JP5588465B2

JP5588465B2 - キチン由来のスポンジ止血材及びその製造方法

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Publication number: JP5588465B2
Application number: JP2011553658A
Authority: JP
Inventors: 誠司黒住; 稔福田; 吉守高森; 道寛岩崎
Original assignee: Koyo Chemical Co Ltd
Current assignee: Koyo Chemical Co Ltd
Priority date: 2010-02-15
Filing date: 2010-02-15
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2030-02-15
Also published as: JPWO2011099087A1; WO2011099087A1

Description

本発明は、非晶質の部分脱アセチル化キチン塩を主成分とするスポンジ状止血材及びその製造方法に関する。

キチン、キトサンは、化粧品分野、医療分野、食品分野などで広く使用され、天然の素材として、コラーゲン材料等と同様に好ましく使用されている。しかし過去の応用例は、粉末としての使用が大部分であり、成形体などの形状を利用した用途は見られなかった。この天然高分子であるキトサンは、酢酸等の酸水溶液に容易に溶解するため、湿式成形によって、フイルム、繊維、スポンジなど種々の成形体を作成することが可能である。しかし、その実用化に関しては、ほとんど成功した例が見られない。
また、キトサンは、キチンの脱アセチル化物と定義され、一般的には、脱アセチル化度70〜80％以上であり、水に不溶であるが、キチンは溶解しない希酸溶液に溶解する特徴を持っている。

キチン、キトサンを医療用バンドとして使用することの試みは２０年以上前から試みられ、その有機酸塩の開示もある（特許文献１）。また、キトサンをスポンジ状にする試みもされている（特許文献２）。そして、キチン又はキチン誘導体の有機酸塩の商品化の試みもおこなわれた（特許文献３）（特許文献４）（特許文献５）。しかし、いずれの製品も、止血材として有用性・安全性において完全なものはない。また、本発明者らは、キトサン自体の改良を行いその脱アセチル化度を調整し、さらに非晶質とした新規な止血材も提案した（特許文献６）（特許文献７）。さらに本出願人は、キトサンスポンジの改良製剤の提供もこころみた（特許文献８）（特許文献９）。

上記のような多くの試みにもかかわらず、キチン誘導体をつかった止血材は、１９９７年の手術用止血材の製品回収という事件から、実用化製品の上市はなされていない。

そこで、本出願人は、スポンジ状止血材に関して、実用化が十分期待される性能を有する製造方法を開発し、コラーゲンによって調製されるスポンジ状止血材と同等以上の良質な性能のものを開発することをこころみた（特許文献１０）。
特許文献１０で開示されるキチン由来のスポンジ止血材は、優れた効果を示すものの、該止血剤の安定的な成形が困難であり大量生産を行うことが困難であった。さらに、滅菌処理としてγ線を照射することによる止血材の強度の低下を避けることができなかった（参照：図１３）。加えて、止血材の止血効果の向上も必要であったし、止血材のひび割れが起こることもあった。

特開昭60-142927公報特開昭63-90507号公報特開平9-169654号公報特開2003-26578号公報特表2005-503197号公報特開平11-5803号公報特開平11-276189号公報特開2003-292501号公報特開2004-256784号公報特開2008-220388号公報

本発明は、上記した問題点を解決することを課題とした。より詳しくは、大量生産が容易に可能であり、γ線照射によっても必要な止血材の強度を維持し、かつひび割れをしない均質な性質を有し、さらに止血効果が向上したキチン由来のスポンジ状止血材を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは、キチン由来のスポンジ状止血材の製造工程において、非晶質の部分脱アセチル化キチン（以下、「非晶質キチン」と称することもある）の製造方法の改良、加熱処理の改良並びに加湿処理の追加を行うことにより、大量生産が容易に可能であり、γ線照射によっても必要な止血材の強度を維持し、かつひび割れをしない均質な性質を有し、さらに止血効果が向上したキチン由来のスポンジ状止血材の開発に成功し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の通りである。
「１．以下の工程を含む非晶質の部分脱アセチル化キチン塩を主成分とするスポンジ状止血材の製造方法；
（１）脱アセチル化度が20〜80％の非晶質の部分脱アセチル化キチンを懸濁させる工程、
（２）グルコン酸又はアスパラギン酸を非晶質の部分脱アセチル化キチンのアミノ基の１モルに対し0.2〜1.0モルを上記（１）の懸濁液に添加する工程、
（３）全溶液重量の0.4〜1.0％のエタノールを上記（２）の溶液に添加する工程、
（４）上記（３）の溶液から得られるろ液を氷結させ、粉砕し、シャーベット状にしてシャーベット凍結氷を得る工程、
（５）上記（４）のシャーベット凍結氷に凍結乾燥を行い、凍結乾燥処理品を得る工程、
（６）上記（５）の凍結乾燥処理品に85〜95℃で18〜48時間の加熱処理を行い、加熱処理品を得る工程、
（７）上記（６）の加熱処理品に加湿処理を行う工程。
２．前記（７）の加湿処理工程の後に、γ線滅菌を行う工程を含む前項１に記載のスポンジ状止血材の製造方法。
３．前記加湿処理が、止血材の水分量を約10〜19％に調整することである前項１又は２に記載のスポンジ状止血材の製造方法。
４．製造方法で使用する水として超純水を使用することを特徴とする前項１〜３のいずれか１に記載の製造方法。
５．前項１〜４のいずれか１に記載の製造方法で得られるスポンジ状止血材。
６．破断強度が5.0Ｎ〜200Nである前項５に記載のスポンジ状止血材。」

