JP5651466B2 - 非相同及び相同のセルラーゼ発現システム - Google Patents
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Description
この出願は、本願に参照として組み込まれる2007年6月8日出願の米国仮出願番号US 60/933,894に基づく優先権を主張する。
この研究の一部は、米国エネルギー省のPrime Contract No. DE-AC36-99G010337に基づくNational Renewable Energy LaboratoryとのSubcontract No. ZCO-0-30017-01による資金援助を受けた。従って米国政府はこの発明に関し一定の権利を有する。
セルロース等は、ポリマー性物質をモノマー性の糖へ加水分解する細胞外酵素を産出するバクテリア、イースト、及び菌類等の様々な微生物によって分解され、エネルギー源として用いられる。
結晶性セルロースを効率的にグルコースへ変換するためには、セルラーゼ系にCBH, EG及びBGの各成分が含まれていることが必要である。これは、各成分単独では結晶性セルロースの加水分解の効率が劣るためである(Filhoら、Can. J. Microbiol. 42巻、1-5頁、1996年)。
糸状菌中に多成分セルラーゼ系のセルラーゼを発現させることができれば、工業的スケールのセルラーゼの製造に有用である。
この糸状菌は非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドとを発現することができ、この非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドとが組み合わされて機能性混合物が形成される。
いくつかの実施形態では、非相同ポリペプチドは、エクソセロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼで、相同ポリペプチドは、エクソセロビオヒドロラーゼである。非相同エクソセロビオヒドロラーゼと、相同エクソセロビオヒドロラーゼとは、同じエクソセロビオヒドロラーゼの一員であってもよく、そうでなくてもよい。
本願について、以下の定義と実施例により説明する。特に断りのない限り、本願で用いるすべての技術用語と科学用語は、この発明の属する分野の当業者が一般的に使用している意味で用いる。
数値範囲には、その上限値及び下限値が含まれる。以下列挙した用語は、明細書全体を参照して把握されるべきこの発明の実施態様または側面を限定するものではない。従って、以下の用語の定義は、明細書全体を参照してより完全に定義される。
いくつかの実施形態では、本願のポリペプチドは商業的に重要な工業用蛋白であり、別の実施形態では非相同ポリペプチドは治療用蛋白である。この用語には、天然由来の遺伝子、成熟遺伝子、および/または、合成遺伝子でエンコードされた蛋白が含まれる。
一般に、転写及び翻訳調整配列には、プロモータ配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、及びエンハンサーまたは活性化配列が含まれるが、これらに限定されない。
DNA構造体、形質転換DNA、または遺伝子工学的発現カセットを、プラスミド、染色体、染色体外要素、ミトコンドリアDNA、プラスミドDNA、ウィルス、または核酸フラグメントに導入することができる。
一般に、発現ベクター、DNA構造体、形質転換DNAの遺伝子工学的発現カセット部位には、他の配列のほかに、転写される核酸配列と、プロモータが含まれる。好ましい実施形態では、発現ベクターは宿主細胞中に非相同なDNAフラグメントを導入し、発現させる能力を有する。
これらの酵素は、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドラーゼとしても知られている。CBH酵素は、セロビオースを、セルロースの還元末端または非還元末端から加水分解する。一般に、CBHI型の酵素はセロビオースをセルロースの還元末端から選択的に加水分解し、CBHII型の酵素はセロビオースをセルロースの非還元末端から選択的に加水分解する。
本願のように、セロビオヒドロラーゼ活性は、LeverらがAnal. Biochem. 47(273-279頁、1972年)に開示したPHBAH法で測定した、セルロースからの水溶性還元糖の放出量により求められる。
セロビオヒドロラーゼのエキソグルカナーゼ型加水分解とエンドグルカナーゼ型加水分解との区別は、例えばカルボキシメチルセルロースやヒドロキシエチルセルロース(Ghose, 1987年, Pure & Appl. Chem. 59: 257-268頁) 等の、置換されたセルロースからの還元糖の放出量を、同様の方法で測定することにより行なうことができる。真のセロビオヒドロラーゼは、非常に高い非置換セルロース対置換セルロースの酵素活性比を有する (Baileyら, 1993年, Biotechnol. Appl. Biochem. 17: 65-76頁)。
本願の「エンドグルカナーゼ」は、セルロース、セルロース誘導体(例えばカルボキシメチルセルロース) 、リケニン、穀物由来のβ-D-グルカンまたはキシログルカン、及びその他のセルロース系化合物等のβ-1,3グルカンの混合物中のβ-1,4-結合等の、1,4-β-D-グルコシド結合のエンド加水分解の触媒となる、エンド-l,4-(l,3;l,4)-β-D-グルカン 4-グルカノヒドラーゼと定義される。
本願のように、エンドグルカナーゼの酵素活性は、GhoseがPure and Appl. Chem. 59(257-268頁、1987年) に開示した方法に従って、カルボキシメチルセルロース (CMC) の加水分解を測定することにより求めることができる。
