JP5628477B2

JP5628477B2 - 肥満治療用植物細胞膜の使用

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Publication number: JP5628477B2
Application number: JP2008515656A
Authority: JP
Inventors: ペル−オーケ・アルベルトソン; シャルロッテ・エルランソン・アルベルトソン
Original assignee: ティラビスコアーベー
Priority date: 2005-06-10
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2026-06-09
Also published as: CN101193649B; CN101193649A; KR20080021127A; AU2006255805B2; ES2681894T3; CA2609208A1; JP5924787B2; US9186384B2; PT1893224T; US9333226B2; US20140220084A1; US8642098B2; EP1893224A4; JP2008545779A; CA2609208C; US20100047270A1; PL1893224T3; EP1893224A1; HUE040501T2; DK1893224T3

Description

本発明は、脂質分解活性の低減および／または脂肪消化の遅延、食欲と体重の抑制および／または血中脂質の低下のための、少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物の使用に関する。本発明は、また、食品組成物ならびに医薬品での前記疎水性ペプチドの使用、および前記組成物により哺乳類を治療する方法に関する。

太り過ぎおよび肥満は、ますます世界的な問題となってきている。肥満は、特定の癌形態ばかりではなく、糖尿病、動脈硬化症、高血圧症等、いくつかの疾病の合併症の増加をもたらす。高脂肪食餌は、それが単独であれ、ショ糖を添加したものであれ、これらの食餌が容易に過食を促すので、肥満をもたらす最も重要な因子の一つである。したがって、食物脂肪に対する食欲コントロールを最適化することにより肥満を減らすことは大変重要である。腸内への脂肪注入により実証されているように、脂肪に対する満腹感(satiety for fat)は主として腸からの働きかけによるものであり、この満腹感が食物摂取量を減らすのである（Greenberg D. and Smith, G.P., Psychosomatic medicine 58: 559-569, 1996）。これらの条件下で食物摂取量が抑制される理由は、腸粘膜に脂肪が接触することにより腸内に様々な満腹ペプチドが放出されるからである。食物脂肪の産物である脂肪酸は産生直後に吸収されるので、脂肪消化率の減少が、脂肪に対する満腹感を理論上最適化することになろう。

腸での脂肪消化中の重要な酵素は膵臓リパーゼである。肥満に抗する薬剤としてリパーゼ阻害剤（ゼニカル）を使用することは十分に確立されている（Sjostrom L. 他, Lancet 352: 167-172, 1998）。リパーゼ阻害剤は体重を減らすだけでなく、抗インシュリン性を改善する。したがって、このような知見は、脂肪に対する満腹感およびインシュリン感受性に対する腸の脂肪消化の役割に関する強力な証拠を提供する。このリパーゼ阻害剤の短所は、すべての型のリパーゼを阻害し、大きく損なわれた脂肪消化に起因して脂肪便症を生ずることである。したがって、副作用として脂肪便症(steatorrhea)をもたらさずに、より穏やかな方法で脂肪消化を遅らせる天然の化合物を開発することが最重要である。本願発明者は、脂肪消化を遅らせて、満腹ホルモンを増すことによって食欲を抑制し、血清トリグルセリドレベルを下げる、高い栄養価の天然の化合物を発見した。

本発明は、脂質分解活性の低減および／または脂肪消化の遅延、食欲と体重の抑制および／または血中脂質の低下のための、組成物の使用に関する。脂質分解活性の低下により脂肪消化は遅延し、食欲が抑制され、それによって、例えば肥満を予防する満腹感が促進される。

第一の局面において、本発明は、脂質分解活性の低減、および／または脂肪消化の遅延、食欲と体重の抑制、および／または血中脂質の低下のための、少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物の使用に関する。