本発明の製造方法によって製造させるキチン由来のスポンジ状止血材は、大量生産が容易に可能であり、γ線照射によっても必要な止血材の強度を維持し、かつひび割れをしない均質な性質を有し、さらに止血効果が向上した止血材である。

各止血材サンプルの製造特性各止血材サンプルの加湿処理条件スポンジ状止血材の破断強度及び吸水量の測定結果 25kGyのγ線照射前後のスポンジ状止血材の破断強度 25kGy又は50kGyのγ線照射前後のスポンジ状止血材の破断強度エタノール添加によるシャーベット状凍結氷の成形評価エタノール終濃度3.0％にして製造した止血材の表面の走査電顕顕微鏡の画像エタノール終濃度1.0％にして製造した止血材の表面の走査電顕顕微鏡の画像止血材中の水分量と吸水時間の関係止血材の破断強度と吸水量の関係止血材の物理的特性の評価止血材の止血効果の確認従来の止血材の吸水量及び破断強度の結果

（部分脱アセチル化キチン）
本発明における部分脱アセチル化キチンとは、カニ、エビなど甲殻類の外骨格等に含まれるアミノ多糖類の一種であるキチン由来であり、化学構造がグルコサミンと少量のＮ−アセチルグルコサミンとの繰り返し構造である天然物由来の高分子である。一般には、甲殻類の外骨格等を苛性ソーダなどのアルカリで脱タンパクし、塩酸などの酸溶液で脱カルシウム処理して得られるキチンを、さらに苛性ソーダなどの高濃度アルカリ水溶液で部分脱アセチル化して得られる。水に難溶性であり、酢酸などの酸水溶液に溶解する。

（非晶質の部分脱アセチル化キチンの製造方法）
非晶質の部分脱アセチル化キチンの製造方法は、タンパク質含量が0.1重量％以下、無機物含量が0.01重量％以下の高純度キチンを約４０％Ｗ／Ｗアルカリ中に35〜60℃、2〜７時間で分散させ、その後冷却条件下（−10℃〜−30℃）に数時間（1〜3時間）置き、アルカリ濃度を約１０％Ｗ／Ｗになるように水を加え、アルカリキチンドープを調製する。なお、均一系においてアルカリ加水分解する際に、アルカリキチンドープを30℃以下で目的粘度まで熟成し、さらに中和して沈殿を生成させ、脱水、洗浄、凍結真空乾燥等を経て、キチンの脱アセチル化率（DAC度ともいう）が一般的には20〜80％程度、好ましくは25〜70％程度、より好ましくは約45〜65％となるように部分脱アセチル化され、20℃において0.5％W/W溶液粘度が20〜300mPa・s、より好ましくは30〜250mPa・s、さらに好ましくは35〜200mPa・sの非晶質の部分脱アセチル化キチンを調製する。なお、中和は、酸の添加又はアルコール類、イオン交換樹脂等で脱アルカリする。

本発明で使用する非晶質の部分脱アセチル化キチンの分子量は、一般的には、重量平均分子量（標準品にプルランを用いGPC分子量測定により算出）が5万〜400万程度のものが使用され、好ましくは10万〜300万、より好ましくは20万〜200万である。脱アセチル化率は、一般的には、20〜80％程度のものが使用され、好ましくは25〜70％程度、より好ましくは約45〜65％である。粘度は、20℃において0.5％W/W溶液粘度が20〜300mPa・s、より好ましくは30〜250mPa・s、さらに好ましくは35〜200mPa・sである。

非晶質の部分脱アセチル化キチンは一定の酸水溶液に溶かして塩として調製をすることができる。部分脱アセチル化キチンの酸溶液に使用する酸は、酢酸などの弱酸なら何でも使用できる。酸の濃度は一般には0.01〜10.0％W/Wで、特に0.05〜5.0％W/Wが好ましく使用される。部分脱アセチル化キチンの濃度は、使用しやすい粘度のものを使用することが好ましく、一般的には0.1〜5.0％W/Wで、特に0.5〜3.0％W/Wが好ましく使用される。酸の添加量は、部分脱アセチル化キチンのアミノ基1モルに対して1.0〜20モル程度の酸を計算して使用してもよい。又、水溶液には、部分脱アセチル化キチンの他に、必要に応じて界面活性剤などの助剤を加えてもよいが、助剤の有り無しが、本発明の効果に影響するものではない。
なお、好ましくは酢酸等の弱酸で溶解された非晶質の部分脱アセチル化キチン塩の溶液は、部分脱アセチル化キチンがほぼ完全に溶解するまで撹拌する。
また、本発明では、上記のように酢酸等の弱酸を使用して非晶質の部分脱アセチル化キチンを溶解せずとも、水に懸濁させれば良い。
なお、酢酸等の弱酸を使用して溶解しなければ、後ほどの工程において、酢酸等の弱酸を減少させる工程が必要ない。

（非晶質の部分脱アセチル化キチン塩の製造）
その後、酸としてグルコン酸又はアスパラギン酸の添加を行い、非晶質の部分脱アセチル化キチンのグルコン酸塩又はアスパラギン酸塩（以下、「非晶質の部分脱アセチル化キチン塩」と称することもある）とする。酸添加量は非晶質の部分脱アセチル化キチンのアミノ基1モルに対し酸0.2〜1.0モル、好ましくは0.3〜0.8モル、より好ましくは0.4〜0.6モルを添加する。
非晶質の部分脱アセチル化キチンのグルコン酸塩又はアスパラギン酸塩は、16〜32時間、好ましくは20〜28時間、より好ましくは23時間〜25時間攪拌を十分に行い、溶解していれば攪拌後の溶液をろ過し、溶解していなければろ過を行わない。

