CN113493800A - 一种提高酿酒酵母中异源蛋白分泌或表面展示表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种提高酿酒酵母中异源蛋白分泌或表面展示表达的方法，具体公开了一种同时提高酿酒酵母中异源蛋白的细胞外分泌和表面展示表达的方法，该方法包括将一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞作为宿主细胞，进行异源蛋白表面展示或分泌表达；异源蛋白为β‑葡萄糖苷酶异源蛋白表面展示或分泌表达的方法为：1)制备细胞外分泌型重组质粒；2)将重组质粒转化至本发明所述的酿酒酵母细胞内，进行培养及酶活测试。

Description

一种提高酿酒酵母中异源蛋白分泌或表面展示表达的方法

技术领域

本发明属于涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术

异源蛋白包括蛋白药物及工业酶等，在医药、大宗化工产品、能源等领域中的应用研究近些年来备受关注。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为重要的真核模式生物，被广泛的用作重组蛋白分泌表达的底盘细胞。与原核生物大肠杆菌(Escherichiacoli)相比，其具有与高等生物相似的蛋白分泌途径和较完善的翻译后修饰过程，有利于保持真核源分泌蛋白的天然活性和功能；与毕赤酵母(Pichia pastoris)相比，酿酒酵母是国际上公认的食品级安全级微生物，不产生毒素，表达产物不需要经过大量安全性实验。因此，构建异源蛋白高效表达的酿酒酵母菌株，对工业生产具有重要的应用价值和实践意义。

异源蛋白在酿酒酵母的常见表达形式是分泌表达和表面展示表达。与其他真核生物相似，酿酒酵母蛋白分泌过程起始于多肽易位进入内质网(Endoplasmic reticulum，ER)内，通过一系列分子伴侣的协助，发生初步的折叠和修饰，结构正确的蛋白前体通过膜泡运输到高尔基体(Golgi)中，进一步加工修饰如糖链延伸，成熟有活性的蛋白再通过膜泡运出胞外。然而，由于胞内存在多个限制因素，例如分泌途径、信号网络调控如细胞壁不完整性信号通路和渗透压信号通路、营养物质代谢如碳源和氮源代谢等干扰或能力不足，往往是异源蛋白在酿酒酵母高效分泌表达的瓶颈问题。

目前，改造酿酒酵母分泌途径，已经成为提高重组蛋白胞外分泌的重要措施。研究者们前期的工作主要是单个优化分泌元件，根据文献报道，过表达新生肽链易位子Sec61p，增强蛋白易位能力，可以提高α-淀粉酶的分泌量；超表达分子伴侣Kar2p、二硫键异构酶Pdi1p，提高蛋白的正确折叠，促进了多种蛋白的胞外产量(Bao et al.,2017；Xu et al.,2014)；改造膜泡运输元件Sso1p、Snc2p、Erv25、Bos1p、Glo3p等，也能促进纤维素酶、α-淀粉酶的胞外分泌(Huang et al.,2018；Tang et al.,2017)；敲除内质网糖基转移酶Alg3p、Alg6p等和高尔基体糖基转移酶Och1p、Mnn11p等，阻断糖基化修饰促进了多种重组蛋白的生物活性，例如纤维素酶、α-淀粉酶、单克隆抗体HyHEL-10等(Hoshida et al.,2013；Parsaie Nasab et al.,2013；Suzuki et al.,2012)；敲除蛋白酶Yap3p、Cym1p，减少重组蛋白的错误降解，能提高甲状腺素、生长激素、肠促胰酶肽前体的胞外分泌(

et al.,2010)。最近，Huang et al.组合改造了多个限制性节点，同时敲除组蛋白去乙酰化酶组分Had2p、膜泡运输元件Gos1p、Vps5p和Tda1p，并且超表达Pdi1p，能大幅度提高α-淀粉酶的发酵产量，约2.5g/L(Huang et al.,2018)。共同超表达Srp54p和Pdi1p，能进一步提高纤维素酶的胞外活性；共同超表达Pdi1p和Sso1p，并同时敲除Vps10p和Ca²⁺/Mn²⁺腺苷三磷酸酶Pmr1p，能极大的促进瑞氏木霉纤维二糖水解酶的胞外产量(Tang et al.,2015；Xu etal.,2014)。

由于蛋白的表面展示和胞外分泌表达受到多方面因素的影响，包括分泌途径、信号网络调控如细胞壁不完整性信号通路和渗透压信号通路、营养物质代谢如碳源和氮源代谢等干扰或能力不足。虽然目前通过分泌途径的改造来提高异源蛋白在酿酒酵母中的表面展示和胞外分泌表达的研究已经比较深入了，但是对于其他影响因素的研究还相对较少。

发明内容

本发明的目的是挖掘能够提高异源蛋白表面展示和胞外分泌表达的元件。

本发明一个方面提供了一种提高酿酒酵母中异源蛋白的细胞外分泌的方法，该方法包括将一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞作为宿主细胞，进行异源蛋白细胞外分泌；所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1、CCW12、LDB17、CWP2；优选地，所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1。

本发明另一个方面提供了一种提高酿酒酵母中异源蛋白的表面展示表达的方法，该方法包括将一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞作为宿主细胞，进行异源蛋白表面展示表达；所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、FKS1、NPP1、CCW12、SHE10或PRY3；优选地，所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、YPS7、LDB17。

在本发明的技术方案中，所述的异源蛋白选自β-葡萄糖苷酶。

在本发明的技术方案中，所述的提高酿酒酵母中异源蛋白的细胞外分泌的方法中一个或多个细胞壁相关蛋白失活或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞通过以下方法获得：通过基因敲除、RNAi或CRISPRi方法将细胞壁相关蛋白的基因失活。

