrada. El flujo de aire hacia el recipiente de fermentador fue de 10 l/min. en todo momento. Se mantuvo la presión en el fermentador entre 50 y 200 mbar.
25 Se realizaron fermentaciones en modo discontinuo hasta agotamiento de la fuente de carbono (es decir glicerol) lo que se produjo aproximadamente 10 h tras la inoculación y se caracterizó por un aumento repentino de la dOT. Se inició la fermentación con alimentación discontinua en el punto de agotamiento de la fuente de carbono mediante la adición de una alimentación de glicerol/cloruro de magnesio a una velocidad de alimentación de 11 g de glicerol por l de medio por h. Se llevó a cabo la inducción mediante la adición de IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM
30 una vez que el nivel de biomasa en la fermentación alcanzó DO600 = 50-60. Se continuó la fase con alimentación discontinua durante 12 h tras la inducción. Se tomaron muestras para determinar el nivel de biomasa (DO600) y la acumulación de hTNF# (% de TCP)/título de hTNF# (g/l) en la recogida (geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue).
35 En la tabla 7 se proporciona la composición del medio de crecimiento discontinuo.
Tabla 7
- Componente
- Concentración final [g/l], [mg/l] y [ml/l] de agua purificada
- (NH4)2SO4
- 14,0
- Glicerol
- 35,0
- Extracto de levadura (Becton Dickinson)
- 20,0
- KH2PO4
- 2,0
- K2HPO4
- 16,5
- Ácido cítrico
- 7,5
- MgSO4,7H2O
- 2,47
- H3PO4
- 1,5 ml/l
- CaCl2,2H2O
- 0,294
- Antiespumante AF204
- 0,2 ml/l
- Tetraciclina
- 15 m g/l
- FeSO4,7H2O
- 114 m g/l
- ZnSO4,7H2O
- 29 m g/l
- MnSO4.H2O
- 17 m g/l
- Na2MoO4,2H2O
- 9 m g/l
- CuSO4,5H2O
- 4 m g/l
- H3.BO3
- 12 m g/l
En la tabla 8 se proporciona la composición de la alimentación de glicerol / cloruro de magnesio. Tabla 8
- Componente de alimentación
- Cantidad requerida [g/l] de agua purificada
- Glicerol
- 714
- MgSO4,7H2O
- 7,4
Se resumen los resultados en la tabla 9.
Tabla 9
- Cepa
- Descripción de vector expresión DO600 en la recogida Acumulación de hTNF (% de TCP) en la recogida Título de hTNF# (mg/l) en la recogida
- CLD018
- Promotor T7A3, palíndromo perfecto doble con 91 pb de separación 147 29 8400
- CLD026
- Promotor T7A3, palíndromo perfecto doble con 92 pb de separación 204 34 11400
- CLD019
- Promotor tac, secuencia palindrómica perfecta doble con 91 pb de separación 196 22 8300
10 Los datos demuestran claramente la utilidad de los sistemas para la fabricación de proteínas heterólogas. Se lograron altos títulos de producto usando una fermentación no optimizada genérica sencilla y procedimientos de inducción.
15 Ejemplo 9
Se extrajo un vial de CLD050 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelara. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Esto se incubó a
20 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Se incubaron los matraces a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujo un matraz con IPTG (isopropil-∀-D-1-tiogalactopiranósido) hasta una concentración final de 0,05 mM mientras que se dejó otro matraz sin inducir y se continuó la incubación, en las condiciones descritas
25 anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, acumulación de hTNF# dentro de las células bacterianas. El nivel de acumulación de hTNF# se determinó usando exploración de densitometría de geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra. A continuación se resumen los resultados en la tabla 10.
30 Tabla 10
- Tiempo tras la inducción (horas)
- Nivel de acumulación de hTNF# (% de TCP)
- 4
- 16
- 24 (basal, sin IPTG)
- No detectado
Sorprendentemente la secuencia de operador palindrómica perfecta doble funcionó cuando se aumentó la separación. La separación del palíndromo perfecto doble puede alterarse, por ejemplo, para lograr un control eficaz
35 de otros promotores.