（エタノール添加工程）
上記攪拌後の液に、エタノール終濃度が0.4〜1.0％になるようにエタノール（99％）を添加する工程を含む。本工程は、「エタノール添加工程」と称する。
なお、下記実施例に示すように、エタノール終濃度を0.4〜1.0％になるように製造すれば、製造時のシャーベット状凍結氷の良好な成形性を損なうことなく、十分な大きさの多孔質構造をもつスポンジが得られ、ウサギ腸骨微小出血モデルを用いた止血実験で十分な止血効果があることが確認している。
以上のことから、容易に大量の止血材を形成でき、かつ該止血材の特性を維持するためにエタノール添加処理でのエタノールの終濃度は0.4〜1.0％とする。
また、従来のキチン由来のスポンジ状止血材（特開2008-220388）の製造工程では、「エタノール添加工程」を行っていない。

（シャーベット凍結工程）
上記の非晶質の部分脱アセチル化キチン塩を「シャーベット凍結工程」に供することによりシャーベット状凍結氷を作製する。ここで、本発明の「シャーベット凍結工程」とは、従来のように急速冷凍、又は、徐々に凍結させて凍結氷を製造するのではなく、一度、凍結させた凍結氷を粉砕し、型枠に充填し、再度、凍結する事でシャーベット状凍結氷が得られる。
また、非晶質キチンの溶液をドライアイスと共に粉砕するとシャーベット状になり、同様に型枠に充填し、再度、凍結する事でシャーベット状凍結氷が得られる。詳しい製造方法は以下の通りである。
非晶質の部分脱アセチル化キチン塩の溶液の約1000gに対しドライアイスを500g〜700g程度加え、ブレンダー等で粉砕し、シャーベット状にする。シャーベット温度は-5℃〜+5℃に調整する。なお、本発明のスポンジ状止血材の製造において、上記のようなシャーベット状にすることができれば、特に凍結方法は限定されない。

さらに、上記シャーベット状の非晶質の部分脱アセチル化キチン塩を、出来上がりのシートの厚みを想定したトレーなどの容器に流し込み、好ましくは-10〜-50℃、より好ましくは-20〜-40℃、最も好ましくは約-30℃で冷凍して凍結させる。
なお、上記非晶質の部分脱アセチル化キチン塩は、凍結させておけば何十日でも保存が可能である。必要な時に凍結氷を次工程である凍結真空乾燥処理に付せば良い。

（凍結真空乾燥処理工程）
上記凍結させた部分脱アセチル化キチン塩の凍結真空乾燥処理を行う。なお、自体公知の真空乾燥機を用いて行うことができる。

（加熱処理工程）
本発明の「加熱処理工程」は、下記実施例より、好ましくは真空乾燥機（真空乾燥状態下）を用いて85〜95℃、好ましくは約88〜92℃において、18〜48時間の加熱処理を行う。
なお、従来のキチン由来のスポンジ状止血材（特開2008-220388）の製造工程では、乾燥機を用いて65〜85℃において、１〜7日の加熱処理を行っていた。従来のキチン由来のスポンジ状止血剤は、加熱処理をしても破断強度が上がりにくく、γ線滅菌で強度が落ちてしまった。
しかし、本発明の「加熱処理工程」では、短時間の加熱処理により破断強度を向上させることができる。

（加湿処理工程）
上記加熱処理工程の後に、止血材の水分量を10〜19％に調整するために、加湿庫に数日間静置させる工程を含む。本工程は、「加湿処理工程」と称する。
止血材の水分量を約10〜19％に調整することができれば、加湿処理の方法は特に限定さえない。例えば、30℃、50〜100％のRH（相対湿度）の加湿庫で上記加熱処理品を数日間（２〜１２日、好ましくは２〜８日間、より好ましくは２〜６日間）保存し（前半加湿処理工程）、さらに、スライスした後に、5〜50℃、20〜100％RHの加湿庫で数日間（２〜１４日間、好ましくは、４〜１２日間、より好ましくは６〜１０日間）保存して（後半加湿処理工程）、加湿処理品を得る。
下記実施例に示すように、「加湿処理工程」を行うことにより、吸水時間が速くなり、さらに破断強度が向上し、加えて、止血材のひび割れを防ぐことができるようになった。
また、従来のキチン由来のスポンジ状止血材（特開2008-220388）の製造工程では、「加湿処理工程」を行っていない。

（γ線滅菌処理）
止血材は、手術時に用いられるため、滅菌処理されていることが必要である。よって、本発明の止血材は、好ましくは、γ線滅菌処理をする。
例えば、25kGy、好ましくは50kGyのγ線を上記加湿処理品に照射する。
なお、下記実施例に示すように、本発明の止血材は、50kGyのγ線照射後でも必要な破断強度（2N以上）を有している。

（超純水処理）
上記いずれの工程で使用する水は、好ましくは超純水を使用する。
本発明者らは、「水道水に含まれるエンドトキシンが止血材の製造工程中のキトサンに吸着することにより、止血材に集積すること」を新規に見出した。
エンドトキシンは、発熱、敗血症やショックを引き起こす有害物質である。
したがって、好ましくは、止血材の製造工程で使用する水はエンドトキシンフリーである超純水を使用する。

本発明の方法で作成できるシートの厚みは、0.5ｍｍ〜20ｍｍ程度であるので、凍結するシャーベット状標品の厚みも、ほぼ同等の厚みになるように設定すればよい。このように作成したシャーベット状標品を、冷却雰囲気に接触して、凍結する。凍結は、水の凍結温度以下、すなわち0℃以下で、好ましくは、−20℃以下で行うことができる。