本发明另一个方面提供了一种酿酒酵母细胞作为提高异源蛋白的表面展示表达的宿主细胞的用途；所述酿酒酵母细胞为一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞。

在本发明的技术方案中，所述的异源蛋白选自β-葡萄糖苷酶。

本发明另一个方面提供了一种酿酒酵母细胞作为提高异源蛋白的细胞外分泌的宿主细胞的用途；所述酿酒酵母细胞为一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞。

在本发明的技术方案中，所述的异源蛋白选自β-葡萄糖苷酶。

本发明另一个方面提供了一种表面展示异源蛋白的酿酒酵母；所述的酿酒酵母为一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞，并且所述酿酒酵母还含有表面展示重组质粒；

异源蛋白为β-葡萄糖苷酶；

所述表面展示重组质粒中包含含有V5标签和连接序列的β-葡萄糖苷酶的片段、SED1表面展示片段以及质粒骨架片段；

所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、FKS1、NPP1、CCW12、SHE10或PRY3；优选地，所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、YPS7、LDB17。

本发明另一个方面提供了一种细胞外分泌异源蛋白的酿酒酵母，所述的酿酒酵母为一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞，并且所述酿酒酵母还含有细胞外分泌重组质粒；

异源蛋白为β-葡萄糖苷酶；

所述细胞外分泌重组质粒中包含含有分泌性的β-葡萄糖苷酶的片段以及质粒骨架片段；

所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1、CCW12、LDB17、CWP2；优选地，所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1。

在本发明的技术方案中，异源蛋白的表面展示表达的提高或异源蛋白细胞外分泌的提高指异源蛋白的分泌量增加或表面展示量增加，或指作为异源蛋白的的酶的活性的提高。

在本发明的技术方案中，异源蛋白细胞外分泌的方法为：1)制备细胞外分泌型重组质粒；2)将重组质粒转化至本发明所述的酿酒酵母细胞内，进行培养。

在本发明的技术方案中，异源蛋白表面展示表达的方法为：1)制备细胞外分泌型重组质粒；2)将重组质粒转化至本发明所述的酿酒酵母细胞内，进行培养。

在本发明的技术方案中，酿酒酵母的培养采用的培养基为酵母营养缺陷型选择培养基，优选为尿嘧啶缺陷培养基。

尿嘧啶缺陷培养基的组成为以下浓度的组分：1.7g/L无氨基酵母氮源、5g/L硫酸铵、20g/L D-葡萄糖、190mg/L精氨酸、52mg/L酪氨酸、108mg/L蛋氨酸、290mg/L异亮氨酸、440mg/L赖氨酸、200mg/L苯丙氨酸、400mg/L天冬氨酸、1260mg/L谷氨酸、380mg/L缬氨酸、220mg/L苏氨酸、400mg/L亮氨酸，130mg/L甘氨酸、40mg/L色氨酸和140mg/L组氨酸。

本发明通过对酿酒酵母细胞壁进行改造，失活细胞壁组分蛋白以及参与细胞壁合成的关键蛋白，获得能够高效分泌或表面展示表达异源蛋白的新策略。例如失活与细胞壁合成相关基因DFG5能够提高外源蛋白在酿酒酵母中的活性，获得的重组菌株能使异源蛋白纤维素酶β-葡萄糖苷酶表面展示和分泌表达的单位活性提高了8倍和3倍。本发明提供的新策略在工业酶及药物蛋白生产中具有十分重要的工业和市场应用价值。

有益效果

本发明首次发现通过失活细胞壁组分及合成相关基因，例如DFG5，能够提高外源蛋白在酿酒酵母中表面展示和胞外分泌活性，获得的重组菌株能使异源蛋白纤维素酶β-葡萄糖苷酶的表面展示活性和分泌活性分别提高了3倍和8倍，从而显著改善异源蛋白的生产成本，该方法在工业酶及药物蛋白生产中具有十分重要的工业和市场应用价值。

本发明通过实验证明了可行性。以异源蛋白β-葡萄糖苷酶为例，获得一系列能够提高蛋白表达活性的元件。其中，失活敲除基因DFG5的酿酒酵母，转入重组质粒TC001和TC002获得的重组酿酒酵母使β-葡萄糖苷酶的表面展示和分泌表达活性分别提高了8倍和3倍。

附图说明

图1为TC001和TC002重组质粒的构建。其中图1A为TC001重组质粒的构建，图1B为TC002重组质粒的构建。

图2pNP标准曲线的绘制。实验数据均为三个平行重复。

图3细胞壁相关蛋白元件敲除提高异源蛋白β-葡萄糖苷酶的表面展示活性。WT表示野生型菌株(Wild type，WT)，BGL1表示β-葡萄糖苷酶。实验数据均为三组平行重复实验。

图4细胞壁相关蛋白元件敲除提高异源蛋白β-葡萄糖苷酶的胞外分泌活性。WT表示野生型菌株(Wild type，WT)，BGL1表示β-葡萄糖苷酶。实验数据均为三组平行重复实验。

具体实施方式

为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。

实施例1构建纤维素酶β-葡萄糖苷酶重组质粒

以来源于扣囊覆膜胞酵母(Saccharomycopsis fibuligera)的纤维素酶β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL1)为例，β-葡萄糖苷酶的功能是将纤维二糖水解生成葡萄糖。BGL1序列为模板，利用引物1和引物2/3/4进行三轮PCR扩增，获得含有V5标签和连接序列的β-葡萄糖苷酶片段1，再利用引物5和引物6以酿酒酵母基因组为模板扩增SED1表面展示片段2，再用引物7和引物8扩增质粒骨架片段3，将片段1，片段2，片段3通过Gibson Assembly方法组装构建表面展示的重组质粒TC001(如图1A)；利用引物1和引物2/9扩增分泌型β-葡萄糖苷酶片段4，将片段3，片段4通过Gibson Assembly方法组装构建重组质粒TC002(如图1B)。重组质粒TC001和TC002分别是URA营养缺陷型标记。本部分内容涉及的引物见表1。

