JP2020156336A - タンパク質細胞表層発現酵母 - Google Patents
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Abstract
【課題】表層提示技術の発現カセット改良アプローチのみに固執することなく、細胞表層のタンパク質の活性を一層向上させることができるタンパク質表層発現酵母を提供すること。【解決手段】タンパク質を細胞表層発現する形質転換酵母であって、ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子、およびそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母における少なくとも１つの該細胞壁関連遺伝子の機能を欠損しており、かつプロモーター、分泌シグナル配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドが導入されている、形質転換酵母を開示する。【選択図】図１
Description
本発明は、タンパク質細胞表層発現酵母に関する。
例えば、リグノセルロース系バイオマスからのエタノールの生産のために、セルロース分解酵素のようなタンパク質を酵母に発現させ、それをその細胞の表層に効率良く提示する表層提示技術が用いられてきた（例えば、特許文献１および２）。こうした表層提示技術の改良のために、従来、高発現プロモーターを用いてタンパク質の発現量を増やすか、または分泌能力が高いシグナル配列を用いて異種タンパク質を効率良く細胞表層へ輸送するように、表層提示を目的とするタンパク質を含む発現カセットを改良するアプローチが取られてきた。
このようなアプローチにより作製されたタンパク質表層発現酵母では、細胞表層のタンパク質の活性を所定レベルまで向上させることができる。しかし、実用性の点、例えばエタノールなどの目的物の工業的生産性を向上させる目的でみれば、未だ十分なニーズに応えているとは言い難く、さらなる表層のタンパク質活性の向上が求められている。
本発明は、従来からの細胞表層提示技術の発現カセット改良アプローチのみに固執することなく、細胞表層のタンパク質の活性を一層向上させることができるタンパク質細胞表層発現酵母を提供することを目的とする。
本発明は、タンパク質を細胞表層発現する形質転換酵母であって、
ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子、およびそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母における少なくとも１つの該細胞壁関連遺伝子の機能を欠損しており、かつ
プロモーター、分泌シグナル配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドが導入されている、
形質転換酵母を提供する。
ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子、およびそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母における少なくとも１つの該細胞壁関連遺伝子の機能を欠損しており、かつ
プロモーター、分泌シグナル配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドが導入されている、
形質転換酵母を提供する。
１つの実施形態では、上記形質転換酵母は、ＣＣＷ１２遺伝子およびＣＣＷ１４遺伝子の少なくとも一方の上記細胞壁関連遺伝子の機能を欠損している。
１つの実施形態では、上記形質転換酵母は、ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子の全ての上記細胞壁関連遺伝子の機能を欠損している。
１つの実施形態では、上記形質転換酵母は、ＳＥＤ１遺伝子の機能をさらに欠損している。
１つの実施形態では、上記タンパク質は酵素である。
１つの実施形態では、上記酵素はセルロース分解酵素である。
１つの実施形態では、上記宿主酵母はサッカロマイセス属酵母である。
本発明は、タンパク質を細胞表層発現する形質転換酵母の製造方法を提供し、この方法は、
ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子、およびそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母における、該宿主酵母の少なくとも１つの該細胞壁関連遺伝子の機能を欠損させる工程、および
該宿主酵母に、プロモーター、分泌シグナル配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドを導入する工程
を含む。
ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子、およびそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母における、該宿主酵母の少なくとも１つの該細胞壁関連遺伝子の機能を欠損させる工程、および
該宿主酵母に、プロモーター、分泌シグナル配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドを導入する工程
を含む。
本発明は、上記形質転換酵母を含む、酵素剤を提供する。
１つの実施形態では、上記酵素剤はバイオマスを用いたエタノール製造のために用いられる。
本発明は、エタノールの製造方法を提供し、この方法は、上記形質転換酵母を、β-１，４結合したグルコース多糖を含む培地で培養する工程を含む。
本発明によれば、酵母の細胞表層の細胞壁構造を変化させることにより、当該細胞表層におけるタンパク質の活性をより向上させることができる。さらに、本発明によれば、例えば、リグノセルロース系バイオマスからエタノールの生産に有用なセルロース分解酵素を細胞表層に発現させた酵母を提供することができる。
本発明について、以下、詳細に説明する。
（１．細胞表層提示方法）
まず、本発明のタンパク質細胞表層発現酵母に採用される細胞表層提示方法について説明する。この細胞表層提示方法は、プロモーター、分泌シグナル配列、細胞表層に提示する目的のタンパク質（「目的タンパク質」）をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドを用いて行われる。
まず、本発明のタンパク質細胞表層発現酵母に採用される細胞表層提示方法について説明する。この細胞表層提示方法は、プロモーター、分泌シグナル配列、細胞表層に提示する目的のタンパク質（「目的タンパク質」）をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドを用いて行われる。
（１．１ アンカードメインをコードするＤＮＡ）
「アンカードメイン」とは、目的タンパク質を酵母の細胞表層に固定化するアンカー活性を有するドメインをいう。「アンカードメイン」としては、例えば、細胞表層局在タンパク質が用いられ得る。「細胞表層局在タンパク質」は、細胞表層に固定化または付着もしくは接着し、そこに局在するタンパク質をいう。細胞表層局在タンパク質としては、脂質で修飾されたタンパク質が知られており、この脂質が膜成分と共有結合することにより細胞膜に固定される。
「アンカードメイン」とは、目的タンパク質を酵母の細胞表層に固定化するアンカー活性を有するドメインをいう。「アンカードメイン」としては、例えば、細胞表層局在タンパク質が用いられ得る。「細胞表層局在タンパク質」は、細胞表層に固定化または付着もしくは接着し、そこに局在するタンパク質をいう。細胞表層局在タンパク質としては、脂質で修飾されたタンパク質が知られており、この脂質が膜成分と共有結合することにより細胞膜に固定される。
細胞表層局在タンパク質の代表例として、ＧＰＩ（glycosyl phosphatidyl inositol（グリコシルホスファチジルイノシトール）：エタノールアミンリン酸−６マンノースα−１，２マンノースα−１，６マンノースα−１，４グルコサミンα−１，６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質）アンカータンパク質を挙げることができる。ＧＰＩアンカータンパク質は、そのＣ末端に糖脂質であるＧＰＩを有しており、このＧＰＩが細胞膜中のＰＩ（phosphatidyl inositol（ホスファチジルイノシトール））と共有結合することによって細胞膜表面に結合する。
ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端へのＧＰＩの結合は、例えば以下のようにして行われる。ＧＰＩアンカータンパク質は、転写および翻訳の後、Ｎ末端側に存在する分泌シグナルの作用により小胞体内腔に分泌される。ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端またはその近傍の領域に、ＧＰＩアンカーがＧＰＩアンカータンパク質と結合する際に認識されるＧＰＩアンカー付着シグナルと呼ばれる領域が存在する。小胞体内腔およびゴルジ体において、このＧＰＩアンカー付着シグナル領域が切断され、新たに生じるＣ末端にＧＰＩが結合する。
ＧＰＩが結合したタンパク質は、分泌小胞により細胞膜まで運ばれ、ＧＰＩが細胞膜のＰＩに共有結合することにより、細胞膜に固定される。さらに、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によりＧＰＩアンカーが切断され、細胞壁に組み込まれることにより細胞壁に固定された状態で、細胞表面に提示される。
細胞表層提示の方法としては、例えば、ＧＰＩアンカリング領域を用いる方法が挙げられる。この方法では、「ＧＰＩアンカリング領域」として、細胞表層局在タンパク質であるＧＰＩアンカータンパク質の全体、またはその細胞壁結合領域であるＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含む領域をコードするＤＮＡを用いることができる。この方法では、「アンカードメイン」として、ＧＰＩアンカータンパク質の全体、またはその細胞壁結合領域であるＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含む領域が用いられる。ＧＰＩアンカリング領域を用いる方法では、ＧＰＩアンカー付着シグナルを細胞表層提示に利用する。細胞壁結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）は、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端側の領域である。細胞壁結合領域は、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含んでいればよく、融合タンパク質の酵素活性を阻害しない限り、ＧＰＩアンカータンパク質のその他の任意の部分を含んでいてもよい。
ＧＰＩアンカータンパク質は、酵母細胞で機能するタンパク質であればよい。このようなＧＰＩアンカータンパク質としては、例えば、ＳＥＤ１、α−またはａ−アグルチニン（ＡＧα１、ＡＧＡ１）、ＴＩＰ１、ＦＬＯ（例えばＦＬＯ１）、ＣＷＰ１およびＣＷＰ２が挙げられる。アンカードメインとして、好ましくは、ＳＥＤ１またはその細胞壁結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）が用いられる。アンカードメインとして、α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸を含む領域もまた好適に用いられ、この領域をコードするＤＮＡは、α−アグルチニン遺伝子の３’末端側の半分の領域とも称される。
ＳＥＤ１の遺伝子（Ｓｅｄ１）は、例えば、GenBankに登録された配列情報に基づき、当業者が通常用いる方法を用いて入手することができる（GenBank accession number NM_001180385；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８５１６４９）。Ｓｅｄ１のタンパク質コーディング領域の塩基配列を配列番号１１（開始メチオニンを除く場合の配列を配列番号４７に示す）に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１２（開始メチオニンを除く場合の配列を配列番号４８に示す）に示す。ＳＥＤ１の細胞壁結合領域は、例えば、配列番号４８の１１０位から３３８位を含む領域である。ＳＥＤ１をコードするＤＮＡは、配列番号４８のアミノ酸配列の全長をコードするポリヌクレオチドであっても、またはアンカー機能を損なわない限り、一部の配列（例えば、配列番号４８の１１０位から３３８位のアミノ酸配列を含む配列）をコードするＤＮＡであってもよい。
ここで、本明細書において記載されるタンパク質またはペプチドは、開示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質またはペプチドであってもよく、ＤＮＡまたはポリヌクレオチドは、そのようなタンパク質またはペプチドをコードするものを含んでもよい。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異（例えば、欠失、置換もしくは付加）は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、１または数個であるが、その所望の機能または効果を実質的に有する限り特に限定されず、タンパク質またはペプチドの大きさにも依存し得る。変異の総数としては、例えば、１個以上１０個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、または１個以上２個以下が挙げられるが、これらに限定されない。また、変異の総数は、例えば、以下に説明する配列同一性を満たす範囲内であり得る。アミノ酸置換の例としては、各機能または効果を実質的に保持する限りにおいていずれの置換であってもよい。例えば、保存的置換が挙げられる。保存的置換としては、具体的には以下のグループ内（すなわち、括弧内に示すアミノ酸間）での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）、（バリン、イソロイシン、ロイシン）、（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（アスパラギン、グルタミン）、（セリン、トレオニン）、（リジン、アルギニン）、（フェニルアラニン、チロシン）。
他の実施形態としては、本明細書において記載されるタンパク質またはペプチドは、開示されるアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質またはペプチドであってもよく、ポリヌクレオチドは、そのようなタンパク質またはペプチドをコードするものであってもよい。アミノ酸配列における配列同一性はまた、開示されるアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質またはペプチドをコードするものであってもよい。アミノ酸配列における配列同一性はまた、７４％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であり得る。
本明細書において配列の同一性または類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一連の、部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、「類似性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一連の、部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res., 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