凍結方法は、標品を通常の空冷式凍結庫に入れる方法や、冷媒例えば、ブラインであるエタノールや塩化カルシウムの水溶液に、−20℃以下で浸漬する方法や、液体窒素、液体炭酸ガス等を吹き付ける方法も利用できる。

最終的に本発明の非晶質の部分脱アセチル化キチン塩を主成分とするスポンジ状止血材を得ることができる。本発明は出来上がったスポンジ状止血材の性能が従来法で得られる物よりはるかに良質なことに特色がある。すなわち、厚みが均一であるともに、吸水速度の速いこと、破断強度が高いこと、吸水量が高いことの性能を同時に有する事ができるという特色がある。

本発明によって得られる最終製剤の残留酸濃度は、酢酸0〜7.0％W/W以下、グルコン酸又はアスパラギン酸2〜40％W/Wであり、非晶質の部分脱アセチル化キチンのアミノ基の1モルに対し総酸イオンが0.2〜1.00モルである。より好ましくは、最終製剤の残留酸濃度は、酢酸約0〜6.0％W/W、グルコン酸又はアスパラギン酸約2.0〜30％W/Wであり、非晶質の部分脱アセチル化キチンのアミノ基の1モルに対し総酸イオンが0.4〜0.8モルである。

本発明によって得られる最終製剤の体積当り重量は、0.005〜0.035ｇ/ｃｍ³であり、より好ましくは、体積当り重量は、約0.01〜0.002ｇ/ｃｍ³である。

本発明によって得られる最終製剤のポアサイズは、50〜200μｍであり、実質的に均質構造である。また、創傷部位に貼付されたときに、創傷局所血液のｐＨの変化が0.05以下である。さらに、創傷部位から、血液吸収後に断片を実質的に残すことなく容易に除去可能である。加えて、手術器具に吸着しないという性状を備えている。

本発明に用いる各濃度の測定方法は以下の通りである。なお、以下の実施例及び試験例でも使用した。

DAC度は、キトサン試料（非晶質キチン又はキトサン）を0.5％(w/w) 酢酸溶液に0.5％(w/w)になるように溶解し、指示薬としてトルイジンブルー溶液を用い、ポリビニル硫酸カリウム水溶液でコロイド滴定して乾物当たりのDAC度（脱アセチル化度）を求めたものである。

粘度は、キトサン試料（非晶質キチン又はキトサン）を0.5％(w/w) 酢酸溶液に0.5％(w/w)になるように溶解し、室温で3時間撹拌し、さらにホモジナイザーで2分間撹拌する。この溶液を恒温槽中で20℃に保ちながらB型粘度計で回転粘度(mPa・s)を測定したものである。

吸水量の測定における吸水は、試料の重量（Ａ）を測定した後、十分な純水を含む容器に試料を5分間浸漬する。次いで試料をザルに引揚げ、5分間水切りし、試料の重量（Ｂ）を測定する。吸水量は、（Ｂ−Ａ）／Ａで表す。より詳しくは、約0.4gを秤量し（Ａ）、5分間純水中に浸漬し、ザルに引揚げ、5分間水切りし秤量し（Ｂ）、以下の式で得た。吸水量＝（Ｂ−Ａ）／Ａ。
なお、本発明の止血材の場合、吸水量は20.0ｇ/ｇ〜120g/gであり、好ましくは、20.0g/g〜60g/gである。

吸水時間の測定における吸水（50mm×50mm，1g当り）は、スポンジを50×50mmにカットし、重量を秤量する（Ａ，最小目盛 0.001g以下）。純水を入れた容器に検体を投入し、完全に吸水する時間（Ｔ）を測定する。次の式でスポンジ（50mm×50mm）の1g当たりの吸水時間を算出する。吸水時間（sec）＝Ｔ／Ａ。
なお、本発明の止血材の場合、吸水時間は、60秒以下であり、良好なものは、50秒以下である。

水分量は、検体約0.2gを秤量し（Ａ，最小目盛 0.001g以下）、110℃で1時間、熱風乾燥し、デシケーターで1時間放冷後、秤量する（Ｂ）。
水分量（％）＝（Ｂ−Ａ）／Ａで算出する。本発明の止血材の場合、水分は9.0〜20％であり、良好なものは10.0〜18.0％である。

吸水後の破断強度は、試料を50mm角にカットし、純水に十分浸漬した後、ザルに引揚げ、5分間水切りする。吸水した試料をコルクボーラーやカッターを使い、直径φ40mm、厚さ15mmにカットし、専用の容器（直径φ40mm、高さh15mm）にセットする。クリープメーター(山電製 RHEONERII)を用い、測定速度 1mm/sec、接触直径 20mm、測定歪率 99.99％、格納ピッチ 0.04secの測定条件で押し潰しによる破断強度を測定したとき、本発明の止血材の場合、2.0Ｎ以上であり、良好な物は5.0Ｎ〜200Nである。

