JP5705825B2 - コヒーレント反ストークスラマン分光法 - Google Patents

Description

本発明は、物質に関する情報を得るためにその物質を電磁放射によってプロ―ビングする分野に関するものである。

コヒーレント反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）は、生体細胞などの物質の特性を調査するための既知の技術である。通常のＣＡＲＳシステムにおいて、サンプルは、ポンプビーム及びストークスビームを照射され、反ストークス放射を発することによって応答する。次に、ＣＡＲＳの物理特性に関する（量子力学的記述に対立するものとしての）古典的記述を簡単に挙げる。

共振周波数ω_ｖの振動モードを有する分子を考える。ポンプビームの周波数ω_ｐ及びストークスビームの周波数ω_ｓがω_ｐ−ω_ｓ＝ω_ｖであるような周波数であるとき、分子は、周波数ω_ｃ＝ω_ｐ＋ω_ｖのＣＡＲＳビームを形成する放射を発することによって応答し、検出される。

既存のＣＡＲＳシステムは、ポンプビーム及びストークスビームを別々のパルスレーザを用いて提供する。これらのビームは、光学的に整合されてターゲットサンプル内の同一ボリュームに入射されなければならず、２つのレーザからのパルスは、そのボリュームへ同時に到着しなければならない。このタイプのＣＡＲＳシステムは、上述されたレーザ放射の発射の空間的及び時間的な整合を達成するために専門的な配慮を必要とし、多くの場合、この整合が容易に（例えば物理的な衝撃によって）乱れえるという点で、不安定である。しかしながら、例えばPhysical Chemistry Chemical Physics 10, 609 (2008)及びそこで引用された文献で報告されているように、ポンプビーム及びストークスビームの両方を１つのレーザ光源を使用して提供することが知られている。

分析下におけるサンプル内の、共振周波数ω_ｖを有する着目振動モードをターゲットにするためには、ポンプビーム及びストークスビームを正確に調整し、ω_ｐ−ω_ｓ＝ω_ｖを達成する必要がある。通常、この調整は、回折格子や液晶アレイなどを使用して広帯域レーザ発光から所望のプロ―ビングＣＡＲＳ周波数を選択することによって達成される。このような調整構成は、やはり、扱いにくく混乱しやすい恐れがある。

本発明は、コヒーレント反ストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）に関するものである。探査光のポンプビーム及びストークスビームを生成するために、１つの光源が使用されてよい。ポンプビーム及びストークスビームは、生成されるＣＡＲＳ光のなかで様々な効果を生み出すために、様々なやり方でチャープされてよい。探査光のパルスの成分は、同一装置内で複数の調査が実施されることを可能にするために、そのほかの成分に相対的に遅延されてよい。複数の調査から差分の結果を得るために、フーリエ解析が使用されてよい。本発明は、以下で参照にするべき添付の特許請求の範囲に定められている。

ＣＡＲＳシステムを概略的に示したブロック図である。 図２は、図１のＣＡＲＳシステムにおいて使用される広帯域レーザの強度−周波数グラフである。 図３は、図１のＣＡＲＳシステムにおけるレーザの、フィルタリング適用後における強度−周波数グラフである。 図４は、図１のＣＡＲＳシステムにおける様々なパルスの周波数−時間グラフである。 図１のＣＡＲＳシステムにおけるパルスの、図４に付随するものと異なる動作パラメータ下における様々なグラフを提供している。 図１のＣＡＲＳシステムの一変形を概略的に示したブロック図である。 図６のＣＡＲＳシステムにおける様々なパルスの強度−時間グラフである。 ＣＡＲＳ光のパルスの、それぞれ補正前及び補正後におけるグラフを示している。 図６のＣＡＲＳシステムの一変形を概略的に示したブロック図である。 図９のＣＡＲＳシステムにおけるパルス複製ユニットを概略的に示したブロック図である。 図１０のパルス複製ユニットにおけるパルスの偏光を示したグラフである。 図１０のパルス複製ユニットにおけるパルスの偏光を示したグラフである。 図１０のパルス複製ユニットの効果を示したグラフである。 図９のＣＡＲＳシステムの顕微鏡における光電子増倍管からの出力信号を処理するための回路を概略的に示したブロック図である。

次に、例示として、添付の図面を参照にして本発明の特定の実施形態が説明される。

図１は、チャープユニット１２を含むＣＡＲＳシステムを示している。チャープユニット１２は、レーザ１４からの広帯域光に変更を加え、顕微鏡１６内でターゲットサンプル（不図示）からＣＡＲＳ光を誘起させるために顕微鏡１６に発射される探査光を形成する。レーザ１４は、１０ｆｓ未満の時間幅のパルスの形をとって７００〜９５０ｎｍの波長範囲に及ぶ広帯域光で構成される直線偏光を発する。顕微鏡１６は、標準的な共焦点蛍光顕微鏡である。次に、チャープユニット１２の特性が論じられる。

