CN104726350A - 异源和同源纤维素酶表达体系 - Google Patents

异源和同源纤维素酶表达体系 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种异源和同源纤维素酶表达体系。本发明提供了表达异源和同源多肽的组合的丝状真菌，包含异源和同源多肽的组合的多肽混合物，和产生多肽混合物的方法。

Description

异源和同源纤维素酶表达体系
本申请是发明人于2008年6月5日提交的题为“异源和同源纤维素酶表达体系”的中国专利申请200880101989.8号的分案申请。
与相关申请的交叉参考
本发明要求2007年6月8日提交的美国临时申请系列号No.US60/933,894的权益和优先权，所述临时申请完整引入本文作为参考。
关于联邦政府赞助研究的声明
通过与美国能源部(United States Department of Energy)的主合同No.DE-AC36-99G010337下与国家可再生能源实验室(National RenewableEnergy Laboratory)的分合同No.ZC0-0-30017-01，为本工作的部分提供资金。因此，美国政府可对本发明具有某些权利。
引言
纤维素和半纤维素是光合作用产生的最大量的植物材料。它们可以被大量微生物降解并用作能量来源，所述微生物包括细菌、酵母和真菌，它们产生能够将多聚体底物水解为单体糖的胞外酶。
纤维素酶是水解纤维素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。纤维素酶传统上被分为三个主要的类别：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)，外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶([β]-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶；EC3.2.1.21)(“BG”)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的无定形部分，而纤维二糖水解酶也能够降解结晶纤维素。为了有效地将微晶纤维素转化为葡萄糖，需要包含来自CBH、EG和BG分类中每一类的组分的完整纤维素酶体系，分离的组件在水解结晶纤维素中效率较低(Filho等,Can.J.Microbiol.42:1-5,1996)。为了工业规模的纤维素酶生产，在丝状真菌中表达这些多组件纤维素酶体系纤维素酶会是有利的。
概述
因此，本发明提供了表达异源和同源多肽的组合的丝状真菌，包含异源和同源多肽的组合的多肽混合物，和产生多肽混合物的方法。
在一些实施方案中，本发明提供了丝状真菌，其包含一种或多种编码两种或更多异源多肽的多核苷酸，和编码同源多肽的多核苷酸。该丝状真菌能够表达异源和同源多肽，所述异源和同源多肽一起形成功能性混合物。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的丝状真菌群体的培养基。
在一些实施方案中，本发明提供了多肽混合物，其包含两种或更多的异源多肽和同源多肽。该多肽混合物可得自本发明的丝状真菌。
在一些实施方案中，本发明提供了生产纤维素酶混合物的方法。该方法包括从本发明的丝状真菌中获得包含两种或更多异源多肽和同源多肽的的多肽混合物。在一些实施方案中，异源多肽是外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶，同源多肽是外切纤维二糖水解酶。异源外切纤维二糖水解酶和同源外切纤维二糖水解酶可以，但不必须是相同的外切纤维二糖水解酶成员。
本发明的这些特性和其他特性在下文中公开。
附图概述
熟练的技术人员会理解，附图仅用于阐述的目的。附图不旨在以任何方式限制本发明的范围。
图1提供了包含2656个碱基的异源纤维素酶融合构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。
图2提供了以图1的核酸序列为基础预测的纤维素酶融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图3A-F展示了含有E1催化结构域的pTrex4载体的核苷酸序列(SEQID NO:14)。
图4展示了里氏木霉(T.reesei)表达载体pTrex3g的质粒图谱。
图5A展示了用于制造示范性三部分菌株(tripartite strain)的表达载体pTrex3g-Hgrisea-cbh1。
图5B-E提供了图5A的表达载体的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)。
图6展示了被转化进cbh1缺失菌株中用于创建4-部分菌株的三条DNA片段。
图7A提供了表达经改造的CBHI蛋白质的多核苷酸从起始密码子到终止密码子的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)。
图7B提供了经改造的CBHI蛋白质的序列(SEQ ID NO:9)。CBHI信号序列加有下划线。
图8A展示了cbhI表达载体pTrex3g-cbh1。
图8B-F提供了表达载体pTrex3g-cbh1的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)。
图9A提供了表达经改造的CBHI蛋白质的多核苷酸从起始密码子到终止密码子的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)。
图9B提供了经改造的CBHI蛋白质(SEQ ID NO:12)的氨基酸序列。信号序列加有下划线。
图10A展示了cbhII表达载体pExp-cbhII。
图10B-G提供了表达载体pExp-cbhII的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。
多个实施方案的详述
接着将仅通过参照的方式，使用以下的定义和实施例详细描述本发明。除非在本文中另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。数值范围包括定义该范围的数值。本文提供的标题不是多个方面或实施方案的限制，所述限制可以由作为整体的本申请文件具有。因此，下文紧接着定义的术语由作为整体的本申请文件更详尽地定义。
在本文中使用时，术语“多肽”表示由通过肽键相连的氨基酸残基单链组成的化合物。在本文中使用时，术语“蛋白质”可与术语“多肽”互换使用。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，并且包括单链或双链的DNA、RNA、cDNA及其化学修饰。因为遗传密码子是简并的，所以可以使用多于一种密码子编码具体的氨基酸，并且本发明包括编码具体氨基酸序列的所有多核苷酸。
关于细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组体”表示已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然的核酸或蛋白质修饰了该细胞、核酸、蛋白质或载体，或者所述细胞来自被如此修饰的细胞，或者蛋白质在非天然的或经遗传修饰的环境中表达，例如在用于原核或真核体系的表达载体中表达。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中不存在的核酸或多肽，或者表达以其他方式异常表达、表达不足、超量表达或完全不表达的天然基因。
关于多核苷酸或多肽的术语“异源的”表示具有下述序列的多核苷酸或多肽，所述序列不天然存在于宿主细胞中。在一些实施方案中，多肽是商业上重要的工业蛋白质，在一些实施方案中，异源多肽是治疗性蛋白质。该术语旨在包括由天然基因、突变的基因和/或合成的基因编码的蛋白质。
关于多核苷酸或多肽的术语“同源的”表示具有下述序列的多核苷酸或多肽，所述序列在宿主细胞中天然序列相同。
在本文中使用时，“融合核酸”包括有效连接在一起的两条或更多条核酸。核酸可以是DNA，基因组DNA和cDNA均可，或为RNA，或为RNA和DNA的杂合体。编码多肽序列全部或部分的核酸可以用于构建融合核酸序列。在一些实施方案中，使用编码全长多肽的核酸。在一些实施方案中，可以使用编码部分多肽的核酸。
术语“融合多肽”是指包含至少两个分开且不同区域的蛋白质，所述区域可来自于或不来自于相同的蛋白质。例如，与目的蛋白质连接的信号肽可以被称作融合多肽或融合蛋白质，其中所述信号肽通常不与所述目的蛋白质结合。
术语“回收的”、“分离的”和“分开的”在本文中可互换使用，表示从与之天然结合的至少一种组分中取出的蛋白质、细胞、核酸、氨基酸等。
在本文中使用时，术语“基因”表示涉及生产多肽链的多核苷酸(例如DNA区段)，其可包含或不包含编码区之前和之后的区域，例如5’非翻译区(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“非转录尾区”序列，以及个体编码区段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
在本文中使用时，术语“启动子”表示功能是指导下游基因转录的核酸序列。启动子通常应适合于在其中表达靶基因的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调节核酸序列(也称作“控制序列”)一起是表达给定基因所必需的。通常，转录和翻译调节序列包括但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，和增强子或激活子序列。
在本文中使用时，术语“有效连接的”表示转录核酸以使得转录引发的方式相对于编码序列放置。通常，这应表示启动子和转录引发或起始序列位于编码区的5’。转录核酸通常会适合于用于表达蛋白质的宿主细胞。本领域中已知用于多种宿主细胞的大量适合的表达载体类型和合适的调节序列。
在本文中使用时，术语“表达”表示以基因的核酸序列为基础生产多肽的过程。该过程包括转录和翻译二者。