本願のように、β-グルコシダーゼの酵素活性は、HPLC等の公知の方法で測定することができる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドまたは酵素は、所定の温度、例えば40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃または80℃に、例えばpH4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5または8において、2、5、7、10、15、20、30、40、50または60分間曝された後、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%より高い生物学的活性を保持しているとき、熱的に安定であると評価する。
いくつかの実施形態では、糸状菌の非限定的例示として以下の属が挙げられる。
アスペルギルス属(Aspergillus)、アクレモニウム属(Acremonium)、オーレオバシジウム属(Aureobasidium)、ビューベリア属(Beauveria)、セファロスポリウム属(Cephalosporium)、セリポリオプシス属(Ceriporiopsis)、ケトミウム属(Chaetomium)、ペシロミセス属(Paecilomyces)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、クラビセプス属(Claviceps)、コチオボラス属(Cochiobolus)、クリプトコカス属(Cryptococcus)、シアツス属(Cyathus)、エンドチア属(Endothia)、エンドチアムコール属(Endothia mucor)、フサリウム属(Fusarium)、ジロクラジウム属(Gilocladium)、フミコーラ属(Humicola)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、マイセリオフトーラ属(Myceliophthora)、マイロセシウム属(Myrothecium)、ムコール属(Mucor)、ニューロスポラ属(Neurospora)、ファネロケーテ属(Phanerochaete)、ポドスポラ属(Podospora)、パエキロミセス属(Paecilomyces)、ペニシリウム属(Penicillium)、ピリクラリア属(Pyricularia)、リゾムコール属(Rhizomucor)、リゾパス属(Rhizopus)、シゾフィラム属(Schizophylum)、スタゴノスポラ属(Stagonospora)、タラロマイセス属(Talaromyces)、トリコデルマ属(Trichoderma)、サーモミセス属(Thermomyces)、サーモアスカス属(Thermoascus)、シーラビア属(Thielavia)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)、トリコフィトン属(Trichophyton)、及びトラメテスプルロタス属(Trametes pleurotus)。
いくつかの実施形態では、以下の糸状菌も含まれる。しかし、これらに限定されない。
アスペルギルス・ニジュランス(A. nidulans)、アスペルギルス・ニジェール(A. niger)、例えばNRRL 31 12, ATCC 22342 (NRRL 31 12), ATCC 44733, ATCC 14331 及びUVK 143f菌株等のアスペルギルス・アワモリ(A. awomari)、例えばATCC 1 1490等のアスペルギルス・オリザエ(A. oryzae)、ニューロスポラ・クラッサ(N. crassa)、例えばNRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767等のトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、及び例えばATCC 32098, 32086等のトリコデルマ・ビリディ(Trichoderma viride)。
いくつかの実施形態では、これらには、トリコデルマ・ロンギブラチアタム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・トリコデルマ(Trichoderma reesei)、トリコデルマ・ビリディ(Trichoderma viride)、ヒポクレア・ジェコリナ(Hypocrea jecorina)が含まれる。
元となる菌株として用いられるものには、トリコデルマ・ロンギブラチアタム/リーゼイ(T. longibrachiatum/reesei)RL-P37 (Sheir-Neiss ら, Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (46-53頁、1984年); Montenecourt B.S., Can., 1-20頁、1987年参照)等のセルラーゼ過剰発現菌株、及びRut-C30菌株が含まれる。
いくつかの実施形態では、改良の対象となっている菌株におけるセルラーゼの発現は厳密に調節され、また様々な外部環境の影響を受けやすい。
いくつかの実施形態では、糸状菌は、第1非相同ポリペプチド及び第2非相同ポリペプチドをそれぞれエンコードする第1ポリヌクレオチド、及び第2ポリヌクレオチドを含み、さらに、相同ポリペプチドをエンコードする第3ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、糸状菌には第3非相同ポリペプチドをエンコードする更なるポリヌクレオチド、すなわち第4ポリヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、糸状菌には4以上の非相同ポリペプチドをエンコードする4以上のポリヌクレオチドと、1以上の相同ポリペプチドをエンコードする1以上のポリヌクレオチドとが含まれる。
いくつかの実施形態では、機能性混合物には少なくとも3種のポリペプチドが含まれ、この混合物に含まれる少なくとも2種または3種のポリペプチドに由来する機能を有する。
また別の実施形態では、機能性混合物には少なくとも3種のポリペプチドが含まれ、この混合物に含まれる少なくとも2種または3種のポリペプチドに由来する酵素活性を有する。
また別の実施形態では、機能性混合物には少なくとも3種のポリペプチドが含まれ、この混合物に含まれる少なくとも2種または3種のポリペプチドに由来するセルラーゼ活性を有する。