スポンジ中の酸濃度の測定において、グルコン酸及び酢酸濃度の測定は、細かく刻んだキチン類スポンジ0.1gを秤量し、超純水80ml、6M HCl 30mlを加え、スターラーで一晩撹拌し、完全に溶解させる。6M NaOHを用い、pHを2〜3に調整し、超純水で100mlにメスアップした。0.45μmフィルターでろ過を行い、サンプル溶液とする。
マイクロシリンジを用いて、上記サンプル溶液 10μl採取し、HPLC（有機酸酸分析システム，島津製作所製）を用いて、ポストカラムpH緩衝化電気伝導度検出法でグルコン酸、酢酸等の有機酸を、以下の条件で測定する。なお、グルコン酸のリテンションタイムは17.1分前後、酢酸は26.1分前後であり、グルコン酸標準溶液、酢酸標準溶液及びサンプル溶液をそれぞれ測定し、標準溶液とサンプル溶液のピークの面積値の比からサンプルのグルコン酸濃度、酢酸濃度を算出する。
［分析条件］
装置：島津製作所製カルボン酸分析計
<分離条件>
カラム：Shim-Pak SCR-102H 2本連結
移動相：5mM p-トルエンスルホン酸水溶液
移動相流速：0.8ml/min
温度：40℃
<検出条件>
緩衝液：5mM p-トルエンスルホン酸水溶液
100μM EDTAを含む20mM Bis-tris水溶液
緩衝液流速：0.8ml/min
検出器：CDD-6A 電気伝導度検出器
注入量：10μl

スポンジ中の酸濃度において、アスパラギン酸の分析は、試料 0.15g程度を細かく刻み秤量し、純水を約20ml加え、ホモジナイザーを用い、懸濁溶液を調製する。次に、50mMリン酸緩衝液（pH 6.9）10mlを添加し、50mlにメスアップする。溶液を0.45μmフィルターでろ過を行いサンプル溶液とし、HPLC（島津製作所製）を用い、以下の分析条件で測定する。アスパラギン酸のリテンションタイムは10.6分前後であるが、酢酸のリテンションタイムが10.8分前後と近いため、スポンジ中に酢酸とアスパラギン酸の両方が含まれる場合は、ピークが重なってしまうため補正が必要である。補正の方法は、本法で酢酸標準溶液を分析し、酢酸濃度に対するピークの面積値を求め、段落「0037」の方法で求めた酢酸濃度から本法における酢酸の面積値を計算し、次にサンプルを分析し、アスパラギン酸と酢酸の重なったピークの面積値から酢酸の面積値を差し引く。アスパラギン酸標準溶液、及びサンプル溶液をそれぞれ測定し、標準溶液のピーク面積値とサンプル溶液の補正したピーク面積値の比からサンプルのアスパラギン酸濃度を算出する。
［分析条件］
<分離条件>
カラム：Shodex KW-802.5
移動相：10mM リン酸緩衝液（pH6.9）
流速：1.0ml/min
温度：40℃
検出器：UV検出器測定波長 210nm
注入量：10μl

（キチン及びキトサンの分類）
本発明では、各キトサンの特性を以下のように表現する。
FMは、中粘度キトサン（DAC度 100％、粘度約44mPa・s）、DAC30Mは中粘度非晶質キチン（DAC度 25％〜40％程度粘度20〜100mPa・s）、DAC30Lは低粘度非晶質キチン（DAC度 25％〜40％程度粘度20mPa・s以下）、DAC30Hは高粘度非晶質キチン(DAC度 25％〜40％程度粘度100〜300mPa・s)、 DAC50Ｌは低粘度非晶質キチン（DAC度 50％付近粘度 20mPa・s以下）、DAC30L＋FH（DAC度 59％、粘度86mPa・s）は低粘度非晶質キチンDAC30Lと高粘度キトサンFH（DAC度 100％、粘度215mPa・s）を13:7に混合したものである。

また、本発明で得られる止血材は、スポンジの特定の密度、強度によっては柔軟性に欠けて割れやすかったり、もろい場合がある。その場合には非晶質の部分脱アセチル化キチン塩の溶液の状態でポリエチレングリコール、エチレングリコール、グリセリン、油剤などの柔軟剤を0.01〜10％W/W程度加えて同様に製造すれば最終に作成された止血材に柔軟性を持たせることができる。

また、本発明では、非晶質の部分脱アセチル化キチン塩の溶液の時点で第３成分を入れ、最終の止血材がこれら第３成分を含んだものが容易に作成可能である。たとえば医薬品、化粧品、医薬部外品を含んだ止血材の製造が可能である。特に生理活性が他の化学成分や温度によって変性しやすい物質を止血材内に保持させることができる。

また、これら薬剤を非晶質の部分脱アセチル化キチン塩のスポンジ中に混合し成型することで、薬剤に徐放性機能をもたせることが可能と考えられる。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。

（キチン由来のスポンジ状止血材の製造）
各実験例で使用するスポンジ状止血材の製造を行った。製造方法は以下の通りである。

下記エタノール添加処理でのエタノール終濃度0.4％（サンプルNo：S806233）、0.5％（サンプルNo：S807091）、1.0%（サンプルNo：S807081）、3.0％（サンプルNo：S801161）のスポンジ状止血材の製造を行った。

（非晶質キチンの製造）
48％NaOH 3ｋｇに水0.6Ｌ、43メッシュの高純度キチン粉末（商品名：キチンＬ−ＰＣ）〔粘度 65mPa・s（NN―ジメチルアセトアミド／8％(W/W)塩化リチウム溶液に0.2％(W/W)の割合で溶解し、30℃で測定）、水分 1.8％、灰分 0.03％、DAC度 0.96％〕0.3ｋｇを加え調製し、35〜60℃で2〜5時間分散させた。その後、氷6ｋｇを加えて冷却条件下（−10〜−30℃）で3時間攪拌し、水6Ｌを加え、キチン濃度約2％(W/W)、アルカリ濃度約10％(W/W)のアルカリキチンドープを調製し、30℃でDAC度（脱アセチル化度）及び粘度が目的値になるように〔例えばDAC度60±5％、粘度 50mＰａ・s(20℃において0.5%(W/W)溶液) 〕熟成した。その後、溶液を150メッシュナイロンメッシュで減圧ろ過し、95％硫酸水溶液で中和した。この際に沈殿した部分脱アセチル化キチンゲルを50メッシュナイロンメッシュに移し、手で絞り脱水した。その後、4回湯洗して脱塩し、次いで圧搾した。次に、この脱水後の部分脱アセチル化キチンゲルを凍結真空乾燥処理した後、粉砕して脱アセチル化度約60％、粘度減少のない〔20℃において20mPa・s〜780mPa・s(0.5%(W/W)溶液)〕の非晶質の部分脱アセチル化キチン（非晶質キチンDAC60ともいう）を得た。
非晶質キチンDAC60（脱アセチル化度＝55〜65％）〔20℃において粘度20 mPa・s〜100 mPa・s (0.5%(W/W)溶液)〕を用い、その１重量％を純水に加えた。その際、非晶質キチンDAC60を撹拌、分散させた。