第二の局面によれば、本発明は、医薬組成物としての前記組成物の使用に関する。

第三の局面によれば、本発明は、食品組成物としての前記組成物の使用に関する。

本発明の組成物を使用して、例えば、疾患または障害としてのメタボリック症候群の治療のために、食欲を調整してもよい。

発明の詳細な説明

定義
本出願および本発明の文脈中、以下の定義を適用する：
用語「細胞膜」は、動物、植物または微生物起源の修飾もしくは未修飾の天然または合成的に作られた生体細胞膜を意味するものとし、そこでの細胞膜は、該細胞膜の疎水性ペプチドまたは疎水性蛋白質のような、細胞膜の部分または部分および完全な細胞膜の混合物、ならびに完全な細胞膜またはその画分を含む。細胞膜の部分は0.1から0.5μmの間にあり、一つまたは複数の膜貫通ペプチドをもっぱら含むだろう。

用語「疎水性ペプチド」は、アルギニンおよびグルタミン酸のような荷電残基をともなう少数のアミノ酸と共に、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン(phenylalanine)、トリプトファン、メチオニン、グリシン、システインから成る群からの選択された、疎水性アミノ酸残基を少なくとも85%有するペプチドを意味する。

用語「脂質分解活性」は、リパーゼによる脂質の加水分解率を意味するように意図される。

用語「膜貫通ペプチド」は、少なくともタンパク質の膜貫通部分を形成するアミノ酸残基を意味する。ペプチドは、15から25の間のアミノ酸残基で構成される一続きおよびその重複等、一つの膜貫通タンパク質の一つまたは複数の膜貫通部分であってよい。

組成物
本発明は、脂質分解活性の低減および／または脂肪消化の遅延、食欲と体重の抑制および／または血中脂質の低下のための、少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物の使用に関する。脂質分解活性の低減により、脂肪消化を遅延させ、食欲と体重を抑制しおよび／または血中脂質を低下させることが可能である。それによって、効率的に人間または他の動物等の哺乳類の食欲を調整することが初めて可能である。脂質分解活性の調節を可能にすることによって、腸において脂肪酸がゆっくり形成されることで満腹感が促がされ、これが持続することになる。

組成物は、少なくとも生体タンパク質の膜貫通部分を含んでもよく、該膜貫通部分は疎水性アミノ酸残基を含む。したがって、組成物は生体膜またはその一部を含んでおり、該生体膜は少なくとも該疎水性ペプチドを含む。組成物は、同一のタンパク質または異なるタンパク質に由来する2、3、4または5つの疎水性ペプチド等、少なくとも一つの、約15からの約25のアミノ酸残基を有する細胞膜疎水性ペプチドを含んでもよく、組成物は構成されてもよい。

生体細胞膜は、例えばすべての生細胞の中に生じて、細胞量の大部分を構成する。本発明に記載の細胞膜画分の例は、動物、植物、藻類、微生物からの得られた細胞膜画分、またはそれらの部分の細胞膜画分であり、それらは合成物またはその混合物である。原核生物では一重または二重の細胞膜があり、光合成細菌では光合成膜であるチラコイドもある。真核生物では、膜は細胞膜、小胞体、ゴルジ膜、核膜、リソソーム膜、ミトコンドリア膜を含み、緑藻類および植物については、２つのエンベロープ膜および光合成膜（チラコイド）を含む葉緑体膜も有する。生体膜はタンパク質および脂質からなる。生体膜はすべて、疎水性アミノ酸からなる一つまたはいくつかの膜貫通ポリペプチド鎖を伴う内在性膜タンパク質を含んでいる。リン脂質およびガラクトリピドのようなほとんどの脂質は、内在性の膜／膜貫通タンパク質が包埋される二重層を形成する。さらに、表在性蛋白質は膜の表面へ付着されている。チラコイドは植物、緑藻類で、および藍色細菌および紅色細菌のような光合成細菌で光合成を担う。チラコイド膜は、約70／30パーセントの比率でタンパク質および脂質を含む。膜中には100種類を超えるタンパク質が存在している。脂質画分は、オメガ-3型を主要脂肪酸とするガラクトリピドが占めている。さらに、チラコイド膜はいくつかの異なる色素である、クロロフィルa、クロロフィルb、プラストキノン、カロテノイド類のβ-カロチン、ルテイン、ビオラキサンチンおよびネオキサンチンを含んでいる。これはチラコイドが高い栄養価の組成物を有していることを意味し、同じことがチラコイドと同一または実質的に同一の組成物を有している合成膜にも当てはまる。すなわち、チラコイドだけでなく葉緑体も、本発明の食品製品でも食品添加物でも使用されてよい。生体膜の例は葉緑体またはチラコイド膜であり、これらの膜は、クローバ、アブラナ、サトウダイコン、タンポポ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、タバコ、ヒマワリ、サラダ用生野菜、アカザ、ヤマホウレンソウ、ホウレンソウおよび草、またはその混合物から得られてもよい。