また別の実施形態では、機能性混合物には4種のポリペプチドが含まれ、この混合物に含まれる2種、3種、または4種のポリペプチドに由来する機能を有する。
いくつかの実施形態では、機能性混合物は、エキソ−セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、またはβ-グルコシダーゼまたはこれらの組合せに由来する機能を有する。いくつかの実施形態では、機能性混合物には、糸状担体蛋白と組み合わされた細菌性酵素は含まれていない。いくつかの実施形態では、機能性混合物は、抗体、またはFabや一本鎖抗体等の抗体フラグメントを形成しない。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは糸状菌に由来する天然のプロモータの下で発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは非相同プロモータの下で発現される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは構成的プロモータまたは誘導プロモータの下で発現される。
使用可能なプロモータの非限定的例示として、セルラーゼプロモータ、キシラナーゼプロモータ、1818プロモータ(以前は、ESTマッピングトリコデルマから高度に発現された蛋白と認定されていた)が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモータは糸状菌のセルラーゼプロモータである。いくつかの実施形態では、プロモータは、エキソ−セロビオヒドロラーゼプロモータ、エンドグルカナーゼプロモータ、またはβ-グルコシダーゼプロモータのいずれかである。
いくつかの実施形態では、プロモータは、セロビオヒドロラーゼI(cbh 1)プロモータである。プロモータの非限定的例示として、cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, pkil, gpdl, xynl, 及び xyn2プロモータが挙げられる。
さらに、非相同又は相同ポリペプチド、またはその一部をエンコードする2以上のポリヌクレオチドが融合されて、融合ポリヌクレオチドを形成していてもよい。融合ポリヌクレオチドは、上記の適切なプロモータのいずれかに、操作可能に結合していてもよい。
融合ポリヌクレオチドを、適切なプロモータに操作可能に結合させることができる。適切なプロモータの例には、相同ポリペプチドをエンコードする遺伝子のプロモータ等が含まれるが、これに限定されない。
融合ポリヌクレオチドは、融合ポリペプチド、または2種の蛋白から成る融合蛋白、またはこれらの蛋白の一部またはドメインで構成される融合ポリペプチドをエンコードする。
ポリペプチドの一部またはドメインは、少なくとも1の生物学的機能またはその他の機能を有するポリペプチド、または融合ポリペプチドと組み合わされたとき機能を発揮するか、あるいは機能性混合物中の他のポリペプチドと組み合わされたとき機能を発揮するポリペプチドの一部またはドメインである。
いくつかの実施形態では、融合蛋白は第2非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドとから成る。
リンカー鎖は、2種のポリペプチドの結合に適していれば、どのようなリンカー鎖でもよい。一般にリンカー領域は、それぞれ独立して折り畳まれている蛋白ドメイン間で、半剛性で伸長したスペーサーの形態となっている。融合蛋白のポリペプチドの間のリンカー領域により、各ポリペプチドはそれぞれ独立して折り畳み構造をとることができる。
いくつかの実施形態では、リンカー鎖はアスペルギルス属に由来するグルコアミラーゼ、及び、トリコデルマ属に由来するCBHIリンカー鎖に由来する。いくつかの実施形態では、リンカー鎖は融合蛋白を構成するポリペプチドの一部であってもよいが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、融合蛋白を構成するポリペプチドは、第2非相同ポリペプチドと、相同ポリペプチドである。
I
一般に、切断部位はリンカー領域内にあって、切断部位を境として複数の配列を分離させることができる。切断部位は、従来知られている方法、または今後開発される方法により切断することができる配列であれば、どのような配列でもよい。切断部位の非限定的例示として、プロテアーゼで切断される配列、あるいは特定の薬品で切断される配列が挙げられる。このような配列の非限定的例示として、例えばアミノ酸LysArgのコドンを含むKEX2認識部位、Lys及びArgのトリプシンプロテアーゼ認識部位、エンドプロテイナーゼ-Lys-Cの切断認識部位等のケキシン(kexin)切断部位が挙げられる。
本願では、マーカという用語は、宿主細胞が導入された特定のDNAを取り込んだか、または他の反応が生じたことの指標となる遺伝子を意味する。一般に選択マーカは、宿主細胞に抗菌薬耐性または代謝上の効果を賦与する遺伝子であり、外来性DNAを有する宿主細胞と、形質転換操作の間に外来性の配列が導入されなかった宿主細胞との区別を可能にする遺伝子である。
このような選択マーカの非限定的例示として、抗菌耐性(例えばカナマイシン、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール、及びテトラサイクリン)が挙げられる。このほかの選択マーカの非限定的例示として、トリコデルマ・リーゼイpyr4、アセトラクテート・シンターゼ、スプレプトマイセスhyg、アスペルギルス・ニデュランスamdS遺伝子、及びアスペルギルス・ニジェールpyrG遺伝子が挙げられる。
例えば、第1非相同ポリペプチドは、修飾された相同ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1及び第2非相同ポリペプチドが修飾された相同ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、第1及び第2非相同ポリペプチドが修飾された相同ポリペプチドであり、糸状菌には第3非相同ポリペプチドをエンコードする第4ポリヌクレオチドが含まれる。第3非相同ポリペプチドは、修飾された相同ポリペプチドであってもよいし、修飾された相同ポリペプチドではなくてもよい。