在本文中使用时，术语“载体”表示被设计为向一个或多个细胞类型中引入核酸的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等等。
在本文中使用时，术语“表达载体”表示能够将异源DNA片段掺入外来细胞中并在其中表达的载体。可商业获得许多原核和真核表达载体。
在本文中使用时，术语“DNA构建体”、“转化DNA”和“表达载体”可互换使用，表示用于将序列引入宿主细胞或生物中的DNA。可以通过PCR或者本领域技术人员已知的任何其他合适的技术，例如使用Sambrook等中所述的标准分子生物学方法，体外产生DNA。另外，表达构建体的DNA可以是人工合成的，例如是化学合成的。DNA构建体、转化DNA或重组表达盒可以被掺入质粒、染色体、染色体外元件、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达盒部分在其他序列中包含要被转录的核酸序列和启动子。在优选的实施方案中，表达载体能够将异源DNA片段整合进宿主细胞中并在其中表达。
在将核酸序列插入细胞中的语境中，术语“引入的”表示“转染”或“转化”或“转导”，并且包括涉及将核酸序列引入真核或原核细胞中，在所述细胞中核酸序列可以被掺入细胞的基因组中(例如染色体、染色体外元件、质粒、质体或线粒体DNA)，转化进自主复制子中，或者被瞬时表达(例如转染的mRNA)。
术语“宿主细胞”表示下述细胞，其含有载体，并且支持表达构建体的复制和/或转录或转录和翻译(表达)。
在本文中使用时，术语“培养”表示在液体、半固体或固体培养基中，在合适的条件下培养细胞群体。
在本文中使用时，“取代的”和“修饰的”可互换使用，并且表示下述序列，例如氨基酸序列或核酸序列，所述序列包含天然序列的缺失、插入、置换或中断。通常，在本发明的上下文中，取代的序列可表示例如天然残基的置换。
在本文中使用时，“经修饰的酶”表示下述酶，所述酶包含天然序列的缺失、插入、置换或中断。
术语“变体”表示与参照蛋白质(例如天然蛋白质或野生型蛋白质)相比，含有一个或多个不同氨基酸的蛋白质区域。
术语“纤维素酶”表示能够将纤维素(β-1,4-葡聚糖或βD-糖苷键)多聚体水解为更短的纤维寡糖寡聚体、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。
术语“外切纤维二糖水解酶”(CBH)表示归类为EC 3.2.1.91的一类纤维素酶和/或某些GH家族中的纤维素酶，包括但不限于GH家族5、6、7、9或48中的纤维素酶。这些酶也称作外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶。CBH酶水解来自纤维素的还原性末端或非还原性末端的纤维二糖。通常，CBHI型酶优先水解来自纤维素的还原末端的纤维二糖，CBHII型酶优先水解纤维素的非还原性末端。
术语“纤维二糖水解酶活性”在本文中定义为1,4-D-葡聚糖纤维二糖水解酶活性，其催化纤维素、纤维四糖或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的多聚体中1,4-β-D-糖苷键的水解，从链末端释放纤维二糖。在本文中使用时，纤维二糖水解酶活性由来自纤维素的水溶性还原糖的释放确定，所述释放通过Lever等,1972,Anal.Biochem.47:273-279的PHBAH方法测量。纤维二糖水解酶的外切葡聚糖酶攻击模式和内切葡聚糖酶攻击模式之间的区别通过对来自取代的纤维素的还原糖释放的类似测量进行，所述取代的纤维素例如羧甲基纤维素或羟乙基纤维素(Ghose,1987,Pure&Appl.Chem.59:257-268)。真实的纤维素二糖水解酶的未取代的纤维素/取代的纤维素的活性比例会非常高(Bailey等,1993,Biotechnol.Appl.Biochem.17:65-76)。
术语“内切葡聚糖酶”(EG)表示归类为EC 3.2.1.4的一类纤维素酶，和/或某些GH家族中的纤维素酶，包括但不限于CH家族5、6、7、8、9、12、17、31、44、45、48、51、61、64、74或81中的纤维素酶。EG酶水解纤维素的内部β-1,4糖苷键。术语“内切葡聚糖酶”在本文中定义为内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，其催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素)、地衣淀粉中1,4-β-D-糖苷键的内切水解，和混合的β-1,3葡聚糖例如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖和含有纤维素组分的其他植物材料中β-1,4键的内切水解。在本文中使用时，根据Ghose,1987,Pureand Appl.Chem.59:257-268的步骤使用羧甲基纤维素(CMC)水解测定内切葡聚糖酶活性。
术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为归类为EC 3.2.1.21的β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶，和/或某些GH家族中的β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶，包括但不限于GH家族1、3、9或48中的β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶，其催化纤维二糖的水解，释放β-D-葡萄糖。在本文中使用时，可以通过本领域已知的方法例如HPLC测量β-葡糖苷酶活性。
“纤维素分解活性”包括外切葡聚糖酶活性、内切葡聚糖酶活性或这两种类型的酶活性，以及β-葡糖苷酶活性。
术语“热稳定的”和“耐热的”表示暴露于提高的温度(即高于室温)后保留特定量的生物活性(例如酶活性)的本发明的多肽或酶。在一些实施方案中，如果多肽或者酶在例如4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8的pH下，在特定温度例如40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃下暴露2、5、7、10、15、20、30、40、50或60分钟后，保留其生物活性的大于50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％，则多肽或酶被认为是耐热的。
术语“丝状真菌”表示本领域技术人员认可的任何和所有丝状真菌。通常，丝状真菌是真核微生物，并且包括真菌亚门(subdivision Eumycotina)的所有丝状形式。这些真菌的特征是具有细胞壁的营养菌丝体，所述细胞壁由甲壳质、β-葡聚糖和其他复合多糖组成。在一些实施方案中，本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上与酵母不同。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于以下属：曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、头孢霉属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomiumpaecilomyces、Chrysosporium、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、镰孢属(Fusarium)、Gilocladium、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、毛霉属(Mucor)、Phanerochaete、柄孢壳属(Podospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Pyricularia、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophylum)、壳多孢属(Stagonospora)、踝节菌属(Talaromyces)、木霉属(Trichoderma)、Thermomyces、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium、发癣菌属(Trichophyton)和Trametes pleurotus。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于以下：构巢曲霉(A.nidulans)，黑曲霉(A.niger)，泡盛曲霉(A.awomari)，例如NRRL 3112、ATCC 22342(NRRL3112)、ATCC 44733、ATCC 14331和菌株UVK 143f，米曲霉(A.oryzae)，例如ATCC 11490，粗糙脉孢霉(N.crassa)，里氏木霉(Trichoderma reesei)，例如NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56765、56466、56767和绿色木霉(Trichoderma viride)，例如ATCC 32098和32086。
本文使用的术语“木霉属(Trichoderma)”或“木霉属物种”表示先前被归类为木霉属物种或菌株，或者目前被归类为木霉属物种或菌株，或被归类为肉座菌属(Hypocrea)物种或菌株的任何真菌生物。在一些实施方案中，物种包括Trichoderma longibrachiatum、里氏木霉、绿色木霉或红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)。还设想用作来源菌株的是过量生产纤维素酶的菌株，例如T.longibrachiatum/里氏木霉L-P37(Sheir-Neiss等,Appl.Microbiol.Biotechnology,20(1984)，第46-53页；Montenecourt B.S.,Can.,1-20,1987)，和Rut-C30菌株。在一些实施方案中，目标在于改进的物种中的纤维素酶生产被严密调节，并且对多种环境条件敏感。