表1质粒构建的引物名称及序列

片段1SEQ ID No:10：

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片段2SEQ ID No:11：

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片段3SEQ ID No:12：

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片段4SEQ ID No:13：

ATGTTGATGATAGTACAGCTTTTGGTCTTTGCACTAGGCCTTGCTGTTGCTGTCCCAATTCAAAACTATACCCAGTCTCCATCCCAGAGAGATGAGAGCTCCCAATGGGTGAGCCCGCATTATTATCCAACTCCACAAGGTGGTAGGCTCCAAGACGTCTGGCAAGAAGCATATGCTAGAGCAAAAGCCATCGTTGGCCAGATGACTATTGTTGAAAAGGTCAATTTGACCACTGGTACCGGTTGGCAATTAGATCCATGTGTTGGTAATACCGGTTCTGTTCCAAGATTCGGCATCCCAAACCTTTGCCTACAAGATGGGCCATTGGGTGTTCGATTCGCTGACTTTGTTACTGGCTATCCATCCGGTCTTGCTACTGGTGCAACGTTCAATAAGGATTTGTTTCTTCAAAGAGGTCAAGCTCTCGGTCATGAGTTCAACAGCAAAGGTGTACATATTGCGTTGGGCCCTGCTGTTGGCCCACTTGGTGTCAAAGCCAGAGGTGGCAGAAATTTCGAAGCCTTTGGTTCCGACCCATATCTCCAAGGTACTGCTGCTGCTGCAACCATCAAAGGTCTCCAAGAGAATAATGTTATGGCTTGTGTCAAGCACTTTATTGGTAACGAACAAGAAAAGTACAGACAGCCAGATGACATAAACCCTGCCACCAACCAAACTACTAAAGAAGCTATTAGTGCCAACATTCCAGACAGAGCCATGCATGCGTTGTACTTGTGGCCATTTGCCGATTCGGTTCGAGCAGGTGTTGGTTCTGTTATGTGCTCTTATAACAGAGTCAACAACACTTACGCTTGCGAAAACTCTTACATGATGAACCACTTGCTTAAAGAAGAGTTGGGTTTTCAAGGCTTTGTTGTTTCGGACTGGGGTGCACAATTAAGTGGGGTTTATAGCGCTATCTCGGGCTTAGATATGTCTATGCCTGGTGAAGTGTATGGGGGATGGAACACCGGCACGTCTTTCTGGGGTCAAAACTTGACGAAAGCTATTTACAATGAGACTGTTCCGATTGAAAGATTAGATGATATGGCAACCAGGATCTTGGCTGCTTTGTATGCTACCAATAGTTTCCCAACAGAAGATCACCTTCCAAATTTTTCTTCATGGACAACGAAAGAATATGGCAATAAATATTATGCTGACAACACTACCGAGATTGTCAAAGTCAACTACAATGTGGACCCATCAAATGACTTTACGGAGGACACAGCTTTGAAGGTTGCTGAGGAATCTATTGTGCTTTTAAAAAATGAAAACAACACTTTGCCAATTTCTCCCGAAAAGGCTAAAAGATTACTATTGTCGGGTATTGCTGCAGGCCCTGATCCGATAGGTTATCAGTGTGAAGATCAATCTTGCACAAATGGCGCTTTGTTTCAAGGTTGGGGTTCTGGCAGTGTTGGTTCTCCAAAATATCAAGTCACTCCATTTGAGGAAATTTCTTATCTTGCAAGAAAAAACAAGATGCAATTTGATTATATTCGGGAGTCTTACGACTTAGCTCAAGTTACTAAAGTAGCTTCCGATGCTCATTTGTCTATAGTTGTTGTCTCTGCTGCAAGCGGTGAGGGTTATATAACCGTTGACGGTAACCAAGGTGACAGAAAAAATCTCACTTTGTGGAACAACGGTGATAAATTGATTGAAACAGTTGCTGAAAACTGTGCCAATACTGTTGTTGTTGTTACTTCTACTGGTCAAATTAATTTTGAAGGCTTTGCTGATCACCCAAATGTTACCGCAATTGTCTGGGCCGGCCCATTAGGTGACAGATCCGGGACTGCTATCGCCAATATTCTTTTTGGTAAAGCGAACCCATCAGGTCATCTTCCATTCACTATTGCTAAGACTGACGATGATTACATTCCAATTGAAACCTACAGTCCATCGAGTGGTGAACCTGAAGACAACCACTTGGTTGAAAATGACTTGCTTGTTGACTATAGATATTTTGAAGAGAAGAATATTGAGCCAAGATACGCATTTGGTTATGGCTTGTCTTACAATGAGTATGAAGTTAGCAATGCAAAGGTCTCGGCAGCCAAAAAAGTTGATGAGGAGTTGCCTGAACCAGCTACCTACTTATCGGAGTTTAGCTATCAAAATGCAAAAGACAGCAAAAATCCAAGTGATGCTTTTGCTCCAGCAGATTTAAACAGAGTTAATGAGTACCTTTATCCATATTTAGATAGCAATGTTACCTTAAAAGACGGAAACTATGAGTATCCTGATGGCTACAGCACTGAGCAAAGAACAACACCTAACCAACCTGGGGGCGGCTTGGGAGGCAACGATGCTTTGTGGGAGGTCGCTTATAACTCCACTGATAAGTTTGTTCCACAGGGTAACTCCACTGATAAGTTTGTTCCACAGTTGTATTTGAAACACCCTGAGGATGGCAAGTTTGAAACCCCTATTCAATTGAGAGGGTTTGAAAAGGTTGAGTTGTCCCCGGGTGAGAAGAAGACAGTTGATTTGAGGCTTTTGAGAAGAGATCTTAGTGTGTGGGATACCACCAGACAGTCTTGGATCGTTGAATCTGGTACTTATGAGGCCTTAATTGGCGTTGCTGTTAATGATATCAAGACATCTGTCCTGTTTACTATTCTCGAGGGTAAGCCAATTCCAAATCCTTTGTTGGGTTTAGATTCTACTTAACCTGCAGGATTGAATTGAATTGAAAT