いくつかの実施形態では、非相同及び相同ポリペプチドの混合により、機能性混合物は糸状菌の活性に関し改良された機能を示す。いくつかの実施形態では、このような活性の非限定的例示として、分泌型蛋白の活性の向上、糖化活性の向上、及び熱安定性、すなわち高温下または異なるpH値における安定性の向上、および/または、同一温度下での、より長時間にわたる活性保持性が挙げられる。
いくつかの実施形態では、第1または第2非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドは、セルラーゼ、またはセルラーゼの一部である。いくつかの実施形態では、第1及び第2非相同ポリペプチド、及び相同ポリペプチドは、組み合わされてセルラーゼの機能性混合物を形成する。
第1または第2非相同ポリペプチド、相同ポリペプチド、または第3非相同ポリペプチドが存在する場合、これらはエキソ-セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、β-グルコシダーゼ、またはこれらのドメインから成る群から、特に制限無く選択される
いくつかの実施形態では、1以上のポリペプチド、非相同または相同ポリペプチドは、同一のセルラーゼのクラスまたはグループに属する。例えば、2以上のポリペプチドが、エキソ-セロビオヒドロラーゼのクラスに属していてもよい。
いくつかの実施形態では、複数の非相同ポリペプチドの内の1つが、相同ポリペプチドと同一のセルラーゼのクラスに属していてもよい。
いくつかの実施形態では、非相同及び相同ポリペプチドが同一のクラスに属し、異なる起源に由来する配列を有していてもよい。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドはEC 3.2.1.91に分類されるエキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはEC 3.2.1.4に分類されるエンドグルカナーゼである。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドはGHファミリー 5, 6, 7, 9, 48から選択されるエキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはGHファミリー5, 6, 7, 8, 9, 12, 17, 31, 44, 45, 48, 51, 61, 64, 74及び81から選択されるエンドグルカナーゼである。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドはエキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはエンドグルカナーゼであり、相同ポリペプチドはエキソ-セロビオヒドロラーゼである。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドは第1エキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはエンドグルカナーゼであり、相同ポリペプチドは第2エキソ-セロビオヒドロラーゼであり、第1エキソ-セロビオヒドロラーゼ及び第2エキソ-セロビオヒドロラーゼは同じセロビオヒドロラーゼの一員であり、例えば第1及び第2エキソ-セロビオヒドロラーゼの両者ともCBHIに属するか、または両者ともCBHIIに属する。
いくつかの実施形態では、糸状菌の非限定的例示として、アスペルギルス属(Aspergillus)、アクレモニウム属(Acremonium)、オーレオバシジウム属(Aureobasidium)、 ビューベリア属(Beauveria)、セファロスポリウム属(Cephalosporium)、 セリポリオプシス属(Ceriporiopsis)、ケトミウム属ペシロミセス(Chaetomium paecilomyces)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、クラビセプス属(Claviceps)、コチオボラス属(Cochiobolus)、クリプトコカス属(Cryptococcus)、シアツス属(Cyathus)、エンドチア属(Endothia)、エンドチアムコール属(Endothia mucor)、フサリウム属(Fusarium)、ジロクラジウム属(Gilocladium)、フミコーラ属(Humicola)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、マイセリオフトーラ属(Myceliophthora)、マイロセシウム属(Myrothecium)、ムコール属(Mucor)、ニューロスポラ属(Neurospora)、ファネロケーテ属(Phanerochaete)、ポドスポラ属(Podospora)、パエキロミセス属(Paecilomyces)、ペニシリウム属(Penicillium)、ピリクラリア属(Pyricularia)、リゾムコール属(Rhizomucor)、リゾパス属(Rhizopus)、シゾフィラム属(Schizophylum)、スタゴノスポラ属(Stagonospora)、タラロマイセス属(Talaromyces)、トリコデルマ属(Trichoderma)、サーモミセス属(Thermomyces)、サーモアスカス属(Thermoascus)、シーラビア属(Thielavia)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)、トリコフィトン属(Trichophyton)、及びトラメテスプルロタス属(Trametes pleurotus)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、以下の糸状菌も含まれるが、これらに限定されない。