さらに他の実施形態として、本明細書に記載されるタンパク質またはペプチドは、開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズしたＤＮＡによりコードされたものであってもよく、そしてポリヌクレオチドは、そのようなハイブリダイズしたＤＮＡを含むものでもよい。開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとのハイブリダイズについては、好ましくは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする。
ストリンジェントな条件とは、例えば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が例えば、１５ｍＭ〜７５０ｍＭ、５０ｍＭ〜７５０ｍＭ、または３００ｍＭ〜７５０ｍＭ、温度が例えば、２５℃〜７０℃、５０℃〜７０℃、または５５℃〜６５℃、そしてホルムアミド濃度が例えば、０％〜５０％、２０％〜５０％、または３５％〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が例えば、１５ｍＭ〜６００ｍＭ、５０ｍＭ〜６００ｍＭ、または３００ｍＭ〜６００ｍＭ、そして温度が例えば５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、または６０℃〜６５℃である。また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌの存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）の中、６５℃でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡが挙げられる。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed,, Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法などの周知の方法で行うことができる。温度が高いほど、または塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり、より相同性（配列同一性）の高いポリヌクレオチドを単離できる。
さらなる他の実施形態として、ＤＮＡまたはポリヌクレオチドは、開示される塩基配列と例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつその所望の機能または効果を実質的に有するポリヌクレオチドが挙げられる。
所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、遺伝暗号の縮重に基づく置換によって、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、所定のアミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも１つの塩基を他の塩基に置換することもできる。
「アンカードメイン」としては、例えば、細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合（例えば、ＦＬＯ（例えばＦＬＯ１））、その糖鎖結合タンパク質ドメイン（国際公開第０２／０８５９３５号）を利用することもできる。糖鎖結合タンパク質ドメインを用いた酵母の細胞表層提示方法としては、例えば、細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインのＮ末端側、Ｃ末端側、またはＮ末端側とＣ末端側との両方に目的タンパク質を融合させた融合タンパク質を発現するように設計されたＤＮＡを、宿主酵母に導入する方法が挙げられる。このような導入されたＤＮＡから発現され、細胞膜外に分泌されたタンパク質は、その糖鎖結合タンパク質ドメインが有する複数の糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用を行うことによって、細胞表層に留まり得る。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。糖鎖結合タンパク質ドメインとしては、例えば、代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。「ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメイン」とは、ＧＰＩアンカリング領域よりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、酵母細胞間の凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
アンカードメインをコードするＤＮＡは、これらを有する微生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに由来する核酸を鋳型として、既知の配列情報に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲによってＤＮＡ断片として取得し得る。アンカードメインをコードするＤＮＡは、既知の配列情報に基づいて設計したプローブを用いて、上記ライブラリー由来の核酸に対してハイブリダイゼーションを行うことによって、ＤＮＡ断片として取得してもよい。アンカードメインをコードするＤＮＡを含む既存のベクターから、ＤＮＡ断片として切り出して利用することもできる。アンカードメインをコードするＤＮＡは、化学合成法等の当該技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、ＤＮＡ断片として合成してもよい。
（１．２ 分泌シグナル配列）
「分泌シグナル配列」は、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡである。分泌シグナルペプチドは、ペリプラズムを含む細胞外に分泌される分泌性タンパク質のＮ末端に通常結合しているペプチドである。このペプチドは、生物間で類似した構造を有しており、例えば２０個程度のアミノ酸からなり、Ｎ末端付近に塩基性アミノ酸配列を有し、その後に疎水性アミノ酸を多く含んでいる。分泌シグナルは、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。
「分泌シグナル配列」は、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡである。分泌シグナルペプチドは、ペリプラズムを含む細胞外に分泌される分泌性タンパク質のＮ末端に通常結合しているペプチドである。このペプチドは、生物間で類似した構造を有しており、例えば２０個程度のアミノ酸からなり、Ｎ末端付近に塩基性アミノ酸配列を有し、その後に疎水性アミノ酸を多く含んでいる。分泌シグナルは、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。
本発明においては、目的タンパク質を酵母の細胞外に分泌させることができる分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡであれば、どのようなものでも用いることができ、その起源は問わない。目的タンパク質が本来有する分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを利用することもできる。分泌シグナルの活性を示す限り、天然型タンパク質をコードする塩基配列において、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異を含む塩基配列であってもよく、あるいは１または２以上（例えば数個）アミノ酸が欠失、付加または置換などの変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列であってもよい。分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列およびコードするタンパク質のアミノ酸配列に関して、上記で説明した配列の同一性およびハイブリダイズ条件等が適用される。
例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の定常期における主要な細胞表層局在タンパク質であるＳＥＤ１（上記）の分泌シグナルペプチドが挙げられる。この分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を配列番号４５に示し、それをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４４に示す。さらに、例えば、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）などのグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド、酵母サッカロマイセス・セレビシエのα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナルペプチド、酵母サッカロマイセス・セレビシエのα因子の分泌シグナルペプチドなどをコードするＤＮＡを好適に用いることができる。リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列は、分泌効率の点で好ましい。また、アスペルギルス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡも好ましいものとして挙げられる。
分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、既知の配列情報に基づいて設計したプライマーを用いて、所定の酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに由来する核酸を鋳型としてＰＣＲを行うことによって、ＤＮＡ断片として取得し得る。分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、既知の配列情報に基づいて設計したプローブを用いて、上記ライブラリー由来の核酸に対してハイブリダイゼーションを行うことによって、ＤＮＡ断片として取得し得る。分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、ＤＮＡ断片として合成してもよい。また、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含む既存のベクターから、ＤＮＡ断片（発現カセットの形態であってもよい）として切り出して利用することもできる。
例えば、ＳＥＤ１の分泌シグナル配列は、アンカードメインをコードするＤＮＡとしてＳＥＤ１の遺伝子Ｓｅｄ１のコーディング領域およびプロモーターとしてその遺伝子Ｓｅｄ１のプロモーターとともに用いることができる。
（１．３ 目的タンパク質）
目的タンパク質の種類、もしくはその起源は特に限定されない。目的タンパク質の種類として、例えば、酵素、抗体、リガンド、蛍光タンパク質などが挙げられる。酵素としては、例えば、セルロース分解酵素、デンプン分解酵素、グリコーゲン分解酵素、キシラン分解酵素、キチン分解酵素、脂質分解酵素などが挙げられ、より具体的には、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼ、アミラーゼ（例えば、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼ）、リパーゼなどが挙げられる。
目的タンパク質の種類、もしくはその起源は特に限定されない。目的タンパク質の種類として、例えば、酵素、抗体、リガンド、蛍光タンパク質などが挙げられる。酵素としては、例えば、セルロース分解酵素、デンプン分解酵素、グリコーゲン分解酵素、キシラン分解酵素、キチン分解酵素、脂質分解酵素などが挙げられ、より具体的には、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼ、アミラーゼ（例えば、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼ）、リパーゼなどが挙げられる。
目的タンパク質をコードするＤＮＡは、イントロンを除いたｃＤＮＡ配列が好ましい。
目的タンパク質をコードするＤＮＡは、その全長をコードする配列であってもよく、目的タンパク質の活性を示すものであれば目的タンパク質の一部領域をコードする配列であってもよい。また、上記のように、目的タンパク質の活性を示す限り、天然型タンパク質をコードする塩基配列において、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異を含む塩基配列であってもよく、あるいは１または２以上（例えば数個）アミノ酸が欠失、付加または置換などの変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列であってもよい。目的タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列およびコードするタンパク質のアミノ酸配列に関して、上記で説明した配列の同一性およびハイブリダイズ条件等が適用される。
目的タンパク質をコードするＤＮＡ（遺伝子）は、そのタンパク質を有するまたは産生する微生物から抽出したＤＮＡ、各種ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーに由来する核酸を鋳型として、既知の配列情報に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲによって核酸断片として取得し得る。このようなポリヌクレオチドは、既知の配列情報に基づいて設計したプローブを用いて、上記ライブラリー由来の核酸に対してハイブリダイゼーションを行うことによって、ＤＮＡ断片として取得し得る。また、目的タンパク質をコードするＤＮＡを含む既存のベクターから、ＤＮＡ断片（発現カセットの形態であってもよい）として切り出して利用することもできる。このような遺伝子は、必要に応じて宿主のコドン頻度を考慮して最適化した配列に基づいて、人工的に合成して得ることもできる。
目的タンパク質の一例として、以下、セルロース分解酵素を例に挙げて説明する。
セルロース分解酵素は、β１，４−グリコシド結合を切断し得る任意の酵素をいう。セルロース分解酵素は、任意のセルロース加水分解酵素生産菌に由来し得る。セルロース加水分解酵素生産菌としては、代表的には、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、およびアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)）、クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)、セルロモナス属（例えば、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)およびセルロモナス・ウダ(Cellulomonas uda)）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescence)）などに属する微生物が挙げられる。