实施例2制备BGL1展示型和分泌型表达的重组酿酒酵母库

将获得的重组质粒TC001和TC002分别转化失活细胞壁相关蛋白的酿酒酵母敲除库(商业化)中，失活的细胞壁相关蛋白分别为DFG5、YPS7、TIR1、FKS1、NPP1、LDB17、CCW12、SHE10、CWP2和PRY3。具体步骤如下：将酵母分别挑取到含有300μL YEPD培养基的96孔深孔板中，30℃活化36h后转接至含有500μL YEPD培养基中，稀释20倍，使起始OD600约为0.2，30℃培养至OD600在0.7-1.0之间，5000rpm离心5min去除YEPD培养基，用500μL无菌水重悬细胞沉淀，5000rpm离心5min去除上清，再用500μL 100mM LiAC重悬细胞沉淀，5000rpm离心5min去除上清。加入178μL转化液，重悬细胞。转化液配制方法，以一个转化的量为例：120μL50％PEG 3350混匀，再加入18μL 1M LiAC，5μL 10mg/mL单链鱼精DNA(100℃煮沸5min后迅速置于冰上)，35μL无菌水和重组质粒(分别是TC001和TC002)混匀。细胞悬浮液于30℃保温30min，置42℃水浴中热激25min。5000rpm离心1min除去转化液，加入500μL无菌水重悬，5000rpm离心1min除去上清，加入200μL无菌水重悬后涂布在营养缺陷型固体培养基SC-URA3上，培养三天，获得BGL1展示型和分泌型表达的重组酿酒酵母库。

实施例3细胞壁元件筛选

为了筛选能够提高异源蛋白在酿酒酵母中表达量的细胞壁元件，分别将组成β-葡萄糖苷酶展示型和分泌型表达的重组酿酒酵母库中的每个单元酵母，分别挑取三个重复于含有300μL SC-URA液体培养基的96孔深孔板中活化36h，再按20倍稀释于含有600μL SC-URA液体培养基(1.7g/L无氨基酵母氮源、5g/L硫酸铵、20g/L D-葡萄糖、190mg/L精氨酸、52mg/L酪氨酸、108mg/L蛋氨酸、290mg/L异亮氨酸、440mg/L赖氨酸、200mg/L苯丙氨酸、400mg/L天冬氨酸、1260mg/L谷氨酸、380mg/L缬氨酸、220mg/L苏氨酸、400mg/L亮氨酸，130mg/L甘氨酸、40mg/L色氨酸和140mg/L组氨酸)的96孔深孔板中，30℃培养24h，获得含有异源蛋白BGL1的培养液，进行下一步的酶活测定。首先，绘制了底物pNP的标准曲线，具体步骤如下：分别配制0，2，4，6，8，10，20，40，60，80，100μM的pNP溶液，取300μL到酶标板中，通过酶标仪OD405进行读数，再对获得数据进行处理，绘制出标准曲线(如图2所示)。进而，进行酶活测试，具体步骤如下：将培养液分别用柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)稀释10倍，取20μL培养液稀释液，加入到130μL含有4mM底物pNPG的柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)中，50℃孵育30min后，加入150μL终止缓冲液10％碳酸钠后，通过酶标仪进行OD405读数。获得数据根据标准曲线进行处理，筛选出能够提高BGL1展示和分泌酶活的细胞壁元件。

通过图3可以看出，这些与细胞壁相关的蛋白元件敲除后，包括DFG5、YPS7、FKS1、NPP1、LDB17、CCW12能极大地促进β-葡萄糖苷酶的表面展示效率，其中DFG5使BGL1的展示活性提高了8倍左右，并且这些基因的敲除不会影响细胞的正常生长状态。

通过图4可以看出，DFG5、NPP1能极大地促进β-葡萄糖苷酶的胞外分泌，其中DFG5使β-葡萄糖苷酶的分泌活性提高了3倍，并且这些基因的敲除也不会影响重组酵母的正常生长状态。

结论：酵母细胞壁相关蛋白元件与异源蛋白的表面展示和分泌表达紧密相关，通过基因敲除，能促进异源蛋白BGL1表达量。其中一些促进β-葡萄糖苷酶展示表达活性的元件如DFG5和NPP1也能促进其胞外分泌活性，但是其他一些元件如YPS7、FKS1、LDB17、CCW12能促进β-葡萄糖苷酶的展示活性，却不能增加其胞外分泌活性，说明β-葡萄糖苷酶的展示表达和分泌表达既有相似性，也具有差异性。本发明表明失活酿酒酵母细胞壁合成相关蛋白或者组分蛋白，既能提高异源蛋白的表面展示和分泌表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 一种提高酿酒酵母中异源蛋白分泌或表面展示表达的方法