アスペルギルス・ニデュランス(A. nidulans)、アスペルギルス・ニジェール(A. niger)、例えばNRRL 31 12, ATCC 22342 (NRRL 31 12), ATCC 44733, ATCC 14331 及びUVK 143f菌株等のアスペルギルス・アワモリ(A. awomari)、例えばATCC 1 1490等のアスペルギルス・オリザエ(A. oryzae)、ニューロスポラ・クラッサ(N. crassa)、例えばNRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56765, 56466, 56767等のトリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、及び例えばATCC 32098, 32086等のトリコデルマ・ビリディ(Trichoderma viride)。
いくつかの実施形態では、非相同ポリペプチドは、フミコーラ・グリセア(Humicola grisea)、アシドサーマス・セルロリティカス(Acidothermus cellulolyticus)、 サーモビフィダ・フスカ(Thermobifida fusca)、及びペニシリウム・フニクロサム(Penicillium funiculosum)の内のいずれかに由来する。
いくつかの実施形態では、非相同ポリペプチドはフミコーラ・グリセア、アシドテルマス・セルロリティカス、サーモモビフィダ・フスカ等のサーモモビフィダ属、及びペニシリウム・フニクロサムの内のいずれかに由来し、相同ポリペプチドはトリコデルマ・リーゼイに由来する。
いくつかの実施形態では、機能性混合物の非相同及び相同ポリペプチドは、T. reesei EGI, EGII, EGIII (それぞれ、CEL7B, 5 A, 12A)、CEL l2Aの変異体、 フミコーラ・グリセアEGIII、サーモビフィダ・フスカE5及びE3、並びに、アシドサーマス・セルロリティカスEl及びGH74から成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、機能性混合物の非相同ポリペプチドはエキソ−エンドセルラーゼ融合構造であってもよい。
いくつかの実施形態では、融合蛋白は真菌性エキソ−セロビオヒドロラーゼに由来する触媒ドメインと、エンドグルカナーゼに由来する触媒ドメインとから成り、セルロース分解活性を有する。好ましい例は、米国特許出願公開20060057672に開示されているが、これに限定されない。
いくつかの実施形態では、宿主糸状菌はT. reeseiであり、第1非相同ポリペプチド、または第2非相同ポリペプチドはペニシリウム・フニクロサム・セロビオヒドロラーゼCBHI、サーモビフィダ・エンドグルカナーゼE3、サーモビフィダ・エンドグルカナーゼE5、アシドサーマス・セルロリティカスGH74-coreおよびGH48からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第1非相同ポリペプチドはエキソ−セロビオヒドロラーゼであり、第2非相同ポリペプチドはエンドグルカナーゼで、相同ポリペプチドはエキソ−セロビオヒドロラーゼである。ここで、第1非相同ポリペプチド、第2非相同ポリペプチド、及び相同ポリペプチドは、熱安定性セルラーゼの混合物を形成する。
いくつかの実施形態では、宿主糸状菌は、そのゲノムに組み込まれた、第1、第2または第3非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドをエンコードする少なくとも1のポリヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、宿主糸状菌は、そのゲノムに組み込まれた、第1、第2または第3非相同ポリペプチド、または相同ポリペプチドをエンコードする、少なくとも1のポリヌクレオチドを有し、また、形質転換された宿主中の安定なベクターに含まれる、非相同または相同ポリペプチドをエンコードする、少なくとも1のポリヌクレオチドを有する。
これらのポリヌクレオチドは第1、第2非相同ポリペプチド、存在する場合は第3非相同ポリペプチド、及び相同ポリペプチドのいずれかをエンコードする。
いくつかの実施形態では、非相同または相同エキソ−セロビオヒドロラーゼのいずれかを発現する1以上のポリヌクレオチドが、宿主のT. reeseiのゲノムに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非相同エンドグルカナーゼを発現するポリヌクレオチドが、宿主のT. reeseiのゲノムに組み込まれる。
いくつかの実施形態では、非相同エンドグルカナーゼを発現するポリヌクレオチドと、非相同または相同エキソ−セロビオヒドロラーゼのいずれかを発現するポリヌクレオチドが、宿主のT. reeseiのゲノムに組み込まれる。
機能性混合物のポリペプチドをエンコードする3種または4種のポリヌクレオチドの内の、1種または2種しか宿主細胞のゲノムに組み込まれていない場合、残余のポリヌクレオチドは宿主細胞中に形質転換され、ベクターまたはプラスミド中に存在することを理解できよう。
いくつかの実施形態では、糸状菌には、第1非相同ポリペプチド及び第2非相同ポリペプチドをそれぞれエンコードする第1ポリヌクレオチド及び第2ポリヌクレオチドと、相同ポリペプチドをエンコードする第3ポリヌクレオチドが含まれ、これらの3種のポリヌクレオチドは染色体外のものである。
上記のように、このポリペプチド混合物は機能性混合物である。いくつかの実施形態では、このポリペプチド混合物は、複数の酵素、またはこれらの酵素のドメインから成る。いくつかの実施形態では、このポリペプチド混合物は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、またはこれらの酵素のドメインの混合物から成る。