したがって、組成物が少なくとも一つの疎水性ペプチドを含む場合、該ペプチドは、16、17、18、19、20、21、22または24アミノ酸残基長を有していてもよい。ペプチドの例は、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3またはその混合物で示され、ペプチドはお互いにに操作しやすく結合されてもよい。アミノ酸残基は、アルギニンおよびグルタミン酸のような荷電残基を伴う少数のアミノ酸と共に、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、システインから成る群から選択されてもよい。アミノ酸残基およびペプチドは合成または天然存在物であってもよいし、同じことはアミノ酸残基に当てはまる、すなわち、それらが疎水性残基または荷電残基を伴う限り、それらは天然か合成アミノ酸残基であってもよい。膜画分は細胞膜画分であってもよく、より小さい断片の細胞膜を供給するために、一つまたは複数の酵素により処理される。

本発明の該生体膜またはその部分のサイズ分布は、例えば0.1、0.2、0.3、0.4、0.5または1.0μm等、0.1μmから約5μmであってよい。

さらに、疎水性ペプチドは約1から約50までの追加アミノ酸残基を有してよく、アミド化、エステル化、アシル化、アセチル化、PEG化またはアルキル化によって修飾されてもよい。

光合成膜は、すべての生体膜で量に関しては地球上で最も豊富である。植物からの緑葉は、本発明の目的のための葉緑体膜の大量の単離および調製のために便利で豊富な材料源である。

生体膜は、各実施例において述べたような様々な方法で単離できる。最も一般的な方法は、最初に機械的に細胞を崩壊させることであり、異なる大きさおよび組成を持った膜小胞をもたらす。大きな細胞残屑を低速度遠心分離によって取り除き、次に上清の膜小胞を分画遠心分離または勾配遠心分離によって集める。代替としては、大きな細胞残屑がろ過によって取り除き、膜小胞は遠心分離によって集める。

遠心分離を含まない方法を計画することも可能である。この場合、大きな細胞残屑をろ過によって最初に取り除く。そして細胞膜を凝集させることができる。すなわち、以下に示すような異なる手順によって沈殿させた：
1. 沈殿時のpHに達するように、酸または塩基を追加する
2. 沈殿を誘導する、多かれ少なかれ荷電した異なる基を有するポリマーを追加する、
3. 小胞懸濁液を、例えば40〜100の℃間で加熱する。

4. 小胞を少容量相中へ濃縮する水性の二相系での分配により小胞を回収する（Albertsson P.A. Partition of cell Particles and macromolecules. Wiley, New York, 1986）。