<130> CP120010159C

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catagcaatc taatctaagt tttaattaca aaggatccca tgttgatgat agtacagc 58

<210> 2

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taaacccaac aaaggatttg gaattggctt accctcgaga atagtaaaca ggacagatg 59

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccaccaccag aaccaccacc accactagca gtagaatcta aacccaacaa aggatttgg 59

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acactagtgc atgcagaacc accaccacca gaaccaccac caccagaacc accaccac 58

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggttctgca tgcactagtg tcgacctgca ggctcttcca actaacggta cttctactg 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tatcgatttc aattcaattc aatcctgcag gttataagaa taacatagca acaccagcc 59

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

attgaattga attgaaatcg atag 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgtaattaa aacttagatt ag 22

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atttcaattc aattcaatcc tgcaggttaa gtagaatcta aacccaacaa aggatttgg 59

<210> 10

<211> 2780

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catagcaatc taatctaagt tttaattaca aaggatccca tgttgatgat agtacagctt 60

ttggtctttg cactaggcct tgctgttgct gtcccaattc aaaactatac ccagtctcca 120

tcccagagag atgagagctc ccaatgggtg agcccgcatt attatccaac tccacaaggt 180

ggtaggctcc aagacgtctg gcaagaagca tatgctagag caaaagccat cgttggccag 240

atgactattg ttgaaaaggt caatttgacc actggtaccg gttggcaatt agatccatgt 300

gttggtaata ccggttctgt tccaagattc ggcatcccaa acctttgcct acaagatggg 360

ccattgggtg ttcgattcgc tgactttgtt actggctatc catccggtct tgctactggt 420

gcaacgttca ataaggattt gtttcttcaa agaggtcaag ctctcggtca tgagttcaac 480

agcaaaggtg tacatattgc gttgggccct gctgttggcc cacttggtgt caaagccaga 540

ggtggcagaa atttcgaagc ctttggttcc gacccatatc tccaaggtac tgctgctgct 600

gcaaccatca aaggtctcca agagaataat gttatggctt gtgtcaagca ctttattggt 660

aacgaacaag aaaagtacag acagccagat gacataaacc ctgccaccaa ccaaactact 720

aaagaagcta ttagtgccaa cattccagac agagccatgc atgcgttgta cttgtggcca 780

tttgccgatt cggttcgagc aggtgttggt tctgttatgt gctcttataa cagagtcaac 840

aacacttacg cttgcgaaaa ctcttacatg atgaaccact tgcttaaaga agagttgggt 900

tttcaaggct ttgttgtttc ggactggggt gcacaattaa gtggggttta tagcgctatc 960

tcgggcttag atatgtctat gcctggtgaa gtgtatgggg gatggaacac cggcacgtct 1020

ttctggggtc aaaacttgac gaaagctatt tacaatgaga ctgttccgat tgaaagatta 1080

gatgatatgg caaccaggat cttggctgct ttgtatgcta ccaatagttt cccaacagaa 1140

gatcaccttc caaatttttc ttcatggaca acgaaagaat atggcaataa atattatgct 1200

gacaacacta ccgagattgt caaagtcaac tacaatgtgg acccatcaaa tgactttacg 1260

gaggacacag ctttgaaggt tgctgaggaa tctattgtgc ttttaaaaaa tgaaaacaac 1320

actttgccaa tttctcccga aaaggctaaa agattactat tgtcgggtat tgctgcaggc 1380

cctgatccga taggttatca gtgtgaagat caatcttgca caaatggcgc tttgtttcaa 1440

ggttggggtt ctggcagtgt tggttctcca aaatatcaag tcactccatt tgaggaaatt 1500

tcttatcttg caagaaaaaa caagatgcaa tttgattata ttcgggagtc ttacgactta 1560

gctcaagtta ctaaagtagc ttccgatgct catttgtcta tagttgttgt ctctgctgca 1620

agcggtgagg gttatataac cgttgacggt aaccaaggtg acagaaaaaa tctcactttg 1680

tggaacaacg gtgataaatt gattgaaaca gttgctgaaa actgtgccaa tactgttgtt 1740

gttgttactt ctactggtca aattaatttt gaaggctttg ctgatcaccc aaatgttacc 1800

gcaattgtct gggccggccc attaggtgac agatccggga ctgctatcgc caatattctt 1860

tttggtaaag cgaacccatc aggtcatctt ccattcacta ttgctaagac tgacgatgat 1920

tacattccaa ttgaaaccta cagtccatcg agtggtgaac ctgaagacaa ccacttggtt 1980

gaaaatgact tgcttgttga ctatagatat tttgaagaga agaatattga gccaagatac 2040

gcatttggtt atggcttgtc ttacaatgag tatgaagtta gcaatgcaaa ggtctcggca 2100

gccaaaaaag ttgatgagga gttgcctgaa ccagctacct acttatcgga gtttagctat 2160

caaaatgcaa aagacagcaa aaatccaagt gatgcttttg ctccagcaga tttaaacaga 2220

gttaatgagt acctttatcc atatttagat agcaatgtta ccttaaaaga cggaaactat 2280

gagtatcctg atggctacag cactgagcaa agaacaacac ctaaccaacc tgggggcggc 2340

ttgggaggca acgatgcttt gtgggaggtc gcttataact ccactgataa gtttgttcca 2400

cagggtaact ccactgataa gtttgttcca cagttgtatt tgaaacaccc tgaggatggc 2460

aagtttgaaa cccctattca attgagaggg tttgaaaagg ttgagttgtc cccgggtgag 2520

aagaagacag ttgatttgag gcttttgaga agagatctta gtgtgtggga taccaccaga 2580

cagtcttgga tcgttgaatc tggtacttat gaggccttaa ttggcgttgc tgttaatgat 2640

atcaagacat ctgtcctgtt tactattctc gagggtaagc caattccaaa tcctttgttg 2700

ggtttagatt ctactgctag tggtggtggt ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt 2760