Ejemplo 10
Se diseñó un diacuerpo tetravalente monocatenario biespecífico sintético (bsctDb), en el que se unieron las regiones
40 ligera variable y pesada variable de D1.3 (anticuerpo anti-lisozima) y A5B7 (anticuerpo anti-CEA (antígeno carcinoembrionario)) en una única cadena polipeptídica. La secuencia de ADN para esta molécula se muestra en la figura 3 (SEQ ID NO 22). Esto se clonó como fragmento de Nde I/Not I en pAVE046 que se había digerido con Nde I y Not I. Se examinaron plásmidos recombinantes mediante digestión de restricción y se confirmaron mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE078. Se transformó pAVE078 en W3110 de E. coli para
45 preparar CLD073, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.
Se extrajo un vial de CLD0073 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelara. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml) y glucosa (1 g/l). Esto se incubó a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular dos matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Se incubaron los matraces a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7.
5 En este punto se indujeron los matraces con IPTG hasta una concentración final de o bien 0,5 mM o bien 0,1 mM y se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente durante 20 horas adicionales. Entonces se recogieron las células y el medio de crecimiento libre de células residual. Se sometieron además las células recogidas a fraccionamiento de células por choque osmótico para aislar la fracción celular que contenía proteínas que se habían repartido en la fracción periplásmica de E. coli soluble. Se estimó la expresión, la secreción, el plegado y la acumulación de bsctDb D1.3-A5B7 biológicamente activo en el extracto periplásmico y medio de crecimiento residual determinando la inhibición de unión de un anticuerpo monoclonal anti-CEA a CEA (antígeno) en un ensayo de ELISA competitivo y mediante la unión de un fragmento de anticuerpo Fab anti-lisozima a lisozima (antígeno) en un ensayo de ELISA competitivo.
15 Los datos obtenidos indicaron que la mayor parte de bsctDb D1.3-A5B7 se repartió en el medio de crecimiento residual (fuga del periplasma) al final de la inducción. Estos datos (unión de bsctDb en ensayo de ELISA competitivo) se muestran en la tabla 11. Los datos obtenidos demuestran que la muestra de medio de crecimiento residual del cultivo inducido con IPTG 0,5 mM inhibe completamente la unión de los anticuerpos tanto anti-CEA como anti-lisozima en los ensayos de ELISA por competencia. La muestra de medio de crecimiento residual del cultivo inducido con IPTG 0,1 mM muestra un nivel reducido de inhibición lo que indica un nivel de acumulación inferior de bsctDb D1.3-A5B7 biológicamente activo en esta muestra.
Tabla 11
- Muestra
- % de inhibición en ensayo de ELISA por competencia con CEA % Inhibición en ELISA por competencia con D1.3
- Control (sin bsctDb D1.3-A5B7)
- Ninguno Ninguno
- Sobrenadante de cultivo inducido con IPTG 0,5 mM
- 100 100
- Sobrenadante de cultivo inducido con IPTG 0,1 mM
- Parcial Parcial
25 Usando el nuevo sistema de expresión es posible producir proteínas heterólogas de múltiples cadenas complejas que han sido difíciles de producir usando E. coli. Esto se ha mostrado a modo de ejemplo demostrando que pueden producirse diacuerpos tetravalentes monocatenarios biespecíficos en una forma biológicamente activa en E. coli usando el nuevo sistema de expresión. Esto muestra además a modo de ejemplo la utilidad del sistema de expresión.
Ejemplo 11
Se clonó el gen de fusión glutatión-S-transferasa-3C proteinasa (GST-3C) como fragmento de Nde I/Xho I en
35 pAVE011 digerido con Nde I y Xho I. La secuencia del inserto se muestra en la figura 4 (SEQ ID NO 23). Se examinaron plásmidos recombinantes mediante digestión de restricción y se confirmaron mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE052. Se transformó pAVE052 en BL21 de E. coli para preparar CLD054, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.
Se clonó el gen interferón #2 (IFN#2) humano como fragmento de Nde I/Xho I en pAVE011 digerido con Nde I y Xho
I. La secuencia de ADN del inserto se muestra en la figura 5 (SEQ ID NO 24). Se examinaron plásmidos recombinantes mediante digestión de restricción y se confirmaron mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE058. Se transformó pAVE058 en W3110 de E. coli para preparar CLD059, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.