いくつかの実施形態では、複数のセルラーゼの混合物には、第1エキソ−セロビオヒドロラーゼである第1非相同ポリペプチドと、エンドグルカナーゼである第2非相同ポリペプチドと、第2エキソ−セロビオヒドロラーゼである相同ポリペプチドとが含まれる。ここで、第1エキソ−セロビオヒドロラーゼと第2エキソ−セロビオヒドロラーゼは、同じセロビオヒドロラーゼの一員である。
いくつかの実施形態では、第1及び第2エキソ−セロビオヒドロラーゼはCBHIである。いくつかの実施形態では、第1及び第2エキソ−セロビオヒドロラーゼはCBHIIである。
別のセルラーゼの混合物の一例は、フミコーラ・グリセアCBHIである第1非相同ポリペプチドと、アシドサーマス・セルロリティカスのエンドグルカナーゼ1である第2非相同ポリペプチドと、トリコデルマ・リーゼイCBHIである相同ポリペプチドとから成る。
三部構成菌株は、(i)T. reeseセルラーゼ生産菌株、(ii) フミコーラ・グリセア菌株中のフミコーラ・グリセアcbh1遺伝子から成る核酸、並びに、(iii) T. reesei cbh1と、アシドサーマス・セルロリティカスのエンドグルカナーゼ1とが融合したエキソ−エンドセルラーゼ融合体、の三部で構成される。
非相同セルラーゼ融合構造体のヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 1)は2656塩基(図1参照)から成り、T. reesei cbhIのシグナル配列と、T. reesei cbhIの触媒配列と、T. reesei cbhIのリンカー配列と、SKRアミノ酸のコドンを含むケキシン(kexin)切断部位、及びアシドサーマス・セルロリティカスGH5A-E/触媒ドメインをコーディングする配列とが含まれる。
図1の核酸配列から予想されるセルラーゼ融合蛋白のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)を、図2に示す。追加の12 のDNA塩基ACTAGT AAGCGG(SEQ ID NO:1のヌクレオチド1565から1576)は、制限エンドヌクレアーゼSpeIと、アミノ酸のThr, Ser, Lys,及びArgをコーディングする。
プラスミドDNAを取り扱う標準的方法、及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用してDNAを増幅する標準的方法はSambrookら(2001年)が開示している。
順方向プライマー1=EL-316 (Spelサイトを含む)
1μリットルのdNTP Master Mix (最終濃度0.2 mM);1μリットルのprimer 1 (最終濃度0.5μM);1μリットルのprimer 2 (最終濃度0.5μM);2μリットルのDNAテンプレート(最終濃度50-200ng);1μリットルの50 mM MgSO4 (最終濃度1 mM);5μリットルの10x Pfx Amplification Buffer;5μリットルの10xPCRx Enhancer溶液;1μリットルのPlatinum Pfx DNA Polymerase (トータル2.5U);33μリットルの水;全反応容量50μリットル。
適正なサイズの挿入を確認するため、この幾つかのコロニーから得たプラスミドDNAを、制限酵素消化した。DNA塩基配列決定法により、適正な配列であることを確認した。次の配列の検証では、SpeI及びAscIで制限酵素消化することにより、TOPOベクターからEl触媒ドメインを切除した。このフラグメントを、図3に示すように、SpeI及びAscIで制限酵素消化されたpTrex4ベクターに結紮した。
紮混されたCBHl-E/融合蛋白ベクターであることを、制限酵素消化により確認した。
当業者であれば、これらの配列を様々な方法で結合させることができる。ひとつの方法は以下の通りである。
100 μl (20 mg/ml)のNovozymeを添加し、ゆっくり撹拌し、次に、90%を超えるプロトプラストが形成されるまで、37℃で最大2時間、プロトプラスト化を行なった。
細胞を1500 rpm (4600 xG)で10分間、遠心分離した。200 μlのTES/SDS (Tris緩衝液 10 mM、EDTA 50 mM、NaCl 150mM、SDS 1%)を添加、混合し、室温で5分間インキュベートした。
Qiagen 分離精製キット(Qiagen社)によりDNAを単離した。100 μlのmilli-Qウォータでカラムから溶出させたDNAを回収した。
このベクターにより、化学的適合性があり、カナマイシン選択性を有するTop10 E. coli 細胞 (Invitrogen社)を形質転換した。
幾つかのクローンのプラスミドDNAを制限酵素消化して、正しいサイズが挿入されたことを確認し、次に、塩基配列決定法により、適正な配列であることを確認した。1つのクローンのプラスミドDNAを、LRクロナーゼ反応 (Invitrogen社、Gatewayシステム)へ、pTrex3g/αmdS目的ベクターDNAとともに添加した。
pTrex3gベクターは、例えば米国特許出願公開No. 20070015266に開示されている。
このベクターは、64の六量体制限酵素認識配列を含む多数の拡張されたクローン化サイトを有するpUCl 18ファージミドベースのベクター(Brosius, J. (1989年) DNA 8: 759)であるE coliベクターpSLl 180 (Pharmacia Inc.社、Piscataway, NJ, USA)をベースとする。
このベクターは、Gateway目的ベクター(Hartley, J. L.ら、(2000年) Genome Research 10: 1788-1795)となるように遺伝子組み換えされたものであり、Gatewayテクノロジー(Invitrogen社)を用いて、T. reesei cbh1遺伝子のプロモータ領域とターミネータ領域の間に、所望のオープン・リーディング・フレームを挿入することができる。
アスペルギルス・ニジュランスamdS遺伝子を、形質転換において選択マーカとして用いるために挿入した。プロモータとターミネータは、本願が対象とする遺伝子が発現されるように配置した。