以下、代表的なセルロース分解酵素として、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼについて説明するが、セルロース分解酵素はこれらに限定されない。
エンドグルカナーゼは、通常、セルラーゼとも称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖を生じる（「セルロース分子内切断」）。エンドグルカナーゼには５種類あり、それぞれエンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩＩＩ、エンドグルカナーゼＩＶ、およびエンドグルカナーゼＶと称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異であるが、セルロース分子内切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、エンドグルカナーゼＩＩ：ＥＧＩＩ）が用いられ得るが、これに限定されない。
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離する（「セルロース分子末端切断」）。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼＩおよびセロビオヒドロラーゼＩＩと称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異であるが、セルロース分子末端切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、セロビオヒドロラーゼＩＩ：ＣＢＨＩＩ）が用いられ得るが、これに限定されない。
β−グルコシダーゼは、セルロースの非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である（「グルコース単位切断」）。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グリコシド結合を切断し得、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成し得る。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の代表例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１と称される。例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ（特に、β−グルコシダーゼ１：ＢＧＬ１）が用いられ得るが、これに限定されない。
セルロースの良好な加水分解のために、セルロース加水分解様式の異なる酵素を組み合わせてもよい。セルロース分子内切断、セルロース分子末端切断、およびグルコース単位切断などの種々の異なるセルロース加水分解様式で作用する酵素が適宜、組み合わされ得る。それぞれの加水分解様式を有する酵素の例として、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるがこれらに限定されない。セルロース加水分解様式の異なる酵素の組合せは、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択され得る。セルロースの構成糖であるグルコースを最終的に生産できることが望ましいので、グルコースを生成し得る酵素を少なくとも１つ含むことが好ましい。グルコースを生成し得る酵素としては、グルコース単位切断酵素（例えば、β−グルコシダーゼ）に加え、エンドグルカナーゼもグルコースを生成し得る。例えば、酵母において、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、およびセロビオヒドロラーゼを分泌または表層提示させ得る。
（１．４ プロモーター）
プロモーターは、プロモーター活性を有するＤＮＡであり、「プロモーター活性」とは、プロモーター領域に転写因子が結合し、転写を惹起する活性をいう。プロモーターは、例えば、所望のプロモーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位またはクローニングベクターとの重複部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のプロモーター領域を増幅することによりプロモーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているプロモーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のプロモーターを化学合成してもよい。目的の機能を果たすものであれば、プロモーターは、上記のように、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異された塩基配列を有するものであってもよい。このプロモーターを構成する塩基配列には、上記で説明した配列の同一性およびハイブリダイズ条件等が適用される。
プロモーターは、プロモーター活性を有するＤＮＡであり、「プロモーター活性」とは、プロモーター領域に転写因子が結合し、転写を惹起する活性をいう。プロモーターは、例えば、所望のプロモーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位またはクローニングベクターとの重複部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のプロモーター領域を増幅することによりプロモーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているプロモーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のプロモーターを化学合成してもよい。目的の機能を果たすものであれば、プロモーターは、上記のように、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異された塩基配列を有するものであってもよい。このプロモーターを構成する塩基配列には、上記で説明した配列の同一性およびハイブリダイズ条件等が適用される。
プロモーターは、酵母においてプロモーター活性を有する限り、任意のプロモーターであり得る。プロモーターは、発現を目的とする遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものを利用してもよい。また、アンカードメインとして用いられる細胞表層局在タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターであってもよい。例えば、ＳＥＤ１プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＣＷＰ２プロモーター、およびＴＤＨ１プロモーターが挙げられる。
ＳＥＤ１プロモーターは、ＳＥＤ１（上述）の遺伝子（Ｓｅｄ１）のプロモーターであり、その塩基配列を配列番号４６に示す。ＳＥＤ１プロモーターは、ＳＥＤ１の遺伝子Ｓｅｄ１のコーディング領域をアンカードメインとしてコードするＤＮＡと併用されることが好ましい。さらに、ＳＥＤ１分泌シグナル配列と併用することもできる。
（１．５ ターミネーター）
ターミネーターは、ターミネーター活性を有するＤＮＡであり、「ターミネーター活性」とは、ターミネーター領域において転写を終結させる活性をいう。ターミネーターは、例えば、所望のターミネーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位またはクローニングベクターの挿入部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のターミネーター領域を増幅することによりターミネーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているターミネーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のターミネーターを化学合成してもよい。目的の機能を果たすものであれば、ターミネーターは、上記のように、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異された塩基配列を有するものであってもよい。このターミネーターを構成する塩基配列には、上記で説明した配列の同一性およびハイブリダイズ条件等が適用される。
ターミネーターは、ターミネーター活性を有するＤＮＡであり、「ターミネーター活性」とは、ターミネーター領域において転写を終結させる活性をいう。ターミネーターは、例えば、所望のターミネーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位またはクローニングベクターの挿入部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のターミネーター領域を増幅することによりターミネーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているターミネーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のターミネーターを化学合成してもよい。目的の機能を果たすものであれば、ターミネーターは、上記のように、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異された塩基配列を有するものであってもよい。このターミネーターを構成する塩基配列には、上記で説明した配列の同一性およびハイブリダイズ条件等が適用される。
ターミネーターとしては、例えば、α−アグルチニンターミネーター、ＡＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）ターミネーター、ＴＤＨ３（グリセルアルデヒド−３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）ターミネーター、ＤＩＴ１ターミネーターなどが挙げられる。
（１．６ 発現カセットおよび発現ベクターの構築）
本発明中において、「発現カセット」とは、目的タンパク質が発現し得るように、該目的タンパク質をコードするＤＮＡと、その発現を調節するための種々の調節エレメントとが、宿主の微生物または細胞中で機能し得る状態で連結されているＤＮＡまたはポリヌクレオチドをいう。ここで「機能し得る状態で連結されている」とは、目的タンパク質をコードするＤＮＡが、プロモーターの制御下で、そして場合により他の調節エレメントの制御下で、発現されるように、発現カセットまたは発現ベクターに含まれる各構成要素が連結されていることを意味する。各構成要素は、目的タンパク質が発現し得る限りにおいて、それらの要素間にリンカーなどの配列をさらに含んで連結されていてもよい。
本発明中において、「発現カセット」とは、目的タンパク質が発現し得るように、該目的タンパク質をコードするＤＮＡと、その発現を調節するための種々の調節エレメントとが、宿主の微生物または細胞中で機能し得る状態で連結されているＤＮＡまたはポリヌクレオチドをいう。ここで「機能し得る状態で連結されている」とは、目的タンパク質をコードするＤＮＡが、プロモーターの制御下で、そして場合により他の調節エレメントの制御下で、発現されるように、発現カセットまたは発現ベクターに含まれる各構成要素が連結されていることを意味する。各構成要素は、目的タンパク質が発現し得る限りにおいて、それらの要素間にリンカーなどの配列をさらに含んで連結されていてもよい。
細胞表層提示技術に用いられる発現カセット（「表層提示用カセット」ともいう）では、分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードするＤＮＡ、およびアンカードメインをコードするＤＮＡが、宿主微生物または宿主細胞中で機能し得る状態で連結され得る。分泌シグナル配列は、目的タンパク質をコードするＤＮＡの上流に位置する。目的タンパク質をコードするＤＮＡとアンカードメインをコードするＤＮＡとの配置は、アンカードメインの種類に応じて、発現されるタンパク質が、アンカードメインのＮ末端またはＣ末端側に目的タンパク質を融合するように配置される。表層提示用カセットは、例えば、５’末端から３’末端に向かって、分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードするＤＮＡおよびアンカードメインをコードするＤＮＡを記載の順に含むか、あるいは分泌シグナル配列、アンカードメインをコードするＤＮＡおよび目的タンパク質をコードするＤＮＡを記載の順に含むように構築される。表層提示用カセットは、分泌シグナル配列の上流にプロモーターをさらに含む。また、表層提示用カセットは、目的タンパク質をコードするＤＮＡおよびアンカードメインをコードするＤＮＡの下流にターミネーターをさらに含む。
本明細書において「発現ベクター」とは、目的タンパク質をコードするＤＮＡの発現のためのユニット（発現カセット）が挿入されたベクターをいい、目的タンパク質をコードするＤＮＡが挿入されたものを含む。発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、あるいは人工染色体であってもよい。酵母を宿主とする場合、ベクターの調製が容易であり、また酵母細胞の形質転換が容易である点で、プラスミドの形態が好ましい。ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、酵母と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。必要に応じて、ベクターは、調節配列（オペレーター、エンハンサーなど）を含み得る。このようなベクターは、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（以下に説明）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有する。
酵母選択マーカーとしては、公知の任意のマーカーが利用され得る。例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ−イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、Ｏ−アセチルホモセリンＯ−アセチルセリンスルフィドリラーゼ（ＭＥＴ１５）をコードする遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝子、およびアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする遺伝子など）が挙げられる。例えば、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＭＥＴ１５欠損マーカーなど）が好ましく用いられ得る。
各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る方法で行われ得る。各構成要素の結合については、例えば、ＰＣＲ法により適当な制限酵素の認識配列を付与された各構成要素のＤＮＡをその制限酵素で切断し、リガーゼなどを用いて連結すること、One-step isothermal assembly（Nature Methods，2009，6:343-345）を用いて行うこと、あるいはIn-Fusion法（Biotechniques，2007，43:354-359）を用いて行うことができる。