（非晶質の部分脱アセチル化キチン塩の製造工程）
上記分散後、酸（リン酸又はアスパラギン酸又はグルコン酸）添加を行った。酸添加量は非晶質キチンのアミノ基1モルに対し酸0.4〜0.8モルを添加する。計算式は以下のようになる。
酸添加量(g)＝非晶質キチン量(g)／非晶質キチンモノマー分子量×脱アセチル化度(%)／100×0.4〜0.8×酸分子量
ここで酸分子量はグルコン酸が178.14、アスパラギン酸が133.1、リン酸が98である。
酸の添加後、撹拌を１晩行い、非晶質の部分脱アセチル化キチン塩の懸濁液または溶解液を調製した。

（エタノール添加処理）
さらに、エタノール終濃度が0.4〜3.0％になるようにエタノールを添加した。なお、必要時までに-30℃で冷凍した。

（シャーベット凍結処理工程）
エタノール添加後の溶液をろ過（ステンレスメッシュ 1480メッシュエアー加圧式ろ過）した。次に、ろ液をシャーベット状氷製造に供した。詳しくは、ろ過した非晶質キチン溶液の約1000gに対しドライアイスを500g〜700g程度加え、ブレンダーで粉砕し、シャーベット状にした。シャーベット温度は-5℃〜+5℃に調整した。

得られたシャーベット状氷をトレイに充填し、凍結させた。凍結は、-30℃の冷凍庫に入れ、１晩かけてシャーベットをしっかり緩徐に凍結させた。なお、冷凍庫に入れておけば何日でも保存が可能である。

（凍結真空乾燥処理）
上記トレイに充填したシャーベット状氷を4日間の凍結真空乾燥処理に供して、凍結真空乾燥処理品を得た。

（加熱処理）
次に、上記凍結真空乾燥処理後の凍結乾燥品に、90℃の加熱処理を24時間行い、加熱処理品を得た。

（加湿処理）
次に、加湿処理として、30℃、50〜100％のRH（相対湿度）の加湿庫で上記加熱処理品を4日間保存した。さらに、スライスした後に、5〜50℃、20〜100％RHの加湿庫で2〜7日間保存（水分が10〜18％になるように調整した）して、加湿処理品を得た。

（滅菌処理）
上記加湿処理品を5cm×5cmに形成し、アルミ滅菌用袋に入れ密封した後に、γ線滅菌（25kGy）を行った。

上記の各止血材サンプルの詳しい製造特性は図１及び図２に記載する。

（加熱処理の検討）
非晶質キチンは100℃、1時間の加熱により、強度や酸に対する溶解性等の物性が変化することが明らかとなっている。そこで、脱アセチル化度約35％の非晶質キチングルコン酸塩スポンジを90℃で6h（加湿処理前のLot.No.S70933）、12h（加湿処理前のLot.No.S709181）、18h（加湿処理前のLot.No.S710111）、24h（Lot.No.S710112)加熱処理して得られたキチン由来のスポンジ状止血材の破断強度及び吸水量を測定した。

上記測定結果を図３に示す。
図３の結果から明らかなように、加熱処理の時間が長くなるほど破断強度は上昇し、逆に吸水量は低下した。また、本発明の加熱処理工程により、18〜24hの短時間で高い破断強度に増加できることができた。
また、従来のキチン由来のスポンジ状止血材（特開2008-220388）の製造工程での加熱処理では、乾燥機を用いて65〜85℃において、1〜7日の加熱処理を行っていた。しかし、本発明の加熱処理では、短時間で破断強度を増加することができる。

（滅菌処理の検討）
キチン類を原材料とした素材をγ線照射すると低分子化が生じ、素材の強度が低下することが知られている。そのため、最終製品の滅菌操作におけるγ線照射後でも十分な破断強度｛２ニュートン（N）以上｝を保持することが必要である。そこで、Lot.No.S801161の止血材に25kGyのγ線照射行い、γ線照射前後の破断強度を測定した。

上記測定結果を図４に示す。
図４の結果から明らかなように、25kGyのγ線照射により破断強度22.1±3.7Nから12.8±6.5Nと約40％の低下が認められた。しかし、下記実施例で示すウサギ腸骨微小出血モデルを用いた止血実験において、良好かつ十分な止血性能とハンドリング性能を維持していた。

キチン由来のスポンジ状止血材の大量生産において、多数量の製品を箱に入れγ線滅菌を行う場合、製品の位置により、照射線量が少ない場所がでてくる可能性がある。滅菌バリデーションでは、照射線量が少ない場所でも25kGyの照射量が要求される。そのため、実際には25kGyよりも多くの照射線量が必要になる。よって、2倍量（50kGy）のγ線照射した製品の安定性を確認する必要がある。そこで、Lot.No.S810141のスポンジ状止血材を25kGy又は50kGyのγ線照射行い、γ線照射前後の破断強度を測定した。