45 Se clonó el gen de eritropoyetina (EPO) humana, que se había sometido a optimización de codones para su expresión en E coli, como fragmento de Nde I/Xho I en pAVE011 digerido con Nde I y Xho I. La secuencia de ADN del inserto se muestra en la figura 6 (SEQ ID NO 25). Se examinaron plásmidos recombinantes mediante digestión de restricción y se confirmaron mediante secuenciación. El plásmido resultante se denominó pAVE061. Se transformó pAVE061 en W3110 de E. coli para preparar CLD060, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.
Se llevaron a cabo fermentaciones con alimentación discontinua usando CLD054, CLD059 y CLD060 usando los medios y las condiciones de procedimiento descritos en el ejemplo 7. Se mantuvieron las fermentaciones a 30ºC o
55 37ºC tal como se describe en la tabla 19. Se realizaron fermentaciones en modo discontinuo hasta agotamiento de la fuente de carbono (es decir glicerol). Se inició la fermentación con alimentación discontinua en este punto mediante la adición de una alimentación que contenía glicerol (714 g/l) y sulfato de magnesio (30 g/l). Se llevó a cabo la inducción mediante la adición de IPTG una vez que el nivel de biomasa en la fermentación alcanzó DO600 = 50-60.
Las concentraciones de IPTG usadas se describen en la tabla 12. Se continuó la fase con alimentación discontinua durante 12-15 h tras la inducción. Se tomaron muestras a lo largo de la totalidad de las fermentaciones para determinar el nivel de biomasa (DO600) y título de producto de proteína ((GST-3C, IFN#2 y EPO) (g/l), usando geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra).
Tabla 12
- Cepa
- Huésped E. coli Descripción de proteína y vector expresión Temp. de ferm. ºC Conc. de IPTG de inducción (mM) DO600 Título de producto (g/l)
- CLD 054
- BL21 GST-3C T7A3:DPPS91 37 0,50 100 8
- CLD
- W3110 IFN#2 T7A3:DPPS91 37 0,10 120 9
- 059
- 37 0,25 150 14
- 37
- 0,50 160 14
- CLD
- W3110 EPO T7A3:DPPS91 37 0,10 100 >13
- 060
- 30 0,50 90 >13
Los datos presentados en la tabla 12 demuestran adicionalmente la utilidad de los sistemas para la fabricación de
10 una amplia gama de proteínas heterólogas. Se logran altos títulos de producto usando un procedimiento de fermentación genérico sencillo acoplado con manipulación tan sólo de la concentración de IPTG usado para la inducción. Esto es particularmente beneficioso para reducir los plazos de desarrollo del procedimiento para proteínas heterólogas terapéuticamente útiles.
15 Ejemplo 12
Se clonó el gen de L-2-haloalcanoato deshalogenasa (hadL) de Pseudomonas putida usando sitios Nde I y Spe I que se habían modificado por ingeniería usando PCR. La secuencia génica se muestra en la figura 7 (SEQ ID NO 26). Se digirió el plásmido pAVE011 con Nde I y Spe I y se extrajo la banda con gel. Se digirió el gen hadL con Nde I
20 y Spe I y se extrajo el gen hadL con gel y se ligó a pAVE011 para producir pAVE075. Se copió el origen de replicación de Pseudomonas savastanoi usando la PCR a partir de plásmido pCN60 (ATCC 77101; Nieto C, et al. (1990) Gene 87: 145-149).
Los cebadores usados fueron:
F37A: Secuencia: 5’ AGATCTACGCTTATGGGTGCCTTTCC (SEQ ID NO 27), y
B29a: Secuencia: 5’ AGATCTAATACGCAAACCGCCTCTCC (SEQ ID NO 28).
30 Se clonó el producto de PCR inicialmente en TOPO TA pCR2.1 (Invitrogen) y luego en pAVE075 mediante digestión con Bgl II. Se transformó el plásmido resultante, pAVE086, en Pseudomonas putida NCIMB 12018, mediante electroporación para preparar CLD075, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC. Se extrajo un vial de CLD075 de un congelador a -80ºC y se dejó que se descongelara. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona
35 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml). Esto se incubó a 30ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular por separado dos matraces Erlenmeyer de 250 ml que contenían 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Se incubaron los matraces a 30ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujo un matraz con IPTG hasta una concentración final de 0,5 mM mientras que se dejó sin
40 inducir el segundo matraz para monitorizar la expresión basal. Se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento y acumulación de proteína HadL dentro de las células bacterianas. Se determinó el nivel de acumulación de HadL usando exploración de densitometría de geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra.