目的タンパク質（例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼなどの酵素、蛍光タンパク質、または各種抗体）をコードする領域（構造遺伝子）、およびプロモーターおよびターミネーターなどの発現調節配列を含むプラスミドから、適宜、ベクターの調製に適した形態で切り出して、インサートを調製することによって利用することもできる。
（２．形質転換酵母の調製）
本発明の形質転換酵母は、上記１で説明した細胞表層提示方法を宿主酵母に適用することにより作製される。本発明の形質転換酵母は、目的のタンパク質を細胞表層にて発現して、その細胞表層に提示するため、「細胞表層発現酵母」または「細胞表層提示酵母」とも称することができる。
本発明の形質転換酵母は、上記１で説明した細胞表層提示方法を宿主酵母に適用することにより作製される。本発明の形質転換酵母は、目的のタンパク質を細胞表層にて発現して、その細胞表層に提示するため、「細胞表層発現酵母」または「細胞表層提示酵母」とも称することができる。
「宿主酵母」は、子のう菌酵母（Ascomycetous yeast）に属するものであればよく、特に限定されない。例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）、カンジダ属（Candida）、ピキア属（Pichia）、スキゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、ハンセヌラ属（Hancenula）、クロッケラ属（Kloeckera）、シュワニオマイセス属（Schwanniomyces）、コマガタエラ属（Komagataella）およびヤロウィア属（Yarrowia）などの酵母が挙げられる。
本発明においては、「宿主酵母」は、所定の細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母である。この所定の細胞壁関連遺伝子とは、ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子、およびそれらに相当する遺伝子、ならびにそれらの組み合わせである。
本発明の形質転換酵母の製造方法は、上記所定の細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母において、この宿主酵母が保有する細胞壁関連遺伝子の少なくとも１つの遺伝子の機能を欠失させる工程、および上記１で説明したようなポリヌクレオチドを宿主酵母に導入する工程を含む。ポリヌクレオチドは、発現カセットの形態であっても発現ベクターの形態であってもよい。遺伝子の機能を欠失させる工程と、ポリヌクレオチドを導入する工程とは、いずれの工程を先に行ってもよい。特に、細胞表層発現するタンパク質を用途に応じて切り替えるのが容易になるという理由から、遺伝子の機能を欠失させる工程を先に行うことが好ましい。
ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子はサッカロマイセス属の酵母の細胞壁関連遺伝子として知られている。これらの遺伝子の配列情報は、Saccharomyces genome database（ＳＧＤ）により入手可能である。ＣＣＷ１２遺伝子は、ＹＬＲ１１０Ｃとも称され、ＳＧＤ ＩＤは、ＳＧＤ：Ｓ０００００４１００である。この遺伝子のタンパク質コーディング領域の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。ＣＣＷ１４遺伝子は、ＹＬＲ３９０Ｗ−Ａとも称され、ＳＧＤ ＩＤは、ＳＧＤ：Ｓ０００００６４２９である。この遺伝子のタンパク質コーディング領域の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および４に示す。ＤＡＮ１遺伝子は、ＹＪＲ１５０Ｃとも称され、ＳＧＤ ＩＤは、ＳＧＤ：Ｓ０００００３９１１である。この遺伝子のタンパク質コーディング領域の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。ＴＩＰ１遺伝子は、ＹＢＲ０６７Ｃとも称され、ＳＧＤ ＩＤは、ＳＧＤ：Ｓ００００００２７１である。この遺伝子のタンパク質コーディング領域の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７および８に示す。ＣＷＰ１遺伝子は、ＹＫＬ０９６Ｗとも称され、ＳＧＤ ＩＤは、ＳＧＤ：Ｓ０００００１５７９である。この遺伝子のタンパク質コーディング領域の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９および１０に示す。
「相当する遺伝子」とは、酵母の細胞壁の構築に影響を及ぼし得る遺伝子であって、ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、またはＣＷＰ１遺伝子と機能的に等価な遺伝子（例えば、異なる名称が付された遺伝子）をいい、これらも本発明における「細胞壁関連遺伝子」として包含される。このような「相当する遺伝子」としては、例えば、サッカロマイセス属以外の酵母における機能的に等価な遺伝子が挙げられる。このような機能的に等価な遺伝子は、例えば、上記各遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列と上記の配列同一性、例えば、７４％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列であるタンパク質をコードする遺伝子であり得る。
１つの実施形態では、本発明の形質転換酵母は、宿主酵母におけるこれらの遺伝子のうち、ＣＣＷ１２遺伝子およびＣＣＷ１４遺伝子の少なくとも１つ（または相当する遺伝子）の機能を欠損している。ＣＣＷ１２遺伝子およびＣＣＷ１４遺伝子の両方の機能を欠損していてもよい。別の実施形態では、本発明の形質転換酵母は、宿主酵母における、ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子の全て（または相当する遺伝子）の機能を欠損している。
さらに、宿主酵母は、上記の遺伝子の機能の欠損に加えて、ＳＥＤ１遺伝子（または相当する遺伝子）の機能を欠損していてもよい。ＳＥＤ１遺伝子（Ｓｅｄ１）は、上述の通り、酵母サッカロマイセス・セレビシエの定常期における主要な細胞表層局在タンパク質である。この遺伝子は、ＹＤＲ０７７Ｗとも称され、ＳＧＤ ＩＤは、ＳＧＤ：Ｓ０００００２４８４である。ＳＥＤ１の遺伝子のタンパク質コーディング領域の塩基配列およびコードされたタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１および配列番号１２に示す。「相当する遺伝子」は、上記と同様に、機能的に等価である遺伝子をいい、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列と上記の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
宿主酵母におけるこのような遺伝子の「機能の欠損」は、後述する人為的な操作を通じて対象となる遺伝子の機能が失われることを意味し、宿主酵母に、対象となる遺伝子自体が元々含まれていない場合は除外される。当該遺伝子の機能の欠損は、例えば、宿主酵母におけるこれらの遺伝子の破壊または発現を抑制することによって行われ得る。このような「欠損」の実施形態としては、タンパク質の発現抑制、正常タンパク質の生産量の抑制、および機能しない変異体タンパク質の生産もしくは促進などが挙げられる。そのための遺伝子操作としては、トランスジェニック、遺伝子ノックアウト、ノックインなどが挙げられる。例えば、宿主細胞への遺伝子ノックアウトにより、当該宿主細胞からその遺伝子を完全に欠失させてしまってもよい。遺伝子ノックアウトの方法として、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを用いることができる。
このような欠損酵母は、公知の遺伝子配列情報に基づいて適宜プライマー等を作製し、上記遺伝子操作を行うことによって作製してもよく、市販の欠損株（ノックアウト株）を利用してもよい。市販の欠損株としては、例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）のYeast Knockout Collection（Open Biosystems社、Thermo Fisher Scientific社などより入手）などが挙げられる。
ポリヌクレオチドの宿主酵母への「導入」とは、ポリヌクレオチドまたは発現カセットまたは発現ベクター中の発現を目的とする遺伝子（目的タンパク質をコードするＤＮＡ）が宿主細胞に導入されるだけでなく、宿主細胞で発現されることも含む。導入方法は特に限定されず、公知の方法を採用できる。代表的には、上記説明した本発明の発現ベクターを用いて酵母を形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。導入された遺伝子は、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。
ポリヌクレオチドが導入された酵母は、常法に従い、酵母選択マーカーによる形質または目的タンパク質の活性などを指標として選択することができる。
また、得られた酵母の細胞表層に目的タンパク質が固定（細胞表層提示）されていることは、常法により確認することができる。例えば、被験酵母に、このタンパク質に対する抗体と、ＦＩＴＣのような蛍光標識２次抗体またはアルカリフォスファターゼのような酵素標識２次抗体などとを作用させる方法、このタンパク質に対する抗体とビオチン標識２次抗体とを反応させた後さらに蛍光標識ストレプトアビジンを作用させる方法などが挙げられる。
複数種のタンパク質を細胞表層提示発現するように、酵母を形質転換することもできる。この場合、複数種のタンパク質のそれぞれをコードする配列の遺伝子発現カセットを含むそれぞれの発現ベクターを構築してもよく、複数の遺伝子発現カセットを１つの発現ベクターに入れることもできる。
本発明の形質転換酵母は、一般的に酵母に適用可能な培養条件下で培養し得る。形質転換酵母の培養は、当業者に周知の方法により適宜実施できる。培地組成、培養ｐＨおよび培養温度は、その酵母の性質および目的タンパク質に応じて、適宜設定し得る。培養の際の菌体密度および培養時間もまた、その酵母の性質および目的タンパク質に応じて適宜設定し得る。
本発明の形質転換酵母は、目的タンパク質に応じて、種々の用途に用いられる。例えば、目的タンパク質が酵素である実施形態では、本発明の形質転換酵母（酵素表層提示酵母）を含む酵素剤がさらに提供される。このような酵素剤は、例えば、酵素表層提示酵母および当該表層提示酵母を維持し得る培地を含む懸濁液、または凍結乾燥した酵素表層提示酵母の形態が挙げられる。このような酵素剤は、生体触媒として用いることができる。「生体触媒」は、酵素表層提示酵母の細胞表層に提示された酵素の活性を利用する用途で用いられるもの、ならびに酵素表層提示酵母の細胞表層に提示された酵素の活性と当該酵母自体の発酵能との両方を利用する用途で用いられるものの両方を包含する。酵素剤が、例えば、セルロース分解酵素、デンプン分解酵素などを細胞表層発現する酵母を含む場合、その酵素剤は、表層提示された酵素が基質とする多糖の分解（糖化）と酵母の発酵との両方の反応を触媒することができる。例えば、セルロース分解酵素を細胞表層発現する酵母を含む酵素剤は、例えば、バイオマスを用いたエタノール製造のために用いることができる。さらに、例えば、リパーゼを細胞表層発現する酵母は、生体触媒として、バイオディーゼルの製造に用いることができる。例えば、抗体またはリガンドを細胞表層発現する酵母は、抗体またはリガンドのライブラリーとして利用し得る。
（３．エタノールの製造方法）
本発明によるセルロース分解酵素を細胞表層発現する酵母は、例えばエタノールの製造に用いられ得る。このような酵母は、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を細胞表層提示する酵母（本明細書中、「セルラーゼ細胞表層提示酵母」ともいう）である。あるいは、このような酵母は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択される２種の酵素；またはエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼを細胞表層提示する酵母であってもよい。
本発明によるセルロース分解酵素を細胞表層発現する酵母は、例えばエタノールの製造に用いられ得る。このような酵母は、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を細胞表層提示する酵母（本明細書中、「セルラーゼ細胞表層提示酵母」ともいう）である。あるいは、このような酵母は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択される２種の酵素；またはエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼを細胞表層提示する酵母であってもよい。
セルラーゼ細胞表層提示酵母は、β-１，４結合したグルコース多糖を発酵基質として利用し得る。β-１，４結合したグルコース多糖では、多糖を構成する１つのβ−グルコースの１位と別のβ−グルコースの４位との間でグリコシド結合（β-１，４グリコシド結合）が形成されている。β-１，４結合したグルコース多糖としては、セルロースおよびその糖化物（例えば、セロビオース、セロオリゴ糖）が挙げられる。β-１，４結合したグルコース多糖について、それらの入手源または材料として、例えば、バイオマスが挙げられる。バイオマスとは、枯渇性資源ではない、現生生物体構成物質起源の産業資源をいう。すなわち、バイオマスとは、再生可能な、生物由来の有機性資源から化石資源を除いたものをいう。バイオマスは、セルロースを含み得る。バイオマスとしては、特に限定されず、例えば、資源作物またはその廃棄物が挙げられる。資源作物としては、特に限定されず、例えば、トウモロコシ、サトウキビが挙げられ、さらに資源作物の廃棄物の例としては、これらの処理工程で発生する廃棄物が挙げられる。リグノセルロース系バイオマスは、食糧と競合しない点で好ましい材料である。リグノセルロース系バイオマスとしては、特に限定されず、例えば、イネ、ムギ、ススキ、ヨシなどのイネ科植物の食糧となる部位を除く部位（例えば、籾殻、根、茎、葉）、およびこれらの部位でなる製品から生じた廃棄物が挙げられる。
必要に応じて、発酵基質材料（例えば、バイオマス）を、発酵に供する前に前処理してもよい。このような前処理は、「糖化」により、バイオマス中の多糖類（例えば、セルロース）をオリゴ糖または単糖に分解し得る。前処理方法としては、特に限定されないが、例えば、酵素法、希硫酸法、水熱分解法が挙げられる。コストの点で、希硫酸法、水熱分解法が好ましい。希硫酸法では、例えば、１％（v/v）〜５％（v/v）の希硫酸で材料を１８０℃〜２００℃にて５分〜１時間程度処理する。水熱分解法では、例えば、１３０℃〜３００℃にて１０ＭＰａ程度の水で材料を処理する。
セルラーゼ細胞表層提示酵母は、発酵に供する前に好気的条件下で培養することにより、その菌体量を増加させ得る。形質転換酵母の培養は、当業者に周知の方法により適宜実施できる。培地のｐＨは、例えば４〜６、好ましくは５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、例えば０．５ｐｐｍ〜６ｐｐｍ、好ましくは１ｐｐｍ〜４ｐｐｍ、より好ましくは２ｐｐｍである。培養温度は、例えば２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３５℃、より好ましくは３０℃である。酵母菌体量が例えば１０ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、好ましくは１２．５ｇ（湿潤量）／Ｌ、より好ましくは１５ｇ（湿潤量）／Ｌ以上になるまで培養することが好ましく、培養時間は例えば２４時間〜９６時間程度である。