5. 上記4）で与えられた相系のような液−液二相系の境界面または水−油相系で回収する。

6. エマルジョンをもたらす水−油相系の境界面で回収する。

7. リン酸カルシウム、シリカ、様々なイオン交換樹脂等の固形物質上へ吸着する。

8. 凍結および融解。凝集物を融解させた後、生じた水結晶により小胞が凝集体へと濃縮される。

疎水性ペプチドは、自動化手順による合成を含む標準的な化学的手法によって合成されてもよい。一般に、ペプチドアナログは、結合剤としてHATU（N -[ジメチルアミノ-1H-1.2.3-トリアゾロ[4,5-B]ピリジン-1-イルメチレン]-N-メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファートN-オキシド）またはHOAt-1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール等の他の結合剤による標準固相Fmoc保護方法に基づいて合成される。ペプチドは、適切な捕捉剤を含むトリフルオロ酢酸（側鎖官能基の脱保護もする）により固相樹脂から切断される。粗精製ペプチドは調製的逆相クロマトグラフィを使用してさらに精製される。分配クロマトグラフィ、ゲル濾過、ゲル電気泳動法またはイオン交換クロマトグラフィのような他の精製方法を使用してもよい。tBoc保護方法のような当該技術分野において公知である他の合成技術または異なる結合試薬または同種を使用して、同等のペプチドを生じさせることができる。

ペプチドを、代替として、組換体産生により合成してもよい（例えば米国特許第5,593,866号を参照）。大腸菌のような細菌、出芽酵母またはピチア属のような酵母、 Sf9のような昆虫、およびCHOまたはCOS-7のような哺乳動物細胞を含む、様々な宿主系はペプチドアナログの産生に適している。ベクターおよび宿主が抗菌ペプチドを生産することができる限り宿主の各々について使用できる多くの発現ベクターがあり本発明はそれらのいずれも制限しない。大腸菌におけるクローニングおよび発現のためのベクターおよび手順は、例えば、Sambrook 他（Molecular Cloning.: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1987）およびAusubel 他（Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Co., 1995）に見出すことができる。

本発明の組成物は、乾燥、冷凍、または冷凍乾燥されるだけではなく、以下に述べるうちの一つのような従来方法によって得られた天然抽出物等の任意な形態であってよい。

本発明の組成物は、食品添加物として使用されてもよく、食品製品に加えられる前、または食品製品への添加の途中のどちらかで、脂肪、バター、マーガリン、油、クリーム、牛乳、チーズ、ブリーチーズ、小麦粉、ジュース、ソフトドリンク、茶等、他の構成要素と混合されてもよい。

前記組成物を含む前記食品添加物または食品組成物は、固形、半固形、または液体の形態であってよい。さらにそれは冷凍乾燥、噴霧乾燥または凍結乾燥されたものであってもよい。本発明の食品添加物は、単独で使用するだけでなく、任意の種類の食品製品に使用してもよい。食品製品例は、脂肪、バター、マーガリン、油、クリーム、牛乳、チーズ、ブリーチーズ、小麦粉、ジュース、ソフトドリンク、茶である。その他の例はヨーグルト、アイスクリーム、ケーキ、パンおよびドレッシングである。

本発明の組成物を医薬組成物として使用してもよい。医薬組成物は、薬学的に許容される緩衝液、賦形剤、担体または希釈剤、そして本発明の組成物を含む。治療疾患例は、疾患または障害のいずれかとしての高血圧症、動脈硬化症、痛風、１型および２型糖尿病、癌および異脂肪血症のようなメタボリック症候群である。

「薬学的に許容される」とは、有効成分（すなわち抗菌ペプチド）の生物活性の有効性を減少させない、無毒な材料を意味する。そのような薬学的に許容される緩衝液、担体または添加剤は当該技術分野において周知である（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990)およびhandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000)を参照）。

用語「緩衝液」は、pHを安定させる目的を持つ、酸−塩基混合物を含む水溶液を意味する。緩衝液の例は、トリズマ、ビシン、トリシン、MOPS、MOPSO、MOBS、トリス、Hepes、HEPBS、MES、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、グリコール酸塩、乳酸塩、ホウ酸塩、ACES、ADA、酒石酸塩、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、カコジル酸塩、CHES、DIPSO、EPPS、エタノールアミン、グリシン、HEPPSO、イミダゾール、イミダゾール乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSOおよびTESである。

用語「希釈剤」は、医薬の調製においてペプチドを希釈する目的をともなう水溶液または非水溶液を意味する。希釈剤は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノールまたは油（サフラワー油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油または胡麻油等）の一つまたは複数であってもよい。