チャープユニット１２において、レーザからの光は、ダイクロイックビームスプリッタ１８に入射する。ビームスプリッタ１８は、レーザ光を、レーザ発光に含まれる異なる周波数サブバンドをそれぞれ含む２つのビーム２０，２２に分割する。ビーム２０をストークス光と呼び、ビーム２２をポンプビームと呼ぶ。ダイクロイックビームスプリッタ１８から、ストークス光２０は、分散ガラスブロック２４を通過し、コーナーキューブタイプの再帰反射器２６で反射され、ダイクロイックビームスプリッタ１８で再び反射され、更なる分散ガラスブロック２８を通過し、顕微鏡１６に入る。ダイクロイックビームスプリッタ１８から、ポンプビーム２２は、分散ガラスブロック３０を通過し、コーナーキューブタイプの再帰反射器３２で反射し、ダイクロイックビームスプリッタ１８を通過し、分散ガラスブロック２８を通過し、顕微鏡１６に入る。ダイクロイックビームスプリッタ１８は、ポンプビーム２２及びストークスビーム２４が同一の光路を進んで顕微鏡１６に入るように配置される。

再帰反射器３２は、リニアモータ３４上に搭載される。モータ３４は、ポンプビーム２２のなかのパルスがレーザ１４から顕微鏡１６まで進むのにかかる時間を短くする又は長くするために、レーザ１４からの光路に沿って前後に動かすことができる。ガラスブロック２４，２８，３０は、レーザパルスに分散を生じさせる。要するに、これらのブロックは、異なる周波数のレーザパルスをそれぞれ異なる時間だけ遅延させる。ガラスブロック２４，２８，３０が生じさせるように設計された分散の量については、後ほど説明される。

図２は、レーザ１４からのパルスのスペクトルを示しており、図３は、ダイクロイック
ビームスプリッタ１８のフィルタリング効果を示している。図３では、比較の目的で図２のスペクトルが破線で重ねられており、ストークスビーム２０及びポンプビーム２２のスペクトルは、それぞれ３８及び３６で示されている。ダイクロイックビームスプリッタ１８を通過するレーザパルスは、「ストークスパルス」と「ポンプパルス」とに分けられる。ストークスパルスは、レーザパルスのうちスペクトル３８を有する部分であり、ストークスビーム２０の一部を成す。ポンプパルスは、レーザパルスのうちスペクトル３６を有する部分であり、ポンプビーム２２の一部を成す。

図４は、同一レーザパルスから派生されるストークスパルス４０とポンプパルス４２とのペアに対するガラスブロック２４，２８，３０の効果を示している。図４は、パルス４０，４２を、ターゲットサンプルに印加するために顕微鏡１６に入るときの形で示している。ガラスブロック２４，２８は、ストークスパルス４０に対し、該パルスの周波数が対時間において特定の勾配で線形チャープを示すような累積的な分散効果を有するように設計される。ガラスブロック３０，２８は、ポンプパルス４２に対し、該パルスの周波数が対時間においてストークスパルスのチャープの勾配と実質的に等しい勾配で線形チャープを示すような累積的な分散効果を有するように設計される。図４からわかるように、ストークスパルス４０及びポンプパルス４２の最も低い周波数成分が、顕微鏡に同時に到達する。この整合は、再帰反射器３２の位置を調節し、ポンプパルス４２がスプリッタ１８に戻るのにかかる時間をストークスパルス４０がスプリッタ１８に戻るのにかかる時間に相対的に調節することによって達成される。

図４は、ストークスパルス４０及びポンプパルス４２に応答してターゲットサンプルによって発せられるＣＡＲＳ光のパルス４４も示している。ストークスパルス４０とポンプパルス４２との間の瞬時周波数差（ＩＦＤ）は、常に一定である。ＣＡＲＳパルス４４は、ＩＦＤに等しい共振周波数ω_ｖを持つターゲットサンプルにおける振動モードに対応している。ＣＡＲＳパルス４４は、ターゲットサンプル内の一振動モードに対応しているので、顕微鏡１６内で単純な光電子増倍管（不図示）によって十分に検出されえる。顕微鏡１６は、また、レーザ１４のバンド幅内の周波数を持つサンプルから発せられる任意の光を阻止するためのフィルタ（不図示）も含む。

図５は、ポンプビーム２２が進むのにかかる時間をモータ３４を使用して変化させることによる効果を示している。参照を容易にするために、図５は、４６で示される図３のスペクトルの再現と、４８で示される図４のグラフの再現とを含む。グラフ４８では、ストークスパルス４０とポンプパルス４２との間のタイミングの関係がτによって示されており、これは、チャープされたポンプパルス４２の低周波数側の端が顕微鏡１６に到着してからストークスパルス４０の高周波数側の端が顕微鏡１６に到着するまでに経過する時間の尺度である。グラフ４８には、ＩＦＤも示されている。５０で示されたグラフは、再帰反射器３２を動かしてτを減少させることによる効果を示している。τが減少されると、ＩＦＤは、なおも一定ではあるが、より低い値を有することが明らかである。この状況で生成されるＣＡＲＳパルスは、５２で示されている。

したがって、再帰反射器３２は、ユーザが調査しようとしているターゲットサンプルの振動モードの共振周波数ω_ｖに対応するようにＩＦＤを調整するために、必要に応じ、ポンプビーム２２の経路に沿って後方又は前方へ動かすことができる。所望の共振周波数ω_ｖの選択は、モータ３４の操作によって比較的容易に達成され、再帰反射器３２の使用は、モータ３４によって課される動きの僅かな不規則性が光ビームの整合不良を引き起こす事態を阻止する。