本发明提供了丝状真菌，其包含编码两种或更多异源多肽的两种或更多多核苷酸，和编码同源多肽的多核苷酸。丝状真菌能够表达异源和同源多肽，所述异源和同源多肽形成功能混合物。在一些实施方案中，丝状真菌含有分别编码第一异源多肽和第二异源多肽的第一多核苷酸和第二多核苷酸，和编码同源多肽的第三多核苷酸。在一些实施方案中。丝状真菌含有编码第三异源多肽的额外的多核苷酸──第四多核苷酸。在一些实施方案中，丝状真菌含有编码四种或更多异源多肽的四种或更多多核苷酸，和编码一种或多种同源多肽的一种或多种多核苷酸。
根据本发明，功能性混合物包括任何多肽混合物，条件是这类混合物具有至少一种功能，所述功能为生物学功能或其他功能，并且来自于混合物中的至少两种或三种多肽。也就是说，混合物中的至少两种或三种多肽在可检测的水平上为多肽混合物的功能做出贡献。在一些实施方案中，功能性混合物包含至少三种多肽，并且具有来自混合物中至少两种或三种多肽的功能。在一些其他的实施方案中，功能性混合物包含至少三种多肽，并且具有来自混合物中至少两种或三种多肽的酶功能。在一些实施方案中，功能性混合物包含至少三种多肽，并且具有来自混合物中至少两种或三种多肽的纤维素酶功能。在一些实施方案中，功能性混合物包含四种多肽，并且具有来自混合物中两种、三种或四种多肽的功能。
在一些实施方案中，功能性混合物包含与丝状真菌相关或者由丝状真菌提供的功能，所述功能对应于任何下述活性或者是所述活性的改进，例如可分泌的蛋白质活性，包括但不限于纤维素酶活性、糖化作用活性或热稳定性。在一些实施方案中，功能性混合物包含来自于外切纤维二糖水解酶。内切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶活性或其任何组合的功能。在一些实施方案中，功能性混合物不包含任何细菌酶与其运载体丝状蛋白质的组合。在一些实施方案中，功能性混合物不形成任何抗体或功能性抗体片段，例如Fab、单链抗体等。
在一些实施方案中，编码异源或同源多肽的多核苷酸与一个或多个启动子有效连接。启动子可以是本领域目前已知或之后发现的任何合适的启动子。在一些实施方案中，多核苷酸在丝状真菌固有的启动子调控下表达。在一些实施方案中，多核苷酸处于异源启动子的调控下。在一些实施方案中，多核苷酸在组成型或诱导型启动子的调控下表达。可以使用的启动子的例子包括但不限于纤维素酶启动子、木聚糖酶启动子、1818启动子(先前通过木霉属的EST作图鉴定为高度表达的蛋白质)。在一些实施方案中，启动子是丝状真菌的纤维素酶启动子。在一些实施方案中，启动子是外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶启动子。在一些实施方案中，启动子是纤维二糖水解酶I(cbh 1)启动子。启动子的非限制性例子包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、pki1、gpd1、xyn1和xyn2启动子。另外，编码异源或同源多肽的两种或更多多核苷酸或其部分可以被融合在一起，形成融合多核苷酸。融合多核苷酸可与上文讨论的任何合适的启动子有效连接。
在一些实施方案中，编码第一异源多肽的第一多核苷酸与第一启动子有效连接。第一启动子可以，但不必须与下述启动子不同，所述启动子与第二或第三多核苷酸有效连接。在一些实施方案中，第一多核苷酸与编码同源多肽的基因的启动子有效连接。
在一些实施方案中，编码第二异源多肽的多核苷酸，例如第二多核苷酸与另一多核苷酸融合，例如与编码同源多肽的第三多核苷酸融合，以形成融合多核苷酸。融合多核苷酸可与任何合适的启动子有效连接，包括但不限于编码同源多肽的基因的启动子。融合多肽编码包含两种多肽或其结构域或部分的融合多肽或融合蛋白质。多肽的部分或结构域可以是多肽的任何部分或结构域，其具有至少一种功能(生物学功能或其他功能)，或者在与融合多肽组合时或与功能性混合物的其他多肽组合时变得有功能。在一些实施方案中，融合蛋白质包含第二异源多肽和同源多肽。
在一些实施方案中，融合多核苷酸编码融合蛋白质，其包含通过接头或接头区域隔开的两种多肽，例如第二异源多肽和同源多肽。接头可以是用于连接两种多肽的任何合适的接头。接头区域通常在独立折叠的肽结构域之间形成展开的、半坚硬的间隔区。融合蛋白质的多肽之间的接头区域可有益于允许多肽独立地折叠。在一些实施方案中，接头是来自于曲霉物种的葡糖淀粉酶的接头和来自于木霉属物种的CBHI接头。在一些实施方案中，接头可以，但不必须是包含融合蛋白质的多肽的一部分。在一些实施方案中，融合蛋白质的多肽是第二异源多肽和同源多肽。
在一些实施方案中，融合多核苷酸编码融合蛋白质，所述融合蛋白质包含被接头或接头区域和切割位点隔开的两种多肽。在一些实施方案中，融合蛋白质的多肽是第二异源多肽和同源多肽。通常，切割位点应位于接头区域内，并且会允许将切割位点边缘的序列分开。切割位点可包含能够通过目前已知或之后开发的任何手段切割的任何序列，所述手段包括但不限于通过蛋白酶切割，或者在暴露于某些化学品后切割。这类序列的例子包括但不限于，kexin切割位点，例如包含氨基酸Lys Arg的密码子的KEX2识别位点，Lys和Arg的胰蛋白酶识别位点，和内切蛋白酶-Lys-C的切割识别位点。
在一些实施方案中，本发明的丝状真菌还包含编码选择性标记的多核苷酸。标记物可以是任何合适的标记物，其允许选择经转化的宿主细胞。通常，选择性标记应当是能够在宿主细胞中表达的基因，其允许容易地选择含有载体的那些宿主。在本文中使用时，该术语通常表示提供下述指示的基因：宿主细胞摄取了引入的目标DNA或者发生了一些其他的反应。通常，选择性标记是对宿主细胞赋予抗微生物剂抗性或者代谢益处的基因，从而允许将含有外源DNA的细胞与转化期间未接收任何外源序列的细胞区分开。这类选择性标记的例子包括但不限于抗微生物剂(例如卡那霉素、红霉素、放线菌素、氯霉素和四环素)。标记物的其他例子包括但不限于里氏木霉pyr4、乙酰乳酸合酶、链霉菌(streptomyces)hyg、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS基因和黑曲霉(Aspergillus niger)pyrG基因。
在一些实施方案中，本发明的丝状真菌还包含，并且能够表达，编码第三异源多肽的第四多核苷酸。异源或同源多肽可以是天然多肽或其变体。在一些实施方案中，一种或多种异源多肽可以是同源多肽的变体。例如，第一异源多肽可以是经修饰的同源多肽。在一些实施方案中，第一异源多肽和第二异源多肽是经修饰的同源多肽。在一些实施方案中，第一异源多肽和第二异源多肽是经修饰的同源多肽，并且丝状真菌含有编码第三异源多肽的第四多核苷酸。第三异源多肽可以是或不是经修饰的同源多肽。
本发明的异源和同源多肽可以是任何想要的多肽，其与本发明的其他多肽混合时产生功能性混合物，所述混合物具有至少一种来自于混合物中至少两种或三种多肽的功能，所述功能是生物学功能或其他功能。在一些实施方案中，异源和同源多肽的混合物允许功能性混合物展示改进的功能，所述功能涉及丝状真菌的活性、与丝状真菌的活性相关，或者由丝状真菌提供。在一些实施方案中，活性包括但不限于改进的可分泌蛋白质活性，改进的糖化作用活性或热稳定性，例如在更高的温度或改变的pH值下的稳定性，和/或在相同温度下保持更长时间的活性。
在一些实施方案中，异源或同源多肽不包含任何细菌酶与其运载体丝状蛋白质的组合。在一些实施方案中，异源或同源多肽不组合形成任何抗体或功能性抗体片段，例如Fab、单链抗体等。
在一些实施方案中，一种或多种第一或第二异源多肽或同源多肽是酶或其部分。在一些实施方案中，第一或第二异源多肽或同源多肽是纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶或其结构域或部分。在一些实施方案中，第一或第二异源多肽或同源多肽是纤维素酶或其部分。在一些实施方案中，第一异源多肽和第二异源多肽，和同源多肽组合形成纤维素酶的功能性混合物。
在一些实施方案中，第一或第二异源多肽或同源多肽是选自以下的纤维素酶：外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或其部分。第一或第二异源多肽、同源多肽和(如果存在的话)第三异源多肽可以选自：外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或其结构域，没有任何限制。在一些实施方案中，多于一种异源或同源多肽可以属于相同的纤维素酶种类或类别。例如，两种或更多多肽可以属于外切纤维二糖水解酶的种类。在一些实施方案中，异源多肽之一属于与同源多肽相同的纤维素酶种类。在一些实施方案中，异源和同源多肽是一个种类的相同成员，但是具有来自不同来源的序列。
在一些实施方案中，本发明的丝状真菌含有分别编码第一异源多肽和第二异源多肽的第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中所述第一异源多肽是外切纤维二糖水解酶且第二异源多肽是内切葡聚糖酶。在一些实施方案中，第一异源多肽是归类为EC 3.2.1.91的外切纤维二糖水解酶，且第二异源多肽是归类为EC 3.2.1.4的内切葡聚糖酶。在一些实施方案中，第一异源多肽是选自GH家族5、6、7、9、48的外切纤维二糖水解酶，且其中第二异源多肽是选自GH家族5、6、7、8、9、12、17、31、44、45、48、51、61、64、74和81的内切葡聚糖酶。
如上文所述，本发明的异源和同源多肽可以没有限制地选自纤维素酶的种类。本文中提供了示范性的酶组合。在一些实施方案中，第一异源多肽是外切纤维二糖水解酶，第二异源多肽是内切葡聚糖酶，且同源多肽是外切纤维二糖水解酶。在一些实施方案中，第一异源多肽是第一外切纤维二糖水解酶，第二异源多肽是内切葡聚糖酶，同源多肽是第二外切纤维二糖水解酶，且第一外切纤维二糖水解酶和第二外切纤维二糖水解酶对应于相同的纤维二糖水解酶成员，例如第一和第二外切纤维二糖水解酶均为CBHI或均为CBHII。