pSLl 180ポリ・リンカー領域には、次のDNAのセグメントを挿入した。(i) T. reesei cbh1遺伝子のプロモータ領域に由来する、DNAの2.2 bpセグメント;(ii) Invitrogen社から入手した、クロラムフェニコール耐性遺伝子(CmR)とccdB遺伝子に隣接するいずれかの端部にある、attRl及びattR2組換え部位を含む1.7 kbのGateway リーディング・フレームAカセット;(iii) T. reesei cbh1遺伝子のターミネータ領域に由来する、DNAの336 bpセグメント;及び、(iv)天然のプロモータ及びターミネータ領域を有するアスペルギルス・ニジュランスamdS遺伝子を含む、2.7 kbのDNAフラグメント。
図4に、T. reesei発現ベクターpTrex3gのプラスミドマップを示す。
H. grisea cbh1により、pTrex3g目的ベクターのCmR及びccdB遺伝子を、pENTR/Dベクター由来のH. grisea cbh1で組み換えた。組み換えにより、目的ベクターのT. reesei cbhIプロモータと T. reesei cbh1ターミネータの間に、H.grisea cbh1が一方向に挿入された。
組み換えにより、H.grisea cbh1の上流側と下流側の両方に、25 bpのAttB配列がそれぞれ隣接する配列が得られた。LR クロナーゼ反応生成物の一部により、Top10 E. coli細胞(Invitrogen社)を形質転換し、カルベニシリン選択性条件下で一晩培養した。
幾つかのクローンのプラスミドDNAを適切に制限酵素消化して、正しいサイズが挿入されたことを確認し、次に、塩基配列決定法により、適正な配列であることを確認した。
形質転換用のDNAを得るために、適正なクローン由来のプラスミドDNAをエンドヌクレアーゼXba1で消化して、T. reesei cbhIプロモータ、H. grisea cbh1、T. reesei cbhIターミネータ、A. nidulans amdSを含む発現フラグメントを分離させた。
この6.2 kbのフラグメントを公知のアガロースゲル抽出法を用いてE. coli DNAから単離し、市場で入手可能なQM6a菌株に由来するT. reesei菌株を形質転換した。QM6a菌株については後述する。
2つのXba Iサイトを有する発現ベクターを図5Aに模式的に示し、この発現ベクターのヌクレオチド配列(SEQ ID NO: 7)を図5Bに示す。
MMアセトアミド培地の組成は次の通りである。0.6 g/Lのアセトアミド;1.68 g/LのCsCl;20 g/Lのグルコース; 20 g/LのKH2PO4;0.6 g/L のCaCl2・2H2O;1 ml/Lの1000X微量元素溶液(trace elements solution);20 g/Lのノーブル・アガー(Noble agar);pH 5.5.の1000X微量元素溶液(5.0 g/1のFeSO4・7H2O、1.6 g/1 のMnSO4-H2O、1.4 g/1のZnSO4・7H2O及び1.0 g/1の CoCl2・6H2Oを含む)。
無菌フード中で、MMアセトアミド培地上の胞子の懸濁液を自然乾燥させた。
60 mgのM10タングステン粒子を微小遠心管に入れた。1mLのエタノールを添加し、この混合物液を少し振り混ぜ、15分間放置した。タングステン粒子を、15,000 rpmで15分間遠心分離した。エタノールを除去し、タングステン粒子を滅菌したdH2Oで3回洗浄し、次に滅菌した50% (v/v)グリセロール1 mLを添加した。
約10秒振り混ぜてタングステン粒子を懸濁させた後、タングステン/グリセロール粒子懸濁液25 μlを採取し、微小遠心管に入れた。
スペルミジンを添加して5分間のインキュベーションを行なった後、粒子を3秒間遠心分離した。上澄みを除去し、得られた粒子を200 μlの70% (v/v)エタノールで洗浄し、次いで3秒間遠心分離した。上澄みを除去し、得られた粒子を200 μlの100% エタノールで洗浄し、次いで3秒間遠心分離した。上澄みを除去し、24 μlの100%エタノールを添加し、ピペッティング操作により混合した。遠心管を超音波洗浄浴に約15分間置き、粒子をエタノール中にさらに再懸濁させた。超音波洗浄浴に置かれた遠心管の中の粒子懸濁液から8 μlを採取し、デシケータ内に置かれたマクロキャリア・ディスク(macrocarrier disk)の中央に滴下した。
5日後、形質転換された大きなコロニーを、第2の新鮮なMMアセトアミドプレートに植えつけ、さらに28℃で3日間インキュベートした。第2のプレート上に成長した複数の密集し不透明なコロニーを、それぞれMMアセトアミドプレートに移し替えた。これらをさらに3日間培養し、ポテトデキストロース寒天培地(PDA) に移し替え、さらに28℃で7-10日間インキュベートして胞子形成を行なった。
先ず、以下を含む接種振蕩フラスコ中で形質転換体を培養した:22.5 g/LのProflo、30 g/Lのa-Lactose・H2O、6.5 g/Lの (NH4)2SO4、2 g/LのKH2PO4、0.3 g/LのMgSO4・7H2O、0.26 g/LのCaCL2・2H2O、0.72 g/LのCaCO3、2 mlの10% Tween 80、1 mlの1000x TRI Trace Salts (1000x TRI Trace Saltsは、5 g/LのFeSO4・7H2O、1.6 g/LのMnSO4・H2O、1.4 g/LのZnSO4・7H2Oから成る)。
培養条件は、次の通りであった:4つのバッフルを備える250 mlの振蕩フラスコ (Bellco Biotechnology社、340 Edrudo Road, Vineland, NJ 08360、米国)中の50 ml培地、インキュベート28℃、振蕩速度225 RPM、軌道半径2.5 cm)
形質転換体の接種振蕩フラスコ内への植菌は、形質転換された菌糸体及び胞子を含む4 cm2のPDA片を移し変えることにより行なった。
発現振蕩フラスコの培養条件は、次の通りであった:4つのバッフルを備える250 mlの振蕩フラスコ、インキュベート28℃、振蕩速度225 RPM。
5日後にサンプルを採取し、上澄みをクーマシー染色したSDS-PAGEプロテインゲルで分析した。