図６は、図１のＣＡＲＳシステム１０の一変形であるＣＡＲＳシステム５４を示している。図１から引き継がれた図６の構成要素は、同じ参照符号を維持しており、それらの特
性及び目的の詳細な説明は、繰り返されない。ビームスプリッタ５６は、レーザ１４の出力の一部をチャープユニット１２から逸らして、ミラー５８で反射し次いでレンズ６０によってサファイア板又は高屈折率液体などの非線形要素６２内の小ボリュームへ集束されるビームを形成する。非線形要素６２内の焦点ボリュームから現れる光は、非線形要素６２内における三次混合プロセス（例えば光カー（Ｋｅｒｒ）効果）の結果として生じる。非線形要素６２内の焦点ボリュームから現れる光は、次いで、レンズ６４によってビームの形に集束しなおされる。レンズ６４からのビームは、次いで、ミラー６６で反射し、参照ビームとして顕微鏡６８に入る。

顕微鏡６８は、チャープユニット１２からのストークスパルス及びポンプパルスをサンプル７２内の一ボリュームへ集束させるための対物レンズ７０を含む。更なる対物レンズ７４が、サンプル７２内のターゲットボリュームからのＣＡＲＳパルス光を収集し、それを、ビームの形でビームスプリッタ７６上へ投射する。ビームスプリッタ７６には、非線形要素６２からの参照ビームも入射する。

対物レンズ７４からの光の一部（理想は半分）が、ビームスプリッタ７６からプリズム７８へ透過し、参照ビームからの光の一部が、ビームスプリッタ７６からプリズム７８へ反射する。プリズム７８から現れるビームは、レンズ８０によって集束され、偏光ビームスプリッタ８２によって２つの直交偏光成分に分けられる。偏光成分は、次いで、レンズ８０の像面内にあるそれぞれのラインスキャンカメラ８４，８６によって検出される。プリズム７８は、ビームスプリッタ７６から受信された光のなかに波長分散を生じさせ、レンズ８０は、その波長分散を、各ラインスキャンカメラ８４，８６に沿った一連の位置へ平行移動させる。

対物レンズ７４からの光の一部（理想は半分）が、ビームスプリッタ７６によってプリズム８８へ反射し、参照ビームからの光の一部が、ビームスプリッタ７６からプリズム８８へ透過する。プリズム８８から現れるビームは、レンズ９０によって集束され、偏光ビームスプリッタ９２によって２つの直交偏光成分に分けられる。偏光成分は、次いで、レンズ９０の像面内にあるそれぞれのラインスキャンカメラ９４，９６によって検出される。プリズム８８は、ビームスプリッタ７６から受信された光のなかに波長分散を生じさせ、レンズ９０は、その波長分散を、各ラインスキャンカメラ９４，９６に沿った一連の位置へ平行移動させる。ラインスキャンカメラ８６，９６へ進む偏光成分は、平行偏光を有する。

ＣＡＲＳ光と参照ビームとの間の干渉は、各ラインスキャンカメラ８４，８６，９４，９６上にスペクトル強度干渉稿を形成する。同じ偏光を受信するカメラのペア（例えばカメラ８４，９４）からの像を互いに差し引くとは、その偏光についての干渉稿（スペクトル干渉図形）が分離され、またＣＡＲＳ光及び参照ビームの個別スペクトルが排除される（ＣＡＲＳ光及び参照ビームの個々のスペクトルは、不要な参照ビーム又はＣＡＲＳ光をブロックすることによって、ラインスキャンカメラ８４，８６，９４，９６上において検出することができる）。スペクトル干渉図形から、スペクトル分光法によって、ＣＡＲＳ光のスペクトル振幅及びスペクトル位相を取り出すことができる（J. Opt. Soc. Am. B 12, 2467 (1995)）。このためには、基準パルスとＣＡＲＳ信号との間に実質的な時間的重複が無いように、参照ビームのパルスの到着時間を、対応するＣＡＲＳパルスよりも前になるように（光路長によって）調節しなければならない。（通常、図６に示されたシステムでは、基準パルスと対応するＣＡＲＳパルスの始まりとの間の時間として約０．５ｐｓが使用されると考えられる。これよりも大幅に短い値を選ぶと、重複が生じ、これよりも大幅に長い値を選ぶと、所定のスペクトル解像度について干渉図形からＣＡＲＳを取り出すことができる時間的範囲が短くなる。）したがって、顕微鏡６８は、サンプル７２内のターゲットボリュームからのＣＡＲＳ光についての振幅情報及び位相情報を再生させるこ
とができる。この能力によって、次に説明されるように、チャープユニット１２に対して特定の調節がなされたときに更に高度な測定が行われることを可能になる。

具体的には、ガラスブロック２４，２８，３０は、ストークスビーム及びポンプビームがともになおも線形チャープを示してはいるがストークスビームパルスの周波数の変化率がポンプビームパルスの周波数の変化率と大きく異なるように、再設計される。サンプル物質に印加されるピークパワーを低減させるために、ストークスビームパルスは僅かにチャープされるだけである。一方で、ポンプビームパルスは強くチャープされて、ポンプビームパルスの周波数が振動の位相緩和時間に匹敵する比較的長い期間にわたってサンプルに到着するようにする。チャープユニット１２に対するこれらの変更による効果は、図７に示されている。また、この図は、ポンプビームに対してこれまでよりも小さい周波数サブバンドを使用するようにダイクロイックビームスプリッタ１８を再設計する選択肢も示している。このサブバンドは、レーザ１４の出力周波数のバンドの上端に位置しており、レーザ１４の出力周波数のバンドのうち比較的大きい中央のサブバンドが顕微鏡１６内でサンプルの照射に使用されないようになっている。これにより、サンプル物質が受けるパワーが低減し、その結果、サンプル物質が損傷するリスクが小さくなる。