発酵培養では、酵母に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養のために、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下、および好気条件などから適宜選択することができる。培養温度は、例えば２５℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃である。培養時間は、必要に応じて任意の時間が設定され得、例えば２４時間〜１２０時間などの範囲内の培養時間に設定することができる。ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。発酵培地には、発酵基質に加えて、酵母の培養のために添加され得る培地成分を必要に応じてさらに含めることもできる。
エタノール発酵終了後、培養液（発酵液）からエタノール含有画分を回収する工程、さらにこれを精製または濃縮する工程を実施することもできる。これらの工程およびそれらに要する手段は、当業者によって適宜選択される。
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
本実施例で用いた酵母サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株およびＢＹ４７４１ｓｅｄ１Δ株は、Thermo Fisher Scientific社より入手した。
本実施例に示す全てのＰＣＲ法には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を用いて実施した。
本実施例に示す全ての酵母への遺伝子導入は、酢酸リチウム法によって実施した。
（調製例１：Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ発現カセットを含有するベクタープラスミドの調製）
下記発現カセットＸ１を含むプラスミドを調製した：
Ｘ１：ＴＥＦ１プロモーター＋Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ＋ＣＹＣ１ターミネーター
下記発現カセットＸ１を含むプラスミドを調製した：
Ｘ１：ＴＥＦ１プロモーター＋Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ＋ＣＹＣ１ターミネーター
上記発現カセットに含まれる各構成要素の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下に示されるとおりである：
配列番号１３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＥＦ１のプロモーターの塩基配列
配列番号１４：ストレプトコッカス・パイロジェネス由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列（両端にシミアンウイルス４０由来の核移行シグナル（SV40 NLS）配列を含む）
配列番号１５：ストレプトコッカス・パイロジェネス由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（両端にシミアンウイルス４０由来の核移行シグナル（SV40 NLS）配列を含む）
配列番号１６：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＣＹＣ１のターミネーターの塩基配列
配列番号１３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＴＥＦ１のプロモーターの塩基配列
配列番号１４：ストレプトコッカス・パイロジェネス由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列（両端にシミアンウイルス４０由来の核移行シグナル（SV40 NLS）配列を含む）
配列番号１５：ストレプトコッカス・パイロジェネス由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列（両端にシミアンウイルス４０由来の核移行シグナル（SV40 NLS）配列を含む）
配列番号１６：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＣＹＣ１のターミネーターの塩基配列
以下、本実施例で用いるＣａｓ９発現カセットを含有するプラスミドの調製手順について説明する。
サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子ＴＥＦ１について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対TEF1pCas9-F（配列番号１７）およびTEF1pCas9-R（配列番号１８）を用いて増幅し、ＴＥＦ１プロモーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。同様に、サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子ＣＹＣ１について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対CYC1tCas9-F（配列番号１９）およびDIT1t-NcoI-R（配列番号２０）を用いて増幅し、ＣＹＣ１遺伝子のコーディング領域下流のターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。さらに、ＰＣＲ法により、プラスミドCas9_Base（SCIENTIFIC REPORTS, 7: 8993, DOI:10.1038/s41598-017-08356-5）を鋳型とし、プライマー対Cas9-F（配列番号２１）およびCas9-R（配列番号２２）を用いて増幅し、ストレプトコッカス・パイロジェネス由来Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片を、ＴＥＦ１プロモーター領域、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子コーディング領域、ＣＹＣ１ターミネーター領域の順番になるようにOverlap extension PCR法により連結し、発現カセットＸ１を含むＤＮＡ断片を調製した。最後に、このＤＮＡ断片をXhoIおよびNotI-HFで処理したプラスミドpGK415（栄養要求性マーカー遺伝子ＬＥＵ２を有する低コピープラスミドベクター：J. Biochem. 2009;145(6)701-708）にIn-Fusion法により連結し、得られたプラスミドをpCL-Cas9と命名した。
（調製例２：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現カセットを含有するベクタープラスミドの調製）
下記発現カセットＸ２〜Ｘ６をそれぞれ、または複数含むプラスミドを調製した：
Ｘ２：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＣＣＷ１２用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
Ｘ３：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＣＣＷ１４用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
Ｘ４：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＤＡＮ１用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
Ｘ５：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＴＩＰ１用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
Ｘ６：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＣＷＰ１用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
下記発現カセットＸ２〜Ｘ６をそれぞれ、または複数含むプラスミドを調製した：
Ｘ２：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＣＣＷ１２用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
Ｘ３：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＣＣＷ１４用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
Ｘ４：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＤＡＮ１用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
Ｘ５：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＴＩＰ１用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
Ｘ６：ＳＮＲ５２プロモーター＋ＣＷＰ１用ｇＲＮＡ＋ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ＋ＳＵＰ４ターミネーター
上記発現カセットに含まれる各構成要素の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下に示されるとおりである：
配列番号２３：サッカロマイセス・セレビシエ由来の核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）遺伝子ＳＮＲ５２のプロモーターの塩基配列
配列番号２４：ＣＣＷ１２用ｇＲＮＡの塩基配列
配列番号２５：ＣＣＷ１４用ｇＲＮＡの塩基配列
配列番号２６：ＤＡＮ１用ｇＲＮＡの塩基配列
配列番号２７：ＴＩＰ１用ｇＲＮＡの塩基配列
配列番号２８：ＣＷＰ１用ｇＲＮＡ
配列番号２９：ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄの塩基配列
配列番号３０：サッカロマイセス・セレビシエ由来のｔＲＮＡ遺伝子ＳＵＰ４のターミネーターの塩基配列
配列番号２３：サッカロマイセス・セレビシエ由来の核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）遺伝子ＳＮＲ５２のプロモーターの塩基配列
配列番号２４：ＣＣＷ１２用ｇＲＮＡの塩基配列
配列番号２５：ＣＣＷ１４用ｇＲＮＡの塩基配列
配列番号２６：ＤＡＮ１用ｇＲＮＡの塩基配列
配列番号２７：ＴＩＰ１用ｇＲＮＡの塩基配列
配列番号２８：ＣＷＰ１用ｇＲＮＡ
配列番号２９：ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄの塩基配列
配列番号３０：サッカロマイセス・セレビシエ由来のｔＲＮＡ遺伝子ＳＵＰ４のターミネーターの塩基配列
以下、本実施例で用いるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）発現カセットを含有する各種プラスミドの調製手順について説明する。
ＰＣＲ法により、プラスミドpGK426（栄養要求性マーカー遺伝子ＵＲＡ３を有する高コピープラスミドベクター：J. Biochem. 2009;145(6)701-708）を鋳型とし、プライマー対Guide-F1（配列番号３１）およびGuide-R1（配列番号３２）を用いて増幅し、得られたＤＮＡ断片をIn-Fusion法により環状化した。さらに、ＰＣＲ法により、この環状ＤＮＡを鋳型とし、プライマー対Guide-F2（配列番号３３）およびGuide-R2（配列番号３４）を用いて増幅することで、ｇＲＮＡｓｃａｆｏｌｄ配列およびサッカロマイセス・セレビシエ由来のｔＲＮＡ遺伝子ＳＵＰ４のコーディング領域下流のターミネーター領域を含むベクターＤＮＡ断片を調製した。続いて、サッカロマイセス・セレビシエ由来の核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）遺伝子ＳＮＲ５２について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対SNR52p-F（配列番号３５）およびSNR52p-R（配列番号３６）を用いて増幅し、ＳＮＲ５２プロモーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。さらに、このＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマー対SNR52p-F（配列番号３５）およびSNR52p-R-CCW12（配列番号３７）、SNR52p-R-CCW14（配列番号３８）SNR52p-R-DAN1（配列番号３９）、SNR52p-R-TIP1（配列番号４０）、またはSNR52p-R-CWP1（配列番号４１）を用いて増幅することで、ＳＮＲ５２プロモーター領域の下流にＣＣＷ１２用ｇＲＮＡ、ＣＣＷ１４用ｇＲＮＡ、ＤＡＮ１用ｇＲＮＡ、ＴＩＰ１用ｇＲＮＡ、またはＣＷＰ１用ｇＲＮＡが連結されたＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。これらのＤＮＡ断片をそれぞれ上記のベクターＤＮＡ断片にIn-Fusion法により連結し、得られた発現カセットＸ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、またはＸ６を含むプラスミドをそれぞれp2gRNA-CCW12、p2gRNA-CCW14、p2gRNA-DAN1、p2gRNA-TIP1、およびp2gRNA-CWP1と命名した。
ＰＣＲ法により、プラスミドp2gRNA-CCW14を鋳型とし、プライマー対gRNA-F（配列番号４２）およびgRNA-R（配列番号４３）を用いて増幅し、発現カセットＸ３を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ＳｍａＩで処理したプラスミドp2gRNA-CCW12にIn-Fusion法により連結し、得られた発現カセットＸ２およびＸ３を含むプラスミドをp2gRNA-CCW12/CCW14と命名した。
ＰＣＲ法により、プラスミドp2gRNA-CWP1を鋳型とし、プライマー対gRNA-F（配列番号４２）およびgRNA-R（配列番号４３）を用いて増幅し、発現カセットＸ６を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ＳｍａＩで処理したプラスミドp2gRNA-TIP1にIn-Fusion法により連結し、得られた発現カセットＸ５およびＸ６を含むプラスミドをp2gRNA-TIP1/CWP1と命名した。
ＰＣＲ法により、プラスミドp2gRNA-DAN1を鋳型とし、プライマー対gRNA-F（配列番号４２）およびgRNA-R（配列番号４３）を用いて増幅し、発現カセットＸ４を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ＳｍａＩで処理したプラスミドp2gRNA-CCW12/CCW14にIn-Fusion法により連結し、得られた発現カセットＸ２、Ｘ３、およびＸ４を含むプラスミドをp2gRNA-CCW12/CCW14/DAN1と命名した。