用語「アジュバント」は、ペプチドの生物学的作用を増すために製剤に加えられた任意の化合物を意味する。アジュバントは異なる陰イオンをともなう、亜鉛塩、銅塩または銀塩の一つまたは複数であってもよく、例えば、フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物、チオシアン酸塩(thiocyanate)、亜硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、炭酸塩、乳酸塩、グリコール酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、および異なるアシル組成物の酢酸塩であるが、これらに限定されない。

賦形剤は、炭水化物、ポリマー、脂質および無機物の一つまたは複数であってもよい。炭水化物の例はラクトース、ショ糖、マンニトールおよびシクロデキストリンを含み、例えば組成物に凍結乾燥の促進のために加えられる。ポリマーの例は、デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール(polyethyleneglycol)／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシド共重合体、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニル、およびポリビニルピロリドンであり、異なる分子量のすべてのものは、生体接着が行なわれるようにするために、または化学的分解および蛋白質分解から脂質を保護するために、例えば粘度調節のために、組成物に加えられる。脂質の例は脂肪酸である、リン脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、セラミド、スフィンゴ脂質および糖脂質、異なるアシル鎖長および飽和度のすべてのもの、卵レシチン、ダイズレシチン、水素化した卵およびダイズレシチンであり、ポリマーのための理由に類似する理由で組成物に加えられる。無機物の例はタルク、酸化マグネシウム、酸化亜鉛および酸化チタンであり、液体の蓄積の減少または都合のよい色素特性のような利点を得るために組成物に加えられる。

デンプン、セルロースエーテル、セルロースカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラギーナン、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリアクリル酸、ポリスルホン酸塩、ポリエチレングリコール／ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシド／ポリ酸化プロピレン共重合体、異なる加水分解度のポリビニルアルコール／ポリ酢酸ビニルおよびポリビニルピロリドンのようなポリマーが、ペプチドを含んでいる溶液の濃厚化のために使用される場合、本発明の組成物はポリマーゲルの形であってもよい。

例えば本明細書の他の部分で開示するように、医薬組成物を殺菌のような従来の製薬工程にさらしてもよく、および／または、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液、増量剤などのような従来のアジュバントを含んでいてもよい。

適切な調製形態には例えば：顆粒；粉末；錠剤；コーティング錠；（マイクロ）カプセル；シロップ；エマルジョン；水、油および界面活性剤からなる光学等方性の熱力学的に安定した系として定義されたマイクロエマルジョン；長距離秩序はあるが短距離秩序の無いことによって特徴づけられる系として定義された液晶相（例えば、水相または油相のいずれかのラメラ相、六方相、および立方相を含む）またはそれらの分散した相当物であるゲル剤；軟膏剤；分散液；懸濁液；クリーム；エアゾール；小滴またはアンプル形態の注射剤；および活性化合物の徐放をともなう調製：があり、その調製においては、上で説明したように、添加剤、希釈剤、アジュバントまたは担体が慣習的に使用される。

患者には、薬学的有効量の医薬組成物が投与されることになる。「薬学的有効量」は、投与される条件に関して所望の効果をもたらすのに十分な用量を意味している。正しい用量は、化合物の活性、投与の様式、疾患の性質および重症度、患者の年齢および体重に依存し、異なる用量が必要となろう。投与量は、個々の用量単位または他の場合には数回のより少ない用量単位の形態での単一投与、および特定間隔で細分された用量の複数回の投与、という両方によって行なうことができる。

本発明は、とりわけヒトと、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ラクダ等の他の哺乳類との両方に関係する。したがって、本方法は、ヒトの治療および獣医学用途の両方に適用可能である。そのような治療に適している対象は、確立した特徴によって同定されるだろう。

以下に、本発明の実施例として、ホウレンソウからの葉緑体膜であるチラコイドの単離、ならびに膵臓リパーゼ活性の阻害および食物摂取量の減少におけるそれらの適用について説明する。次の実施例は、任意の様式、姿、または形態で本発明を明示的かつ黙示的に説明するが、それらに限定されるものではない。