図７は、ストークスビーム及びポンプビームに使用されることになったレーザ１４の出力バンドのサブバンドをグラフ９８で示している。破線は、図３と同様に、レーザ１４の出力周波数のバンドを表わしている。ポンプビームに割り当てられた調節後のサブバンドは、９９で示されている。サブバンド９９と、ストークスビームに使用されるサブバンド３６との間のギャップは、図３におけるサブバンド３８と３６との間のギャップよりも広くなっていることが明らかであり、これは、ダイクロイックビームスプリッタ１８の随意の再設計を通じて達成されるサンプルへの印加パワーの減少を表わしている。図７は、また、レーザ１４からの同一パルスから派生されるストークスパルス１０２及びポンプパルス１０４がとることになる変更後の形態を示したグラフ１００も提供している。

ストークスパルス１０２及びポンプパルス１０４が同時に到着しはじめるように再帰反射器３２を位置決めすることによって、ＩＦＤは、ストークスパルス１０２のパルス幅の間に最大値ＩＦＤ_ｍａｘから最小値ＩＦＤ_ｍｉｎの範囲にわたって変化することが明らかである。ＩＦＤが一定の範囲にわたって変化するので、ポンプパルス及びストークスパルスは、ゆえに、サンプル物質の、ＩＦＤ_ｍａｘからＩＦＤ_ｍｉｎまでの範囲内の様々な共振周波数を有する様々な振動モードからＣＡＲＳ光を励起させることができる。したがって、パルス１０２，１０４に応答して生成されるＣＡＲＳ光は、サンプル物質内のそれぞれ異なる共振周波数に関連したＣＡＲＳパルス１０６〜１１０の集合で構成される。各ＣＡＲＳパルス１０６〜１１０は、その振動モードのコヒーレンス時間によって決定される期間にわたって持続する。振動コヒーレンス時間は、パルス１０６、パルス１０８、パルス１１０の順で短くなる。

ストークスパルス１０２及びポンプパルス１０４に応答して対物レンズ７４によって収集されるＣＡＲＳ光は、図８のグラフ１１２にも再度示されている。顕微鏡６８は、ＣＡＲＳ光をその振幅及び位相の形で検出するので、ポンプパルス１０４のチャープに起因するパルス１０６〜１１０の傾斜を平らにするために、顕微鏡６８によって検出されるＣＡＲＳ光を表わす数学的データに、OPTICS LETTER 31, 1543 (2006)に記載されるような数学的手法を適用することができる。これにより、グラフ１１４に示されるようなスペクトルを再生でき、サンプル内において励起された異なる振動モードを区別することができる。パルス１０６〜１１０は、それぞれ平らにされて、パルス１１６〜１２０になっている。具体的には、経時的ＣＡＲＳ変化のスペクトルを振幅及び位相の形で取り出すことができ、これらは、ＣＡＲＳ強度のみを測定するのとは対照的に、線形分解によって化学組成を見出すために使用することができる。

別のＣＡＲＳシステム１２２が、図９に示されている。ＣＡＲＳシステム１２２は、ＣＡＲＳシステム１０の一変形であり、レーザ１４とチャープユニット１２との間に、パルス複製ユニット１２４が挿入されている。パルス複製ユニット１２４は、図１０に更に詳しく示されている。

図１０に示されるように、レーザ１４からのビームは、パルス複製ユニット１２４に入り、半波長板１２６を通過する。レーザビームは、次いで、偏光ビームスプリッタ１２８へ進み、該スプリッタは、レーザビームを直交偏光成分に分割する。これらの成分の一方は、偏光ビームスプリッタ１２８を第２の偏光ビームスプリッタ１３０へ透過する「透過成分」である。もう一方の成分は、反射して分散ガラスブロック１３２を通り、次いでミラーペア１３４によって第２の偏光ビームスプリッタ１３０へ反射する「反射成分」である。半波長板１２６は、入力されるレーザビームの直線偏光を回転させ、偏光ビームスプリッタ１２８によって生成される透過成分及び反射成分に対して所望の相対強度を与えるように方向付けられる。第２の偏光ビームスプリッタは、透過成分を透過させるとともに反射成分を反射させ、それらを同じ方向に進ませるように方向付けられる。再結合されたレーザビーム偏光は、次いで、偏光ビームスプリッタ１３０から半波長板１３６へ進む。偏光ビームスプリッタ１２８，１３０、ガラスブロック１３２、及びミラーペア１３４は、レーザビームの反射成分をレーザビームの透過成分に相対的に量Ｔ_１だけ遅延させる第１の遅延アーム１３８を構成する。更に、反射成分は、遅延アーム１３８において、ガラスブロック１３２の特性によって決定される度合いの分散を受ける。この分散による効果は、後ほど説明される。

半波長板１３６から、レーザビームは、アーム１３８の構成と類似した構成を有する更なる遅延アーム１４０へ進む。半波長板１３６は、偏光ビームスプリッタ１４４によって生成される直交偏光成分に対して所望の相対強度を与えるように方向付けられる。遅延アーム１４０は、ミラーペア１４２へ進むレーザビームの成分に対し、真っ直ぐに偏光ビームスプリッタ１４４，１４６を通って進む成分に相対的にＴ_２の遅延を課する。更に、ガラスブロック１４８を通って進むレーザビームの成分は、更なる分散を受ける。第２の遅延アーム１４０を経た後、レーザビームは、４分の１波長板１５０を通って進み、次いで、チャープユニット１２に入る。