本发明的丝状真菌可以是本领域技术人员认可的任何丝状真菌。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于以下属：曲霉属、枝顶孢属、短梗霉属、白僵菌属、头孢霉属、拟蜡菌属、Chaetomium paecilomyces、Chrysosporium、麦角菌属、旋孢腔菌属、隐球酵母属、黑蛋巢菌属、内座壳属、Endothia mucor、镰孢属、Gilocladium、腐质霉属、Magnaporthe、毁丝霉属、漆斑菌属、毛霉属、Phanerochaete、柄孢壳属、拟青霉属、青霉属、Pyricularia、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、壳多孢属、踝节菌属、木霉属、Thermomyces、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、Tolypocladium、发癣菌属和Trametes pleurotus。在一些实施方案中，丝状真菌包括但不限于以下：构巢曲霉，黑曲霉，泡盛曲霉，例如NRRL 3112、ATCC 22342(NRRL3112)、ATCC 44733、ATCC 14331和菌株UVK 143f，米曲霉，例如ATCC11490，粗糙脉孢霉，里氏木霉，例如NRRL 15709、ATCC 13631、56764、56765、56466、56767和绿色木霉，例如ATCC 32098和32086。
在一些实施方案中，本发明的丝状真菌是木霉。在一些实施方案中，本发明的丝状真菌是里氏木霉。在一些实施方案中，异源多肽可以来自于以下任何：灰腐质霉(Humicola grisea)、解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolyticus)、嗜热放线菌(Thermobifida fusca)或绳状青霉(Penicilliumfuniculosum)。在一些实施方案中，异源多肽来自于灰腐质霉、解纤维热酸菌、喜热裂孢菌属(Thermobifida)，例如嗜热放线菌或绳状青霉，并且同源多肽来自里氏木霉。
本文提供了异源和同源多肽的示范性组合。在一些实施方案中，功能性混合物的异源和同源多肽可选自里氏木霉EGI、EGII、EGIII(分别为CEL7B、5A、12A)、CEL12A的变体、灰腐质霉(H.grisea)EGIII、嗜热放线菌(T.fusca)E5和E3，和解纤维热酸菌(A.cellulolyticus)E1和GH74。在一些实施方案中，功能性混合物的异源多肽可以是外切-内切纤维素酶融合构建体。在一些实施方案中，融合蛋白质具有纤维素分解活性，其包含来自真菌外切纤维二糖水解酶的催化结构域和来自内切葡聚糖酶的催化结构域。合适但非限制性的例子在美国专利申请公开No.20060057672中提供。
在一些实施方案中，功能性混合物的异源多肽可以是一种Cel7酶──红褐肉座菌(H.jecorina)CBH I的变体。在一些实施方案中，纤维二糖水解酶可具有改进的耐热性和可逆性，包括但不限于美国专利申请公开No.20050277172和20050054039中所述的纤维二糖水解酶。
在一些实施方案中，功能性混合物的异源多肽可以是一种Cel7酶──红褐肉座菌CBH 2的变体。在一些实施方案中，纤维二糖水解酶可具有改进的耐热性和可逆性，包括但不限于美国专利申请公开No.20060205042中所述的纤维二糖水解酶。
在一些实施方案中，宿主丝状真菌是里氏木霉，第一异源多肽是灰腐质霉CBHI，第二异源多肽是解纤维热酸菌内切葡聚糖酶1，且同源多肽是里氏木霉CBHI。在一些实施方案中，丝状真菌是里氏木霉，且第一异源多肽或第二异源多肽选自绳状青霉纤维二糖水解酶CBHI、喜热裂孢菌内切葡聚糖酶E3、喜热裂孢菌内切葡聚糖酶E5、解纤维热酸菌GH74-核心和GH48。
在一些实施方案中，丝状真菌包含编码第三异源多肽的第四多核苷酸。此处第一多肽是经修饰的里氏木霉CBHI，第二异源多肽是经修饰的里氏木霉CBHII，第三异源多肽是解纤维热酸菌内切葡聚糖酶1，且同源多肽是里氏木霉CBHI。
本发明还提供了具有改进的特性和/或活性的功能性混合物。在一些实施方案中，第一异源多肽是外切纤维二糖水解酶，第二异源多肽是内切葡聚糖酶，且同源多肽是外切纤维二糖水解酶。此处第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽形成耐热纤维素酶的混合物。
另外，在一些实施方案中，本发明提供了：编码异源以及同源多肽的多核苷酸，其可以是染色体外的，例如在载体或质粒中，或者该多核苷酸可以被整合进丝状真菌宿主的染色体内。在一些实施方案中，丝状真菌宿主的基因组中整合了至少一种编码第一、第二或第三异源多肽或同源多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，丝状真菌宿主的基因组中整合了至少一种编码第一、第二或第三异源多肽或同源多肽的多核苷酸，并且在稳定载体中编码异源或同源多肽的至少一种多核苷酸被转化进宿主中。
在一些实施方案中，宿主是其基因组中整合了至少一种编码第一或第二异源多肽或同源多肽的多核苷酸的里氏木霉。在一些实施方案中，宿主是其基因组中整合了两种多核苷酸的里氏木霉。多核苷酸编码第一、第二或(如果存在的话)第三异源多肽或同源多肽。在一些实施方案中，表达异源或同源外切纤维二糖水解酶的一种或多种多核苷酸被整合进里氏木霉宿主的基因组中。在一些实施方案中，编码异源内切葡聚糖酶的多核苷酸被整合进里氏木霉宿主的基因组中。在一些实施方案中，编码异源内切葡聚糖酶的多核苷酸和编码异源或同源外切纤维二糖水解酶之一的多核苷酸被整合进里氏木霉宿主的基因组中。可以理解的是，当编码功能性混合物的多肽的三种或四种多核苷酸中只有一种或两种被整合进宿主基因组中时，剩余的多核苷酸被转化进宿主中并存在于载体或质粒中。在一些实施方案中，丝状真菌含有分别编码第一异源多肽和第二异源多肽的第一多核苷酸和第二多核苷酸，和编码同源多肽的第三多核苷酸，并且所有三种多核苷酸是在染色体外的。
本发明还提供了包含上文所述丝状真菌群体的培养基。该培养基可以是固体、半固体或液体，并且根据宿主以及其中表达的多肽而适当地选择。
另外，本发明还提供了多肽混合物，其包含得自本文所述丝状真菌的第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽。在一些实施方案中，多肽混合物是酶或其结构域的混合物。在一些实施方案中，多肽混合物是纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶或其结构域的混合物。
另外，本发明提供了生产多肽混合物的方法，其包括从本文所述的丝状真菌中获得多肽混合物。多肽混合物含有第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽。在一些实施方案中，多肽混合物含有第三异源多肽。如上文所述，多肽混合物是功能性混合物。在一些实施方案中，多肽混合物是酶或其结构域的混合物。在一些实施方案中，多肽混合物是纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶或其结构域的混合物。
在一些实施方案中，多肽混合物是纤维素酶的混合物，其包含是外切纤维二糖水解酶的第一异源多肽，是内切葡聚糖酶的第二异源多肽，和是外切纤维二糖水解酶的同源多肽。在一些实施方案中，纤维素酶的混合物含有是第一外切纤维二糖水解酶的第一异源多肽，是内切葡聚糖酶的第二异源多肽，和是第二外切纤维二糖水解酶的同源多肽。因此，第一外切纤维二糖水解酶和第二外切纤维二糖水解酶对应于纤维二糖水解酶的相同成员。在一些实施方案中，第一和第二外切纤维二糖水解酶是CBHI。在一些实施方案中，第一和第二外切纤维二糖水解酶是CBHII。
本领域技术人员明白，可以在本发明的丝状真菌中表达异源和同源多肽的若干其他组合。纤维素酶的另一示范性混合物包含是灰腐质霉CBHI的第一异源多肽，是解纤维热酸菌内切葡聚糖酶1的第二异源多肽，和是里氏木霉CBHI的同源多肽。
本发明的方面可根据以下实施例进一步理解，所述实施例不应被理解为限制本发明的范围。本领域技术人员明白，可以对材料和方法二者进行许多修饰而不偏离本发明。
实施例
实施例1三部分菌株的构建
三部分菌株由以下三部分组成：(i)里氏木霉纤维素酶生产菌株；(ii)该菌株中包含灰腐质霉cbh1基因的核酸；和(iii)里氏木霉cbh1与解纤维热酸菌内切葡聚糖酶1的外切-内切纤维素酶融合物。
CBH1-E1融合载体的构建
CBH 1-E1融合构建体含有里氏木霉cbhI启动子；从起始密码子到cbhI接头末端的里氏木霉cbhI基因序列，和DNA 5'到内切葡聚糖酶编码序列起点的额外12个碱基，内切葡聚糖酶编码序列，终止密码子和里氏木霉cbhI终止子。异源纤维素酶融合构建体的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)包含2656个碱基(见图1)，并且包含里氏木霉cbhI信号序列；里氏木霉cbhI的催化结构域；里氏木霉cbhI接头序列；包含氨基酸SKR的密码子的kexin切割位点，和编码解纤维热酸菌GH5A-E1催化结构域的序列。图2中显示以图1的核酸序列为基础预测的纤维素酶融合蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。额外的12个DNA碱基ACTAGTAAGCGG(SEQ IDNO:1的核苷酸1565到1576)编码限制性内切核酸酶SpeI和氨基酸Thr、Ser、Lys和Arg。
在PCR反应中使用含有E1基因座的可读框的E1-pUC19质粒作为DNA模板。(等同的质粒描述于美国专利No.5,536,655中，所述专利还描述了从放线菌解纤维热酸菌ATCC 43068中克隆E1基因，Mohagheghi A.等,1986)。加工质粒DNA和使用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA的标准步骤见Sambrook等,2001。