ggttctgcat gcactagtgt 2780

<210> 11

<211> 752

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggttctgca tgcactagtg tcgacctgca ggctcttcca actaacggta cttctactga 60

agctccaact gatactacta ctgaagctcc aaccaccggt cttccaacca acggtaccac 120

ttcagctttc ccaccaacta catctttgcc accaagcaac actaccacca ctcctcctta 180

caacccatct actgactaca ccactgacta cactgtagtc actgaatata ctacttactg 240

tccagaacca accactttca ccacaaacgg taagacttac accgtcactg aaccaaccac 300

attgactatc actgactgtc catgcaccat tgaaaagcca acaaccacat caaccaccga 360

atacactgta gtcactgagt acactactta ctgtccagaa ccaaccactt tcaccacaaa 420

cggtaagact tacaccgtca ctgaaccaac cactttgact atcactgact gtccatgtac 480

tattgaaaag agcgaagccc ctgagtcttc tgtcccagtt accgaatcta agggcactac 540

caccaaagaa acaggtgtta ctaccaaaca aaccacagcc aacccaagtc taaccgtctc 600

cacagtcgtc ccagtttcat cctctgcttc ttctcattcc gttgtcatca acagtaacgg 660

tgctaacgtc gtcgttccag gtgctttagg tttggctggt gttgctatgt tattcttata 720

acctgcagga ttgaattgaa ttgaaatcga ta 752

<210> 12

<211> 6062

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

attgaattga attgaaatcg atagatcaat ttttttcttt tctctttccc catcctttac 60

gctaaaataa tagtttattt tattttttga atatttttta tttatatacg tatatataga 120

ctattattta tcttttaatg attattaaga tttttattaa aaaaaaattc gctcctcttt 180

taatgccttt atgcagtttt tttttcccat tcgatatttc tatgttcggg ttcagcgtat 240

tttaagttta ataactcgaa aattctgcgt tcgttaaagc ttggcgtaat catggtcata 300

gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag 360

cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg 420

ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca 480

acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 540

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 600

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 660

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 720

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 780

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 840

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 900

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 960

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 1020

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 1080

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 1140

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 1200

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 1260

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 1320

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt 1380

cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta 1440

aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct 1500

atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg 1560

cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga 1620

tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt 1680

atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt 1740

taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt 1800

tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat 1860

gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc 1920

cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc 1980

cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat 2040

gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag 2100

aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt 2160

accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc 2220

ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa 2280

gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg 2340

aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa 2400

taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 2460

cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca 2520

agaattagct tttcaattca attcatcatt ttttttttat tctttttttt gatttcggtt 2580

tctttgaaat ttttttgatt cggtaatctc cgaacagaag gaagaacgaa ggaaggagca 2640

cagacttaga ttggtatata tacgcatatg tagtgttgaa gaaacatgaa attgcccagt 2700

attcttaacc caactgcaca gaacaaaaac atgcaggaaa cgaagataaa tcatgtcgaa 2760

agctacatat aaggaacgtg ctgctactca tcctagtcct gttgctgcca agctatttaa 2820

tatcatgcac gaaaagcaaa caaacttgtg tgcttcattg gatgttcgta ccaccaagga 2880

attactggag ttagttgaag cattaggtcc caaaatttgt ttactaaaaa cacatgtgga 2940

tatcttgact gatttttcca tggagggcac agttaagccg ctaaaggcat tatccgccaa 3000

gtacaatttt ttactcttcg aagacagaaa atttgctgac attggtaata cagtcaaatt 3060

gcagtactct gcgggtgtat acagaatagc agaatgggca gacattacga atgcacacgg 3120

tgtggtgggc ccaggtattg ttagcggttt gaagcaggcg gcagaagaag taacaaagga 3180

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atatactaag ggtactgttg acattgcgaa gagcgacaaa gattttgtta tcggctttat 3300

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gttgcatttt cggaagcgct cgttttcgga aacgctttga agttcctatt ccgaagttcc 4020