レーザ１４は、パルスを発する。図１１ａ〜１１ｈは、パルス複製ユニット１２４がレーザ１４からの任意のパルスに及ぼす効果を示している。図１１ａ〜１１ｈの各図は、強度−時間グラフをペアで示している。各ペアにおいて、上側のグラフは、偏光ビームスプリッタ１２８によって生成される反射成分の偏光に平行な偏光における強度を示しており、下側のグラフは、偏光ビームスプリッタ１２８の透過成分に平行な直交偏光における強度を示している。図１１ａ〜１１ｈに示された２つの直交偏光を、これ以降、「基準偏光」と呼ぶ。図１１ａ〜１１ｈの各図において、上側及び下側のグラフの時間軸は、共通のゼロ時刻に揃えられている。説明を容易にするために、更に、偏光ビームスプリッタ１２８，１４４の透過成分の偏光を平行であると想定し、偏光ビームスプリッタ１２８，１４４によって生成される反射成分の偏光を平行であると想定する。

図１１ａは、レーザ１４からの任意のパルスに応答した半波長板１２６の出力を示している。半波長板１２６は、到着するレーザパルスの強度が基準偏光の間で等しく分割されて直交偏光パルス１５１，１５３が得られるように、そのレーザパルスの直線偏光を回転させるように位置決めされる。図１１ｂは、ブロック１３２に向かう偏光ビームスプリッタ１２８の出力を、すなわちパルス１５１のみを示している。図１１ｃは、スプリッタ１３０に向かう偏光ビームスプリッタ１２８の出力を、すなわちパルス１５３のみを示している。図１１ｄは、偏光ビームスプリッタ１３０の出力を、すなわち、パルス１５３と、
時間Ｔ_１だけ遅れたパルス１５１とを示している。

偏光ビームスプリッタ１３０からの光は、半波長板１３６に向かって進む。半波長板１３６は、図１１ｅに示されるように、パルス１５３を基準偏光の間で等しく分けてパルス１５２，１５４を形成するように角度付けられる。同様に、遅延パルス１５１も、やはり図１１ｅに示されるように、パルス１５８，１６０に等しく分けられる。図１１ｆは、ブロック１４８に向かう偏光ビームスプリッタ１４４の出力を、すなわちパルス１５４，１５８のみを示している。図１１ｇは、スプリッタ１４６に向かう偏光ビームスプリッタ１４４の出力を、すなわちパルス１５２，１５６のみを示している。図１１ｈは、偏光ビームスプリッタ１４６の出力を、すなわち、パルス１５２，１５６と、時間Ｔ_２だけ遅れたパルス１５４，１５８とを示している。遅延Ｔ_１，Ｔ_２は、４つのパルスが全てレーザ１４のパルス繰り返し期間Ｔ_ＲＥＰ内に収まるように制約される（１／Ｔ_ＲＥＰは、レーザがパルスを発する速さである）。

４分の１波長板１５０は、パルス１５２〜１５８の直線偏光を回転偏光に変換し、これにより、パルス１５２〜１５８がサンプルに印加されるに際し、それらが誘発するＣＡＲＳ応答が、時間平均されたときにパルスの偏光とサンプルの構造との間の特定の向きに無関係になる。

図１１ａ〜１１ｈを単純に維持するために、これらの図では、ブロック１３２〜１４８による分散効果を示そうとしていない。しかしながら、図１２は、その分散による効果のみならず、チャープユニット１２のなかのダイクロイックビームスプリッタ１８がパルス１５２〜１５８に及ぼす効果も示している。したがって、図１２は、ダイクロイックビームスプリッタ１８によってパルス１５２がストークスパルス１５２ａとポンプパルス１５２ｂとに分割されることを示している。同様に、パルス１５４〜１５８は、それぞれのストークスパルス１５４ａ〜１５８ａとそれぞれのポンプパルス１５４ｂ〜１５８ｂとに分割される。

パルス１５４は、ガラスブロック１４８によって分散され、したがって、図１２では、破線でつながれたパルス１５４ａ，１５４ｂによって示されるように「前のめり」である。この分散の結果、ポンプパルス１５４ｂの始まりは、ストークスパルス１５４ａの始まりに対して僅かに遅延される。この遅延は、パラメータτ（図５及び対応する説明を参照せよ）の大きさを変化させ、したがって、遅延がない場合にパルス１５４ａ，１５４ｂが可調節式再帰反射器３２の現行位置とガラスブロック２４，２８，３０によって導入される分散とにしたがってターゲットにすると考えられるＩＦＤの大きさを変化させる。言い換えると、ストークスパルス１５４ａの開始とポンプパルス１５４ｂの開始との間の遅延は、パルス１５４がターゲットにする共振周波数ω_ｖを調節する。