以下の四部を備える菌株を構築した:(i) cbhI欠損生産株から成る宿主株;(ii) cbhI-El融合遺伝子を発現する核酸配列;(iii) 遺伝子組み換えされた熱安定性T.reesei cbhI遺伝子を発現する核酸配列;及び(iv) 遺伝子組み換えされた熱安定性T.reesei cbhII遺伝子を発現する核酸配列。
図6に示すように、3つの発現フラグメントのDNAは、cbh1欠損生産株を共形質転換している。
3つの各発現フラグメントを増幅するため、PCRプライマー対を消化した。PCRに基づく32の形質転換体が、3つの発現フラグメント全ての存在を示し、これらを振蕩フラスコ発酵に供した。振蕩フラスコによる培養は3日間行い、上澄みのサンプルを採取し、トリス-グリシンSDS泳動緩衝液中で 8%のトリス-グリシンNuPAGE (invitrogen社)ゲル、1 mmで分析した。
サンプルは、100℃で7分間インキュベートし、次に氷の上で5分間インキュベートした後、特に断りの無い限り、20μl/レーンで仕込んだ(8μlの上澄み+2μlの還元剤+10 μlの2X トリス-グリシンSDSサンプル緩衝液) 。
32のサンプルの内のいくつかに、高レベルの発現遺伝子が存在することが蛋白質バンドで示された。
S8P+T41I+N49S+A68T+N89D+S92T+S113N+S196T+P227L+
D249K+T255P+S278P+E295K+T296P+T332Y+V403D+S411F
図7Aに示すように、開始コドンから終止コドンまでのDNA配列は1545塩基(SEQ ID NO: 8)であった。
図7Bに、遺伝子組み換えされたCBHI蛋白の配列(SEQ ID NO: 9)を示す(CBHIシグナル配列に下線を付してある)。
図8Aに、cbh1発現ベクターpTrex3g-cbh1を図示した。
図8Bに示すように、発現ベクターpTrex3g-cbh1のDNA配列は10145塩基(SEQ ID NO: 10)であった。
このベクターの発現部位を、特異的制限エンドヌクレアーゼNotl 及びSrflを用いてプラスミドを消化させることによりシャトルベクターから切り取り、長さが約10.68 kbのフラグメントを生成させ、このフラグメントをT. reeseiの形質転換に用いた。
図9Aに示すように、開始コドンから終止コドンまでのDNA配列は1416塩基(SEQ ID NO: 11)であった。
図9Bに、そのアミノ酸配列(SEQ ID NO: 12)を示す。(シグナル配列に下線を付した)
図10Aに、cbhII発現ベクターを図示した。
図10Bに示すように、全cbhII発現ベクターpExp-cbhIIのDNA配列は14158塩基(SEQ ID NO: 11)であった。
前記実施例に記載したcbhI-El融合フラグメントを、cbhIプロモータ、cbhI-El融合遺伝子、及び、cbhIターミネータ(amdSマーカ無し)から成る直鎖フラグメントを生成させるためのPCRテンプレートとして用いた。
これらの3つのフラグメントで、遺伝子銃による共形質転換用のタングステン粒子をコートした。前記実施例に記載した手順で共形質転換を行なった。
この共形質転換において、タングステン粒子に各フラグメント1, 2, 3を1.5 μlずつ添加した(DNA濃度 100-300 ng/μl)。
形質転換体の選択は、前記のようにしてMMアセトアミド培地で行なった。
以下の評価方法と基質を用いて、CBHI-EI融合蛋白のセルロース分解活性を評価した。トリコデルマ・リーゼイ菌株Tr-A及びTr-Dは、RL-P37の変異誘発に由来する。
トウモロコシ茎葉を、Schell, D.らのJ. Appl. Biochem. Biotechnol. 105:69 - 86頁 (2003年)に記載されているように、2% w/w H2SO4で前処理し、次に脱イオン水でpHが4.5になるまで数回洗浄した。酢酸ナトリウムを最終濃度が50mMになるまで添加し、滴定した結果pH 5.0であった。
蛋白の濃度は、ウシ血清アルブミンを標準に用いたビシンコニン酸法により測定した。(Smith, P. K.ら、(1985年) Anal. Biochem. 150:76-85頁)
反応混合物中のセルロースの濃度は約7%であった。酵素または酵素混合物は、セルロース1グラムに対し、総蛋白の量が1から60 mgの範囲となるように添加した。
Claims (7)
- 第1異種ポリペプチドをエンコードする第1ポリヌクレオチドと、第2異種ポリペプチドをエンコードする第2ポリヌクレオチドと、第3異種ポリペプチドをエンコードする第3ポリヌクレオチドとを含む糸状菌であって、
前記第1異種ポリペプチドがSEQ ID NO: 9で定義される修飾されたトリコデルマ・リーゼイCBHIであり、
前記第2異種ポリペプチドがSEQ ID NO: 12で定義されるトリコデルマ・リーゼイCBHIIであり、
前記第3異種ポリペプチドがトリコデルマ・リーゼイCBHIとアシドサーマス・セルロリティカスエンドグルカナーゼIとが融合したCBHIエンドグルカナーゼE1融合ポリペプチドであり、前記糸状菌がCBHIが欠失したトリコデルマ・リーゼイである糸状菌。 - 前記第3ポリヌクレオチドが、染色体外のポリヌクレオチドである、請求項1に記載の糸状菌。
- 前記第1、第2、及び第3ポリヌクレオチドが、染色体外のポリヌクレオチドである、請求項1に記載の糸状菌。
- 請求項1〜3に記載の糸状菌の集団を含む培地。
- 請求項1〜3に記載の糸状菌から得られる前記第1異種ポリペプチド、前記第2異種ポリペプチド、及び前記第3異種ポリペプチドから成るポリペプチド混合物。
- 前記ポリペプチド混合物がセルラーゼの混合物である、請求項5に記載のポリペプチド混合物。
- 請求項1に記載の糸状菌からポリペプチド混合物を得る工程を含む、セルラーゼの混合物を製造する方法であって、前記ポリペプチド混合物が、前記第1異種ポリペプチド、前記第2異種ポリペプチド、及び前記第3異種ポリペプチドから成る、セルラーゼの混合物を製造する方法。
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