上記測定結果を図５に示す。
図５の結果から明らかなように、50kGyのγ線照射後には、γ線照射前より、破断強度は半分以下に低下するが、必要な破断強度（2N以上）を有していた。
以上の結果より、本発明のキチン由来のスポンジ状止血材は、γ滅菌処理後においても必要な破断強度を有している。

（エタノール添加処理の検討）
シャーベット凍結処理工程において、従来の方法ではシャーベット状氷が固まりやすく安定的な成形が困難であり、キチン由来のスポンジ状止血材の大量生産には不向きであった。したがって、大量生産を行うためには、さらに作業効率のよい製造方法を開発する必要があった。
本発明者らは、エタノールを、非晶質の部分脱アセチル化キチン塩（DAC 37.2％）を含む溶液に添加することにより、凍結氷を柔らかくすることをできると考えた。そこで、エタノールをそれぞれ終濃度5％、10％、15％、20％、30％となるように、非晶質の部分脱アセチル化キチン塩を含む溶液に添加し、−20℃及び−30℃に冷却したときの凍結氷の変化を肉眼的に観察した。

観察結果を下記表１に示す。
エタノールの添加量が増えるほど凍結氷は柔らかくなった。また、エタノールを５％添加した溶液について−20℃から−30℃に温度を下げると、氷の性状は柔らかい氷から硬い氷へと変化した。
以上のことから、シャーベット状凍結氷を成形する−10℃〜0℃の温度域では、氷は柔らかく流動性のある性状で作業効率が良く、さらに凍結工程（−30℃）で硬い氷状になり凍結乾燥処理工程で沸騰すること無く良質なスポンジを得ることができ、大量生産に有用な製造方法を開発することができる。

（最適なエタノール添加量の検討）
非晶質の部分脱アセチル化キチン塩（DAC 58.5％）を含む溶液のエタノール終濃度が0％〜3.0％になるようにエタノールを添加して特性を評価した。
さらに、エタノール終濃度3.0%になるように製造した止血材でウサギ腸骨微小出血モデルを用いた止血実験を行った。加えて、エタノール終濃度3.0％又は1.0％にして製造した止血材の表面の構造を走査電顕顕微鏡で観察した。

特性評価を図６に示す。
エタノール終濃度を0.4〜1.0％なるように製造したところ、製造時のシャーベット状凍結氷の良好な成形性を損なうことなく、ウサギ腸骨微小出血モデルを用いた止血実験で十分な止血効果があることが確認できた。なお、エタノール終濃度3.0％になるように製造した止血材では止血効果が認められなかった。

エタノール終濃度3.0％及び1.0％になるように製造した止血材の表面の構造を走査電顕顕微鏡の観察結果を、それぞれ図７、図８に示す。
図７の画像から明らかなように、エタノール終濃度3.0％になるように製造した止血材では血液吸収に必要な十分な大きさの細孔（50〜200μm径）が形成されなかった。
図８の画像から明らかなように、1.0％で製造した止血材の表面には十分な大きさの多孔質構造を確認した。

上記結果より、エタノール終濃度を3.0%から0.4〜1.0％に低下させて製造したところ、製造時のシャーベット状凍結氷の良好な成形性を損なうことなく、十分な大きさの多孔質構造をもつスポンジが得られ、ウサギ腸骨微小出血モデルを用いた止血実験で十分な止血効果があることが確認できた。
以上のことから容易に成形できるためエタノール添加処理でのエタノールの終濃度は0.4〜1.0％とした。

（加湿処理の検討）
ウサギ腸骨微小出血モデルを用いた止血実験で十分な止血効果を得るためには血液の吸収時間が早い必要がある。加湿環境下でスポンジを静置（加湿処理）し、スポンジ中の水分量と吸水時間の関係並びに破断強度と吸水量の関係を確認した。なお、使用した止血材は、Lot.S710111 A〜K（それぞれ、0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10日間の加湿時間：後半加湿処理）である。
具体的には、厚さ約20mmのスポンジを50×50mmにカットし、重量を秤量した（Ａ，最小目盛 0.001g以下）。室温（20℃）中で純水を入れた容器に検体を投入し、完全に吸水する時間（Ｔ）を測定した。吸水時間（sec）＝Ｔ／Ａで算出した。
なお、吸水時間100秒以下であれば、ウサギ腸骨微小出血モデルを用いた止血実験での止血効果を達すことができることを確認している。
加湿処理は、キチン類スポンジ状止血材DAC35を乾燥機（ダルトン製）内に加湿機を入れ、乾燥機を30℃に設定し、加湿器を運転した。

止血材中の水分量と吸水時間の関係を図９に示す。
図９から明らかなように、後半加湿処理において加湿7日にスポンジ中の水分が10％を超えた時、吸水時間が急速に早くなった。このことからスポンジ中の水分が吸水時間に影響することを確認した。

止血材の破断強度と吸水量の関係を図１０に示す。
図１０から明らかなように、止血材中の水分量が高くなれば、破断強度が高くなり、吸水量が低下していった。特に、止血材中の水分量の変化と破断強度の変化の傾向は、同じパターンを示しており、止血材中の水分量が破断強度に影響を与えることを確認した。

以上により、加湿処理により、止血材の水分量を約11〜17％に調整すれば、破断強度及び吸収時間の向上させることができた。
また、γ線滅菌により止血材の破断強度が低下するので、該滅菌前に加湿処理を行い破断強度を予め高くしておくことは好ましい。