同様に、ポンプパルス１５６ｂの開始は、ガラスブロック１３２による分散によってストークスパルス１５６ａの開始に対して遅延され、ポンプパルス１５８ｂの開始は、ガラスブロック１３２，１４８による分散によってストークスパルス１５８ａの開始に対して遅延される。したがって、４つのパルス１５２〜１５８は、全て、それらの分散の度合いが異なるゆえに、サンプル内の異なる共振周波数をターゲットにする。図が複雑にならないように、ガラスブロック２４，２８，３０によるパルス１５２ａ〜１５８ｂのチャープ、及びミラー２６，３２へのルートの光路差による遅延効果は、図１２には示されていない。しかしながら、レーザ１４からのパルスの繰り返し期間Ｔ_ＲＥＰは、図１２にも再度示されている。

前述のように、顕微鏡１６は、光電子増倍管を使用して、サンプルからのＣＡＲＳパルスを検出する。光電子増倍管は、受信されたＣＡＲＳ光の強度を電気信号Ｉ（ｔ）に変換
する。１５２〜１５８は、それぞれ、対応するＣＡＲＳ光パルスを生成することができ、これらのＣＡＲＳパルスは、電気信号Ｉ（ｔ）内で瞬時だと見なすことができるように、この光電子増倍管の時間分解能と比べて短くなっている。したがって、ノイズなどを無視すると、信号Ｉ（ｔ）は、Ｔ_ＲＥＰごとに繰り返す一連のデルタ関数の形を有する。信号Ｉ（ｔ）は、したがって、フーリエ級数として表わすことができる。

遅延アーム１３８，１４０は、２Ｔ_１＝４Ｔ_２＝Ｔ_ＲＥＰとなるように設計される。その結果、持続時間Ｔ_ＲＥＰのＩ（ｔ）期間内に繰り返すデルタ関数のセットは、

である。ここで、Ａ_１〜Ａ_４は、パルス１５２〜１５８によってそれぞれトリガされる（一見瞬時に見える）ＣＡＲＳパルスの時間平均信号である。数学的には、以下のように示すことができる。

これら４つの連立方程式から、４つのＣＡＲＳパルス１５２〜１５８の振幅Ａ_１，Ａ_２，Ａ_３，Ａ_４を再生させることができる。

図１３は、光電子増倍管信号Ｉ（ｔ）を処理してａ_０／２、ａ_１，ｂ_１，ａ_２を導くための顕微鏡１６内の電子回路１６０を示している。光電子増倍管からの信号Ｉ（ｔ）は、入力ライン１６２に印加される。入力ライン１６４は、レーザ１４内のフォトダイオード（不図示）から得られる電気信号を受信する。該電気信号は、レーザ１４のパルス周波数（フォトダイオードのバンド幅によって制限される。該バンド幅は、明確にすることのみを目的として挙げるならば、通常は約５００ＭＨｚである、すなわち８ω_１である）で繰り返されるデルタ関数で構成される。したがって、ライン１６４に印加される電気信号も、やはり、Ｉ（ｔ）内に含まれるのと同じ周波数のフーリエ級数である。

回路１６０は、複数のハイパスフィルタ１６６〜１７２を含む。フィルタ１６６，１６８は、ω_１／２未満の周波数（ω_１＝２π／Ｔ_ＲＥＰであることが思い起こされる）をブロックし、フィルタ１７０，１７２は、３ω_１／２未満の周波数をブロックする。回路１６０は、また、複数のローパスフィルタ１７４〜１８８も含む。フィルタ１７４〜１８０は、ω_１／２を超える周波数をブロックし、フィルタ１８２，１８４は、３ω_１／２を超える周波数をブロックし、フィルタ１８６，１８８は、５ω_１／２を超える周波数をブロックする。回路は、また、フィルタ１８２から出る信号をＴ_ＲＥＰ／４だけ遅延させてその信号をπ／２ラジアンだけ位相シフトさせるための遅延ライン１９０も含む。

回路１６０は、また、周波数ダウン変換をそれぞれ実施するよう構成された複数のミキサ１９２〜１９６を含む。回路１６０に供給される信号は、ｋを（ゼロを含む）整数としたときに、ｋω_１の関係を満たすような周波数のみを含む。したがって、ミキサ１９２の出力は、ａ_１に比例するダウン変換成分を含み、ミキサ１９４の出力は、ｂ_１に比例するダウン変換成分を含み、ミキサ１９６の出力は、ａ_２に比例するダウン変換成分を含む。ａ_１，ｂ_１，ａ_２に対する比例定数は、ミキサ１９２〜１９６の損失と、ライン１６４上における信号の振幅とによって決定される。したがって、図９〜１３に関して説明されるＣＡＲＳシステムは、追加の光学素子を伴わずに様々な測定を時間的に多重化することができるという点で、有用である。

係数ａ_１は、ＣＡＲＳパルス高さＡ_１の大きさとＡ_２の大きさとの間の差の尺度であり、したがって、次に説明されるように、差分測定法で使用することができる。

例えば、パルス１５２に応答して生成されるＣＡＲＳパルスを考える。前述のように、このＣＡＲＳパルスは、パルス１５２の対応するＩＦＤによってターゲットにされる共振周波数（ｆ_０と呼ぶ）を持つ振動モードからのＣＡＲＳ光を含む。しかしながら、ＣＡＲＳパルスは、顕微鏡１６の焦点ボリューム内にある物質の、ｆ_０よりも大きい共振周波数を有するあらゆる振動モードからの非共鳴ＣＡＲＳ光も、また、純粋に電子的な寄与からの非共鳴ＣＡＲＳ光も含む。この非共鳴ＣＡＲＳ光は、共振周波数ｆ_０の振動モードからのＣＡＲＳ光である所望のＣＡＲＳ信号を覆い隠す傾向がある背景ＣＡＲＳ信号である。