使用以下两种引物扩增E1内切葡聚糖酶的催化结构域的编码区。正向引物1＝EL-316(含Spe1位点)：GCTTATACTAGTAAGCGCGCGGGCGGCGGCTATTGGCACAC(SEQ ID NO:3)；反向引物2＝EL-317(含AscI位点和终止密码子反向互补体)：GCTTATGGCGCGCCTTAGACAGGATCGAAAATCGACGAC(SEQ ID NO:4)。
反应条件如下，使用来自PLATINUM Pfx DNA聚合酶试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)的材料：1μl dNTP母液混合物(终浓度0.2mM)；1μl引物1(终浓度0.5μM)；1μl引物2(终浓度0.5μM)；2μl DNA模板(终浓度50-200ng)；1μl 50mM MgSO4(终浓度1mM)；5μl 10x Pfx扩增缓冲液；5μl 10xPCRx增强子溶液；1μl Platinum Pfx DNA聚合酶(总计2.5U)；33μl水至50μl总反应体积。
扩增参数为：步骤1：94℃2分钟(仅1个循环，用于使与抗体结合的聚合酶变性)；步骤2：94℃45秒；步骤3：60℃30秒；步骤4：68℃2分钟；步骤5：重复(至)步骤2，24个循环；和步骤6：68℃4分钟。
将尺寸大致正确的PCR产物克隆进Zero Blunt TOPO载体中，并转化进化学感受态Top10大肠杆菌(E.coli)细胞(Invitrogen Corp.,Carlsbad,Calif.)中，涂布在适当的选择培养基(含50ppm卡那霉素的LA)上并在37℃下过夜培养。从平板培养基上挑取若干菌落，并于37℃下在选择培养基(含50ppm卡那霉素的LB)中于5ml培养物中培养过夜，从所述培养物中制备质粒小量制备物。对来自若干克隆的质粒DNA进行限制性消化，验证正确尺寸的插入片段。通过DNA测序验证正确的序列。在序列验证后，通过用限制性酶SpeI和AscI消化，从TOPO载体上切下E1催化结构域。将该片段连接进pTrex4载体中，所述载体已如图3中所示用限制性酶SpeI和AscI消化。
将连接混合物转化进MM294感受态大肠杆菌细胞中，涂布在适当的选择培养基(含50ppm羧苄青霉素的LA)中，并在37℃下培养过夜。从平板培养基上挑取若干菌落，并在选择培养基(含50ppm羧苄青霉素的LB)中于37℃下在5ml培养物中过夜培养，从所述培养物中制备质粒小量制备物。通过限制性消化验证正确连接的CBH1-E1融合蛋白质载体。
灰腐质霉(H.grisea)cbh1表达载体的构建
灰腐质霉cbh1表达构建体含有里氏木霉cbhI启动子；灰腐质霉cbhI基因序列，里氏木霉cbh1终止子和构巢曲霉(A.nidulans)amdS选择性标记。这些序列可以由本领域技术人员以大量方式装配，一种方法如下文描述。
从灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)(CBS 225.63)的菌丝体样品中提取基因组DNA。可以使用本领域已知的任何方法分离基因组DNA。可使用以下方案。
将细胞于45℃下在20ml马铃薯葡萄糖发酵液中(PDB)培养24小时。将细胞1:20在新鲜的PDB培养基中稀释，并培养过夜。离心两升细胞，并用1ml KC(每升60g KCl、2g柠檬酸，用1M KOH将pH调节至6.2)洗涤沉淀物。将细胞沉淀物重悬于900μl KC中。添加100μl(20mg/ml)Novozyme，轻柔混合并在37℃下显微镜监测原生质体化，直至大于90％的原生质体形成，最多耗时2小时。将细胞在1500转/分钟(4600xG)下离心10分钟。添加200μl TES/SDS(10mM Tris,50mM EDTA,150mMNaCl,1％SDS)，混合并在室温下孵育5分钟。使用Qiagen小量制备分离试剂盒(Qiagen)分离DNA。用100μl milli-Q水洗脱柱并收集DNA。
使用的一种替代方法是FastPrep方法，用于从45℃下在PDA平板上培养的灰腐质霉高温变种中分离基因组DNA。该体系由用于核酸分离的FastPrep仪器以及FastPrep试剂盒组成。(FastPrep可得自Qbiogene,MPBiomedicals United States,29525Fountain Pkwy.,Solon,OH 44139)。
PCR扩增灰腐质霉cbh1基因的引物基于NCBI ACCESSIOND63515。它们被设计为从灰腐质霉cbh1的起点到终止子扩增。正向引物序列包含便于克隆进载体TOPO pENTR中的4核苷酸CACC，从而使得能够使用Gateway克隆体系(Invitrogen)。
正向引物：5’CACCATGCGTACCGCCAAGTTCGC 3’(SEQ ID NO:5)
反向引物：5’TTACAGGCACTGAGAGTACCAG 3’(SEQ ID NO:6)。
PCR反应条件
根据Invitrogen Gateway系统方案，将PCR产物克隆进pENTR/D中。然后将载体转化进化学感受态Top10大肠杆菌(Invitrogen)中，使用卡那霉素选择。对来自若干克隆的质粒DNA进行限制性消化，验证正确尺寸的插入，然后测序验证正确的序列。向具有pTrex3g/amdS目标载体(destination vector)DNA的LR clonase反应(Invitrogen Gateway体系)中添加来自一个克隆的质粒DNA。
pTrex3g的构建
这一部分描述了用于表达目的基因的基本载体的构建。载体pTrex3g先前已描述于例如美国专利申请公开No.20070015266中。简言之，该载体基于大肠杆菌载体pSL1180(Pharmacia Inc.,Piscataway,NJ,USA)，所述大肠杆菌载体pSL1180是基于pUC118噬菌粒的载体(Brosius,J.(1989)DNA 8:759)，其具有含64个六聚体限制性酶识别序列的扩展的多克隆位点。pTrex3g被改造成为Gateway目标载体(Hartley,J.L.等,(2000)Genome Research 10:1788-1795)，从而允许使用Gateway技术(Invitrogen)插入里氏木霉cbh1基因的启动子和终止子区域之间的任何想要的可读框。构巢曲霉amdS基因被插入，在转化中用作选择性标记。启动子和终止子被定位为允许表达目的基因。
pTrex3g的细节如下：
载体尺寸为10.3kb。插入pSL1180的多接头区域中的是以下DNA区段：(i)来自里氏木霉cbh1基因启动子区的2.2bp DNA区段；(ii)得自Invitrogen的1.7kb Gateway读框A盒，其在氯霉素抗性基因(CmR)和ccdB基因侧翼的任一末端包含attR1和attR2重组位点；(iii)来自里氏木霉cbh1基因终止子区的336bp DNA区段；和(iv)含有构巢曲霉amdS基因及其固有启动子和终止子区域的2.7kg DNA片段。图4展示了里氏木霉表达载体pTrex3g的质粒图谱。
根据制造商(Invitrogen)的说明书，使用上述载体pENTR中的灰腐质霉cbh1克隆在LR clonase反应中与pTrex3g-目标载体重组。灰腐质霉cbh1用来自pENTR/D载体的灰腐质霉cbh1代替pTrex3g目标载体的CmR和ccdB基因。重组将灰腐质霉cbh1定向插入目标载体的里氏木霉cbhI启动子和里氏木霉cbh1终止子之间。重组导致灰腐质霉cbh1上游和下游两侧翼有25bp的AttB序列。将LR clonase反应的等分试样转化进化学感受态Top10大肠杆菌细胞(Invitrogen)中并过夜培养，使用羧苄青霉素选择。用适当的限制性酶消化来自若干克隆的质粒DNA，验证正确的插入尺寸，之后测序验证正确的序列。为了提供用于转化的DNA，用内切核酸酶Xba1消化来自正确克隆的质粒DNA，释放包含里氏木霉cbhI启动子:灰腐质霉cbh1:里氏木霉cbhI终止子:构巢曲霉amdS的表达片段。使用标准技术通过琼脂糖凝胶提取从大肠杆菌DNA中分离该6.2kb片段，并转化进里氏木霉菌株中，所述菌株如下文进一步描述的来自于公众可获得的菌株QM6a。含有两个Xba I位点的表达载体在图5A中图示，表达载体的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)在图5B中提供。
里氏木霉的共转化和发酵
使用里氏木霉宿主菌株RL-P37(Sheir-Neiss等,1984)的衍生物作为用本发明构建体转化的宿主菌株，所述菌株RL-P37经过大量诱变步骤以提高纤维素酶生产，包括缺失天然的cbh1基因(Suominen,P.L.等,1993,MolGen Genet 241:523-30)。
使用下文所列方案，用灰腐质霉cbh1表达构建体和里氏木霉cbh1与解纤维热酸菌E1的融合构建体对里氏木霉进行使生物射弹转化。
用里氏木霉P-37衍生菌株制备孢子悬浮液(约3.5x108孢子/ml)。将100μl-200μl该孢子悬浮液涂布在MM乙酰胺培养基平板中心上。MM乙酰胺培养基具有以下成分：0.6g/L乙酰胺；1.68g/L CsCl；20g/L葡萄糖；20g/L KH2PO4；0.6g/L CaCl2.2H2O；1ml/L 1000X微量元素溶液；20g/LNoble琼脂；pH 5.5。1000X微量元素溶液含有5.0g/l FeSO4.7H2O、1.6g/lMnSO4.H2O、1.4g/l ZnSO4.7H2O和1.0g/l CoCl2.6H2O。允许孢子悬浮液于无菌舱中在MM乙酰胺培养基的表面上干燥。
根据制造商的说明(Lorito,M.等,1993,Curr Genet 24:349-56)，使用来自Bio-Rad(Hercules,CA)的PDS-1000/He颗粒递送体系进行里氏木霉的转化。将60mg M10钨颗粒置于微量离心管中。添加1ml乙醇，将混合物大致振荡并允许其静置15分钟。将颗粒在15,000转/分钟离心15分钟。去除乙醇并用无菌dH2O将颗粒洗涤三次，之后添加1mL 50％(v/v)无菌甘油。涡旋10秒悬浮钨之后，去除25μl钨/甘油颗粒悬浮液，并置于微量离心管中。