膜および膜蛋白質の調製
Danielsson 他 Biochim Biophys Acta 1608, 53-61 (2004) に記載されているように、リパーゼ分析で使用するためのチラコイドを単離した。食品調製のために、チラコイドを以下のように単離した：葉を破砕器でホモジネートし、ナイロンメッシュ（20μm）の4層を通して濾過した。チラコイドを集めるために、濾液を5000gで10分間、遠心分離機にかけた。これらを水中での再懸濁によって洗浄し、前のように再度遠心分離機にかけた。脂質抽出： 40mLクロロホルム／メタノールと混合した4mlのチラコイド懸濁液（3.8mgクロロフィル／mL）を、氷上で1時間インキュベートした。4000gで10分間の遠心分離後、ペレットの第2回目の抽出を行い、前のように遠心分離機にかけた。ペレットを空気中で乾燥し、水溶性蛋白質を取り除くために、チラコイド単離に使用した緩衝液溶液10 mLによって氷上で抽出した。混合物を4000gで10分間の遠心分離機にかけ、ペレットを集めた。これを「膜蛋白質画分」と命名する（図1）。トリプシン処理は、チラコイドを、300μgトリプシン（III型Sigma）／mgクロロフィルにより、20mMリン酸塩緩衝液（pH 7.4）中で37℃、45分間のインキュベーションにより行なった。トリプシンを阻害するために1mMフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）を加えた後に、チラコイドを900gで10分間の遠心分離によって集めた。上記 (Danielsson et al. Biochem Biophys Acta 1608, 53-61 (2004)) のようにクロロフィルを測定し、Bradford (Bradford, M. M.. Anal Biochem 72,248-54 (1976) にしたがい蛋白質を測定した。Andersson, B. & Albertsson, P.-A. J. Cliromatogr. 890, 131-141 （1981）に記載されているようにして、集光性複合体II（LHCII）を調製した。（Petit, P. X., Edman, P., Gardestrom, P. & Ericson, I. Biochim Biophys Acta 890, 377-386 （1987））にしたがって、バレイショ塊茎からミトコンドリアを調製した。（Kjellbom, P. & Larsson, C. Physiol Plant 62, 501-509 （1984））にしたがって、ホウレンソウ葉から細胞膜を調製した。（Norling, B., Zak, E., Andersson, B. & Pakrasi, H. FEBS Lett 436, 189-92 （1998））にしたがって、シネコシスティス(Synechocystis)から膜を調製した。（Wang, H., Franke, C. C, Nordlund, S. & Noren, A. FEMS Microbiol Lett 253: 273-279 （2005））にしたがって、ロドスピリルム・ルブルムから色素胞を調製した。（Wang, H., Franke, C. C, Nordlund, S. & Noren, A. FEMS Microbiol Lett 253: 273-279 （2005））にしたがって、使用前に、0.5MNaCl、25mMトリス-HCl、pH 7.8で洗浄、続いてトリス緩衝液単独で2回洗液して、表在性水溶性蛋白質を取り除いた。（Althage, M. 他 Biochim Biophys Acta 1659, 73-82 （2004））にしたがって、大腸菌からトランスヒドロゲナーゼを調製した。（Romanowska, E. & Albertsson, P.-Å. Plant Cell Physiol 35, 557-568 （1994））にしたがって、ホウレンソウ葉からシトクロムb₆fを調製した。

細胞膜（チラコイド）の粗調製
新鮮な、または冷凍のホウレンソウ葉を小片に裁断した。これら小片を水中に懸濁させ、ほとんどの細胞が破壊されるまで機械的ミンサーを用いて崩した。次に、このスラリをポアサイズ20μmのナイロンネットによって濾過した。濾液を2000xgで5分間、遠心分離機にかけた。このペレットを水中に再懸濁させ、2000xgで5分間、再度遠心分離機にかけた。これを冷凍または乾燥状態で保存した。代替として、沈澱剤を濾液に加えた。膜が沈殿するように、例えばpH 4〜5のような低pHになるまで酸を添加することにより、濾液を酸性化した。沈殿物をpH 4〜5の水中での再懸濁させて、これを再沈降させることにより洗浄した。沈殿物は回収される。