水は、生体細胞の支配的成分であるので、水からの背景ＣＡＲＳ信号は、調査中の細胞の一特徴の振動モードから誘発される共鳴ＣＡＲＳ信号を支配する、すなわち覆い隠す恐れがある。この問題に取り組むために、以下のように、係数ａ_１の差分的特性を活用することができる。

振幅Ａ_１のＣＡＲＳ応答を引き出すパルス１５２は、調査対象とされる細胞タイプの膜内の着目振動モードの共振周波数であるｆ_１のＩＦＤをチャープユニット１２によって与えられると考える。また、振幅Ａ_２のＣＡＲＳ応答を引き出すパルス１５４は、共振周波数がｆ_２＞ｆ_１であって水のなかにも調査中の細胞タイプのなかにも見出されることを予期されないような振動モードをターゲットにすると想定する。

最初、顕微鏡の焦点ボリュームが水のみを含むとき、半波長板１２６は、ＣＡＲＳパルス振幅Ａ_１，Ａ_３が実質的に等しく尚且つａ_１（フィルタ１７６の出力信号）が実質的にゼロであるようにピーク１５２，１５６の振幅を変更するように調節される。この状況では、ＣＡＲＳパルス振幅Ａ_１，Ａ_２は、完全に非共鳴ＣＡＲＳ光に由来する。次いで、焦点ボリューム内に、サンプル物質が配される。したがって、フィルタ１７６の出力信号を生じさせるいかなる変化も、共振周波数ｆ_１を有する着目振動モードからの共鳴ＣＡＲＳ光に帰せられる。言い換えると、半波長板１２６を調節することによるフィルタ１７６の出力信号のゼロ化は、実際のサンプルの調査に顕微鏡が使用されるときに、水からの非共
鳴ＣＡＲＳ背景信号を補正する効果を有する。４つのパルスは、全て、同一レーザパルスから派生されるので、従来のような強度変動は示さず、平衡信号ａ_１の形に完全に抑えられ、したがって、信号のショットノイズによってのみ制限される。これは、物質組成における僅かな変化の高感度検出を可能にする。同様な議論は、係数ａ_２，３にも当てはまり、したがって、合計３つの平衡信号が抽出される。

（パルス１５２〜１５８が全て、チャープユニット１２によって同じＩＦＤを与えられるように、）ガラスブロック１３２，１４８を取り除くことによって、ＣＡＲＳシステム１２２は、次に説明されるように、他の測定を実施するように適応させることができる。

４つのパルス１５２〜１５８のビーム方向は、全て、ビームスプリッタ１４６，１３０の傾き／傾斜によって僅かに異ならせることができる。すると、顕微鏡は、パルスを、サンプル内の複数の横方向に変位した焦点ボリュームへ集束させる。したがって、パルス１５２〜１５８に応答して生成されるＣＡＲＳパルスは、サンプル内の異なる場所に関する。焦点ボリュームのサイズに匹敵する横変位を使用すると、係数ａ_１は、（Ａ_１，Ａ_３がサンプル内の異なる場所に関するものであるゆえに、）サンプル内におけるＣＡＲＳ応答の空間的勾配を表わすようになる。同様な議論は、係数ａ_２，３にも当てはまる。

また、４分の１波長板１５０を取り除き、半波長板に置き換えることも可能である。これらの状況下では、パルス１５２，１５６は、パルス複製ユニット１２４から第１の偏光で現れ、パルス１５４，１５８はパルス複製ユニット１２４から、第２の直交偏光で現れる。ここで、パルス１５２〜１５８によって誘発されるＣＡＲＳパルスは、それぞれ振幅Ａ_１〜Ａ_４を有することを思い出されたい。したがって、係数ａ_２＝Ａ_１−Ａ_２＋Ａ_３−Ａ_４は、パルス１５２〜１５８の第１および第２の偏光に対するサンプルのＣＡＲＳ応答の差の尺度である。ゆえに、例えば脂質膜などにおいて、ＣＡＲＳ光の複屈折性をもたらすサンプル物質の空間的順序付けを探査することが可能である（J. Raman Spectrosc. 34, 642 - 650 (2003)を参照せよ）。この追加の半波長板は、もちろん、パルス１５２〜１５８の２つの直交偏光をサンプル物質に相対的に回転させるために回転させることができる。

当該技術に熟達した読者ならば、説明されたＣＡＲＳシステムの様々な変更形態が明らかである。例えば、以下のものがある。

パルス複製ユニット１２４のなかで非偏光ビームスプリッタを使用することができる（ただし、各遅延アーム１３８，１４０の出力におけるビームの再結合の際に、強度損失が発生するであろう）。

偏光ビームスプリッタ８２，９２を省き、レンズ８０，９０からの光をそれぞれの１つのラインスキャンカメラ上に集束させることができる（ただし、ＣＡＲＳ光に関する偏光情報が失われるであろう）。

８２，９２の代わりに、２本のラインを伴う１つのカメラを偏光ディスプレーサと併せて使用することができる。

２本のラインを伴うラインスキャンカメラを（偏光ディスプレーサと併せずに）又は４本のラインを伴うラインスキャンカメラを（偏光ディスプレーサと併せて）使用して、ビームスプリッタ７６の両方の出力を１本の分散ビーム経路に導くことができる。