tattctctag ctagaaagta taggaacttc agagcgcttt tgaaaaccaa aagcgctctg 4080

aagacgcact ttcaaaaaac caaaaacgca ccggactgta acgagctact aaaatattgc 4140

gaataccgct tccacaaaca ttgctcaaaa gtatctcttt gctatatatc tctgtgctat 4200

atccctatat aacctaccca tccacctttc gctccttgaa cttgcatcta aactcgacct 4260

ctacattttt tatgtttatc tctagtatta ctctttagac aaaaaaattg tagtaagaac 4320

tattcataga gtgaatcgaa aacaatacga aaatgtaaac atttcctata cgtagtatat 4380

agagacaaaa tagaagaaac cgttcataat tttctgacca atgaagaatc atcaacgcta 4440

tcactttctg ttcacaaagt atgcgcaatc cacatcggta tagaatataa tcggggatgc 4500

ctttatcttg aaaaaatgca cccgcagctt cgctagtaat cagtaaacgc gggaagtgga 4560

gtcaggcttt ttttatggaa gagaaaatag acaccaaagt agccttcttc taaccttaac 4620

ggacctacag tgcaaaaagt tatcaagaga ctgcattata gagcgcacaa aggagaaaaa 4680

aagtaatcta agatgctttg ttagaaaaat agcgctctcg ggatgcattt ttgtagaaca 4740

aaaaagaagt atagattctt tgttggtaaa atagcgctct cgcgttgcat ttctgttctg 4800

taaaaatgca gctcagattc tttgtttgaa aaattagcgc tctcgcgttg catttttgtt 4860

ttacaaaaat gaagcacaga ttcttcgttg gtaaaatagc gctttcgcgt tgcatttctg 4920

ttctgtaaaa atgcagctca gattctttgt ttgaaaaatt agcgctctcg cgttgcattt 4980

ttgttctaca aaatgaagca cagatgcttc gttaacaaag atatgctatt gaagtgcaag 5040

atggaaacgc agaaaatgaa ccggggatgc gacgtgcaag attacctatg caatagatgc 5100

aatagtttct ccaggaaccg aaatacatac attgtcttcc gtaaagcgct agactatata 5160

ttattataca ggttcaaata tactatctgt ttcagggaaa actcccaggt tcggatgttc 5220

aaaattcaat gatgggtaac aagtacgatc cgatatatgc ggtgtgaaat accgcacaga 5280

tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg caactgttgg 5340

gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg gggatgtgct 5400

gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg taaaacgacg 5460

gccagtgaat tcgagctcgg taccacaatg catactttgt acgttcaaaa tacaatgcag 5520

tagatatatt tatgcatatt acatataata catatcacat aggaagcaac aggcgcgttg 5580

gacttttaat tttcgaggac cgcgaatcct tacatcacac ccaatccccc acaagtgatc 5640

ccccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg 5700

gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct 5760

ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag 5820

accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt 5880

ttcttgaaaa tttttttttt tgattttttt ctctttcgat gacctcccat tgatatttaa 5940

gttaataaac ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac 6000

tttttttact tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag ttttaattac 6060

aa 6062

<210> 13

<211> 2705

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgttgatga tagtacagct tttggtcttt gcactaggcc ttgctgttgc tgtcccaatt 60