45 La expresión y acumulación de proteína HadL se presentan en la figura 8. Los datos indican que el sistema de expresión de T7A3:DPPS91 funcionó en otro sistema de huésped procariota. Sorprendentemente, el sistema de expresión funcionó con la misma eficacia en Pseudomonas putida que la observada cuando se usó E. coli como sistema huésped. No se detectó expresión basal incluso tras 23 h de incubación en ausencia de inductor. Se logró
50 un alto nivel de expresión y acumulación de proteína en Pseudomonas putida tras la inducción usando IPTG.
Ejemplo 13
Se llevó a cabo una fermentación con alimentación discontinua usando Pseudomonas putida CLD075 usando los
55 medios de E. coli genéricos y las condiciones de procedimiento descritas en el ejemplo 7. Se mantuvieron las fermentaciones a 30ºC y pH 7,0 (controlado con hidróxido de amonio al 25% y ácido fosfórico al 10%). Se realizaron fermentaciones en modo discontinuo hasta agotamiento de la fuente de carbono (es decir glicerol). Se inició la fermentación con alimentación discontinua en este punto mediante la adición de una alimentación que contenía glicerol (714 g/l) y sulfato de magnesio (30 g/l). Se llevó a cabo la inducción mediante la adición de IPTG 1 mM (concentración final) una vez que el nivel de biomasa en la fermentación alcanzó DO600 = 50. Se continuó la fase con
5 alimentación discontinua durante 12-15 h tras la inducción. Se tomaron muestras a lo largo de la totalidad de la fermentación para determinar el nivel de biomasa (DO600) y la acumulación de proteína HadL ((% de TCP) geles SDS-PAGE teñidos con Colloidal Blue de lisados de células completas de las bacterias tomadas como muestra). El crecimiento de CLD075 y la expresión/acumulación de proteína HadL tras la inducción se presentan en la figura 9.
Se lograron altos niveles de expresión y acumulación de proteína (>40% TCP) usando el sistema de expresión en Pseudomonas putida incluso usando únicamente un medio de crecimiento genérico diseñado para su uso con E. coli.
Ejemplo 14
15 Se clonó un gen represor Gal sintético (E. coli) en vector pZen042 (tal como se describe en el documento EP 0 502 637) como fragmento de Pstl en el sitio Pstl. Se identificaron clones con el gen represor Gal en orientaciones tanto horaria como anti-horaria. Se seleccionó un clon con orientación anti-horaria para generar pAVE071.
Se inició la construcción de secuencias de promotor y operador Gal en plásmido pZT7#2.0, preparado tal como se describe en el documento US 6.537.779. pZT7#2.0 tiene una estructura principal de vector pAT153, secuencia de estabilidad cer, tet A/R, una secuencia de operador lac nativa individual en el sentido de 5’ del gen de interés y un terminador de la transcripción de T4 en el sentido de 5’. Se modificó la secuencia de operador Gal nativa para producir una secuencia de operador palindrómica perfecta. Ésta se clonó en el plásmido descrito anteriormente
25 usando ligadores sintéticos por medio de sitios de enzimas de restricción EcoRI y Xbal. Se preparó el ligador GalB hibridando los oligonucleótidos GalB1 y GalB2:
GalB1 (SEQ ID NO 29)
GalB2 (SEQ ID NO 30)
35 Entonces se ligó el ligador al plásmido pZT7#2.0 y se transformó en la cepa huésped de clonación XL-1 Blue MR (Stratagene) como fragmento de EcoR I/Xba I. Se realizó un examen inicial de transformantes mediante digestión de restricción usando Agel. Se confirmó la secuencia mediante secuenciación. Se clonó el gen de hTNF# en este plásmido como fragmento Ndel/Xhol.
Se clonaron el gen de hTNF# y la secuencia de operador palindrómica perfecta Gal parcial digiriendo con Xmal y Mscl y ligando en pAVE071 digerido con Xmnl y Xmal. Se examinaron clones para determinar la presencia del gen de hTNF# mediante digestión de restricción.