プリズム７８，８８を回折格子に交換することができる。

パルス複製ユニット１２４がレーザのパルス繰り返し期間Ｔ_ＲＥＰ内に製造する遅延パルスの数と、配置とを、（相伴う回路１６０の調節とともに）変更することができる。これは、遅延ユニット１３８，１４０の数を変更することによって、レーザパワーの損失を伴うことなく達成することができる。ｎ回の繰り返しの間に、合計２^ｎ個のパルスと、それぞれの電気信号とが生成される。

ビームスプリッタ７６に入射する参照ビームを、（レーザの特性に応じて）レーザ１４から直接提供し、そうして、非線形要素６２及びレンズ６０，６４の必要性を排除することができる。

Claims (14)

1. サンプルを調査するための装置であって、
   パルス光を発する光源と、
   前記光源からの光のパルスを、時間的に分離された複数の派生光パルスに変換するための変換手段と、
   各派生光パルスを、前記派生光パルスの周波数のサブセットで構成される第１の探査パルスと、それらの周波数の別のサブセットで構成される第２の探査パルスとに分離するための分離手段と、
   各派生光パルスの前記第１及び第２の探査パルスをチャープするためのチャープ手段と、
   各派生光パルスのチャープされた第１及び第２の探査パルスを時間的に重複する形で前記サンプルに印加するための方向付け手段と、
   前記サンプルからそこでの各派生パルスのチャープされた第１及び第２の探査パルスの相互作用によって誘起される誘起光を検出するための検出手段と、
   を備える装置。
2. 請求項１に記載の装置であって、
   前記チャープ手段は、各派生光パルスの第１の探査パルスを、そのなかの少なくとも一周波数バンドにわたって第１の実質的に線形の分散を導入することによってチャープするように設定され、かつ、各派生光パルスの第２の探査パルスを、そのなかの少なくとも一周波数バンドにわたって第２の実質的に線形の分散を導入することによってチャープするように設定される、装置。
3. 請求項２に記載の装置であって、
   前記第１及び第２の実質的に線形の分散は、実質的に同じ、対周波数の遅延変化率を有する、装置。
4. 請求項３に記載の装置であって、
   前記検出手段は、前記検出された誘起光を対時間で記録する信号を生成し、前記装置は、更に、少なくとも１つの量を計算するための計算手段を備え、前記少なくとも１つの量は、前記信号を表わすフーリエ級数の個々の係数を少なくとも示す、装置。
5. 請求項１ないし４のいずれかに記載の装置であって、
   前記変換手段は、前記光源からの前記パルスを、前記サンプルに到達するために異なる長さの経路を進む複数の部分に分けるための分割手段を含む、装置。
6. 請求項１ないし５のいずれかに記載の装置であって、更に、
   第１の派生光パルスの進む方向と、第２の派生光パルスの進む方向との間に差を生じさせて、前記第１の派生光パルスの前記チャープされた第１及び第２の探査パルスが前記サンプル内の第１の場所から光を誘起させ尚且つ前記第２の派生光パルスの前記チャープされた第１及び第２の探査パルスが前記サンプル内の異なる場所から光を誘起させるようにする、偏向手段を備える装置。
7. 請求項１ないし６のいずれかに記載の装置であって、
   前記方向付け手段は、前記派生光パルスの全てについて、前記チャープされた第１の探査パルスの先頭の前記サンプルへの到着と、前記チャープされた第２の探査パルスの先頭の前記サンプルへの到着との間の期間に対して共通の調節を行うための、調節手段を含む、装置。
8. 請求項１ないし７のいずれかに記載の装置であって、
   前記チャープ手段は、前記第１及び第２の探査パルスによって走行される経路において分散ガラスを含む、装置。
9. 請求項１ないし８のいずれかに記載の装置であって、
   前記検出手段は、前記サンプルから誘起される光を、その振幅及び位相の形で検出するように設定される、装置。
10. 請求項９に記載の装置であって、
    前記検出手段は、更に、前記サンプルから誘起される光の、その振幅及び位相の形での記録をもとに、前記サンプルから誘起される光のスペクトルを推定するように設定された、処理手段を含む、装置。
11. 請求項１ないし１０のいずれかに記載の装置であって、
    前記光源は、広帯域パルスレーザを含む、装置。
12. 請求項１ないし１１のいずれかに記載の装置であって、
    前記検出手段は、前記前記サンプルから誘起される前記光のなかのＣＡＲＳ光を区別するための区別手段を含む、装置。
13. 請求項１ないし１２のいずれかに記載の装置であって、
    前記検出手段は、所定の直線偏光で前記サンプルから誘起される光を区別するように設定される、装置。
14. サンプルを調査する方法であって、
    光源からパルス光を提供することと、
    前記光源からの光のパルスを、時間的に分離された複数の派生光パルスに変換することと、
    各派生光パルスを、前記派生光パルスの周波数のサブセットで構成される第１の探査パルスと、それらの周波数の別のサブセットで構成される第２の探査パルスとに分離することと、
    各派生光パルスの前記第１及び第２の探査パルスをチャープすることと、
    各派生光パルスのチャープされた第１及び第２の探査パルスを時間的に重複する形で前記サンプルに印加することと、
    前記サンプルからそこでの各派生パルスのチャープされた第１及び第２の探査パルスの相互作用によって誘起される誘起光を検出することと、
    を備える方法。

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