粗精製細胞膜画分の調製
ほとんどの細胞が破壊されるまで、水中に懸濁させた細胞をさらにミンサーによって機械的に崩した。破壊されていない細胞および細胞壁の大きな断片を除去するために、このスラリを濾過した。濾液を10000xgで10分間、遠心分離機にかけた。ペレットを再懸濁させ、10000xgで10分間、再度遠心分離機にかけた。このペレットを回収し、冷凍または乾燥状態で保存した。

もっぱら濾過の使用によるホウレンソウからのチラコイドの調製。

新鮮または冷凍のホウレンソウ葉を小片に裁断した。これら小片を水中に懸濁させ、ほとんどの細胞が破壊されるまで機械的ミンサーによって崩した。次に、このスラリをポアサイズ20μmのナイロンネットによって濾過した。凝集を誘導するために、pHが4.7に達するまで濾液に酢酸を追加した。凝集物が容器の底に沈降した時に、上清を静かに移して取り除く。次に凝集物をポアサイズ20μmのフィルタ上に載せる。凝集したチラコイドはフィルタにとどまり、pH 4.7の水で洗浄することができる。洗浄されたチラコイドを回収し、所望のpHに調節した後に、それらを冷凍または乾燥状態で保存する。

リパーゼ活性の測定
リパーゼ活性を以下にしたがって測定した（Borgstrom B. and Erlanson C. European J. of Biochemistry 37: 60-68, 1973）：pH 7.0の 1mMトリス緩衝液と、1mM塩化カルシウムと、150mM塩化ナトリウムと、4mMタウロデオキシコール酸ナトリウムと、0.5μgリパーゼと、1μgコリパーゼとを含む15ml水溶液。

この混合物に、0.5mlトリブチリンを膜の量を増すと共に加え、放出された脂肪酸をpHスタットを使用して測定した。

リパーゼ活性に対する生体膜の効果を図1〜2に示す。膜蛋白質および合成ポリペプチドの効果を図3にさらに示す。

食品製品の調製および食物摂取量に与える効果
ケーキ（500g、エネルギーの42%が脂肪）を以下の方法で調製した:

30gの水中で懸濁した葉緑体膜（1000mgクロロフィルを含むチラコイド）

手順：
デンプンおよび油をフードプロセッサ（Bosch Universal）で混合した。残りの固形成分、続いてゼラチン溶液を加えた。完全に混合した後、葉緑体膜（チラコイド）を含む水、または葉緑体膜（チラコイド）を含まない水を最終的に加えた。ケーキを２日間、70℃でオーブンで焼いた。

図4に示す実験を以下の方法で行なった。

メスのスプレーグドーリーラット（200g）（B&K, Sollentuna, Swedenから）を、12時間明期（6:00〜18:00）／12時間のサイクル下の恒温室（22±1℃）で飼育し、自由給水と、高脂肪食実験中の特別の指定のない限り標準餌の不断給餌とが行なわれた。動物を使用するすべての手順は、Local Animal Ethics Committee Lund, Lund, Swedenによる承認を受けた。

給餌手順
食餌消費を測定するために、ラットをケージで個別に飼育し、研究開始前に1週間高脂肪食を与えた。説明したように、与えた飼料は、高脂肪食のカロリー密度は4.7kcal／gで、エネルギーの42.1%は脂肪、23.9%はタンパク質、34.0%は炭水化物であった（Lindquist 他 Regul. Pept. 130: 123-132 （2005））。チラコイドを含む高脂肪食は、食品グラム当たり2mgのクロロフィル濃度で、精製チラコイドを添加した高脂肪食として調製した。食物摂取量を毎日測定し、飼育期間の開始時および終了時に体重を測定した。