ＰＣＲ法により、プラスミドp2gRNA-DAN1を鋳型とし、プライマー対gRNA-F（配列番号４２）およびgRNA-R（配列番号４３）を用いて増幅し、発現カセットＸ４を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ＳｍａＩで処理したプラスミドp2gRNA-TIP1/CWP1にIn-Fusion法により連結し、得られた発現カセットＸ４、Ｘ５、およびＸ６を含むプラスミドをp2gRNA-TIP1/CWP1/DAN1と命名した。
（調製例３：細胞表層発現カセットを含有するベクタープラスミドの調製）
下記発現カセットＸ７およびＸ８をそれぞれ含むプラスミドを調製した：
Ｘ７：ＳＥＤ１プロモーター＋ＳＥＤ１分泌シグナル＋ＢＧＬ１＋ＳＥＤ１アンカードメイン＋ＤＩＴ１ターミネーター
Ｘ８：ＳＥＤ１プロモーター＋ＳＥＤ１分泌シグナル＋ＥＧＩＩ＋ＳＥＤ１アンカードメイン＋ＤＩＴ１ターミネーター
下記発現カセットＸ７およびＸ８をそれぞれ含むプラスミドを調製した：
Ｘ７：ＳＥＤ１プロモーター＋ＳＥＤ１分泌シグナル＋ＢＧＬ１＋ＳＥＤ１アンカードメイン＋ＤＩＴ１ターミネーター
Ｘ８：ＳＥＤ１プロモーター＋ＳＥＤ１分泌シグナル＋ＥＧＩＩ＋ＳＥＤ１アンカードメイン＋ＤＩＴ１ターミネーター
上記発現カセットに含まれる各構成要素の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下に示されるとおりである：
配列番号４４：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号４５：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号４６：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１のプロモーターの塩基配列
配列番号４７：本発明の実施例においてＳＥＤ１アンカードメインとして用いた、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１アンカータンパク質のコーディング領域から開始コドンを除いた領域のＤＮＡの塩基配列
配列番号４８：本発明の実施例においてＳＥＤ１アンカードメインとして用いた、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１アンカータンパク質（但し開始メチオニンを含まない）のアミノ酸配列
配列番号４９：アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号５０：アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）のアミノ酸配列
配列番号５１：トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号５２：トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）のアミノ酸
配列番号５３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＤＩＴ１のターミネーターの塩基配列
配列番号４４：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号４５：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号４６：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１のプロモーターの塩基配列
配列番号４７：本発明の実施例においてＳＥＤ１アンカードメインとして用いた、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１アンカータンパク質のコーディング領域から開始コドンを除いた領域のＤＮＡの塩基配列
配列番号４８：本発明の実施例においてＳＥＤ１アンカードメインとして用いた、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＳＥＤ１アンカータンパク質（但し開始メチオニンを含まない）のアミノ酸配列
配列番号４９：アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号５０：アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）のアミノ酸配列
配列番号５１：トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号５２：トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）のアミノ酸
配列番号５３：サッカロマイセス・セレビシエ由来のＤＩＴ１のターミネーターの塩基配列
以下、本実施例で用いる細胞表層発現カセットを含有するプラスミドの調製手順について説明する。
サッカロマイセス・セレビシエ由来の遺伝子ＤＩＴ１について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノム（Biotechniques.2011, 50(5):325-328に記載の方法により調製した）を鋳型とし、プライマー対DIT1t-BsrGI-F（配列番号５４）およびDIT1t-NcoI-R（配列番号５５）を用いて増幅し、ＤＩＴ１遺伝子のコーディング領域下流のターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。他方で、ベクタープラスミドpIEG-SSS（栄養要求性マーカー遺伝子ＨＩＳ３、およびＥＧ発現カセット（すなわち、ＳＥＤ１プロモーター、ＳＥＤ１の分泌シグナルペプチド配列、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（「ＥＧＩＩ」）遺伝子のコーディング領域、ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域、およびα−アグルチニン遺伝子のコーディング領域下流４４５ｂｐのターミネーター領域がこの順に配置されているカセットを有する表層発現用ベクター： Biotechnology and Bioengineering, Vol.113, No.11, 2016, 2358-2366）を鋳型とし、プライマー対pRS403-NcoI-F（配列番号５６）およびSED1a-BsrGI-R（配列番号５７）を用いて増幅することにより、このプラスミドのα−アグルチニン遺伝子のターミネーター領域を除いた全長を含むＤＮＡ断片を調製した。これらの断片をそれぞれＢｓｒＧＩおよびＮｃｏＩで処理し、ライゲーション法により連結した。得られた発現カセットＸ８を含むプラスミドをpIEG-SSSDと命名した。
プラスミドpIBG-SSS（栄養要求性マーカー遺伝子ＨＩＳ３、およびＢＧＬ発現カセット（すなわち、ＳＥＤ１プロモーター、ＳＥＤ１の分泌シグナルペプチド配列、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ１（「ＢＧＬ１」）遺伝子のコーディング領域、ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域、およびα−アグルチニン遺伝子のコーディング領域下流４４５ｂｐのターミネーター領域がこの順に配置されているカセットを有する表層発現用ベクター：Biotechnology and Bioengineering, Vol.113, No.11, 2016, 2358-2366）をＮｄｅＩおよびＢｓｒＧＩで処理し、栄養要求性マーカー遺伝子ＨＩＳ３の一部、ＳＥＤ１プロモーター、ＳＥＤ１の分泌シグナルペプチド配列、ＢＧＬ遺伝子のコーディング領域、およびＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を、同様にＮｄｅＩおよびＢｓｒＧＩで処理したプラスミドpIEG-SSSDにライゲーション法により連結した。得られた発現カセットＸ７を含むプラスミドをpIBG-SSSDと命名した。
（調製例４：遺伝子ノックアウト酵母の調製）
以下、本実施例で用いる遺伝子ノックアウト酵母のＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９システムを介した調製手順について説明する。
以下、本実施例で用いる遺伝子ノックアウト酵母のＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９システムを介した調製手順について説明する。
調製例１に記載のプラスミドpCL-Cas9を酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（ヒスチジン、メチオニン、およびウラシルを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9を保持する形質転換株を獲得した。次に、調製例２に記載のプラスミドp2gRNA-CCW12/CCW14/DAN1と、ＣＣＷ１２、ＣＣＷ１４、およびＤＡＮ１遺伝子のコーディング領域とそれぞれ相同性を有し、かつ特定のアミノ酸コドンが終止コドンに置き換えられた配列を持つ２本鎖のオリゴＤＮＡ（配列番号５８、５９、および６０）を混合して上記の形質転換株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（ヒスチジンおよびメチオニンを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9およびp2gRNA-CCW12/CCW14/DAN1を保持する形質転換株を獲得した。得られた形質転換株のうち、シーケンス解析によりゲノム上のＣＣＷ１２、ＣＣＷ１４、およびＤＡＮ１遺伝子の標的コドンがすべて終止コドンに置換されていることが確認できた株について、ＳＤ培地（ヒスチジン、メチオニン、およびウラシルを補充）にて数日間培養してプラスミドp2gRNA-CCW12/CCW14/DAN1を菌体から脱落させた。その後、ＳＤ培地（ヒスチジンおよびメチオニンを補充）において生育が見られないことが確認できた株を、ＣＣＷ１２、ＣＣＷ１４、およびＤＡＮ１遺伝子がノックアウトされた株として選択した。この株をBY-ccw12/ccw14/dan1株と称する。
調製例２に記載のプラスミドp2gRNA-TIP1/CWP1と、ＴＩＰ１およびＣＷＰ１遺伝子のコーディング領域とそれぞれ相同性を有し、かつ特定のアミノ酸コドンが終止コドンに置き換えられた配列を持つ２本鎖のオリゴＤＮＡ（配列番号６１および６２）を混合してBY-ccw12/ccw14/dan1株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（ヒスチジンおよびメチオニンを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9およびp2gRNA-TIP1/CWP1を保持する形質転換株を獲得した。得られた形質転換株のうち、シーケンス解析によりゲノム上のＴＩＰ１およびＣＷＰ１遺伝子の標的コドンがすべて終止コドンに置換されていることが確認できた株について、ＹＰＤ培地にて数日間培養してプラスミドpCL-Cas9およびp2gRNA-TIP1/CWP1を菌体から脱落させた。その後、ＳＤ培地（ヒスチジン、メチオニン、およびロイシンを補充）およびＳＤ培地（ヒスチジン、メチオニン、およびウラシルを補充）の両方において生育が見られないことが確認できた株を、ＣＣＷ１２、ＣＣＷ１４、ＤＡＮ１、ＴＩＰ１、およびＣＷＰ１遺伝子がノックアウトされた株として選択した。この株をGPImutant株と称する。
（調製例５：細胞表層発現酵母の調製）
以下、各種細胞表層発現酵母の調製手順について説明する。
以下、各種細胞表層発現酵母の調製手順について説明する。
（５−１：５遺伝子ノックアウト株を宿主とするβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）表層提示株）
調製例３に記載のプラスミドpIBG-SSSDをNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株およびGPImutant株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、およびウラシルを補充）にて選択を行うことで、形質転換株を獲得した。これらの形質転換株をそれぞれBY-BG-SSSD株（ＢＹ４７４１株を宿主とするＢＧＬ細胞表層提示株）およびGPIm-BGSD株（５遺伝子ノックアウト株を宿主とするＢＧＬ細胞表層提示株）と称する。
調製例３に記載のプラスミドpIBG-SSSDをNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株およびGPImutant株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、およびウラシルを補充）にて選択を行うことで、形質転換株を獲得した。これらの形質転換株をそれぞれBY-BG-SSSD株（ＢＹ４７４１株を宿主とするＢＧＬ細胞表層提示株）およびGPIm-BGSD株（５遺伝子ノックアウト株を宿主とするＢＧＬ細胞表層提示株）と称する。
（５−２：５遺伝子ノックアウト株を宿主とするエンドグルカナーゼ（ＥＧ）表層提示株）
調製例３に記載のプラスミドpIEG-SSSDをNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株およびGPImutant株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、およびウラシルを補充）にて選択を行うことで、形質転換株を獲得した。これらの形質転換株をそれぞれBY-EG-SSSD株（ＢＹ４７４１株を宿主とするＥＧ細胞表層提示形質転換株）およびGPIm-EGSD株（５遺伝子ノックアウト株を宿主とするＥＧ細胞表層提示形質転換株）と称する。
調製例３に記載のプラスミドpIEG-SSSDをNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株およびGPImutant株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、およびウラシルを補充）にて選択を行うことで、形質転換株を獲得した。これらの形質転換株をそれぞれBY-EG-SSSD株（ＢＹ４７４１株を宿主とするＥＧ細胞表層提示形質転換株）およびGPIm-EGSD株（５遺伝子ノックアウト株を宿主とするＥＧ細胞表層提示形質転換株）と称する。
BY-EG-SSSD株およびGPIm-EGSD株のそれぞれの細胞壁を透過型電子顕微鏡にて観察した。これらの電子顕微鏡写真を図１に示す（Ａ：BY-EG-SSSD株およびＢ：GPIm-EGSD株）。GPIm-EGSD株では、BY-EG-SSSD株と比べて、細胞壁の細胞外側の表面にブラシ状構造の乱れが観察された。細胞壁の厚みには両株間であまり大きな差は見られなかった。
（５−３：ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４遺伝子がノックアウトされた細胞表層発現酵母株）