45 Se clonaron cada uno de promotor Gal y operador Gal palindrómico perfecto el sentido de 5’ en este plásmido usando ligadores sintéticos por medio de sitios Stul y EcoRI. Se preparó ligador GalA hibridando los oligonucleótidos GalA1 y GalA2:
GalA1 (SEQ ID NO 31):
GalA2 (SEQ ID NO 32)
Se detectó la presencia del ligador con digestión con Mfel y se confirmó mediante secuenciación. Se transformó este plásmido en cepa W3110 de E. coli para generar CLD085, que se purificó y se mantuvo en disoluciones madre en glicerol a -80ºC.
Se extrajo un vial de CLD085 del congelador a -80ºC y se dejó que se descongelara. Se inocularon 10 ∃l de la disolución madre en glicerol descongelada en 5 ml de caldo de Luria (LB, extracto de levadura 5 g/l (Oxoid), triptona 10 g/l (Oxoid) y cloruro de sodio 5 g/l) complementado con tetraciclina (10 ∃g/ml). Esto se incubó a 37ºC en un agitador orbital durante 16 h. Entonces se usaron 500 ∃l de este cultivo para inocular un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 50 ml de caldo de Luria (composición tal como se describió anteriormente). Se incubó el matraz a 37ºC, a 200 rpm en un agitador orbital. Se monitorizó el crecimiento hasta DO600=0,5-0,7. En este punto se indujo el matraz con galactosa hasta una concentración final de 10,0 mM. Se continuó la incubación, en las condiciones descritas anteriormente, durante la cual se tomaron muestras para la medición del crecimiento, acumulación de hTNF# dentro de las células bacterianas. Se determinó el nivel de acumulación de hTNF# usando análisis de inmunotransferencia de tipo Western (usando anticuerpo anti-hTNF#) tras SDS-PAGE de las bacterias tomadas como muestra. Los datos se presentan en la figura 11. Esto demuestra que usar secuencias de operador gal perfectamente palindrómicas en combinación con un gen represor gal conduce a una represión muy ajustada del promotor gal en ausencia de inductor mientras que sorprendentemente todavía se mantiene la capacidad de inducción cuando se añade el inductor galactosa.
<110> Avecia Biologics Limited
<120> Sistema de expresión
<130> SMC 60733/WO
<160> 40
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 1
catgtgggaa ttgtgagcgc tcacaattcc aagaacaatc ctgcacg 47
<210> 2
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 2
aattcgtgca ggattgttct tggaattgtg agcgctcaca attccca 47
<210> 3
<211> 77
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 3
<210> 4
<211> 77
<212> ADN
<213> Artificial
<223> Secuencia artificial
<400> 4
<210> 5
<211> 79
<212> ADN 15 <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
20 <400> 5
- 25
- <210> 6 <211> 79 <212> ADN <213> Artificial
- 30
- <220> <223> Secuencia artificial
- <400> 6
- 35 40
- <210> 7 <211> 78 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Secuencia artificial
- 45
- <400> 7
<210> 8
- <211>
- 78 50 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 8
<210> 9
- <211>
- 78 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 9
15 <210> 10
<211> 78
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Secuencia artificial
<400> 10
<210> 11
<211> 77
<212> ADN 30 <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
35 <400> 11
- 40
- <210> 12 <211> 77 <212> ADN <213> Artificial
- 45
- <220> <223> Secuencia artificial
- <400> 12
- 50 55
- <210> 13 <211> 77 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Secuencia artificial
<400> 13
<210> 14
<211> 77
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 14
- 20
- <210> 15 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial
- 25
- <220> <223> Secuencia artificial <400> 15
- aattcaccgg tgtacagtca tgtacaaccg gtg
- 33
- 30
- <210> 16 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial
- 35
- <220> <223> Secuencia artificial
- <400> 16
- 40
- aattcaccgg ttgtacatga ctgtacaccg gtg 33
- 45
- <210> 17 <211> 1550 <212> ADN <213> ratón
- <400> 17
- 5
- <210> 18 <211> 72 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Secuencia artificial
- <400> 18
- 15 20
- <210> 19 <211> 72 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Secuencia artificial
- <400> 19
- 5
- <210> 20 <211> 79 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Secuencia artificial
- <400> 20
- 15 20
- <210> 21 <211> 79 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Secuencia artificial
- 25
- <400> 21
<210> 22 30 <211> 1592
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 35 <223> Proteína artificial producida en el ejemplo 15
<400> 22 <210> 23
<211> 1237
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Proteína de fusión GST producida en el ejemplo 16
<400> 23
<210> 24
<211> 513
<212> ADN