caaaactata cccagtctcc atcccagaga gatgagagct cccaatgggt gagcccgcat 120

tattatccaa ctccacaagg tggtaggctc caagacgtct ggcaagaagc atatgctaga 180

gcaaaagcca tcgttggcca gatgactatt gttgaaaagg tcaatttgac cactggtacc 240

ggttggcaat tagatccatg tgttggtaat accggttctg ttccaagatt cggcatccca 300

aacctttgcc tacaagatgg gccattgggt gttcgattcg ctgactttgt tactggctat 360

ccatccggtc ttgctactgg tgcaacgttc aataaggatt tgtttcttca aagaggtcaa 420

gctctcggtc atgagttcaa cagcaaaggt gtacatattg cgttgggccc tgctgttggc 480

ccacttggtg tcaaagccag aggtggcaga aatttcgaag cctttggttc cgacccatat 540

ctccaaggta ctgctgctgc tgcaaccatc aaaggtctcc aagagaataa tgttatggct 600

tgtgtcaagc actttattgg taacgaacaa gaaaagtaca gacagccaga tgacataaac 660

cctgccacca accaaactac taaagaagct attagtgcca acattccaga cagagccatg 720

catgcgttgt acttgtggcc atttgccgat tcggttcgag caggtgttgg ttctgttatg 780

tgctcttata acagagtcaa caacacttac gcttgcgaaa actcttacat gatgaaccac 840

ttgcttaaag aagagttggg ttttcaaggc tttgttgttt cggactgggg tgcacaatta 900

agtggggttt atagcgctat ctcgggctta gatatgtcta tgcctggtga agtgtatggg 960

ggatggaaca ccggcacgtc tttctggggt caaaacttga cgaaagctat ttacaatgag 1020

actgttccga ttgaaagatt agatgatatg gcaaccagga tcttggctgc tttgtatgct 1080

accaatagtt tcccaacaga agatcacctt ccaaattttt cttcatggac aacgaaagaa 1140

tatggcaata aatattatgc tgacaacact accgagattg tcaaagtcaa ctacaatgtg 1200

gacccatcaa atgactttac ggaggacaca gctttgaagg ttgctgagga atctattgtg 1260

cttttaaaaa atgaaaacaa cactttgcca atttctcccg aaaaggctaa aagattacta 1320

ttgtcgggta ttgctgcagg ccctgatccg ataggttatc agtgtgaaga tcaatcttgc 1380

acaaatggcg ctttgtttca aggttggggt tctggcagtg ttggttctcc aaaatatcaa 1440

gtcactccat ttgaggaaat ttcttatctt gcaagaaaaa acaagatgca atttgattat 1500

attcgggagt cttacgactt agctcaagtt actaaagtag cttccgatgc tcatttgtct 1560

atagttgttg tctctgctgc aagcggtgag ggttatataa ccgttgacgg taaccaaggt 1620

gacagaaaaa atctcacttt gtggaacaac ggtgataaat tgattgaaac agttgctgaa 1680

aactgtgcca atactgttgt tgttgttact tctactggtc aaattaattt tgaaggcttt 1740

gctgatcacc caaatgttac cgcaattgtc tgggccggcc cattaggtga cagatccggg 1800

actgctatcg ccaatattct ttttggtaaa gcgaacccat caggtcatct tccattcact 1860

attgctaaga ctgacgatga ttacattcca attgaaacct acagtccatc gagtggtgaa 1920

cctgaagaca accacttggt tgaaaatgac ttgcttgttg actatagata ttttgaagag 1980

aagaatattg agccaagata cgcatttggt tatggcttgt cttacaatga gtatgaagtt 2040

agcaatgcaa aggtctcggc agccaaaaaa gttgatgagg agttgcctga accagctacc 2100

tacttatcgg agtttagcta tcaaaatgca aaagacagca aaaatccaag tgatgctttt 2160

gctccagcag atttaaacag agttaatgag tacctttatc catatttaga tagcaatgtt 2220

accttaaaag acggaaacta tgagtatcct gatggctaca gcactgagca aagaacaaca 2280

cctaaccaac ctgggggcgg cttgggaggc aacgatgctt tgtgggaggt cgcttataac 2340

tccactgata agtttgttcc acagggtaac tccactgata agtttgttcc acagttgtat 2400

ttgaaacacc ctgaggatgg caagtttgaa acccctattc aattgagagg gtttgaaaag 2460

gttgagttgt ccccgggtga gaagaagaca gttgatttga ggcttttgag aagagatctt 2520

agtgtgtggg ataccaccag acagtcttgg atcgttgaat ctggtactta tgaggcctta 2580

attggcgttg ctgttaatga tatcaagaca tctgtcctgt ttactattct cgagggtaag 2640

ccaattccaa atcctttgtt gggtttagat tctacttaac ctgcaggatt gaattgaatt 2700

gaaat 2705

Claims (10)

1.一种提高酿酒酵母中异源蛋白的细胞外分泌的方法，该方法包括将一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞作为宿主细胞，进行异源蛋白细胞外分泌；所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1、CCW12、LDB17、CWP2；优选地，异源蛋白为β-葡萄糖苷酶；

更优选地，异源蛋白细胞外分泌的方法为：1)制备细胞外分泌型重组质粒；2)将重组质粒转化至本发明所述的酿酒酵母细胞内，进行培养。

2.一种提高酿酒酵母中异源蛋白的表面展示表达的方法，该方法包括将一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞作为宿主细胞，进行异源蛋白表面展示表达；所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、FKS1、NPP1、CCW12、SHE10或PRY3；优选地，异源蛋白为β-葡萄糖苷酶；

更优选地，异源蛋白表面展示表达的方法为：1)制备细胞外分泌型重组质粒；2)将重组质粒转化至本发明所述的酿酒酵母细胞内，进行培养。

3.根据权利要求1或2的方法，一个或多个细胞壁相关蛋白失活或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞通过以下方法获得：通过基因敲除、RNAi或CRISPRi方法将细胞壁相关蛋白的基因失活。

4.一种同时提高酿酒酵母中异源蛋白的细胞外分泌和表面展示表达的方法，该方法包括将一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞作为宿主细胞，进行异源蛋白表面展示表达；所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1、CCW12；

优选地，异源蛋白为β-葡萄糖苷酶；

更优选地，异源蛋白表面展示表达的方法为：1)制备细胞外分泌型重组质粒和表面展示表达重组质粒；2)将重组质粒转化至所述的酿酒酵母细胞内，进行培养。

5.一种酿酒酵母细胞作为提高异源蛋白的细胞外分泌的宿主细胞的用途；所述酿酒酵母细胞为一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞；所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1、CCW12、LDB17、CWP2；优选地，所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1。

6.一种酿酒酵母细胞作为提高异源蛋白的表面展示表达的宿主细胞的用途；所述酿酒酵母细胞为一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞；所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、FKS1、NPP1、CCW12、SHE10或PRY3；优选地，所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、YPS7、LDB17。

7.一种酿酒酵母细胞作为同时提高异源蛋白的表面展示表达和细胞外分泌的宿主细胞的用途，所述酿酒酵母细胞为细胞壁相关蛋白FG5、NPP1、CCW12中的一种或多种失活的酿酒酵母细胞或敲除编码细胞壁相关蛋白FG5、NPP1、CCW12中的一种或多种基因的酿酒酵母细胞。

8.一种表面展示表达异源蛋白的酿酒酵母；所述的酿酒酵母为一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞，并且所述酿酒酵母还含有表面展示重组质粒；

异源蛋白为β-葡萄糖苷酶；

所述表面展示重组质粒中包含含有V5标签和连接序列的β-葡萄糖苷酶的片段、SED1表面展示片段以及质粒骨架片段；

所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、FKS1、NPP1、CCW12、SHE10或PRY3；优选地，所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、YPS7、LDB17。

9.一种细胞外分泌异源蛋白的酿酒酵母，所述的酿酒酵母为一个或多个细胞壁相关蛋白失活的酿酒酵母细胞或敲除一个或多个编码细胞壁相关蛋白基因的酿酒酵母细胞，并且所述酿酒酵母还含有细胞外分泌重组质粒；

异源蛋白为β-葡萄糖苷酶；

所述细胞外分泌重组质粒中包含含有分泌性的β-葡萄糖苷酶的片段以及质粒骨架片段；

所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1、CCW12、LDB17、CWP2；优选地，所述细胞壁相关蛋白选自DFG5、NPP1。

10.一种表面展示表达同时细胞外分泌异源蛋白的酿酒酵母，所述的酿酒酵母为细胞壁相关蛋白FG5、NPP1、CCW12中的一种或多种失活的酿酒酵母细胞或敲除编码细胞壁相关蛋白FG5、NPP1、CCW12中的一种或多种基因的酿酒酵母细胞，并且所述酿酒酵母还含有细胞外分泌重组质粒和表面展示重组质粒；

异源蛋白为β-葡萄糖苷酶；

所述细胞外分泌重组质粒中包含含有分泌性的β-葡萄糖苷酶的片段以及质粒骨架片段；

所述表面展示重组质粒中包含含有V5标签和连接序列的β-葡萄糖苷酶的片段、SED1表面展示片段以及质粒骨架片段。

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