连续涡旋25μl钨/甘油颗粒悬浮液时，顺次添加以下内容，在添加之间允许赋予5分钟温育：2μl(100-300ng/μl)灰腐质霉cbh1表达载体(XbaI切割的片段)、2μl(100-300ng/μl)cbh1-E1表达载体(XbaI切割的片段)、25μl 2.5M CaCl2和10μl 0.1M亚精胺。在添加亚精胺后温育5分钟后，将颗粒离心3秒。去除上清；用200μl 70％(v/v)乙醇洗涤颗粒，然后离心3秒。去除上清；将颗粒用200μl 100％乙醇洗涤并离心3秒。去除上清，添加24μl 100％乙醇并通过吹吸混合。将管置于超声波清洗槽中约15秒，从而将颗粒再次重悬于乙醇中。当管处于超声波浴中时，移出8μl悬浮颗粒的等分试样，置于大量携带盘(macrocarrier disk)中心，并将盘置于干燥器中。
一旦钨/DNA溶液在大量携带盘上干燥(约15分钟)，将其置于轰击舱中。接着用孢子涂布含MM乙酰胺的平板，并根据制造商的说明使用1100psi破裂盘(rupture disc)进行轰击过程。用钨/DNA颗粒轰击平板孢子后，将平板在28℃下温育。5天后将大的经转化的菌落挑取至新鲜的第二MM乙酰胺平板上(Penttila等,(1987)Gene 61:155–164)，并在28℃下再孵育3天。将在第二平板上显示密集的、不透明生长的菌落转移至个体MM乙酰胺平板上。将其再培养3天，转移至马铃薯葡萄糖琼脂平板(PDA)上并在28℃下再孵育7-10天，允许孢子形成。
接着在两阶段摇瓶中评价转化体对酶的表达。首先将其在含有以下培养基的接种摇瓶中培养：22.5g/L Proflo、30g/L a-乳糖.H2O、6.5g/L(NH4)2SO4、2g/L KH2PO4、0.3g/L MgSO4.7H2O、0.26g/L CaCL2.2H2O、0.72g/L CaCO3、2ml 10％Tween 80、1ml 1000x TRI微量盐(1000x TRI微量盐由5g/L FeSO4.7H2O、1.6g/L MnSO4.H2O、1.4g/L ZnSO4.7H2O组成)。条件如下：带有4块挡板的250ml摇瓶(Bellco Biotechnology,340Edrudo Road,Vineland,NJ 08360USA)中50ml培养基，在28℃下孵育，2.5cm直径的轨道上摇速225转/分钟。通过转移含有转化体菌丝体和孢子的4cm2PDA块，将转化体接种进接种摇瓶中。
在接种瓶中培养2天后，将5ml转移进含有50ml以下培养基的表达摇瓶中：5g/L(NH4)2SO4、33g/L PIPPS缓冲液、9g/L Bacto CasaminoAcids、4.5g/L KH2PO4、1.32g/L CaCl2.2H2O、1g/L MgSO4.7H2O、5mlMazu DF204消泡剂、2.5ml 400x里氏木霉(T.reesei)微量盐(400x里氏木霉微量盐由按照所列顺序添加的175g/L柠檬酸(无水)、200g/LFeSO4.7H2O、16g/L ZnSO4.7H2O、3.2g/L CuSO4.5H2O、1.4g/LMnSO4.H2O、0.8g/L H3BO3组成)，将pH调节至5.5，将培养基灭菌，灭菌后添加40ml 40％乳糖。表达摇瓶培养条件如下：带有4个挡板的250ml摇瓶，在28℃下孵育，摇速225。在第5天取样，在SDS-PAGE蛋白质凝胶上分析上清，进行考马斯染色。
实施例2.四部分菌株构建
构建包含四个部分的菌株：(i)由cbhI缺失的生产菌株组成的宿主菌株；(ii)用于表达cbhI-E1融合基因的核酸序列；(iii)用于表达蛋白质经改造的耐热的里氏木霉cbhI基因的核酸序列；和(iv)用于表达蛋白质经改造的耐热的里氏木霉cbhII基因的核酸序列。如图6中所示，将所有三种表达片段的DNA共同转化进cbh1缺失的生产菌株中。
针对整合进基因组中的所有三种表达片段的存在筛选里氏木霉转化体。PCR引物被设计为扩增三种表达片段的每一种。基于PCR选择32个显示存在所有三种表达片段的转化体用于摇瓶发酵。将摇瓶培养三天，获得上清样品并在tris-甘氨酸SDS电泳缓冲液中1mm的8％tris-甘氨酸NuPAGE(invitrogen)凝胶上电泳。除非有说明，在100℃孵育7分钟并在冰上孵育5分钟后将样品以20μl/泳道上样(8μl上清+2μl还原剂+10μl 2Xtris-甘氨酸SDS样品缓冲液)。蛋白质条带证明，32个样品中的若干个显示表达的基因的高水平存在。
可以通过本领域已知的多种方法制备编码里氏木霉cbhI和cbhII的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但不限于，基因合成，通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变制备，PCR诱变，和较早制备的编码里氏木霉cDNA序列的DNA的盒诱变。
在pTrex3g中构建表达下述酶改造的里氏木霉cbhI基因的载体，所述基因编码成熟氨基酸序列中具有以下突变的经改造的蛋白质：S8P+T41I+N49S+A68T+N89D+S92T+S113N+S196T+P227L+D249K+T255P+S278P+E295K+T296P+T332Y+V403D+S411F。如图7A中所提供放的，从起始密码子到终止密码子的DNA序列为1545个碱基(SEQID NO:8)。图7B中提供了经改造的CBHI蛋白质的序列(SEQ ID NO:9)(CBHI信号序列加有下划线)。图8A中展示了cbhI表达载体pTrex3g-cbh1的图谱。如图8B中所提供的，表达载体pTrex3g-cbh1的DNA序列为10145个碱基(SEQ ID NO:10)。
构建表达酶改造的CBHII蛋白质的载体。该载体包含cbhII启动子、经改造的cbhII基因、cbhII终止子、作为选择性标记的构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)、cbhII终止子的额外的侧翼3’序列。该载体使用穿梭载体pCR-XL-TOPO(Invitrogen)构建。通过用特有的限制性内切核酸酶NotI和SrfI消化，从穿梭载体上切下载体的表达部分，产生长度约10.68kb的片段，使用该片段转化里氏木霉。
该载体表达里氏木霉cbhII基因，所述基因编码氨基酸序列中具有以下突变的经改造的蛋白质：P98L、M134V、T154A、I212V、S316P和S413Y。如图9A中所提供的，从起始密码子到终止密码子的DNA序列为1416个碱基(SEQ ID NO:11)。图9B中提供了氨基酸序列(SEQ ID NO:12)(信号序列加有下划线)。图10A中提供了cbhII表达载体的图谱。如图10B中所提供的，整个cbhII表达pExp-cbhII载体的DNA序列为14158个碱基(SEQ ID NO:11)。
使用三个DNA片段，对缺失cbhI的里氏木霉菌株进行共转化：
使用NotI和SrfI从质粒pExp-cbhII上切下的经改造的cbhII表达片段。
表达载体pTrex3g中经改造的cbhI，其被用作PCR模板，用于产生仅由cbhI启动子、经改造的cbhI和cbhI终止子组成的线性片段(无amdS标记物)。前一实施例中所述cbhI-E1融合片段，其被用作PCR模板，用于产生由cbhI启动子、cbhI-E1融合基因和cbhI终止子组成的线性片段(无amdS标记物)。在生物射弹共转化中使用这三种片段包裹钨颗粒。步骤如前一实施例中所述进行。在该共转化中，以每个片段1.5μl的体积(100-300ng/μl DNA浓度)向钨颗粒上添加三种片段1、2和3中的每一种。转化体选择如所述在MM乙酰胺培养基上进行。
6.3实施例3.来自转化的里氏木霉菌落的纤维素分解活性测定法
使用以下的测定法和底物测定CBHI-EI融合蛋白质的纤维素分解活性。里氏木霉菌株Tr-A和Tr-D通过诱变来自RL-P37。
预处理的玉米秆(PCS)：如Schell,D.等,J.Appl.Biochem.Biotechnol.105:69–86(2003)中所述，用2％w/w H2SO4预处理玉米秆，之后用去离子水多次洗涤得到4.5的pH。添加乙酸钠至50mM终浓度，并将其滴定至pH 5.0。
测量总蛋白质：使用双喹啉-4-羧酸(bicinchoninic acid)方法，用牛血清白蛋白作为标准，测量蛋白质浓度(Smith,P.K.等(1985)Anal.Biochem.150:76-85)。
根据Baker等,Appl.Biochem.Biotechnol.70-72:395–403(1998)中所述方法，通过HPLC评价纤维素转化(可溶性糖测定)。
在实验中使用标准纤维素转化测定法。在该测定法中，将酶和缓冲的底物置于容器中，并在一定温度下孵育一定时间。用足够使反应混合物的pH成为至少pH 10的100mM甘氨酸，pH 11.0终止(quench)反应。反应被终止后，将反应混合物的等分试样滤过0.2微米的膜，去除固体。然后如上文所述通过HPLC针对可溶糖测定滤过的溶液。反应混合物中的纤维素浓度约为7％。酶或酶混合物是每克纤维素从1到60mg总蛋白质的任何剂量。
下表1概括了显示超过经修饰的Tr-D的4-部分菌株的提高的特定性能。
PCS(13％)SSC，20小时，65℃
下表2概括了显示超过Tr-A的3-部分菌株的提高的特定性能。
PCS(13％)SSC，72小时，59℃
本文应用的所有参考文献和出版物均通过完整引入本文作为参考。应当注意，存在完成本发明的替代方式。因此，本发明的实施方案应被认为是阐述性而非限制性的，并且本发明不限于本文给出的细节，而是可以在附带的权利要求的范围和等同物内进行修改。

Claims (34)

1.丝状真菌，其包含：
编码第一异源多肽的第一多核苷酸，
编码第二异源多肽的第二多核苷酸，和
编码同源多肽的第三多核苷酸，
其中所述丝状真菌能够表达所述第一异源多肽和第二异源多肽与同源多肽，并且其中所述第一异源多肽和第二异源多肽与同源多肽形成功能性混合物。
2.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一多核苷酸与第一启动子有效连接。
3.权利要求1的丝状真菌，其中所述第二多核苷酸与第三多核苷酸融合，并且其中所述第二和第三多核苷酸与第二启动子有效连接。