調製例１に記載のプラスミドpCL-Cas9をBY-BG-SSSD株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニンおよびウラシルを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9を保持する形質転換株を獲得した。次に、調製例２に記載のプラスミドp2gRNA-CCW12/CCW14と、ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４遺伝子のコーディング領域とそれぞれ相同性を有し、かつ特定のアミノ酸コドンが終止コドンに置き換えられた配列を持つ２本鎖のオリゴＤＮＡ（配列番号５８および５９）を混合して上記の形質転換株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニンを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9およびp2gRNA-CCW12/CCW14を保持する形質転換株を獲得した。得られた形質転換株のうち、シーケンス解析によりゲノム上のＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４遺伝子の標的コドンがすべて終止コドンに置換されていることが確認できた株について、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、およびウラシルを補充）にて数日間培養してプラスミドpCL-Cas9およびp2gRNA-CCW12/CCW14を菌体から脱落させた。その後、ＳＤ培地（メチオニンおよびロイシンを補充）およびＳＤ培地（メチオニンおよびウラシルを補充）の両方において生育が見られないことが確認できた株を、ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４遺伝子がノックアウトされた細胞表層発現酵母株として選択した。この株をccw12/ccw14-BGSD株と称する。
調製例１に記載のプラスミドpCL-Cas9をBY-BG-SSSD株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニンおよびウラシルを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9を保持する形質転換株を獲得した。次に、調製例２に記載のプラスミドp2gRNA-CCW12/CCW14と、ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４遺伝子のコーディング領域とそれぞれ相同性を有し、かつ特定のアミノ酸コドンが終止コドンに置き換えられた配列を持つ２本鎖のオリゴＤＮＡ（配列番号５８および５９）を混合して上記の形質転換株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニンを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9およびp2gRNA-CCW12/CCW14を保持する形質転換株を獲得した。得られた形質転換株のうち、シーケンス解析によりゲノム上のＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４遺伝子の標的コドンがすべて終止コドンに置換されていることが確認できた株について、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、およびウラシルを補充）にて数日間培養してプラスミドpCL-Cas9およびp2gRNA-CCW12/CCW14を菌体から脱落させた。その後、ＳＤ培地（メチオニンおよびロイシンを補充）およびＳＤ培地（メチオニンおよびウラシルを補充）の両方において生育が見られないことが確認できた株を、ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４遺伝子がノックアウトされた細胞表層発現酵母株として選択した。この株をccw12/ccw14-BGSD株と称する。
（５−４：ＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１遺伝子がノックアウトされた細胞表層発現酵母株）
調製例１に記載のプラスミドpCL-Cas9をBY-BG-SSSD株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニンおよびウラシルを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9を保持する形質転換株を獲得した。次に、調製例２に記載のプラスミドp2gRNA-TIP1/CWP1/DAN1と、ＤＡＮ１、ＴＩＰ１、およびＣＷＰ１遺伝子のコーディング領域とそれぞれ相同性を有し、かつ特定のアミノ酸コドンが終止コドンに置き換えられた配列を持つ２本鎖のオリゴＤＮＡ（配列番号６０、６１、および６２）を混合して上記の形質転換株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニンを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9およびp2gRNA-CCW12/CCW14/DAN1を保持する形質転換株を獲得した。得られた形質転換株のうち、シーケンス解析によりゲノム上のＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１遺伝子の標的コドンがすべて終止コドンに置換されていることが確認できた株について、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、およびウラシルを補充）にて数日間培養してプラスミドpCL-Cas9およびp2gRNA-TIP1/CWP1/DAN1を菌体から脱落させた。その後、ＳＤ培地（メチオニンおよびロイシンを補充）およびＳＤ培地（メチオニンおよびウラシルを補充）の両方において生育が見られないことが確認できた株を、ＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１遺伝子がノックアウトされた細胞表層発現酵母株として選択した。この株をtip1/cwp1/dan1-BGSD株と称する。
調製例１に記載のプラスミドpCL-Cas9をBY-BG-SSSD株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニンおよびウラシルを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9を保持する形質転換株を獲得した。次に、調製例２に記載のプラスミドp2gRNA-TIP1/CWP1/DAN1と、ＤＡＮ１、ＴＩＰ１、およびＣＷＰ１遺伝子のコーディング領域とそれぞれ相同性を有し、かつ特定のアミノ酸コドンが終止コドンに置き換えられた配列を持つ２本鎖のオリゴＤＮＡ（配列番号６０、６１、および６２）を混合して上記の形質転換株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニンを補充）にて選択を行うことで、pCL-Cas9およびp2gRNA-CCW12/CCW14/DAN1を保持する形質転換株を獲得した。得られた形質転換株のうち、シーケンス解析によりゲノム上のＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１遺伝子の標的コドンがすべて終止コドンに置換されていることが確認できた株について、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、およびウラシルを補充）にて数日間培養してプラスミドpCL-Cas9およびp2gRNA-TIP1/CWP1/DAN1を菌体から脱落させた。その後、ＳＤ培地（メチオニンおよびロイシンを補充）およびＳＤ培地（メチオニンおよびウラシルを補充）の両方において生育が見られないことが確認できた株を、ＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１遺伝子がノックアウトされた細胞表層発現酵母株として選択した。この株をtip1/cwp1/dan1-BGSD株と称する。
（５−５：６遺伝子ノックアウト細胞表層発現酵母株）
ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１ｓｅｄ１Δ株ゲノム（Biotechniques.2011, 50(5):325-328に記載の方法により調製した）を鋳型とし、プライマー対sed1-F（配列番号６３）およびsed1-R（配列番号６４）を用いて増幅し、ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域上流５２０ｂｐの領域、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカー遺伝子ｋａｎＭＸ遺伝子、およびＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域下流５２６ｂｐの領域をこの順番で含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をGPIm-BGSD株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、ウラシル、およびＧ４１８を補充）にて選択を行うことで、形質転換株を獲得した。この形質転換株をGPIm-sed1-BGSD株と称する。
ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１ｓｅｄ１Δ株ゲノム（Biotechniques.2011, 50(5):325-328に記載の方法により調製した）を鋳型とし、プライマー対sed1-F（配列番号６３）およびsed1-R（配列番号６４）を用いて増幅し、ＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域上流５２０ｂｐの領域、抗生物質Ｇ４１８耐性マーカー遺伝子ｋａｎＭＸ遺伝子、およびＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域下流５２６ｂｐの領域をこの順番で含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をGPIm-BGSD株に供し、酢酸リチウム法により導入した。その後、ＳＤ培地（メチオニン、ロイシン、ウラシル、およびＧ４１８を補充）にて選択を行うことで、形質転換株を獲得した。この形質転換株をGPIm-sed1-BGSD株と称する。
（試験例１：β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性の検討）
酵母菌体のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（Ｕ）の検討を以下の手順に従って行った。
酵母菌体のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（Ｕ）の検討を以下の手順に従って行った。
菌体をＳＤ培地（ロイシン、メチオニン、およびウラシルを補充）５ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５０ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの２４時間経過ごとに培養液をそれぞれ回収し、１，０００ｇ、５分間の遠心分離にて菌体と培地とを分離した。
菌体のβ−グルコシダーゼ活性の測定は、以下のように行った：
（１）菌体を蒸留水で２回洗浄；
（２）反応液５００μＬ（組成：１０ｍＭ ｐＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）１００μＬ（最終濃度２ｍＭ）；５００ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０） ５０μＬ（最終濃度５０ｍＭ）；蒸留水２５０μＬ；および酵母懸濁液１００μＬ）（最終菌体濃度１〜１０ｇ湿潤菌体／Ｌ））を調製し、５００ｒｐｍ、３０℃にて１０分間反応；
（３）反応終了後、３Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ５００μＬを加え反応を停止；そして
（４）１０，０００ｇで５分間遠心後、上清の４００ｎｍにおける吸光度ＡＢＳ４００を測定。１分間で１μmolのｐＮＰ（ｐ−ニトロフェノール）を遊離する酵素量を１Ｕとする。
（１）菌体を蒸留水で２回洗浄；
（２）反応液５００μＬ（組成：１０ｍＭ ｐＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）１００μＬ（最終濃度２ｍＭ）；５００ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０） ５０μＬ（最終濃度５０ｍＭ）；蒸留水２５０μＬ；および酵母懸濁液１００μＬ）（最終菌体濃度１〜１０ｇ湿潤菌体／Ｌ））を調製し、５００ｒｐｍ、３０℃にて１０分間反応；
（３）反応終了後、３Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ５００μＬを加え反応を停止；そして
（４）１０，０００ｇで５分間遠心後、上清の４００ｎｍにおける吸光度ＡＢＳ４００を測定。１分間で１μmolのｐＮＰ（ｐ−ニトロフェノール）を遊離する酵素量を１Ｕとする。
（試験例２：エンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性の検討）
酵母菌体のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性（乾燥菌体重量当たりの活性量）の検討を以下の手順に従って行った。
酵母菌体のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性（乾燥菌体重量当たりの活性量）の検討を以下の手順に従って行った。
菌体をＳＤ培地（ロイシン、メチオニン、およびウラシルを補充）５ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５０ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの４８時間後に培養液をそれぞれ回収し、１，０００ｇ、５分間の遠心分離にて菌体と培地とを分離した。
菌体のエンドグルカナーゼ活性の測定は、以下のように行った：
（１）菌体を蒸留水で２回洗浄；
（２）反応液２５００μＬ（組成：セラザイムＣタブレット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１錠；５００ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０） ２５０μＬ（最終濃度５０ｍＭ）；蒸留水２０００μＬ；および酵母懸濁液２５０μＬ（最終菌体濃度１０ｇ湿潤菌体／Ｌ））を調製し、静置、３８℃にて３時間反応；
（３）反応終了後、１０，０００ｇで５分間遠心後、上清の５９０ｎｍの吸光度ＡＢＳ５９０を測定。
（１）菌体を蒸留水で２回洗浄；
（２）反応液２５００μＬ（組成：セラザイムＣタブレット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１錠；５００ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０） ２５０μＬ（最終濃度５０ｍＭ）；蒸留水２０００μＬ；および酵母懸濁液２５０μＬ（最終菌体濃度１０ｇ湿潤菌体／Ｌ））を調製し、静置、３８℃にて３時間反応；
（３）反応終了後、１０，０００ｇで５分間遠心後、上清の５９０ｎｍの吸光度ＡＢＳ５９０を測定。
（試験例３：β−グルコシダーゼ表層提示酵母を用いたセロビオースからのエタノール生産能力の検討）