食餌のこぼれた量の形跡について、ケージを注意深く監視した。

値は平均値±標準誤差であり、対照飼料およびチラコイド投与間で* P<0.05の有意水準および**P<0.01の有意水準である。TG=トリグリセリド、CCK=コレシストキニン

実施例7
食品エマルジョン
家庭用ミキサで完全に処理する前に、野菜（300g）を室温で0.5時間解凍した。家庭用ジュース遠心機に細かくカットした野菜を入れて、野菜ジュースを作った。

野菜ジュース（60g）とトリグリセリド油（30g）を、ステンレス鋼切断刃を装備した携帯型ミキサでホモジネートすることによって、滑らかで美味なエマルジョンを得た。ブロッコリおよびホウレンソウジュースから作ったエマルジョンを、0.5時間（室温保存）および10時間（冷蔵庫保存）の後に、遊離油および／または水相の有無について視覚検査を行った。

検査の結果を上記の表に要約するが、癒着が観察されないことから、エマルジョン中の油小滴が非常に安定していることが分かる（遊離油相が無い）。

葉からの生体膜による膵臓リパーゼの阻害を示す。ホウレンソウ（黒円）；クローバ（黒正方形）；シロイヌナズナ（三角形）；アブラナ（円）およびサトウダイコン（十字形）からの葉緑体膜。生体膜による膵臓リパーゼの阻害を示す。バレイショ塊茎からのミトコンドリア（正方形）、ニワトリ心臓からのミトコンドリア（黒円）、ホウレンソウ葉からの細胞膜（菱形）、シネコシスティスからの膜（十字形）およびロドスピリルム・ルブルムの色素胞（三角形）。単離された膜タンパク質による膵臓リパーゼの阻害を示す。集光性クロロフィルa／b複合体、LHC II（三角形）、LHCIIのαヘリックスの一つと同じアミノ酸配列（すなわちVIHCRWAMLGALGCVFPELL）をともなう合成ポリペプチド（十字形）、トランスヒドロゲナーゼ（菱形）およびチトクロムb₆f複合体（正方形）。高脂肪食実施中のスプレーグドーリーラットにおける１１日間の葉緑体膜（チラコイド）による治療効果を示す。葉緑体膜有り（正方形）および無し（三角形）での食物摂取量。毎日の食物摂取量は、各群における８匹の動物からの平均値±SEMとして与えられる（n=8）。チラコイド治療開始後の体重増加量、血清トリグリセリドおよび血漿コレシストキニンについてのデータを表1に示す。

Claims

少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物であって、
前記細胞膜またはその部分が植物から得られるチラコイド膜であり、
前記チラコイド膜が、ホウレンソウから得られ、
食欲の抑制、食物摂取の減少、および／または体重の低下に使用するための組成物。
前記組成物が、細胞膜タンパク質の少なくとも膜貫通部分を含み、前記膜貫通部分は疎水性アミノ酸残基を含む請求項１に記載の組成物。
前記組成物が、１５から２５までのアミノ酸残基を有する細胞膜疎水性ペプチドの少なくとも一つを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
前記疎水性ペプチドが、配列番号：１である請求項３に記載の組成物。
前記細胞膜またはその部分が、０．１μｍから５μｍのサイズ分布を有する請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
前記組成物が、さらに薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または緩衝液を含む請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
少なくとも一つの細胞膜またはその部分を含む組成物であって、前記細胞膜またはその部分が植物から得られるチラコイド膜であり、
前記チラコイド膜またはその部分が、クローバ、アブラナ、サトウダイコン、シロイヌナズナおよびホウレンソウ、またはその混合物から得られ、
疾患または障害のいずれかとしてのメタボリック症候群及び／または肥満症の治療で使用するための組成物。
前記チラコイド膜が、ホウレンソウから得られる、請求項７に記載の組成物。
前記組成物が、さらに薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または緩衝液を含む請求項７又は８に記載の組成物。