4.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一多核苷酸与编码同源多肽的基因的固有启动子有效连接。
5.权利要求1的丝状真菌，其中所述第二多核苷酸与第三多核苷酸融合，并且其中所述第三多核苷酸与编码同源多肽的基因的启动子有效连接。
6.权利要求1的丝状真菌，其中所述第二多核苷酸与第三多核苷酸融合以形成编码融合蛋白的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含通过接头隔开的第二异源多肽和同源多肽。
7.权利要求6的丝状真菌，其中所述融合蛋白还包含切割位点。
8.权利要求1的丝状真菌，其还包含编码选择性标记的第四多核苷酸。
9.权利要求1的丝状真菌，其还包含编码第三异源多肽的第四多核苷酸，其中所述丝状真菌能够表达第三异源多肽。
10.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一异源多肽是经修饰的同源多肽。
11.权利要求1的丝状真菌，其还包含编码第三异源多肽的第四多核苷酸，其中所述第一异源多肽和第二异源多肽是经修饰的同源多肽。
12.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一异源多肽、第二异源多肽或同源多肽是酶。
13.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一异源多肽、第二异源多肽或同源多肽是纤维素酶。
14.权利要求1的丝状真菌，其中所述功能性混合物是纤维素酶的混合物。
15.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一异源多肽、第二异源多肽或同源多肽是选自以下的纤维素酶：外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡糖苷酶。
16.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一异源多肽是外切纤维二糖水解酶，且第二异源多肽是内切葡聚糖酶。
17.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一异源多肽是选自GH家族5、6、7、9和48的外切纤维二糖水解酶，并且其中所述第二异源多肽是选自GH家族5、6、7、8、9、12、17、31、44、45、48、51、61、64、74和81的内切葡聚糖酶。
18.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一异源多肽是外切纤维二糖水解酶，第二异源多肽是内切葡聚糖酶，并且其中所述同源多肽是外切纤维二糖水解酶。
19.权利要求1的丝状真菌，其中第一异源多肽是第一外切纤维二糖水解酶，第二异源多肽是内切葡聚糖酶，同源多肽是第二外切纤维二糖水解酶，且其中第一外切纤维二糖水解酶和第二外切纤维二糖水解酶对应于相同的纤维二糖水解酶成员。
20.权利要求1的丝状真菌，其中所述丝状真菌选自曲霉属、枝顶孢属、短梗霉属、白僵菌属、头孢霉属、拟蜡菌属、毛壳菌属、拟青霉、Chrysosporium、麦角菌属、旋孢腔菌属、隐球酵母属、黑蛋巢菌属、内座壳属、镰孢属、Gilocladium、腐质霉属、Magnaporthe、毁丝霉属、漆斑菌属、毛霉属、脉孢菌属(Neurospora)、Phanerochaete、柄孢壳属、拟青霉属、青霉属、Pyricularia、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、壳多孢属、踝节菌属、木霉属、Thermomyces、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、Tolypocladium、发癣菌属、栓菌(Trametes)和侧耳(Pleurotus)。
21.权利要求1的丝状真菌，其中所述丝状真菌是里氏木霉，并且其中第一异源多肽是灰腐质霉CBHI，第二异源多肽是解纤维热酸菌内切葡聚糖酶1，并且其中同源多肽是里氏木霉CBHI。
22.权利要求1的丝状真菌，其中所述丝状真菌是里氏木霉，并且其中第一异源多肽或第二异源多肽选自绳状青霉纤维二糖水解酶CBHI、喜热裂孢菌内切葡聚糖酶E3、喜热裂孢菌内切葡聚糖酶E5、解纤维热酸菌GH74-核心和GH48。
23.权利要求1的丝状真菌，其还包含编码第三异源多肽的第四多核苷酸，其中所述第一多肽是经修饰的里氏木霉CBHI，第二异源多肽是经修饰的里氏木霉CBHII，第三异源多肽是解纤维热酸菌内切葡聚糖酶1，同源多肽是里氏木霉CBHI。
24.权利要求1的丝状真菌，
其中所述第一异源多肽是外切纤维二糖水解酶，第二异源多肽是内切葡聚糖酶，同源多肽是外切纤维二糖水解酶，并且
其中第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽的表达形成热稳定的纤维素酶的混合物。
25.权利要求1的丝状真菌，其中所述第三多核苷酸是染色体外的多核苷酸。
26.权利要求1的丝状真菌，其中所述第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸是染色体外的多核苷酸。
27.包含权利要求1的丝状真菌群体的培养基。
28.多肽混合物，其包含得自权利要求1的丝状真菌的第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽。
29.权利要求28的多肽混合物，其中所述混合物是纤维素酶的混合物。
30.生产纤维素酶混合物的方法，其包括从权利要求1的丝状真菌中获得多肽混合物，其中所述多肽混合物包含第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽。
31.生产纤维素酶混合物的方法，其包括从权利要求1的丝状真菌中获得多肽混合物，
其中所述多肽混合物包含第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽，并且
其中第一异源多肽是外切纤维二糖水解酶，第二异源多肽是内切葡聚糖酶，同源多肽是外切纤维二糖水解酶。
32.生产纤维素酶混合物的方法，其包括从权利要求1的丝状真菌中获得多肽混合物，
其中所述多肽混合物包含第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽，
其中第一异源多肽是第一外切纤维二糖水解酶，第二异源多肽是内切葡聚糖酶，同源多肽是第二外切纤维二糖水解酶，且
其中第一外切纤维二糖水解酶和第二外切纤维二糖水解酶对应于纤维二糖水解酶的相同成员。
33.生产纤维素酶混合物的方法，其包括从权利要求1的丝状真菌中获得多肽混合物，
其中所述多肽混合物包含第一异源多肽、第二异源多肽和同源多肽，且
其中所述丝状真菌是里氏木霉并且第一异源多肽是灰腐质霉CBHI，第二异源多肽是解纤维热酸菌内切葡聚糖酶1，同源多肽是里氏木霉CBHI。
34.生产纤维素酶混合物的方法，其包括从权利要求23的丝状真菌获得多肽混合物，其中所述多肽混合物包含第一异源多肽、第二异源多肽、第三异源多肽和同源多肽。
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Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8097445B2 (en) * 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
CA2693084A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 Benjamin S. Bower Heterologous and homologous cellulase expression system
JP5745404B2 (ja) * 2009-07-03 2015-07-08 Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 ２種類の異なる微生物に由来するエンドグルカナーゼを含んでなるセルラーゼ調製物
DK3296394T3 (da) 2009-09-23 2020-12-21 Danisco Us Inc Hidtil ukendte glycosylhydrolaseenzymer og anvendelser heraf
AU2010333801B2 (en) 2009-12-23 2015-12-17 Danisco Us Inc. Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
EA201201125A1 (ru) 2010-02-11 2013-03-29 ДСМ АйПи АССЕТС Б.В. Клетка-хозяин, способная продуцировать ферменты, пригодные для деградации лигноцеллюлозного материала
WO2011143632A2 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Codexis, Inc. Cellobiohydrolase variants
RU2013146245A (ru) 2011-03-17 2015-04-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Способ уменьшения вязкости в процессе осахаривания
EP2702154A4 (en) * 2011-04-27 2015-04-08 Codexis Inc VARIANTS OF CELLOBIOHYDROLASE
BR112014003740A2 (pt) 2011-08-23 2018-08-14 Codexis Inc variantes da celobiohidrolase