β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）表層提示酵母を用いたセロビオースからのエタノール生産能力の検討を以下の手順に従って行った。
β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）表層提示酵母を用いたセロビオースからのエタノール生産能力の検討を以下の手順に従って行った。
菌体をＳＤ培地（ロイシン、メチオニン、およびウラシルを補充）５ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５００ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの４８時間後に培養液をそれぞれ回収し、菌体を蒸留水で２回洗浄し、エタノール生産試験に用いた。
エタノール生産試験は、以下の条件下で行った：
セロビオース ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス １０ｇ／Ｌ
ペプトン ２０ｇ／Ｌ
酵母菌体 １０ｇ湿潤菌体重量／Ｌ
合計 ２０ｍＬ
上記を回転式発酵装置に入れ、市販酵素剤を添加せずに、３０℃、１５０ｒｐｍ、８時間反応させた。
セロビオース ２０ｇ／Ｌ
酵母エキス １０ｇ／Ｌ
ペプトン ２０ｇ／Ｌ
酵母菌体 １０ｇ湿潤菌体重量／Ｌ
合計 ２０ｍＬ
上記を回転式発酵装置に入れ、市販酵素剤を添加せずに、３０℃、１５０ｒｐｍ、８時間反応させた。
（実施例１：β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）細胞表層提示における宿主酵母の比較）
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株およびその５遺伝子ノックアウト株を宿主として発現カセットＸ７を含むプラスミドを導入して得られた細胞表層提示形質転換酵母（BY-BG-SSSD株およびGPIm-BGSD株：それぞれ調製例５の５−１にて調製した）について、菌体のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を測定した。
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株およびその５遺伝子ノックアウト株を宿主として発現カセットＸ７を含むプラスミドを導入して得られた細胞表層提示形質転換酵母（BY-BG-SSSD株およびGPIm-BGSD株：それぞれ調製例５の５−１にて調製した）について、菌体のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を測定した。
この結果を図２に示す。（Ａ）β−グルコシダーゼ活性および（Ｂ）菌体増殖の経時変化を示す。図２（Ａ）（Ｂ）とも横軸は培養時間（「時間（時間）」）を示し、そして縦軸は、（Ａ）ではβ−グルコシダーゼ活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（「Ｕ／ｇ乾燥菌体重量」）、（Ｂ）では菌体増殖（ＯＤ６００）を示す。図２中の記号は以下の通りである：黒丸、BY-BG-SSSD株；および黒四角、GPIm-BGSD株。
図２に示されるように、５遺伝子ノックアウト株を宿主に用いたＢＧＬ細胞表層提示形質転換株（GPIm-BGSD株）は、従来のＢＹ４７４１株を宿主に用いた形質転換株（BY-BG-SSSD株）と比較しても、相当に高い表層ＢＧＬ活性を示すことが分かった。
（実施例２：エンドグルカナーゼ（ＥＧ）細胞表層提示における宿主酵母の比較）
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株およびその５遺伝子ノックアウト株を宿主として発現カセットＸ８を含むプラスミドを導入して得られた細胞表層提示形質転換酵母（BY-EG-SSSD株およびGPIm-EGSD株：それぞれ調製例５の５−２にて調製した）について、菌体のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性を測定した。
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株およびその５遺伝子ノックアウト株を宿主として発現カセットＸ８を含むプラスミドを導入して得られた細胞表層提示形質転換酵母（BY-EG-SSSD株およびGPIm-EGSD株：それぞれ調製例５の５−２にて調製した）について、菌体のエンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性を測定した。
この結果を図３に示す。図３の縦軸は、ＥＧ相対活性（吸光度測定値（「ＡＢＳ５９０」）を示す。図３の棒グラフは、左から順に：BY-EG-SSSD株およびGPIm-EGSD株を表す。
図３に示されるように、ＥＧ活性を指標とした場合でも、５遺伝子ノックアウト株を宿主に用いたＥＧ細胞表層提示形質転換株（GPIm-EGSD株）は、従来のＢＹ４７４１株を宿主に用いた形質転換株（BY-EG-SSSD株）よりも高い細胞表層ＥＧ活性を示すことが観察された。
（実施例３：ノックアウトする遺伝子の組み合わせの検討）
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株、５遺伝子ノックアウト株、および５遺伝子のうちの２つ（ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４）または３つ（ＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１）のみをノックアウトした株を宿主として発現カセットＸ１を含むプラスミドを導入して得られた表層提示形質転換酵母（BY-BG-SSSD株、GPIm-BGSD株（上記５−１）、ccw12/ccw14-BGSD株（上記５−３）、tip1/cwp1/dan1-BGSD株（上記５−４））について、菌体のＢＧＬ活性を測定した。
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株、５遺伝子ノックアウト株、および５遺伝子のうちの２つ（ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４）または３つ（ＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１）のみをノックアウトした株を宿主として発現カセットＸ１を含むプラスミドを導入して得られた表層提示形質転換酵母（BY-BG-SSSD株、GPIm-BGSD株（上記５−１）、ccw12/ccw14-BGSD株（上記５−３）、tip1/cwp1/dan1-BGSD株（上記５−４））について、菌体のＢＧＬ活性を測定した。
この結果を図４に示す。（Ａ）β−グルコシダーゼ活性および（Ｂ）菌体増殖の経時変化を示す。図４（Ａ）（Ｂ）とも横軸は培養時間（「時間（時間）」）を示し、そして縦軸は、（Ａ）ではβ−グルコシダーゼ活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（「Ｕ／ｇ乾燥菌体重量」）、（Ｂ）では菌体増殖（ＯＤ６００）を示す。図４中の記号は以下の通りである：黒丸、BY-BG-SSSD株；および黒四角、GPIm-BGSD株。黒菱形、ccw12/ccw14-BGSD株；および黒三角、tip1/cwp1/dan1-BGSD株。
図４に示されるように、ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４のみをノックアウトした株を宿主に用いたＢＧＬ細胞表層提示形質転換株（ccw12/ccw14-BGSD株）は、５遺伝子ノックアウト株を宿主に用いた形質転換株（GPIm-BGSD株）とほぼ同等の、高い細胞表層ＢＧＬ活性を示すことが分かった。また、ＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１のみをノックアウトした株を宿主に用いた形質転換株（tip1/cwp1/dan1-BGSD株）についても、従来のＢＹ４７４１株を宿主に用いた形質転換株（BY-BG-SSSD株）と比較して、わずかに高い表層ＢＧＬ活性を示すことが観察された。
（実施例４：ノックアウトする遺伝子を追加された宿主酵母の比較）
本実施例では、５遺伝子ノックアウト株を宿主として発現カセットＸ７を含むプラスミドを導入して得られた細胞表層提示形質転換酵母（GPIm-BGSD株）（上記５−１）およびその株のＳＥＤ１遺伝子を追加でノックアウトした形質転換株（GPIm-sed1-BGSD株）（上記５−５）について、菌体のＢＧＬ活性を測定した。
本実施例では、５遺伝子ノックアウト株を宿主として発現カセットＸ７を含むプラスミドを導入して得られた細胞表層提示形質転換酵母（GPIm-BGSD株）（上記５−１）およびその株のＳＥＤ１遺伝子を追加でノックアウトした形質転換株（GPIm-sed1-BGSD株）（上記５−５）について、菌体のＢＧＬ活性を測定した。
この結果を図５に示す。（Ａ）β−グルコシダーゼ活性および（Ｂ）菌体増殖の経時変化を示す。図５（Ａ）（Ｂ）とも横軸は培養時間（「時間（時間）」）を示し、そして縦軸は、（Ａ）ではβ−グルコシダーゼ活性（乾燥菌体重量当たりの活性量（「Ｕ／ｇ乾燥菌体重量」）、（Ｂ）では菌体増殖（ＯＤ６００）を示す。図５中の記号は以下の通りである：黒四角、GPIm-BGSD株；および黒菱形、GPIm-sed1-BGSD株。
図５に示されるように、５遺伝子ノックアウト株を宿主に用いたＢＧＬ細胞表層提示形質転換株（GPIm-BGSD株）と比較して、ＳＥＤ１遺伝子を追加でノックアウトした形質転換株（GPIm-sed1-BGSD株）は、培養時間７２時間以降において、高い細胞表層ＢＧＬ活性を示すことが分かった。
（実施例５：β−グルコシダーゼ細胞表層提示酵母を用いたセロビオースからのエタノール生産における宿主酵母の比較）
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株、ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４の２遺伝子ノックアウト株、ＣＣＷ１２、ＣＣＷ１４、ＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１の５遺伝子ノックアウト株を宿主として発現カセットＸ７を含むプラスミドを導入して得られた細胞表層提示形質転換酵母（BY-BG-SSSD株、ccw12/ccw14-BGSD株、およびGPIm-BGSD株）（上記５−１、５−３）について、グルコース２分子の重合体であるセロビオースからのエタノール生産能力を比較した。
本実施例では、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株、ＣＣＷ１２およびＣＣＷ１４の２遺伝子ノックアウト株、ＣＣＷ１２、ＣＣＷ１４、ＴＩＰ１、ＣＷＰ１、およびＤＡＮ１の５遺伝子ノックアウト株を宿主として発現カセットＸ７を含むプラスミドを導入して得られた細胞表層提示形質転換酵母（BY-BG-SSSD株、ccw12/ccw14-BGSD株、およびGPIm-BGSD株）（上記５−１、５−３）について、グルコース２分子の重合体であるセロビオースからのエタノール生産能力を比較した。
この結果を図６に示す。図６（Ａ）（Ｂ）とも横軸は発酵時間（「時間（時間）」）を示し、そして縦軸は、（Ａ）ではセロビオース濃度（ｇ／Ｌ）、（Ｂ）ではエタノール濃度（ｇ／Ｌ）を示す。図６中の記号は以下の通りである：黒丸、BY-BG-SSSD株；黒菱形、ccw12/ccw14-BGSD株；および黒四角、GPIm-BGSD株。
図６に示されるように、２遺伝子ノックアウト株を宿主に用いたＢＧＬ細胞表層提示形質転換株（ccw12/ccw14-BGSD株）および５遺伝子ノックアウト株を宿主に用いたＢＧＬ細胞表層提示形質転換株（GPIm-BGSD株）は、従来のＢＹ４７４１株を宿主に用いた形質転換株（BY-EG-SSSD株）よりもセロビオースからエタノールを生産する速度が速いことが確認された。
本発明によれば、酵母を用いた物質生産の効率化、低コスト化およびその普及の促進に非常に有用である。より具体的な応用分野としては、セルロース分解酵素を細胞表層に提示した酵母によるセルロース系バイオマスからの化学品生産等の効率化、低コスト化が考えられる。さらに、例えばリパーゼを細胞表層に提示した酵母によるバイオディーゼルの製造の効率化、抗体またはリガンドを細胞表層に提示した酵母ライブラリーによる薬剤スクリーニングへの利用が考えられる。
Claims (11)
- タンパク質を細胞表層発現する形質転換酵母であって、
ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子、およびそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母における少なくとも１つの該細胞壁関連遺伝子の機能を欠損しており、かつ
プロモーター、分泌シグナル配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドが導入されている、
形質転換酵母。 - ＣＣＷ１２遺伝子およびＣＣＷ１４遺伝子の少なくとも一方の前記細胞壁関連遺伝子の機能を欠損している、請求項１に記載の形質転換酵母。
- ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子およびＣＷＰ１遺伝子の全ての上記細胞壁関連遺伝子の機能を欠損している、請求項１に記載の形質転換酵母。
- ＳＥＤ１遺伝子の機能をさらに欠損している、請求項１から３のいずれかに記載の形質転換酵母。
- 前記タンパク質が酵素である、請求項１から４のいずれかに記載の形質転換酵母。
- 前記酵素がセルロース分解酵素である、請求項５に記載の形質転換酵母。
- 前記宿主酵母がサッカロマイセス属酵母である、請求項１から６のいずれかに記載の形質転換酵母。
- タンパク質を細胞表層発現する形質転換酵母の製造方法であって、
ＣＣＷ１２遺伝子、ＣＣＷ１４遺伝子、ＤＡＮ１遺伝子、ＴＩＰ１遺伝子、ＣＷＰ１遺伝子、およびそれらに相当する遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの細胞壁関連遺伝子を保有する宿主酵母における、該宿主酵母の少なくとも１つの該細胞壁関連遺伝子の機能を欠損させる工程、および
該宿主酵母に、プロモーター、分泌シグナル配列、該タンパク質をコードするＤＮＡ、アンカードメインをコードするＤＮＡおよびターミネーターを含むポリヌクレオチドを導入する工程
を含む、方法。 - 請求項５または６に記載の形質転換酵母を含む、酵素剤。
- バイオマスを用いたエタノール製造のために用いられるエタノール製造のために用いられる、請求項９に記載の酵素剤。
- エタノールの製造方法であって、
請求項６に記載の形質転換酵母を、β-１，４結合したグルコース多糖を含む培地で培養する工程
を含む、方法。
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| APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 105, JPN6023008750, 2021, pages 5895 - 5904, ISSN: 0005005495 * |
| MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 52, no. 5, JPN6023008747, 2004, pages 1413 - 1425, ISSN: 0005005493 * |
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