（止血材の物理的特性の評価）
実施例１で製造した各止血材（Lot.No.S801161、S806233、S807081及びS807091）の物理的特性を分析、評価した。
なお、各物理的特性の測定方法は、以下の通りである。
色差b値：スポンジ表面の色を色差計（ZE-200，日本電色）で測定した。
体積当たり重量の押潰し：押し潰した状態（スポンジをアルミ板で上から手で押さえ潰した）のスポンジの体積当たり重量を測定した。さらに、スポンジの縦、横、高さをノギスで測定し、体積を計算した。電子天秤で重量測定を行い、体積当り重量を求めた。
体積当たり重量の非押潰し：押し潰していない状態のスポンジの体積当たり重量を測定した。さらに、スポンジの縦、横、高さをノギスで測定し、体積を計算した。電子天秤で重量測定を行い、体積当り重量を求めた。
エンドトキシン分析方法：検体約2mgを秤量し、0.05N HCl 0.9mlを加え、超音波処理を行いながら、 4℃,15分間抽出処理を行う。その後、0.05N NaOHでpHを6〜8に調整し、試験溶液とした。エンドトキシンの定量または検出は、エンドトキシン定量キット（比色法） Limulus Amebocyte Lysate,QCL-1000で定量（製造：Cambrex Bio Science Walkersville,Inc.）、又は、エンドトキシン検出キット（ゲル化法）パイロテル^{（登録商標）}（製造：Associates of Cape Cod,Inc.）で測定した。なお、エンドトキシンは100EU/g以下の場合を陰性とした。

分析結果を図１１に示す。
図１１から明らかなように、本発明の止血材｛Lot.No.S806233、S807081及びS807091（エタノール終濃度0.4％〜1.0％）｝は、コントロールの止血材｛Lot.No.S801161（エタノール終濃度3.0％）と比較して、吸水時間及び破断強度が優れていることを確認した。

（止血材の止血効果の確認）
実施例１で製造した各止血材（Lot.No.S801161、S806233、S807081及びS807091）の止血効果を確認した。
なお、動物実験の詳細は、以下の通りである。
全身麻酔下において、背臥位にした家兎の腰部（腸骨稜直上部）より切開し、電気メスを用いて止血しながら腸骨翼から仙腸関節部までの腸骨を露出させた。仙腸関節部より遠位へ10〜15mmの腸骨平坦部分に直径5mm、深さ4〜5mmの穴を電気ドリルにて開穴した。次に、初期の出血をガーゼにて5秒間押さえ、各サンプルを10mg骨穴に充填した。充填後、予め重量を計測しておいたウレタンスポンジで出血する血液を5分間吸収させた。5分後止血したか否かを確認した。さらに、ウレタンスポンジの重量を計測し、最初の重量との差から出血量を測定した。5分間のうちに完全止血した場合はその時間を測定し、5分まで待って該サンプルを除去、骨穴よりの出血の有無を確認した。操作中は持続的に血圧のモニタリングを行った。

止血効果を図１２に示す。
図１２から明らかなように、本発明の止血材｛Lot.No.S806233、S807081及びS807091（エタノール終濃度0.4％〜1.0％）｝は、コントロールの止血材｛Lot.No.S801161（エタノール終濃度3.0％）と比較して、血液吸収時間、血液吸収量及び止血効果が優れていることを確認した。
さらに、本発明の止血材の血液吸収時間は、従来の止血材（特開2008-220388号公報に記載の止血材）の血液吸収時間と比較して、約1.9〜15倍優れていることを確認した。

（止血材のひび割れの確認）
下記表２に記載の本発明の止血材のひび割れ率を、従来の止血材のひび割れ率と比較した。

下記表２に示すように、本発明の止血材ではひび割れが起こらなかった（ひび割れ率０％）。一方、従来の止血材のひび割れ率は、66.7％であった。
以上により、本発明の止血材は、ひび割れることなく均一な性質を有することを確認した。

本発明は、大量生産が容易に可能であり、かつγ線照射によっても必要な止血材の強度を維持し、かつひび割れをしない均質な性質を有し、さらに止血効果が向上した止血材である。

Claims

以下の工程を含む非晶質の部分脱アセチル化キチン塩を主成分とするスポンジ状止血材の製造方法；
（１）脱アセチル化度が20〜80％の非晶質の部分脱アセチル化キチンを懸濁させる工程、
（２）グルコン酸又はアスパラギン酸を非晶質の部分脱アセチル化キチンのアミノ基の１モルに対し0.2〜1.0モルを上記（１）の懸濁液に添加する工程、
（３）溶液重量の0.4〜1.0％のエタノールを上記（２）の溶液に添加する工程、
（４）上記（３）の溶液から得られるろ液を氷結させ、粉砕し、シャーベット状にしてシャーベット凍結氷を得る工程、
（５）上記（４）のシャーベット凍結氷に凍結乾燥を行い、凍結乾燥処理品を得る工程、
（６）上記（５）の凍結乾燥処理品に85〜95℃で18〜48時間の加熱処理を行い、加熱処理品を得る工程、
（７）上記（６）の加熱処理品に加湿処理を行う工程。
前記（７）の加湿処理工程の後に、γ線滅菌を行う工程を含む請求項１に記載のスポンジ状止血材の製造方法。
前記加湿処理が、止血材の水分量を10〜19％に調整することである請求項１又は２に記載のスポンジ状止血材の製造方法。
製造方法で使用する水として超純水を使用することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１に記載の製造方法。
請求項１〜４のいずれか１に記載の製造方法で得られるスポンジ状止血材。
破断強度が5.0Ｎ〜200Nである請求項５に記載のスポンジ状止血材。