<213> humano
<400> 24
<210> 25
<211> 517
<212> ADN 15 <213> humano
<400> 25
<210> 26
<211> 713
<212> ADN
<213> Pseudomonas putiva
<400> 26
<210> 27
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 27
agatctacgc ttatgggtgc ctttcc 26
<210> 28
<211> 26 25 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 28
agatctaata cgcaaaccgc ctctcc 26
<210> 29
<211> 69
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 29
<210> 30
<211> 69 15 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 30
25 <210> 31
<211> 68
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 31
<210> 32
<211> 72
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ligador
45 <400> 32
<210> 33
<211> 438
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 55 <223> Secuencia artificial
<400> 33 <210> 34
<211> 813
5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 34 <210> 36
- <210> 35
- <211> 1104
- <212> ADN
- <213> Artificial
- 20
- <220>
- <223> Secuencia de clones 1 usada en el ejemplo 20
- <400> 35
- 25
- <211>
- 1026 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de clones 2 usada en el ejemplo 20
<400> 36
<210> 37
- <211>
- 78 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 37
15 <210> 38
<211> 78
<212> ADN
<213> Artificial
20 <220>
<223> Secuencia artificial
<400> 38
<210> 39
<211> 78
<212> ADN 30 <213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
35 <400> 39
<211> 78
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia artificial
<400> 40
Claims (17)
- REIVINDICACIONES1. Sistema de expresión de proteínas recombinantes basado en secuencias de operador palindrómicas perfectas para la expresión de proteínas en células procariotas, que comprende:a) un promotor; yb) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;caracterizado porque el promotor no es de T7.
- 2. Plásmido para la expresión de proteínas en células procariotas que comprende:a) un promotor; yb) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;caracterizado porque el promotor no es de T7.
-
- 3.
- Plásmido según la reivindicación 2, que comprende además un casete de expresión para una proteína.
-
- 4.
- Plásmido según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, siendo el plásmido un plásmido de replicación autónoma.
-
- 5.
- Plásmido según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, siendo el plásmido un plásmido de integración.
-
- 6.
- Célula huésped transformada mediante un plásmido según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.
-
- 7.
- Célula huésped según la reivindicación 6, siendo la célula huésped E. coli.
35 8. Método para la producción de una proteína recombinante en una célula procariota que comprende expresar un sistema de expresión que comprendea) un promotor;b) dos o más secuencias de operador palindrómicas perfectas; yc) un casete de expresión para una proteína recombinante, estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 3’ del promotor, y estando ubicada al menos una secuencia de operador en el sentido de 5’ del promotor;caracterizado porque el promotor no es de T7. -
- 9.
- Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en los que el promotor es un promotor de polimerasa de célula huésped.
-
- 10.
- Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según la reivindicación 9, en los que el promotor es un promotor de ARN polimerasa de E. coli.
- 11. Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 55 en los que el promotor es T7A1, T7A2, T7A3, !pL, !pR, lac, lacUV5, trp, tac, trc, phoA o rrnB.
-
- 12.
- Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en los que el sistema de operador es lac, gal, deo o gln.
-
- 13.
- Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en los que se emplean dos secuencias de operador palindrómicas perfectas.
-
- 14.
- Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según la reivindicación 13, en los que las secuencias de operador están separadas por desde 85 hasta 150 pares de bases.
-
- 15.
- Sistema de expresión, plásmido, célula huésped o método según la reivindicación 14, en los que las
secuencias de operador están separadas por 91 ó 92 pares de bases. -
- 16.
- Método para producir una proteína recombinante, que comprende:
5 a) cultivar una célula huésped procariota transformada con un plásmido según la reivindicación 3; y b) recuperar la proteína. - 17. Método según la reivindicación 16, en el que la célula huésped es E. coli.
- 18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 y 17, en el que el plásmido es un plásmido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15.
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