CN102304540B (zh) * 2011-08-26 2013-10-09 华东理工大学 一种在里氏木霉分泌表达外源蛋白的表达设备及其应用
EP2758515A4 (en) * 2011-09-20 2015-03-18 Codexis Inc ENDOGLUCANASE 1B
WO2013043860A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 Danisco Us Inc. Endogenous dnase activity to reduce dna content
WO2013177153A1 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Danisco Us Inc. Trichoderma hydrophobin production
WO2014192647A1 (ja) * 2013-05-27 2014-12-04 独立行政法人産業技術総合研究所 培養細胞および糖液の製造方法
BR112018015626A2 (pt) 2016-02-22 2018-12-26 Danisco Us Inc sistema fúngico de produção de alto nível de proteínas
EP4095152A3 (en) 2016-03-04 2022-12-28 Danisco US Inc. Engineered ribosomal promoters for protein production in microorganisms
US10428334B2 (en) * 2016-04-05 2019-10-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of creating industrial streptomyces with capability to grow on cellulosic polysaccharide substrates
EP3690040A4 (en) * 2017-09-25 2021-09-29 Ajinomoto Co., Inc. PROCESS FOR THE PRODUCTION OF PROTEIN AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF DISACCHARIDES
JP2021035330A (ja) 2017-09-29 2021-03-04 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 発現カセット
WO2019089898A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Danisco Us Inc Freezing point depressed solid matrix compositions for melt granulation of enzymes

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5536655A (en) * 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
US5475101A (en) * 1990-10-05 1995-12-12 Genencor International, Inc. DNA sequence encoding endoglucanase III cellulase
US5677151A (en) * 1994-06-24 1997-10-14 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable cellulase from a thermomonospora gene
DK0857216T3 (en) * 1995-10-17 2014-12-15 Ab Enzymes Oy Cellulases, GENES ENCODING THEM AND USES THEREOF
FI964692A0 (fi) * 1996-11-25 1996-11-25 Primalco Ltd Foerbaettrad cellulassammansaettning foer bioefterbehandling av textilmaterial som innehaoller cellulosa
US6265204B1 (en) * 1997-01-17 2001-07-24 Genencor International, Inc. DNA sequences, vectors, and fusion polypeptides for secretion of polypeptides in filamentous fungi
US7074608B1 (en) * 1998-05-12 2006-07-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for coenzyme B12 synthesis
AU755850B2 (en) * 1998-06-10 2002-12-19 Novozymes A/S Novel mannanases
US6358715B1 (en) * 1998-12-04 2002-03-19 Genencor International, Inc. Production of ascorbic acid
ATE327322T1 (de) * 2000-09-25 2006-06-15 Iogen Energy Corp Verfahren zur herstellung von glucose mit ein ermodifizierten zellulase
EP2305800B1 (en) * 2002-08-16 2015-05-27 Danisco US Inc. Novel variant hyprocrea jecorina CBH1 cellulases
WO2004065556A2 (en) * 2003-01-17 2004-08-05 E.I. Du Pont De Nemours And Company Pet family of efflux proteins
WO2004078919A2 (en) * 2003-02-27 2004-09-16 Midwest Research Institute Superactive cellulase formulation using cellobiohydrolase-1 from penicillium funiculosum
EP1601761A1 (en) * 2003-03-12 2005-12-07 VIB vzw Improved protein secretion in eukaryotic cells
WO2005028636A2 (en) * 2003-03-21 2005-03-31 Genencor International, Inc. Novel cbh1 homologs and variant cbh1 cellulases
EP2385104A1 (en) * 2003-04-01 2011-11-09 Danisco US Inc. Variant Scytalidium thermophilium CBH1
EP1622921B1 (en) * 2003-05-02 2010-06-16 Novozymes Inc. Variants of beta-glucosidases
US8097445B2 (en) * 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
RU2394909C2 (ru) * 2004-03-25 2010-07-20 Айоджен Био-Продактс Корпорейшн Модифицированная ксиланаза
US7413887B2 (en) * 2004-05-27 2008-08-19 Genecor International, Inc. Trichoderma reesei glucoamylase and homologs thereof
CA2592550C (en) * 2004-12-30 2015-05-19 Genencor International, Inc. Novel variant hypocrea jecorina cbh2 cellulases
US8962298B2 (en) * 2006-05-02 2015-02-24 Butamax Advanced Biofuels Llc Recombinant host cell comprising a diol dehydratase
CA2693084A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-18 Benjamin S. Bower Heterologous and homologous cellulase expression system
SG165884A1 (en) * 2008-04-23 2010-11-29 Goodyear Tire & Rubber Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
EP2601300A1 (en) * 2010-08-06 2013-06-12 Danisco US Inc. Production of isoprene under neutral ph conditions
JP2014504497A (ja) * 2010-12-22 2014-02-24 ダニスコ・ユーエス・インク ２種類のｉｓｐｇ酵素を用いてイソプレン生産を向上させる組成物及び方法

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